KR20130000988A

KR20130000988A - 히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제

Info

Publication number: KR20130000988A
Application number: KR1020110061827A
Authority: KR
Inventors: 우구; 한만덕; 백영준; 유대근; 김하나; 이현수; 김용현
Original assignee: (주)한국비엠아이
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2013-01-03

Abstract

히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제에 관한 것으로, (a) 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조된 히알루로니다아제(hyaluronidases)를 통한 원료를 마련하는 단계, (b) 상기 단계 (a)에서 마련된 히알루로니다아제를 블루 세파로스(Blue sepharose)로 1차 정제하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (b)는 카프릴산 나트륨으로 세척하는 과정을 포함하는 구성을 마련한다.
상기와 같은 히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제를 이용하는 것에 의해, 기존 제품화된 히알루로니다아제의 순도를 높일 수 있고, 기존 제품화된 히알루로니다아제가 가지고 있던 문제점인 이물단백질을 제거함으로써 안전성을 확보할 수 있다.

Description

히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제{High-degree purification method of hyaluronidases and parenteral-injection using there}

본 발명은 기존 제품화된 히알루로니다아제(hyaluronidases)의 순도를 높이기 위한 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제에 관한 것으로, 특히 안전성을 랫드를 이용한 아나필락시스 쇼크 반응으로 확인하여 기존 제품화된 히알루로니다아제가 가지고 있던 문제점인 이물단백질을 제거함으로서 안전성이 보다 확보된 고도정제 히알루로니다아제 주사제에 관한 것이다.

히알루론산을 저분자화하는 효소의 총칭인 히알루로니다아제는 Duran-Reynals (1933)에 의하여 처음에는 확산 인자로써 알려졌으나, 그 후 히알루론산(hyaluronic acid, HA)에 강력한 활성을 나타나는 것이 관찰되어 히알루로니다아제(hyaluronidase, HAase)라 불리게 되었다. 이 효소는 그 작용기전에 따라 고환, 리소좀 및 벌독에 분포하는 히알루로네이트 4-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.2.35), 거머리에 존재하는 히알루로네이트 3-글리카노하이드로라아제(EC 3.2.2.36)와 세균에 존재하는 히알루로네이트 라이아제(EC 4.2.2.1)로 분류된다. 특히 고환에서의 히알루로니다아제(PH-20)는 정자의 첨체 부분의 글리코실 포스파티딜이노시톨 고정부위(GPI anchor)에 부착되어 있어서, 난자 외부의 두꺼운 외벽층을 분해하여 수정을 일으키는 중요한 효소이다. PH-20의 작용으로 히알루로난(HA)와 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트에 존재하는 D-글루쿠로닉 산과 N-아세티-D-글루코사민의 β(1-4) 결합을 가수 분해하는 것으로 알려져 있다. 이 효소들의 일반적인 분자식은 C₂₄₅₅H₃₇₇₅N₆₁₇O₇₀₄S₂₁이며, 분자량(Mol. mass)은 53870.9 g/mol 이다. 사람의 경우, HYAL1, HYAL2, HYAL3, 및 PH-20/SPAM1 등을 포함한 6개의 유전자가 이 효소와 연관되어 있다.

1950년대 부터 히알루로니다아제의 광범위한 사용에 대하여 포괄적으로 검토되었는데, 최초의 사용은 수액제의 피하주입이었으며, 그 외의 정형외과, 안과, 성형외과, 치과, 구강외과, 부인과 및 이비인후과의 수술에서 국소 마취제 및 스테로이드의 확산을 증가시키기 위하여 침윤 및 차단 마취에 사용, 혈종과 같이 체액이 모인 것을 분산, 복막 유착의 방지, 결석 생성 방지 및 불임의 치료 등에 사용되고 있다.

즉, 다음과 같은 분야에서 유용하게 사용되었다.

A. 통증치료 영역에서의 유용성

척추수술 후 요통증후군(FBSS) 환자에게 신경근 주위의 섬유 증식을 제거하는 히알루로니다아제의 역할로 섬유증식에 기인한 만성적 통증치료에 효과적이다.

