CN102639129B - 含游离脂肪酸的抗微生物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含用膜脂或其水解衍生物乳化的游离脂肪酸的抗微生物组合物及包含所述组合物的药物制剂。该组合物可用于治疗或预防微生物感染。它们还可以调节凝血速度，这使它们适合掺入导管封管溶液和用于伤口护理。

Description

含游离脂肪酸的抗微生物组合物

本发明涉及含游离脂肪酸的抗微生物组合物，以及涉及含所述组合物的药物制剂。

游离脂肪酸基本上不溶于水。它们的不溶性及与许多常规赋形剂不相容的事实迄今已严重地制约了其药物用途。虽然游离脂肪酸的盐可溶于水，但已知它们的抗微生物效果大幅度降低。已经采用了若干方法来“増溶”游离脂肪酸，包括使用醇和表面活性剂以及通过再酯化进行衍生化以形成单甘油脂和/或乙氧基化及丙氧基化程序。

多年以来游离脂肪酸的抗微生物特性是已知的(Kabara J.等人，AntimicrobialAgents and Chemotherapy,July 1972;2(1):pp 23-28)。

Bergson等人(Antimicrobial Agents and Chemotherapy,November2001,pp3209-3212)报导了癸酸和月桂酸能有效地杀灭酵母白色念珠菌。

Sun等人(Chemico-Biological Interactions 140(2002),pp185-198)确认了辛酸、癸酸和月桂酸的优异的杀微生物特性，结果认为月桂酸针对革兰氏阳性菌是最有效力的，而辛酸针对革兰氏阴性生物体是最佳的。

Halldor等人报导了游离脂肪酸的抗病毒特性(Antimicrobial Agents andChemotherapy;Jan 1987,pp 27-31)。

WO 03/018049公开了乳清载脂蛋白与乳脂中的游离脂肪酸组合的抗微生物活性。说明乳精的粘附抑制特性仅只可归因于水溶性蛋白质部分，并且脂质组分对此效果没有贡献。

WO 2009/072097公开了游离脂肪酸的组合物的特性，如影响抗微生物效力的熔点降低及螯合。还公开了用于在乳清蛋白分离物中合并游离脂肪酸的共混物的乳化方法。

Sprong等人(Antimicrobial Agents and Chemotherapy,Vol 45,No 4,2001,pp1298-1301)报导了鞘氨醇和鞘磷脂的杀微生物效果及来自溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱的一些轻微效果，但没有观察到来自任何未改性磷脂的效果。值得注意的是，这些结果报导的是在37℃下暴露时间超过2小时的结果，这与本发明是不同的，在本发明中所示的是膜脂和游离脂肪酸组合的杀微生物效果，暴露时间不到5分钟。

Jones等人：Journal of Pharmacy and Pharmacology,2003,Vol 55,No 1.pp43-52公开了使用卵磷脂与胆固醇的组合作为表面涂层以抑制医疗器械上的生物膜形成。

本发明的目的是提供含有游离脂肪酸的改进的抗微生物组合物。

本发明提供抗微生物组合物，其包含：

(a)一种或多种具有4至22个、优选6至18或6至12个碳原子的饱和或不饱和游离脂肪酸或其药学上可接受的盐或酯；和

(b)一种或多种膜脂或其水解衍生物，作为所述游离脂肪酸或其盐或酯的乳化剂。

所述游离脂肪酸可选自：丁酸(C4:0)、戊酸(C5:0)、己酸(C6:0)、庚酸(C7:0)、辛酸(C8:0)、壬酸(C9:0)、癸酸(C10:0)、十一酸(C11:0)、十一烯酸(C11:0)、月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、珠光脂酸(C17:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸酸(C18:3)、花生四烯酸(C20:4)和芥子酸(C22:1)。

优选游离脂肪酸选自：戊酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十一烯酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸及其混合物，及其药学上可接受的盐和酯。特别优选的是己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烯酸和月桂酸，特别是辛酸。

在使用包括较高熔点实体(如月桂酸)的组合脂肪酸的情况下，优选在其中包括较低熔点实体(如辛酸或油酸)以将组合的熔点降低到低于正常的生理温度。

膜脂是动植物领域的所有细胞膜中普遍存在的组分。它们典型地由连接于高极性头基的一个或(在大多数情况下)两个长链烃分子组成，所述高极性头基是醚的衍生物、甘油-3-磷酸酯、长链氨基醇(鞘氨醇)、糖或类固醇(胆固醇)的衍生物。每种膜脂的性质主要取决于极性头基的变化。就它们的酸和碱的行为而言，几乎全都是两性的，并且更重要地，全都是两亲性的，在极性头基具有水溶性亲水端，在烃尾具有脂溶性亲脂端。

膜脂的理化性质是众所周知的，有关它们的存在及生物学特性的合适综述可见于Biochemistry,3^rd edition:Mathews,Van Holde &Ahern:ISBN 0-8053-3066-6，表1即整理自该书。

四种主要类别的膜脂中，在极性头基中含有磷酸酯的膜脂是最常见的。这一组被称为甘油磷脂、磷酸甘油酯或更经常地被称为磷脂，构成细菌、植物和动物领域中的所有膜脂的主要部分。所有磷脂均基于甘油主链，在sn1和sn2碳上带有两个疏水酰基侧链，并在sn3带有磷酸酯部分。由磷酸酯头中的变化区分六种不同的常见磷脂，最简单的是磷脂酸，而按磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇顺序的复杂性递增，磷脂酰胆碱是动物和细菌中最普遍的。

