CN104382911B - 牛磺熊去氧胆酸盐作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了牛磺熊去氧胆酸盐作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，以牛磺熊去氧胆酸盐为杀灭细粒棘球蚴病的病原‑细粒棘球蚴绦虫，具有显著的抑制和杀灭细粒棘球蚴原头节的效果，从而实现细粒棘球蚴病的治疗。

Description

牛磺熊去氧胆酸盐作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药 物中的应用

技术领域

本发明涉及牛磺熊去氧胆酸盐的药学效果和生物效果，属于药物化学领域。

背景技术

细粒棘球蚴病(echinococcosis)又称囊性包虫病(cystic echinococcosis，CE)，是由细粒棘球蚴绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)的中绦期幼虫所致的一种严重危害人民健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病。该病呈全球性分布，在我国主要流行于新疆、青海、内蒙古、西藏等畜牧业发达的省区。囊性包虫病主要影响肝脏，也可以在肺中发展。目前，针对于该病的治疗主要是外科手术的方法，即肝包虫外膜内外囊完整切除术。近年来所采用的肝包虫外膜内外囊完整摘除术尽管能大大降低包虫病的复发率，最大程度地减少手术对肝实质的损伤，但当包虫囊肿体积较大或贴近重要脏器或管道(肝门或胆管)时，则需要选择开放式外膜内外囊完整摘除术。此种术式可能会有头节的外漏和残留，术中和术后需要药物辅助治疗预防包虫复发。因此总体来看，术中头节外溢及头节的处理不当是手术治疗囊性包虫病存在的难以克服的缺陷。

针对上述问题，本领域尝试在体外采用高浓度酸性(HCl)和碱性溶液(KOH)，临床常用的局部化疗药物有20％高渗盐水，但对周围正常肝组织有一定的破坏作用；本领域也曾有研究发现胆汁可以抑制包虫囊肿的发育，但是胆汁成分复杂，作用目标多，药学效果多变，例如胆汁、胆汁酸在肝脏和血液中滞留会产生多种毒性作用,包括细胞毒作用及急、慢性毒性作用,造成肝损伤及全身多系统、多器官损害,最终导致肝硬化、肝功能衰竭和死亡；也曾有研究发现胆汁酸对胰腺腺泡细胞形成损伤等。

因此，获得一种作用确切、疗效明确、能有效防治细粒棘球蚴病的药物依旧是本领域亟待解决的课题。

发明内容

在申请人的长期研究过程中惊喜地发现牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)作为胆汁成分之一可以有效抑制和杀灭原头节的生长，从而可应用于细粒棘球蚴病的临床治疗。

在本发明中，牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，其化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的梭基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸，目前以该成分为活性成分的药物主要是滔罗特(taurolite)，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。

首先，本发明公开了牛磺熊去氧胆酸盐作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用。

上述的药物，既可以是单纯的活性成分原料，还可以是将牛磺熊去氧胆酸盐作为活性成分与其他辅料做成的各种制剂，例如常见的片剂、胶囊、滴丸、输液、冻干粉针等，对于药物剂型及其相应辅料的选择，本领域技术人员可根据需要进行调整。

上述的细粒棘球蚴病，既可以是动物体上的，也可以是人体上的，根据该症的临床发病部位，通常指的是囊性肝包虫病。

根据需要，可使用不同浓度的牛磺熊去氧胆酸盐，一般来说，为了有效的杀灭病原，牛磺熊去氧胆酸盐的浓度为不低于500μmol/L。

针对常见的原头节生长密度，优选的，牛磺熊去氧胆酸盐的浓度为 2000-3000μmol/L。

在上述浓度下，对细粒棘球蚴原头节具有比较理想的抑制和杀灭效果。

在此基础上，本发明还公开了牛磺熊去氧胆酸盐作为细粒棘球蚴原头节抑制剂的应用。

本领域技术人员可以理解，在多种实验环境下，尤其是动物离体实验情况下，为了防止由于动物体内的细粒棘球蚴原头节在体外的生长和头节外溢，需要加入必要的抑制剂，例如20％高渗盐水等。