B. 성형외과 수술시의 유용성

국소 마취제와 병용 투여 시 짧은 마취시간, 넓은 마취범위 및 마취제 사용량을 감소시키므로 부작용을 최소화시키며, 수술 시 조직변형을 감소시켜 수술 결과를 정확히 예측 가능케 하며, 수술 후 부종과 멍을 예방하고 가슴 확대 수술 시 조직박리를 쉽게 하고 수술 후 혈종의 흡수를 촉진하며, 주름살 개선을 위한 과다 주입된 필러의 제거하는데 사용되고 있다.

C. 기타 영역에서의 유용성

안과 수술시 국소마취의 효과를 증가시키며, 혈관외 유출에서 독성약제를 확산시켜 국소농도를 저하시키고 다른 약물과 병용사용 시 피하주입을 가능케 함으로써 정맥주사가 힘든 환자에 효과적이다.

또한 비만 환자 치료시 효율적인 조직을 제거하는데 유용하게 사용할 수 있다.

현재 시판되고 있는 히알루로니다아제는 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조하여 원료로 사용하고 있다. 이러한 가공되지 않은 히알루로니다아제를 적정농도로 녹여 바이알에 충전하여 동결건조하는 방법으로 제품화하고 있다. 제품화된 히알루로니다아제에는 이물단백질이 과량 포함되어 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 가공되지 않은 히알루로니다아제 제품에서 이물단백질을 제거하고 순도 95%이상의 히알루로니다아제를 고도로 정제할 수 있는 고도정제 히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 고도 정제된 히알루로니다아제를 사용하여 랫드를 이용한 아나필락시스 반응을 통하여 안정성을 확인하여, 고도정제 히알루로니다아제를 주사제로 개발할 수 있는 고도정제 히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 히알루로니다아제의 고도정제 방법은 (a) 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조된 히알루로니다아제(hyaluronidases)를 통한 원료를 마련하는 단계, (b) 상기 단계 (a)에서 마련된 히알루로니다아제를 블루 세파로스(Blue sepharose)로 1차 정제하는 단계를 포함하고, 상기 단계 (b)는 카프릴산 나트륨으로 세척하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 히알루로니다아제의 고도정제 방법에 있어서, (c) 상기 단계 (b)에서 1차 정제된 히알루로니다아제를 사용하여 모노 인산 나트륨(sodium phosphate)로 2차 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 히알루로니다아제의 고도정제 방법에 있어서, (d) 상기 단계 (c)에서 2차 정제된 히알루로니다아제를 사용하여 헤파린 세파로스(Heparin sepharose)로 3차 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 히알루로니다아제의 고도정제 방법을 이용한 주사제는 상술한 바와 같은 히알루로니다아제의 고도정제 방법에 의해 얻어진 주사제인 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 고도정제 히알루로니다아제의 고도정제 방법에 의하면, 기존 제품화된 히알루로니다아제의 순도를 높일 수 있다는 효과가 얻어진다.

또, 본 발명에 따른 고도정제 히알루로니다아제 주사제에 의하면, 기존 제품화된 히알루로니다아제가 가지고 있던 문제점인 이물단백질을 제거함으로써 안전성을 확보할 수 있다는 효과도 얻어진다.

도 1은 본 발명에 따른 고도정제 히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제의 제조 방법을 설명하기 위한 공정도,
도 2는 본 발명에 따른 블루 세파로스 정제 차트를 나타내는 도면,
도 3은 본 발명에 따른 모노 인산 나트륨(sodium phosphate) 정제 차트를 나타내는 도면,
도 4는 본 발명에 따른 헤파린 세파로스 정제 차트를 나타내는 도면.

본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.

먼저 본 발명의 개념에 대해 설명한다.

본 발명은 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조된 히알루로니다아제의 이물단백질제거하여 고순도의 히알라루로니다아제를 제조하기 위한 방법으로 하기 과정 순으로 정제공정을 설계하였다.