所有六种上面提到的磷脂均可见于卵磷脂中，卵磷脂是以产业规模由多种来源提取的商业化膜脂，这些来源包括但不限于大豆、向日葵、油菜、棕榈油、蛋黄和乳脂。术语“卵磷脂”的使用经常与主要的磷脂组分磷脂酰胆碱同义，磷脂酰胆碱可纯化自粗卵磷脂，当在制药应用中要求严格控制质量时经常是这样的。也有可能对卵磷脂或任何其组分磷脂进行酶改性，例如通过去除烃侧链之一以形成“溶血磷脂”，它们全都同等适用于本发明。

膜脂的水解衍生物包括溶血磷脂和溶血鞘脂，它们可采用酶法制备，使用可得自Novozyme,Denmark的胰腺磷脂酶。所述方法涉及制备磷脂或鞘脂的水性分散液、以2％W/V添加磷脂酶和在约50℃至约60℃的高温下温育约2小时。水解膜脂的产率可高达70％，并且可基于溶血衍生物亲水性的提高而通过水分配使产物与混合物分离。

本文中使用的膜脂可提取自植物或动物来源，包括含油种子、动物脂肪、羊毛、奶和鸡蛋。

在本发明中使用的膜脂及其衍生物优选为脱脂的。用在本文中的术语“脱脂”旨在表示去除了膜脂通常实际上与之结合的基本上所有的结合外来脂质物，如油、脂肪或甘油三酯物质。就此而言的“基本上所有的”旨在表示脱脂膜脂含有不到10％、优选不到5％、更优选不到3％的结合的外来脂质物。

优选膜脂选自磷脂、卵磷脂、甘油磷脂、鞘脂、鞘糖脂、甘油糖脂和胆固醇中的一种或多种。合适的膜脂包括卵磷脂、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、神经酰胺、鞘磷脂、糖脂、鞘糖脂、脑苷脂、神经节苷脂、甘油糖脂、单半乳糖甘油二酯、羊毛甾醇或胆固醇或其任意组合。优选的是卵磷脂和选自磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰环己六醇和磷脂酰丝氨酸的其它磷脂及其混合物。卵磷脂是特别优选的。

在本发明的抗微生物组合物中，己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烯酸和月桂酸中的一种或多种与一种或多种磷脂的组合是特别优选的，特别是辛酸与优选为脱脂的卵磷脂的组合。

游离脂肪酸或其药学上可接受的盐或酯与膜脂的比例按重量与重量计可以为约0.25:1至约10:1；或约0.5:1至约10:1或约0.5:1至约5.0:1或约1.0:1至约2.5:1或约1.25:1至约2.5:1。

游离脂肪酸在与诸如血液、血清或粘液的体液接触时会受到负面影响。然而意外地发现，在存在有机酸或其盐或酯和/或无机酸盐的情况下，这种受影响的情况可得到改善。因此，本发明的抗微生物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的有机酸或其药学上可接受的盐或酯；和/或一种或多种药学上可接受的无机酸盐。

优选有机酸选自乙酸、丙酮酸、丙酸、乙醇酸、草酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸、苹果酸、马来酸、抗坏血酸、富马酸、酒石酸、丙二酸、戊二酸、丙烯酸、顺或反丁烯酸和柠檬酸及其混合物及其药学上可接受的盐和酯。优选无机酸盐选自氯化物、硫酸盐和硝酸盐。

特别优选的有机酸是柠檬酸和乳酸及其钠盐和钾盐，特别是柠檬酸钠。

有机酸的摩尔浓度优选为约25mM至约500mM，更优选为约50mM至250mM，且更优选为约50mM至150mM。有机酸盐的pH值优选在4.0与6.5之间，优选在4.0与5.5之间或者在4.0与5.0之间。

在本发明的抗微生物组合物中，膜脂乳化脂肪酸，使之具有水分散性。因此，膜脂-脂肪酸组合是乳液，优选为水包油型乳液，虽然油包水型乳液也是可能的。

在特别优选的实施方案中，本发明的组合物包括0.5％辛酸在0.4％脱脂卵磷脂中的乳液，然后用pH值4.5的200mM柠檬酸钠缓冲液将其稀释到其浓度的50％，终浓度为在0.2％脱脂卵磷脂中乳化并在100mM柠檬酸钠(pH值4.5)中分散的0.25％辛酸。此组合物在下文中被称为“标准制剂”，并且可方便地用来显示本发明组合物的抗微生物效果。

本发明的抗微生物组合物显示出双重抗微生物效果，即它们显示出抑制对宿主细胞表面的微生物粘附并通过微生物细胞膜的溶解达到杀微生物效果。

已经意外地发现，当膜脂与结合的脂质部分分离时，不同的膜脂在浮游培养物中显示出对微生物细胞截然不同的粘附抑制特性。虽然不希望被理论束缚，但认为这些差别起因于可变化的疏水/亲水特性。此外已经发现，相同的两性分子可变性影响以单独的膜脂形成的乳液的粘性，并且可利用这些差别来控制乳化的杀微生物游离脂肪酸的释放速度，从而大大地方便在医疗应用中具有卓越效用的快速或慢速作用的杀微生物制剂的设计。

如本文中所述，使用膜脂，特别是统称为卵磷脂的磷脂，在它们已经被提取出来，并且不含在天然环境中通常与之相关的结合脂质的情况下，可以获得优异和可调的粘附抑制特性。抑制微生物粘附要求膜脂的亲脂端不会朝微生物细胞表面上的脂质部分定向并与之结合。如果亲脂位点被非膜脂(例如甘油三酯)占据的话，会使这一过程受到阻碍。

