CN107441128A - 一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和干细胞注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和制备方法。该药物组合物由间充质干细胞和银杏叶提取物组成。本发明药物组合物将间充质干细胞与银杏叶提取物联合使用后可协同治疗缺血性脑中风；本发明药物组合物成分明确，安全，有效，且制成混合制剂直接注射治疗，程序简单。

Description

一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和 干细胞注射液及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞制剂技术领域，特别涉及一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和干细胞注射液及其制备方法。
背景技术
脑血流的供应障碍导致缺氧和缺血，从而引起脑软化或者局限性脑组织的缺血性坏死疾病。缺血性脑血管病具有发病率、致残率和致死率都高的特点，已是当前疾病三大死亡原因之一。本病以脑卒中为主，尤以缺血性的脑卒中最为多见，且近年来呈上升的趋势，占卒中的80％。卒中后肢体致残和智力障碍是严重的社会的问题和医学的难题。研究促进神经的再生和大脑功能的重组及其调节机制，促进机体功能的恢复，这对于减少残疾的发生具有重要的意义。
缺血性脑卒中(又称缺血性脑中风)的发病机制复杂，涉及了时间和空间级联反应，发病时可启动疾病的诸多环节；其中能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用(EAA)、炎症反应、半暗带去极化及细胞凋亡等共同参与了缺血性脑卒中病发的生理过程。其中细胞凋亡的生理过程如下：Caspase-3是凋亡过程中最重要的蛋白，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必要物质。脑缺血后，神经元Caspase-3细胞凋亡也参与缺血性细胞损害，作为脑缺血后迟发型神经元死亡的重要形式，其与神经细胞坏死同时并存。
近年来，国内外学者提出了干细胞移植(主要采用间充质干细胞作为种子细胞)治疗脑卒中的手段，为治疗缺血性脑卒中的治疗开辟了新的途径，已有大量的临床研究和基础研究证实了间充质干细胞治疗缺血性脑卒中(共2625例)的有效性和安全性。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)用于脑卒中治疗具有不可比拟的优势：MSC具有低免疫原性，是最理想的组织工程、再生医学和治疗自身免疫性疾病种子细胞。目前，临床研究已表明使用间充质干细胞移植治疗脑卒中后遗症具有良好的疗效，患者均出现不同程度的运动功能改善、日常生活能力高，标志着该治疗方法的可行性。单独注射间充质干细胞虽然具有细胞替代作用、分泌神经营养因子、促进内源性神经干细胞增生和定向迁移、免疫调节作用等，但是却无法扩张血管、改善血流循环障碍。
银杏叶提取物(EGb761)是公认的治疗脑功能损害的有效药物，主要成分是黄酮类和萜内酯类。银杏叶提取物能促进损伤神经再生和功能恢复，其机制可能为EGb通过降低神经元和雪旺细胞钙浓度而减轻损伤、保护神经元和雪旺细胞，并通过扩张血管、促进毛细血管再生，改善神经组织缺血状态、清除溃变的髓鞘、促进雪旺细胞的分裂和增殖，从而促进神经再生。或者降低神经细胞iNOS的表达，减少NO对神经组织的进一步损伤作用，有利于其促进神经再生。
目前还未见将间充质干细胞与银杏叶提取物联合使用的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和干细胞注射液及其制备方法。该药物组合物由间充质干细胞与银杏叶提取物组成，联合使用后可协同治疗缺血性脑中风。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物，由间充质干细胞和银杏叶提取物组成。
作为优选，以cell/mg计，间充质干细胞与银杏叶提取物的比例为(1～3)×107：(300～400)。
在本发明提供的实施例中，以cell/mg计，间充质干细胞与银杏叶提取物的比例为(1～3)×107：350。
作为优选，银杏叶提取物的制备方法为：醇提大孔树脂纯化法。
作为优选，间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
作为优选，脐带间充质干细胞为第2、3或4代脐带间充质干细胞。
在本发明提供的具体实施例中，脐带间充质干细胞为第3代脐带间充质干细胞。
本发明还提供了该药物组合物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
本发明还提供了一种促进损伤神经再生和功能恢复的干细胞注射液，包括间充质干细胞和银杏叶提取物注射液。
作为优选，银杏叶提取物注射液为金纳多银杏叶提取物注射液。
作为优选，银杏叶提取物注射液中银杏叶提取物的浓度为3～4mg/mL。
在本发明提供的具体实施例中，银杏叶提取物注射液中银杏叶提取物的浓度为3.5mg/mL。
作为优选，以cell/mL计，间充质干细胞与银杏叶提取物注射液的比例为(1～3)×107：100。
在本发明提供的具体实施例中，以cell/mL计，间充质干细胞与银杏叶提取物注射液的比例为3×107：100。
作为优选，间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
作为优选，脐带间充质干细胞为第2、3或4代脐带间充质干细胞。
在本发明提供的具体实施例中，脐带间充质干细胞为第3代脐带间充质干细胞。
本发明还提供了该干细胞注射液的制备方法，包括：将间充质干细胞和银杏叶提取物注射液混合。
本发明提供了一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和干细胞注射液及其制备方法。该药物组合物由间充质干细胞和银杏叶提取物组成。本发明至少具有如下优势之一：
1、本发明药物组合物由间充质干细胞与银杏叶提取物组成，联合使用后可协同治疗缺血性脑中风；
2、本发明药物组合物成分明确，安全，有效，且制成混合制剂直接注射治疗，程序简单；
3、本发明药物组合物制备方法简单，适合工业化生产。