1) 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조된 히알루로니다아제를 통한 원료 준비 단계

2) 블루 세파로스(Blue sepharose) 크로마토그래피 단계

3) 모노 S 크로마토그래피 단계

4) 헤파린 세파로스(Heparin sepharose) 크로마토그래피 단계

상기 개시된 공정과정은 높은 생물학적 효소 활성을 갖는 본 발명에 따른 단백질이 수득될 수 있도록 보장한다. 따라서, 본 발명은 히알루로니다아제의 생물학적 활성이 500 kU/mg 이상으로 나타나는 특이적 효소 활성을 가진 단백질을 제공하는 것이다. 용어 “단위”는, 상기 및 하기에서 “국제단위” (IU)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 고도정제된 히알루로니다아제를 사용하여 랫드를 이용한 항원성 시험을 하기와 같이 시행 후 안정성이 확인된 고도정제 히알루로니다아제 주사제를 개발하고자 한다.

1) 아나필락시스 쇼크 반응 시험

2) 수동 피부 아나필락시스 반응 시험

본 발명을 통하여 기존 히알루로니다아제 주사제가 가지고 있던 이물단백질을 제거하고, 소량의 주사제 주입이 가능해진다. 이로써 정형외과, 안과, 성형외과, 치과, 구강외과, 부인과 및 이비인후과의 수술에서 국소 마취제 및 스테로이드의 확산을 증가시키기 위하여 침윤 및 차단 마취에 사용, 혈종과 같이 체액이 모인 것을 분산, 복막 유착의 방지, 결석 생성 방지 및 불임의 치료 등에 사용되고 있는 기존의 히알루로니다아제 주사제를 본 발명을 통한 고도정제 히알루로니다아제 주사제로 대체하고자 한다.

이하, 본 발명에 따른 고도정제 히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제의 제조 과정에 대해 도 1 내지 도 4에 따라 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 고도정제 히알루로니다아제의 고도정제 방법 및 이를 이용한 주사제의 제조 과정을 설명하기 위한 공정도이고, 도 2는 본 발명에 따른 블루 세파로스 정제 차트를 나타내는 도면이고, 도 3은 본 발명에 따른 모노 인산 나트륨(sodium phosphate) 정제 차트를 나타내는 도면이며, 도 4는 본 발명에 따른 헤파린 세파로스 정제 차트를 나타내는 도면이다.

< 실시 예 1 > 블루 세파로스 정제 공정(S10)

히알루로니다아제를 블루 세파로스로 1차 정제하기 위해 레진(resin) 양을 20 mL로 하였고 이동상으로 A 용액 (10 mM 글리신, pH 10.0)과 B 용액 (10 mM 글리신, 1 M 염, pH 10.0)을 사용하였다. 히알루로니다아제 200 mL (2 mg/mL)로 하여 2.0 mL/min의 유속에서 적용하였고, 3.0 mL/min의 유속으로 분석하였다. 정제 단계는 불순물의 제거를 위하여 0.3% 카프릴산 나트륨으로 세척 후 40 mM, 125 mM, 1 M 순으로 염의 농도를 높여 주면서 분석하였다. 분석 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.

블루 세파로스 정제 시 나타나는 불순물의 제거 및 특이 활성(specific activity) 개선을 위하여 카프릴산 나트륨 세척 과정 후, 염 농도별 정제를 한 결과, 125 mM 염 단계의 정제 과정을 통하여 총 단백질 수율이 4%로 감소하였지만 특이 활성은 22배 증가되었다.

표 1은 상술한 실시 예 1에 따른 정제 수율을 나타낸다.

< 실시 예 2 > 모노 S 정제 공정(S20)

블루 세파로스로 정제된 히루로니다아제를 모노 S로 2차 정제하기 위해 레진 양을 20 mL로 하였고 이동상으로 A 용액 (10 mM 인산염, 1 mM EDTA, 0.1% Tween80, pH 7.0)과 B 용액 (10 mM 인산염, 1 M 염, 1 mM EDTA, 0.1% Tween80, pH 7.0)을 사용하였다. 1차 정제된 히알루로니다아제 125 mM (2~3배 희석 전량)로 하여 0.7 mL/min의 유속에서 적용하였고, 3.0 mL/min의 유속으로 분석하였다. 정제 단계는 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, 1 M 순으로 염의 농도를 높여 주면서 분석하였다. 분석 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.

블루 세파로스로 정제를 통해 얻은 125 mM 히알루로니다아제를 사용하여 모노 S 정제를 시행 한 결과, 125 mM 염 단계의 정제 과정을 통하여 총 단백질 수율이 32%로 감소하였지만, 특이 활성은 2.8배 증가되었다.