可由本发明组合物提供的特别效用是，发现不同类膜脂和每类膜脂的不同成员具有不同的释放特性。相同量的不同膜脂中的相同剂量的相同脂肪酸在较快或较慢的期间将产生相同的杀微生物效果，这取决于单独的膜脂。这一独特的特性有利于使用相同脂肪酸的不同膜脂乳液的组合在相对适用的期间实现缓释效果。

游离脂肪酸，特别是短链到中链的饱和脂肪酸(如辛酸)的特点是，它们可通过皮肤和粘膜被快速吸收。快速吸收消耗掉在上皮表面的剂量，并因此消弱了在该表面的杀微生物效果。出于这个原因，提供最直接杀微生物效果的膜脂不一定是在治疗应用中最有效的。如在下文实施例9中所示，某些单独的膜脂比其它膜脂粘，这限制了它们的乳化游离脂肪酸的可利用性，并因而限制了其杀微生物效果的等级，这也同样限制了其在上皮表面的吸收。然而应当指出的是，总杀微生物效果(杀死微生物数目的对数)不受影响。

还意外地发现，本发明的抗微生物组合物可用于调节凝血速度。通过改变游离脂肪酸与膜脂的比例和/或通过掺入有机或无机酸的药学上可接受的盐或者寡糖或其它聚合物，制剂将会促进凝血速度或完全抑制凝血速度。这一性质在用作血液接触抗微生物剂时有很大的优点。

如本文中所公开，以20％体积添加至新鲜羊血的脱脂膜脂的水性分散液会加速正常的凝血速度，将凝结时间从6分钟缩短为不到一分钟。通过乳化添加脂肪酸(如辛酸)直到约1.0-1.3倍脱脂膜脂(如卵磷脂)重量的比例将会进一步缩短凝块形成时间，但此后随脂肪酸比例的提高，凝块形成时间增加，并且当乳化脂肪酸的重量超过脱脂膜脂重量的约1.0-1.3倍时观察到抗凝血效果。本领域技术人员会意识到，血液调节效果不仅取决于游离脂肪酸与脱脂膜脂的比例，还取决于所用膜脂和游离脂肪酸的性质。

本发明组合物中有机盐的存在(如放大杀微生物效果可能需要的那样)也会破坏促凝血效果，并且如本文中所示，使用增粘剂(如葡聚糖)将会延长抗凝血效果，达到它们与肝素溶液相当的地步。

在进一步的实施方案中，游离脂肪酸不超过脱脂膜脂重量的约1.0-1.3倍的乳液可用于提高凝血速度，并且在出血部位产生抗微生物效果，而超过脱脂膜脂重量的约1.0-1.3倍的游离脂肪酸加或不加有机酸盐的乳液可用于抑制血液凝块的形成，并在出血部位产生杀微生物效果。

本发明含膜脂乳化的游离脂肪酸的组合物会产生极其优异的双重抗微生物效果：抑制粘附效果和杀微生物效果。双重抗微生物效果提供的显著优点之一是，在杀微生物有效能力耗尽后，粘附抑制特性还长时间地发挥作用。大多数杀微生物剂与目标生物体具有化学反应性，并且大多数杀微生物反应在生理条件下是不可逆的；因此固定剂量的杀微生物剂具有有限的反应能力。然而在与粘附抑制物质组合的情况下，在杀微生物剂已消耗完毕后仍保留有粘附抑制特性，并且会针对任何残留的存活病原体提供额外的保护。

本发明的组合物除了具有优异和可调节的粘附抑制性连同优异的杀微生物效果和内在的凝血调节效果外，其与全身施用(血液接触)的情况也是相容的，这与WO 03/018049和WO 2009/072097中公开的乳蛋白组合物相反。膜脂和游离脂肪酸是人和动物体内的自然代谢产物，它们的抗微生物效果具有浓度依赖性，并且当它们进入体循环时，它们会快速地被稀释、代谢并作为自然代谢产物排出。

使用膜脂与抗微生物剂的组合是反直觉的，因为卵磷脂及相关的膜脂会使大多数常规的抗微生物剂失活；卵磷脂是列为在欧洲标准EN 1499和1500测试中使用的经批准的消毒中和剂，用于评价洗手皂和洗手凝胶的杀微生物效果。

本发明的组合物可用于治疗或预防人或动物中的微生物感染。由于对凝血具有调节作用，因此所述组合物可用于例如导管封管溶液和用于伤口护理。

本发明还提供包含根据本发明的组合物和其药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物制剂。组合物在药物制剂中的存在量可以为约0.1％至约25％(w/v)；或约0.1％至约10％(w/v)；或约0.1％至约1.0％(w/v)。

药物制剂可以为适合对人或动物施用的任何形式，包括例如适合口服、局部、肠内、肠外或粘膜施用的形式。

本发明的制剂可用作局部抗微生物剂，用于预防和治疗皮肤、毛发、指甲和体孔外部膜的感染。

本发明的组合物或制剂可用来构成液体皂或洗手凝胶，用于消除无症状性携带潜在的病原菌，如耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌及其它通常与医源性或院内感染相关的菌种。其可用作治疗痤疮的凝胶。其使用形式可以为软膏，用于治疗毛囊的皮肤真菌感染，包括由通常被称为癣的毛癣菌种引起的感染。其可以构成为喷雾剂的形式以递送至皮肤，用于治疗由包膜病毒(包括引起唇疱疹和带状疱疹的疱疹变种)引起的感染。其可制成液滴的形式，用于治疗眼和耳的感染。其可以在多种药学上可接受的递送系统中进行制备，用于治疗包括鼻、口、喉、细支气管及胃肠道和生殖器的粘膜表面在内的粘膜感染。其可例如制成牙膏和漱口水的形式以方便改善口腔卫生，并消除引起龋齿、牙龈病、口疮性溃疡和口臭的生物体的负担。其可制成适合作为唾液补充物的形式，用于缓解口腔干燥症状。其可制成喷雾剂，用于口、喉和鼻膜的去定殖，特别是用于消除无症状性携带耐抗生素性菌种。其可制成凝胶的形式，用于预防和治疗由多种细菌、酵母和病毒(包括已知为念珠菌病、非特异性细菌性阴道炎的致病剂的那些、疱疹病毒和HIV)引起的生殖器微生物感染。其可制成灌肠剂的形式，用于预防和治疗肠和下肠道的感染，包括由厌氧梭菌种和脱硫弧菌引起的感染，医学上称为伪膜性结肠炎和结肠袋炎。