与上述类似，牛磺熊去氧胆酸盐的浓度为不低于500μmol/L，优选的，牛磺熊去氧胆酸盐的浓度为2000-3000μmol/L。

附图说明

图1为牛磺熊去氧胆酸盐对细粒棘球蚴原头节形态的影响，其中，A：对照组原头节；B：500μmol/L TUDCA作用4d的原头节；C：1000μmol/L TUDCA作用4d的原头节；D：2000μmol/L TUDCA作用4d的原头节；E：3000μmol/L TUDCA 作用4d的原头节。

图2为不同浓度的牛磺熊去氧胆酸盐对细粒棘球蚴原头节活力的影响。

图3为牛磺熊去氧胆酸盐对细粒棘球蚴原头节表面超微结构的影响，其中，A：

对照组原头节；B、C：2000μmol/L牛磺熊去氧胆酸盐作用4d原头节。

图4为牛磺熊去氧胆酸盐对细粒棘球蚴原头节内部超微结构的影响，其中，A：

对照组原头节；B、C：2000μmol/L牛磺熊去氧胆酸盐作用4d原头节。

具体实施方式

为了说明牛磺熊去氧胆酸盐(TUDCA)的应用效果，申请人进行了体外实验说明牛磺熊去氧胆酸盐对细粒棘球蚴原头节的杀灭效果，申请人进行了下述实验。实验1：TUDCA体外作用于细粒棘球蚴原头节的效果

取新鲜的自然感染细粒棘球蚴的绵羊肝脏，清洁羊肝表面，用75％酒精消毒表面，无菌条件下抽取含原头节的囊液，移入无菌瓶中。用PBS(PH＝7.2)清洗原头节3次至澄清，用0.1％伊红染液做染色排斥实验，98％以上拒染。肉眼观察原头节呈细白沙样均匀颗粒，活性好的原头节沉降速率快，活性不好的或者死亡的原头节沉降速率相对比较慢。

倒置显微镜下观察原头节虫体呈内陷型，散在密布，虫体结构饱满，呈椭圆形，结构清晰完整，钙颗粒清亮而明显。然后将原头节分装至含10％小牛血清的 RPMI 1640培养基中(青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)，置37℃、5％CO2培养箱内培养。

实验分组：实验分组：RMPI-1640培养基空白对照组、500μmol/L TUDCA 组、1000μmol/L TUDCA组、2000μmol/L TUDCA组、3000μmol/L TUDCA组、 DMSO组。取六孔板，每孔设5mL体系，按以上分组，配好相应的培养液。

将在体外培养5天后的细粒棘球蚴原头节用PBS(pH＝7.2)清洗3遍，每组培养液中加入约2000个原头节，置37℃，5％CO₂孵育箱内培养，在倒置显微镜下观察TUDCA对细粒棘球蚴原头节形态和活力的影响。

数据统计方法：加药后24h开始，每组每天均匀抽取200μL培养液(平均含原头节约90-120个)，用0.1％伊红染色15min，倒置显微镜下观察原头节的活力。活头节拒染、不着色，且有活动性；死亡或活力减弱的原头节红染着色，伴有结构破坏。计算每组每天平均死亡率。每隔4d换液一次(每组体系和浓度同第一次加药时)，连续观察，直至最大作用浓度的原头节全部死亡。实验重复三次。

实验2：TUDCA作用后原头节表面结构的变化

在测活力的同时，随机取相对应的原头节做电镜，观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次，每次5min；置4％戊二醛固定24h。将原头节放入浓度为50％、 70％、80％、90％、100％的酒精内逐级梯度脱水，脱水时间分别为5min、10min、 30min、1h至过夜，临界点干燥，真空喷金LOOA，在LEO1430VP扫描电子显微镜下观察原头节表层超微结构变化。

实验3：TUDCA作用后原头节内部结构的变化

在测活力的同时，随机取相对应的原头节做电镜，观察原头节超微结构的变化。PBS洗涤3次，每次5min；置4％戊二醛前固定24h。用小离心管离心，去除上清液，用琼脂糖包埋头节，取出凝胶继续放入4％戊二醛内固定24h。将固定好的原头节用PBS(PH7.4)冲洗3次，每次15min，2％OsO4中后固定1h，用PBS 再冲洗两遍。酒精逐级梯度脱水，30％→50％→60％各10min，70％过夜，次日再置 80％→90％各10min，100％30min。之后丙酮逐级脱水，环氧树脂(Epon812)包埋，固定后修型，LKB2088V型超薄切片机切片，醋酸铀和硝酸铅双重染色，置于日立H-600型透射电子显微镜观察原头节内部超微结构的变化。