표 2는 상술한 실시 예 2에 따른 정제 수율을 나타낸다.

< 실시 예 3 > 헤파린 세파로스 정제 공정(S30)

모노 S로 정제된 히루로니다아제를 헤파린 세파로스로 3차 정제하기 위해 레진 양을 2.5 mL로 하였고 이동상으로 A 용액 (20 mM 아세트산 나트륨, 1 mM EDTA, 0.1% Tween80, pH 4.5)과 B 용액 (20 mM 아세트산 나트륨, 1 M 염, 1 mM EDTA, 0.1% Tween80, pH 4.5)을 사용하였다. 3차 정제된 히알루로니다아제 초기 용출물을 농축 및 완충액 교환하여 0.5 mL/min의 유속에서 적용하였고, 1.0 mL/min의 유속으로 분석하였다. 정제 단계는 100 mM, 200 mM, 500 mM, 700 mM, 1 M 순으로 염의 농도를 높여 주면서 분석하였다. 분석 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.

모노 S 정제를 통해 얻은 초기 단계 히알루로니다아제를 사용하여 헤파린 세파로스 정제를 시행 한 결과, 500 mM 염 단계의 정제 과정을 통하여 총 단백질 수율이 74.6%로 감소하였지만, 특이 활성은 1.2배 증가되었다.

표 3은 상술한 실시 예 3에 따른 정제 수율을 나타내고, 표 4는 본 발명에 따른 고도정제 과정을 통한 정제 배율을 나타낸다.

본 발명은 3단계의 정제과정을 통하여 총 단백질 수율이 0.8%로 감소하였지만, 특이 활성은 85배 증가된 고도정제 히알루로니다아제를 생산할 수 있다.

< 실시 예 4 > 아나필락식스 쇼크 시험(S40)

Sprague-Dawley계 랫드를 이용하여 고도정제 히알루로니다아제의 아나필락식스 쇼크 유발가능성을 평가하였다. 본 시험은 기본적으로 식품 의약품 안전청 고시 제 2009-116호 (2009. 8. 24.) "의약품등 독성시험 기준" 및 식품의약품안전청 고시 제 2009-183호 (2009.12.22) “비임상시험관리기준”에 준하여 수행하였다. 본 시험물질인 고도정제 히알루로니다아제 임상예정용량이 25 IU/kg 이므로, 저용량군과 고용량군을 150 IU/kg B.W.와 1,500 IU/kg 으로 설정하여 감작 유도를 실시하였고, 야기시에는 공히 1,500 IU/kg B.W.으로 설정하여 투여하였다. 항원을 생체에 투여하여 항체를 생산시키는 유도작업인 감작(sensitization)과 야기에 대한 자세한 사항은 하기와 같다.

1) 감작 단계

* HAase; 히알루로니다아제, (1); 원료 1, (2); 원료 2, S.C: 피하주사,

p-HAase; 고도정제 히알루로니다아제, FCA; Freund's complete adjuvant (항원보강제) ASA; 아나필락시스 쇼크

2) 야기 단계

* HAase; 히알루로니다아제, (1); 원료 1, (2); 원료 2, I.V; 정맥주사,

p-HAase; 고도정제 히알루로니다아제

시험물질의 야기 후 양성대조군 히알루로니다아제(원료 1)의 모든 동물은 10여 분간 불안, 입모, 진전, 코를 문지르거나 핥음, 일시적인 과호흡, 호흡불안, 보행불안, 경련 및 횡와 등의 매우 심한 아나필락시스 쇼크를 보였으나, 음성대조군 (Saline), 양성대조군 Hyaluronidase(원료 2) 및 각 조합의 고도정제 히알루로니다아제(저농도 - 150IU/kg, 고농도 - 1,500IU/kg) 투여군에서는 기모나 코를 문지르거나 핥는 행위가 초기 1~5분간 나타나는 모습 외에는 아나필락시스 쇼크라고 할 수 있는 어떠한 임상 예도 관찰되지 않았다.