膜脂乳化的游离脂肪酸可用于制备在胃肠道中产生抗微生物效果的食品，用来针对肠道病原体(如螺杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、梭菌种、原生动物和包膜病毒)提供保护。

用于膜脂乳化的游离脂肪酸的合适食品载体是牛奶，优选为脱脂牛奶，更优选为脱脂奶粉，如可商购自英国林肯郡斯伯丁的Premier International Foods(UK)Ltd的Marvel。

例如辛酸、癸酸和月桂酸的单独的乳液可制成为在4.0％W/V脱脂卵磷脂中的5.0％W/V乳液，如本发明方法中所述。可以1:1:1的比例或任何其它合适的比例(如1:2:3)合并单独的乳液。可以添加其它脂肪酸(如丁酸)的膜脂乳液和或精油(如薄荷或香草)的乳液以赋予香味和改善口感。

可以通过向饮用水中添加指定量的Marvel脱脂奶粉而对其进行冲泡(4满匙至一品脱)。可以向此中添加约1％W/V至15％W/V量的选定比例的膜脂乳化的游离脂肪酸并通过搅拌混合。优选乳化的脂肪酸量为约1％W/V至10％W/V，更优选为约5％W/V。技术人员可明确的是，可以按低于最佳的水体积冲泡脱脂奶粉用作奶制品，在这种情况下形成浓缩奶油，可以向其中添加一些量的乳化的脂肪酸。

或者，奶乳清分离蛋白可用作合适的食品载体：得自Glanbia PLC的Provon 190是合适的乳清分离蛋白。可以按约10％W/V至20％W/V、优选为约15％W/V的量在饮用水中对乳清分离蛋白进行复水。一旦经过充分水化，则可以添加一定量的膜脂乳化的游离脂肪酸或其共混物并通过搅拌混合。当乳清分离蛋白用作载体时，膜脂乳化的游离脂肪酸的添加量可以为约1％W/V至20％W/V，优选为约5％W/V至15％W/V，更优选为约10％W/V。

本发明的产品具有作为血液接触抗微生物剂的效用，其中它们联合的凝血或抗凝血能力与它们的抗微生物效果相结合。这种用途包括手术冲洗、伤口护理、导管封管溶液、涂覆导管及其它用于插入体孔或体腔的管状手术器械和食品安全。

本发明产品的显著优点是，达到抗微生物效果所需的接触时间非常短，通常不到1小时或不到30分钟或不到10分钟。

如本文中所用和常规所用，术语“抗微生物”是指针对原生动物、革兰氏阳性和阴性菌(包括需氧菌和厌氧菌)、酵母、真菌、支原体和/或病毒以及特别是能够导致人和动物疾病的微生物种显示出对抗效果的任何物质、组分或组分的组合物。

传染病的产生源于外部环境中的病原微生物种(微生物)的入侵，或者由于正常存在于皮肤、毛发的天然微生物群落及眼、鼻、口、胃肠道和生殖器的粘膜中的微生物的异常生长。

无论是外源性还是内源性的情况，医护专业人员普遍理解的是，微生物发病机制的第一阶段涉及微生物粘附于人或动物组织的表面。一经粘附，则借助于增殖和进一步粘附而发生定殖，此后产毒炎症和宿主组织的破坏导致典型的传染病症状。还广泛公认的是，如果能防止粘附，则可以抑制致病过程的引发，并且许多传染病可得到预防，或者至少被限制在它们的增殖范围内。

膜脂乳化的游离脂肪酸的新颖特性对人和动物保健方面提供了广泛的效用。在血液接触应用中，这些效用包括手术冲洗液、伤口护理中的止血抗微生物药、用于预防与导管有关的菌血症的导管涂层和导管封管溶液；在粘膜保健中，它们可用于模拟健康粘液的天然抗微生物机制；在局部皮肤护理中，它们可用于增强皮肤的天然抗微生物防御功能；在食品安全方面，因为它们是自然代谢产物，所以可将它们直接应用于食品表面以消除食源性病原体；并且作为医疗食品，它们可用于补充正常饮食以预防或治疗胃肠道感染。

手术冲洗和伤口护理

在手术介入治疗期间，通常的做法是采用多种技术以尽量减少潜在病原菌、酵母、霉菌和病毒的入侵。普遍和愈发严重的问题是裸露伤口被耐抗生素性细菌感染，如耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA)，许多其它细菌包括但不限于肠球菌种、假单胞菌和酵母白色念珠菌。在许多情况下，冲洗裸露伤口以清除其松散组织、血液及其它体液，并且在许多情况下目前使用消毒盐水，虽然这并不能提供抗微生物效果。并不推荐使用含有抗生素的手术冲洗液，这只是因为它们有可能产生进一步的耐抗生素性物种。同样，许多常规的消毒剂在与裸露伤口进行直接的系统性接触时是不合适的，并且可能有毒性。因此非常需要安全和有效的抗微生物冲洗液，优选另外可选在显微手术期间具有抑制凝血特性的抗微生物冲洗液，和/或可促进凝血和术后愈合的伴随产品。如本文中所述基于可选的脱脂膜脂与游离脂肪酸和/或其衍生物组合的组合物提供这种效用。另外在意外伤害后或军事行动期间的创伤护理中，伤口经常是参差不齐、肮脏并可能大量出血。非常需要进行采用抗微生物产品的紧急干预，所述抗微生物产品会促进凝血，并可安全地应用于裸露伤口。