实验结果：

参考图1，为TUDCA体外培养细粒棘球蚴原头节的形态变化，倒置显微镜下观察，TUDCA作用后的原头节多呈外翻型，原头节顶突上的小钩排列紊乱，部分脱落，吸盘突起，变形，活动性减弱或死亡。药物作用4d后，随着TUDCA 浓度的增加，原头节的形态变化明显。空白对照组和DMSO组的原头节顶突凸出或凹入，体积较大，活动良好。

参考图2，为TUDCA对体外细粒棘球蚴原头节的杀伤作用。不同浓度TUDCA (2000μmol/L、3000μmol/L)体外培养12d 的细粒棘球蚴原头节活力测定结果见图2，显示不同浓度TUDCA对体外细粒棘球蚴原头节均有抑制作用。其中3000μmol/L TUDCA作用8d原头节死亡率达 100％。2000μmol/L作用8d原头节死亡率为65.8％。从活力曲线图中可以看出，随着药物浓度的增加和用药时间的延长，原头节的抑制率增加，此作用具有剂量依赖性和时间依赖性。各实验组原头节死亡率与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。

同时，申请人在扫描电子显微镜下观察了TUDCA作用后的原头节超微结构变化，观察显示空白对照组原头节表面光滑，多呈内陷型，头节呈球形或椭圆形；用2000μmol/LTUDCA作用细粒棘球蚴原头节4d后，在扫描电子显微镜下观察发现，原头节多呈外翻型，顶突破坏、头钩缺损、吸盘变形，体表出现许多陷窝，皮层呈虫蛀样损害(图3)。

同时，在透射电镜下观察，正常培养的细粒棘球蚴原头节合胞体带结构较致密，内有大小不等、形状不一的囊泡，排列较规则，外侧有较多排列整齐的微毛；原头节内含有不同类型的细胞，实质细胞的核大而明显，核仁居中，核内染色质较细腻，异染色质较少。TUDCA作用后的细粒棘球蚴原头节合胞体带变薄，结构松散，囊泡扩张，纤毛减少，且排列不规则；部分实质细胞基质浓缩，核周隙轻微增宽，核仁消失；合胞体带和腔内出现空泡(图4)。

综合上述实验结果可以看到，不同浓度TUDCA对体外细粒棘球蚴原头节均有抑制作用，浓度为3000μmol/L的TUDCA对细粒棘球蚴原头节杀伤作用最明显，随着时间的延长，抑制作用显著增加(P＜0.01) 。在证实TUDCA对原头节有抑制作用的基础上，探索不同浓度的TUDCA对细粒棘球蚴原头节的形态学影响。研究结果显示，TUDCA作用后，可导致体外细粒棘球蚴原头节的形态发生不同程度的改变。内陷型和外翻型原头节是虫体不同的存在形式。当条件适适宜时，原头节顶突内凹，可保护头钩、吸盘、微毛不受损害；当加入TUDCA后，外翻型的原头节增多。正常培养的细粒棘球蚴原头节生发层的微毛发育良好，数量多，附着并延伸入角质层内，可增加生发层与角质层的接触面积，有利于营养物质的吸收，在棘球蚴无血液供应的情况下仍可较快生长并不断形成育囊。不同浓度TUDCA作用后的细粒棘球蚴原头节，在透射电镜下观察，微毛出现不同程度的缺损，并且生发层内的细胞被空泡和脂滴所替代。其不利于形成育囊，使原头节的生长受到抑制而死亡。总而言之，TUDCA对体外细粒棘球蚴原头节有杀伤作用。

Claims (2)

1.牛磺熊去氧胆酸盐作为活性成分在制备治疗细粒棘球蚴病药物中的应用，其特征在于牛磺熊去氧胆酸盐的浓度为2000-3000μmol/L。

2.牛磺熊去氧胆酸盐在制备细粒棘球蚴原头节抑制剂的应用，其特征在于牛磺熊去氧胆酸盐的浓度为2000-3000μmol/L。