附图说明
图1示培养至第4天P3代hUC-MSCs的形态图。
具体实施方式
本发明公开了一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和干细胞注射液及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物及其应用和制备方法中所用药剂和细胞均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 脐带间充质干细胞的培养
脐带取自健康产妇(乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性)，将脐带置于含有100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75％酒精，浸泡1-2min，期间不停翻动脐带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将脐带剪成2mm左右的小段，每段用眼科剪纵向开，用血管钳去除脐带内三根血管(两条动脉，一条静脉)，同时去除脐带外膜。将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm3大小的组织块，取适量放入直径为10cm的无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积。加入LONZA人干细胞无血清培养液(LonzaUltraCULTURETM)，5％CO2、37℃、饱和湿度为95％的CO2培养箱中培养。第5-7天半量换培养基，继续培养12-14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养。
经传递3-5代的脐带间充质干细胞生长旺盛，hUC-MSCs生长旺盛，边界光滑，呈现巢状生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰富，细胞核大，核仁大，如图1。
取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，流式细胞术检测表面抗原CD105、CD45、CD34、CD19、CD90、CD73、CD11b、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样本分析6000-8000个细胞，结果见表1。结果显示，第3代hUC-MSCs高表达CD105、CD90和CD73，低表达或不表达HLA-DR、CD19、CD45、CD11b和CD34等标记物。结果表明hUC-MSCs与其他来源的MSCs基本相同。
表1 流式细胞术检测表面抗原表达情况
细胞表型 CD73 CD19 CD34 CD11b
阳性表达率(％) 95±1.06 1.27±0.39 2.13±0.35 1.24±0.06
细胞表型 CD90 CD45 CD105 HLA-DR
阳性表达率(％) 95.8±1.27 1.22±0.05 98.84±0.17 2.93±0.21
实施例2 脐带间充质干细胞与银杏叶提取物注射液的制备
用金纳多(银杏叶提取物注射液，规格：17.5mg/5mL)将脐带间充质干细胞以3×107cells/次(100mL)的剂量稀释成混合注射液。
实施例3 脐带间充质干细胞与银杏叶提取物注射液的制备
用金纳多(银杏叶提取物注射液，规格：17.5mg/5mL)将脐带间充质干细胞以2×107cells/次(100mL)的剂量稀释成混合注射液。
实施例4 脐带间充质干细胞与银杏叶提取物注射液的制备
用金纳多(银杏叶提取物注射液，规格：17.5mg/5mL)将脐带间充质干细胞以1×107cells/次(100mL)的剂量稀释成混合注射液。
试验例1 效果试验
对实施例2-4和金纳多(银杏叶提取物注射液，规格：17.5mg/5mL)、脐带间充质干细胞的疗效进行考察，大鼠脑缺血再灌注后24h内进行干预治疗。干预方式：①静脉注射，每周4次。②静脉注射+脊柱局部注射，每周1次。实施例2-4注射液治疗组：每次100mL；
金纳多注射液治疗组：每次200mL；
脐带间充质干细胞治疗组：每次6×107cells。
观察周期：细胞回输后90天对比观察期约三个月，定期进行观察。
干预后进行神经功能的评分，评分结果见表2：
表2 大鼠治疗后神经功能评分
由表2试验结果可知，实施例2-4注射液可有效改善神经功能，显示其可有效治疗缺血性脑中风；且与金纳多注射液、间充质干细胞单独治疗相比，在治疗剂量减半的情况下，仍然具有显著的神经功能改善作用，可见间充质干细胞与银杏叶提取物可协同治疗缺血性脑中风。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种促进损伤神经再生和功能恢复的药物组合物，其特征在于，由间充质干细胞和银杏叶提取物组成。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，以cell/mg计，所述间充质干细胞与所述银杏叶提取物的比例为(1～3)×107：(300～400)。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为第2、3或4代脐带间充质干细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述药物组合物在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。
6.一种干细胞注射液，其特征在于，包括间充质干细胞和银杏叶提取物注射液。
7.根据权利要求6所述的干细胞注射液，其特征在于，所述银杏叶提取物注射液为金纳多银杏叶提取物注射液。
8.根据权利要求7所述的干细胞注射液，其特征在于，所述银杏叶提取物注射液中银杏叶提取物的浓度为3～4mg/mL。
9.根据权利要求6所述的干细胞注射液，其特征在于，以cell/mL计，所述间充质干细胞与所述银杏叶提取物注射液的比例为(1～3)×107：100。
10.如权利要求6至9中任一项所述干细胞注射液的制备方法，其特征在于，将间充质干细胞和银杏叶提取物注射液混合。
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