预防与导管有关的感染

按简化的术语讲，导管是穿过皮肤插入动脉或静脉或穿过自然孔插入的管，目的是为了排走体液或为了施用药物或为了监测疾病或操作手术器械的目的。一些导管留在适当的位置上达相对较长的时间段，并且在许多情况下，这些导管容易受到微生物污染，造成在内外表面上产生生物膜，并可能导致患者感染的传播。

最常见的导管是尿路管，所述尿路管具有收集管以排出膀胱中的尿液；这些被确认为是医源性感染的重要来源。更精细和复杂的系统是中心静脉导管(CVC)，其通过颈中颈静脉插入并穿过到达心脏处的上腔静脉，或者通过外周静脉插入并穿过到达流入心脏的相同静脉。CVC被设计成长期留在适当的位置，长达90天或更长的时间，并用于长期反复地灌注药物和/或营养制剂；在这种应用中，它们通常是开放性以便于施用的，并在间歇期间又是闭合的，在此期间导管腔中的流体是静态的，并且如果受到污染就容易发生微生物生长。CVC的意外污染是相对常见的，并且经常引起与导管有关的血流感染，这种感染具有潜在的致命性。

在例行的医疗程序期间，血液进入CVC腔，在此其粘在内部，并且可能凝结，阻塞管腔。阻塞的CVC腔要求必需要手术置换导管，这大大增加了时间、成本和患者死亡率。

导管封管溶液(CLS)是在医疗程序之间足以填充导管腔的液体量。最佳的CLS将产生抗微生物和抗凝血效果。目前市场上有许多专利性的CLS制剂，它们被设计成达到防止凝血和抗杀微生物效果。选择组构这些CLS制剂的活性成分受意外静脉内输注风险的限制。CVC的空隙体积可能多达3.0ml或更大。如果医疗实施者忘记已插入封管溶液并意外地增加了第二次剂量，则第一空隙体积将会被直接注入血流，这会对患者产生严重的毒性影响。

本文中的制剂形式可以为导管封管溶液，其可以在不到1个小时内达到最佳的杀微生物效果，并且具有类似于肝素的抗凝血特性而不用使用制剂形式的该物质。导管封管溶液的粘度优选接近全血的粘度，以尽量减少在导管尖端稀释和混合的可能性。可使用增粘剂达到所需的粘度。

通常在医药制剂中使用的增粘剂包括广泛的天然或合成来源的水凝胶。这些当中包括有纤维素的衍生物，如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素。其它植物来源的天然聚合物包括右旋糖酐、海藻酸盐、果胶、瓜尔豆胶和阿拉伯胶；合成聚合物，包括一系列卡波姆(丙烯酸酯/丙烯酸C10-30烷基酯交聚物)和泊洛沙姆(聚氧乙烯和聚氧丙烯的三嵌段共聚物)。由于残留毒性和代谢清除的原因，这些当中很少被批准在人体医学中常规全身使用。泊洛沙姆Pluronic F68已用于静脉营养制剂，但天然右旋糖酐在外科手术中的用途更广泛。

在本发明的制剂中，右旋糖酐是优选的增粘剂。右旋糖酐是天然的多糖。作为葡萄糖单体的复杂支链葡聚糖，它是由许多细菌产生的，包括明串珠菌种，并且已经在显微手术中用作冲洗剂和抗凝血剂。右旋糖酐可以在10千道尔顿(Kd)至150Kd范围的一系列分子量商购获得。在本发明中，20Kd至60Kd右旋糖酐是优选的。更优选地，40Kd右旋糖酐用于调节基于膜脂/游离脂肪酸的导管封管溶液的粘度，使之接近全血粘度：3.6-6.5cP。

当40Kd右旋糖酐用作增粘剂时，其在制剂中的浓度按重量比体积计应优选为约5％至50％，更优选为约10％至40％，按全部制剂的重量比体积计还更优选为约15％至30％。

下表2提供目前使用的较常见的专利性CLS制剂的汇总：

目前使用的大多数封管溶液具有相对较低的杀微生物效果：经超过一个小时的暴露的微生物活力减少3-4个对数。如本文中所公开，基于膜脂乳化的游离脂肪酸的CLS显示出优异的抗微生物效果，在不到6分钟的消除大于6个对数。最佳的抗凝血效果是通过改变膜脂与游离脂肪酸的比例实现的，且任选使用增粘剂杜绝了血液向导管尖端里面的迁移。在本发明中所使用的组分是自然代谢产物，这一事实确保了在意外双封情况下具有更大的安全性。

抗微生物表面涂层

本发明的组合物可用于产生双重作用的抗粘附和抗微生物表面涂层，方式是在有生命或无生命的表面上设置游离脂肪酸膜，所述表面包括但不限于皮肤、塑料、橡胶、金属或玻璃，其中它们除了抵制微生物种的粘附外还在表面产生杀微生物效果。