< 실시 예 5 > 수동 피부 아나필락식스 반응시험(S40)

랫드-랫드 모델을 이용하여 고도정제 히알루로니다아제의 조직 친화적인 IgE 항체생성 유·무를 평가하였다. 본 시험은 기본적으로 식품 의약품 안전청 고시 제2009-116호 (2009. 8. 24.) “의약품등 독성시험 기준” 및 식품의약품안전청 고시 제2009-183호(2009.12.22) “비임상시험관리기준”에 준하여 수행하였다. 본 시험물질인 시험물질 히알루로니다아제의 임상예정용량이 25 IU/kg 이므로 저용량군과 고용량군을 150 IU/kg B.W.와 1,500 IU/kg 으로 설정하여 감작유도를 실시하였고, 야기시에는 공히 1,500 IU/kg B.W.으로 설정하여 투여하였다. 감작과 야기에 대한 자세한 사항은 하기와 같다.

1) 감작 단계

p-HAase; 고도정제 히알루로니다아제, FCA; Freund's complete adjuvant (항원보강제) PCA; 수동 피브 아나필락시스 반응

2) 야기 단계

* HAase; 히알루로니다아제, (1); 원료 1, (2); 원료 2, I.D; 피내주사, I.V; 정맥주사, p-HAase; 고도정제 히알루로니다아제

수동피부 아나필락시스 반응시험을 위해 각 항혈청을 단계 희석하여 피내 주사한 다음 항원과 에반스 블루(Evan’s Blue) 혼합 용액을 정맥 주사한 결과, 양성대조군인 시그마(Sigma) 사의 히알루로니다아제(원료 1) 혼합 투여군에서는 1마리만 양성반응을 나타내었으며, PCA 항체가는 8배(1마리)로 나타났으나, 음성대조군(saline), 시험물질인 고도정제 히알루로니다아제 및 정제되지 않은 히알루로니다아제(원료 2) 투여군의 모든 동물은 음성의 결과를 나타내었다.

표 5는 아나필락시스 쇼크 시험의 결과를 나타낸다.

그룹1 - 대조군 (생리식염수);

그룹2 - 히알루로니다아제 (원료 1, 항원보강제 첨가) 첨가군;

그룹3 - 히알루로니다아제 (원료 2, 항원보강제 첨가) 첨가군;

그룹4 - 고도정제 히알루로니다아제 첨가군(저농도);

그룹5 - 고도정제 히알루로니다아제 첨가군(고농도);

그룹6 - 고도정제 히알루로니다아제 첨가군(저농도, 항원보강제 첨가)

그룹7 - 고도정제 히알루로니다아제 첨가군(고농도, 항원보강제 첨가)

상술한 바와 같은 고도정제 히알루로니다아제에 대하여 랫드에 대한 아나필락시스 쇼크 반응 및 수동 피부 아나필락시스 반응 시험에서 문제점이 발생하지 않아 안정성이 확보되었다. 따라서 고도정제 히알루로니다아제는 현재 시판중이 주사제보다 순도가 높고 안전성이 우수한 주사제로서 가치가 있었다.

이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.

본 발명에 따른 히알루로니다아제의 고도정제 방법은 히알루로니다아제의 순도를 높일 수 있다는 기술에 적용된다.

Claims

(a) 양(ovine)의 고환에서 추출한 후 동결건조된 히알루로니다아제(hyaluronidases)를 통한 원료를 마련하는 단계,
(b) 상기 단계 (a)에서 마련된 히알루로니다아제를 블루 세파로스(Blue sepharose)로 1차 정제하는 단계를 포함하고,
상기 단계 (b)는 카프릴산 나트륨으로 세척하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다아제의 고도정제 방법.
제1항에 있어서,
(c) 상기 단계 (b)에서 1차 정제된 히알루로니다아제를 사용하여 모노 인산나트륨(sodium phosphate)로 2차 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다아제의 고도정제 방법.
제2항에 있어서,
(d) 상기 단계 (c)에서 2차 정제된 히알루로니다아제를 사용하여 헤파린 세파로스(Heparin sepharose)로 3차 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루로니다아제의 고도정제 방법.
특허청구범위 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 히알루로니다아제의 고도정제 방법에 의해 얻어진 주사제.
항원성이 높은 기존 제품보다 항원성이 낮은 고도 정제 히알루로니다아제를 분리 및 정제하는 방법 및 그 결과산물의 효소제제.