活性抗微生物表面涂层在保健中具有特定的应用，用于防止在医疗器械上和在导管表面上形成生物膜，并且也用作工作站、程序托盘及所有的患者接触面(包括医护人员的手)的表面涂层。类似地，活性抗微生物表面涂层在食品工业中具有广泛的应用，其中它们可应用于食品制作和包装表面以尽量减少携带食源性病原体，如沙门氏菌、弯曲杆菌、李斯特菌和大肠杆菌，并且如本文中所示，它们也可应用于食品(特别是屠宰后的肉)的表面，以从源头上消除这些病原体。

使用消毒剂抹布实现常规的表面消毒，所述消毒剂抹布可含有三氯生、洗必泰、季铵化合物或醇的浓溶液。然而，许多常规消毒剂的残留毒性限制了它们在食品和有生命的表面上的用途。

当用于表面涂层应用时，本发明的组合物可应用在有或没有其它赋形剂的合适的药学上可接受的递送系统中。药学上可接受的递送系统包括但不限于旨在施用后蒸发而留下干燥残余物的有机溶剂、液体、霜剂、凝胶、糊剂、软膏、粉末或喷雾剂，包括这些与不溶性物质(如纤维抹布)的组合。

粘膜防御：

人和动物的粘膜是在自然体孔界面处的特性湿润表面，并且是胃肠道和生殖器的衬里，它们包括眼、鼻、内耳、口、鼻咽面、气管、细支气管、食管、胃、大小肠、直肠、阴道和外阴唇、龟头和尿路衬里。除了这些人和动物常见的在解剖学上有关的表面外，还有特定物种独特的粘膜结构，如马科动物中的喉囊。

粘膜由粘液层覆盖，所述粘液是粘稠的水状胶体，主要由粘蛋白组成，粘蛋白是充当基质的一组大量糖基化的高分子量蛋白质，许多其它生物活性物质分散在所述基质内，包括分泌的抗体和先天免疫系统的组分，如唾液中的组肽和富酪蛋白。除了水化和润滑作用外，粘液对于防止潜在微生物病原体的入侵和防止粘膜本身的粘附及定殖是必要的。

粘膜分泌物受损及粘液本身完整性的削弱可因疾病而产生，或者是医疗和/或药物干预的副作用，或者是生活方式的结果。当出现这种情况时，罹病者遭受经常性的粘膜感染，包括但不限于龋齿、牙龈疾病、酵母菌性阴道炎、细菌性阴道炎、肠炎和传染性结肠炎。粘液的复杂性已经否定了所有构造可以在替代疗法中使用的精确复制品的企图。有许多商业替代品，它们被设计用于缓解口腔干燥的主要躯体症状。这些中的大部分是基于水凝胶，如羧甲基纤维素和影响缓冲及再矿化的盐的组合物。一种是基于猪肠粘蛋白(SalivaOrthana,AS Pharma，英国伊斯特本)，但一般没有能接近唾液和粘液的自然粘附抑制性能。本发明制剂的粘附抑制特性与杀微生物特性相结合，特别是如本文中所述能适应特定需要释放制剂，这样可优异地模拟自然粘液的抗微生物特性。

局部消毒和皮肤护理

哺乳动物的皮肤、毛发和趾甲作为外部体表面不断受环境污染的影响。健康哺乳动物的皮肤具有基于皮肤中的天然游离脂肪酸的内在抗微生物特性，并且可以如本文中所公开的那样通过局部施用脱脂膜脂乳化的游离脂肪酸对这些方面有利地予以强化。

引起皮肤感染的细菌包括但不限于金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和绿脓杆菌，它们引起脓庖疹、毛囊炎、丹毒、蜂窝组织炎和坏死性筋膜炎。丙酸杆菌属痤疮是青少年痤疮的病原体。真菌皮肤感染主要是由毛癣菌、小孢子菌和表皮癣菌种引起的，并且所述疾病被统称为癣(足癣、股癣、头癣、体癣和甲癣)，其包括环癣和趾甲感染。包括白色念珠菌在内的酵母引起间擦疹和甲沟炎；糠秕马拉色氏霉菌引起花斑癣(脂溢性皮炎和感染性头皮屑)，并且它也是狗耳的常见病。包膜病毒感染包括影响颜面区域的1型单纯疱疹和影响生殖器区的2型单纯疱疹。带状疱疹病毒引起带状疱疹，并且痘病毒引起传染性软疣。使用本文中的组合物也可以消除HIV、SARS、肝炎、猪流感、禽流感和许多其它动物传染病毒感染的浅表无症状性携带。

公众严重关注着越来越高的医源性感染(HAI)发病率。HAI包括由耐抗生素性细菌引起的感染，所述耐抗生素性细菌如耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素性肠球菌(VRE)及其它具有多药抗药性的菌种，如艰难梭菌及其它少为人知的机会致病原体，包括假单胞菌和念珠菌。

众所周知的是，手部消毒对于防止患者与患者护工人员之间的交叉污染来说是关键性的。大多数患者护理机构通常使用酒精凝胶进行手部消毒。酒精是直接和有效力的杀微生物剂。然而其在数秒钟内便蒸发，没有持久的效果以防止蒸发后可能会立即发生的意外污染。可以按一定方式制定游离脂肪酸的膜脂乳液，使之提供缓释的杀微生物效果，并且当与酒精配制时，效果即直接又持久。

食品安全

众所周知的是，许多食品动物存留食源性病原体，主要存在于它们的肠道中，但也由于粪便污染而存留在它们的皮肤上。常规的消毒剂和抗生素不适合在屠宰前自由地局部或全身施用于动物上或者在屠宰后施用于其肉上。然而构成本发明产品的单独组分具有通常用于肠外营养的优点；因此在不同的构造中，它们已被认为是无毒的，并且本文中公开了它们适合用于鲜肉的局部上。

食源性病原体包括沙门氏菌、埃希氏菌、弯曲杆菌和梭菌种。实施例中显示了本发明产品的体外功效。在初级肉类加工中消除食源性病原体的方法包括所建议的采用合适的抗微生物剂洗涤肉体。与食品安全有关的其它应用方法包括使用膜脂乳化的游离脂肪酸作为食品包装的表面涂层，采用的程序类似于对医疗器械施用抗微生物表面涂层中所述的内容。

方法与材料：

乳化程序

C6以上的游离脂肪酸不溶于水性介质。膜脂同样不溶于水，但可分散在其中，并且在适当的条件下，可促使游离脂肪酸与膜脂的组合在水中形成乳液。这些要么是水包油型乳液，要么是油包水型乳液，后者具有较高的相对脂肪酸重量浓度。可以通过在约2克游离脂肪酸中溶解例如约1克膜脂(如可选的脱脂卵磷脂)来制备油(游离脂肪酸)包水型乳液。搅拌约10分钟，然后加约2克无菌蒸馏水，通过摇晃30秒用力搅动，并使之水化30分钟。当完全水化时，乳液具有浓奶油稠度，其可进一步用以5ml等份加入的多达20ml水稀释，中间通过摇晃来进行搅动。向此乳液中加过量的水将使之破乳并部分或全部反转，变得不适合进一步处理。

水包油型乳液更适合高水含量的应用，如伤口敷料、导管封管溶液和表面消毒，如下文中所述。制备水包油型乳液的方法是本领域技术人员熟知的，公开在例如WO2009/072097中。

游离脂肪酸在膜脂中的水包油型乳液的合适例子可以这样来制备，将适量的膜脂(如可选的脱脂卵磷脂)悬浮在无菌蒸馏水中，并利用磁力搅拌器在室温下将此搅拌约30分钟以确保均匀分散。使用合适的分散设备，缓慢添加所需量的游离脂肪酸，如己酸或辛酸或壬酸，同时用力搅动分散膜脂的体积。膜脂(例如，卵磷脂)的量在100ml水中合宜地为0.4g，可使用例如5-ml注射器或移液管向此中加0.5g游离脂肪酸。优选的搅动方法使用实验室均化器，如Ultra-TuraxModel T18(IKA Works,Wilmington,NC 28405,USA)，配有S18N-19G分散工具，以6,000至8,000RPM操作。所得乳液为游离脂肪酸的稀白色悬浮液，其是稳定的，并且可多倍稀释而不会使乳液不稳定。

可采用类似的程序制备例如癸酸或十一烯酸的水包油型乳液，条件是首先在37℃或高于其熔点下平衡组分。一旦乳化，乳液在经冷却到掺入的游离脂肪酸的熔点以下保持稳定，并可进一步稀释以用于制剂。

可以按类似的方式制备月桂酸的膜脂乳液，条件是首先在50℃或月桂酸的熔点以上平衡所有组分，并且此乳液经冷却也保持稳定，并进一步稀释以用于制剂。

游离脂肪酸在低于其单独的熔点的温度下具有有限的杀微生物效果。对于熔点低于正常生理温度(37℃)的酸来说，这一事实意义不大，除非是这样的情况，其中可能需要这种乳液在低体温状态下显示效果。

高熔点和低熔点游离脂肪酸的共混物的熔点降低，这是由于较低熔点成分的溶剂效应所致。熔点44℃的月桂酸与熔点-3.4℃的己酸的50:50比例的组合显示出的组合熔点为26℃，并且如上所述可以在26℃以上的温度下乳化所述共混物。

也可将较高熔点的游离脂肪酸溶解在精油或其它中性油的低熔点共混物中，以实现适合在生理条件下的抗微生物用途的熔点降低。精油是通过蒸馏或溶剂萃取从许多不同的植物中提取的疏水成分。它们在商业上被广泛用作香水并用于边缘医疗实践，如芳香疗法。最著名的例子包括丁香、橙、柠檬、薰衣草、杜松和玫瑰的油。已知这些当中的许多自身显示出杀微生物效果；例如香蜂草油被确认为是有效的杀病毒剂，并且当用作较高熔点脂肪酸(如月桂酸)的溶剂时，杀微生物与杀病毒特性的结合在医疗应用中提供了扩展的效用。

香蜂草油在20℃下可溶解多达40重量％的月桂酸，并且可以在膜脂(如卵磷脂)中乳化共混物，如上所述。

制备的游离脂肪酸的水包油型乳液或其共混物的浓度可以是，可选的脱脂膜脂为约0.1％至10％，乳化的游离脂肪酸载量为0.1至10％。所述载量可合宜地为4％膜脂(如卵磷脂)和5％游离脂肪酸或其共混物。还更优选使用载量为0.4％可选的脱脂卵磷脂和0.5％游离脂肪酸或其共混物，其可进一步稀释以用于制剂。

通过增加乳化液滴的表面积来扩大根据本发明的游离脂肪酸的膜脂乳液的杀微生物效力；通过减小液滴尺寸来增加相对表面积。液滴尺寸取决于在乳化程序期间由分散工具所施加的能量多少。一般来说，可以采用较高的均化速度制备较细的液滴，并且使用靠近乳化头的超声探针也会促使液滴较小和表面积增加。

膜脂的去脂质化

可以这样来实现去脂质化，将膜脂或其水解衍生物以浓度约10％w/v悬浮在极性溶剂(如醇或酮)中并搅拌约30分钟，在此期间外来的脂质被溶解。膜脂不溶于极性溶剂，并且在搅拌后容易沉淀下来，使得能够倾析出极性溶剂与其所溶解的脂质。使残留的溶剂在例如通风橱中蒸发。合适的溶剂包括丙酮和乙醇。

粘附试验：

通过酵母白色念珠菌与由颊内部新鲜获得的人颊上皮细胞之间的相互作用来提供微生物粘附和粘附抑制的合适模型。

在试验程序中，使新鲜的晚对数期念珠菌的标准化种群暴露于可变浓度的测试物质达10分钟，然后与固定比例的颊上皮细胞(BEC)合并达60分钟，在此期间酵母将以较大或较小的程度粘附于BEC，这取决于在预处理中所使用的抑制物质的效力。在粘附期后，将合并的酵母和BEC在无菌缓冲液中稀释2X倍并在实验室涡系中短时搅动(5秒)。在显微镜下观察混合物的湿装样本，采用400X放大率。粘附于BEC的酵母细胞清晰可见，并且采用暗场条件有利于对这些进行点查；使用Neubauer血球计幻灯片有利于计数。总共评价100个BEC，并且将粘附于这些上面的酵母总数用作样本计数。对照相当于100％粘附，并将响应于测试物或蛋白质空白的这一数目的减少记录为粘附抑制百分比。

由志愿者的内颊粘膜获得颊上皮细胞，方法是以圆形方式刮擦无菌压舌板，并将收集的细胞淋洗到5ml无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)当中。应优选在早晨进食或刷牙前收集BEC。需要4-5个志愿者进行提供以获得五个试验点。

合并BEC并以血球计幻灯片采用直接显微镜计数的方式进行计数；可以获得(例如)500/ml的计数。以1,500RPM离心合并的样本3分钟，并再悬浮于一定体积的无菌PBS中，计算以达到每ml为500个BEC的浓度。将此浓缩物分成2.5ml等份装在10ml离心管中，并以1,500RPM再次离心3分钟。弃去上清液，细胞团粒保持在冰上待用于其余的试验中。

这些试验中使用的酵母为白色念珠菌的新鲜临床分离物；ATCC10231可用作替代物，但所有菌种保藏“型”菌株均已失去一些毒性，并且不像新鲜分离物那样很好地粘附。

酵母细胞保持在酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YEPD)琼脂上，并使用全循环纯培养物对含100ml无菌YEPD肉汤的250ml厄伦美氏烧瓶进行接种。在37℃轨道培养器中以100RPM对接种的烧瓶进行过夜培养(10-14小时)。YEPD为：2％W/V葡萄糖，1％W/V酵母提取物，1％W/V细菌蛋白胨，琼脂(其中需要1-2％W/V)，均得自英国的Oxoid。

用血球计幻灯片对晚对数期细胞进行计数，并将浓度调至100XBEC的测试浓度(在这些例子中为40,000/ml)，使用pH 4.5的50mM乳酸钠缓冲液。通过以4,000RPM用乳酸钠缓冲液离心将2.5ml等份的标准化酵母悬浮液洗涤一次，并以团粒保持待用于如下所述的试验程序。在pH 4.5的50/100mM乳酸钠缓冲液或pH 4.5的柠檬酸钠缓冲液中制备测试物溶液和所需浓度的蛋白质空白溶液；除另有说明外，使用柠檬酸盐或乳酸盐本身作为对照以测定全粘附。牛血清白蛋白(BSA)用作蛋白质“空白”，Sigma-Aldrich A-7030；美国密苏里州圣路易斯。所述物质为粗的“热休克初组分”，因为非热休克组分可能含有活性血清免疫球蛋白，其可能有助于抑制粘附。

将上面洗过的酵母团粒再悬浮于2.5ml体积的测试、空白或对照溶液中，并保持在37℃预处理10分钟。然后用每个2.5ml体积的测试、空白或对照(酵母悬浮)溶液再悬浮上面洗过的BEC的团粒。然后在37℃温和搅动的情况下将合并的悬浮液培养60分钟。使用轨道培养器在50RPM下提供了合适的环境。

培养后对每一测试溶液添加pH 4.5的50mM乳酸钠缓冲液2.5ml，混合并在实验室涡系上经受5秒脉冲。最终稀释和涡旋的目的是要分离松散粘附的酵母与位置靠近但未粘附于BEC的酵母细胞。可能有必要进一步稀释以便于对粘附酵母进行计数。

可以作为BEC的预处理进行试验，方式是颠倒上述的再悬浮顺序。首先将BEC再悬浮于2.5ml体积的对照缓冲液、测试或蛋白质空白中，在37℃下保持10分钟，然后用于再悬浮洗过的酵母的团粒，并如上所述完成程序

杀微生物/抑微生物效果试验：

试验为标准的微生物学悬浮测试，其中将已知浓度的晚对数期细菌、酵母或真菌接种到固定体积或重量的测试物、空白或对照物当中。经过设定的时间段后加入中和溶液以终止抗微生物效果，并通过连续稀释和平板计数点查存活微生物的剩余种群。计数程序是点查存活微生物的标准和基本微生物学程序，并且是本领域技术人员熟知的。

在其通用形式中，所述方法需要用0.1ml接种1克或1ml测试样本18小时(晚对数期)，接着用力搅动混合。在预定的暴露时间过后，加9.0ml中和缓冲液并混合。这有终止杀微生物效果的作用，这使得能够对在接种与中和当间的期间中由特定测试样本实现的杀灭百分比作出可靠的估计。通常暴露时间从30秒直到30分钟不等，并且可进行达数小时，其中需要该时间段来测量效果。为了点查剩余的存活细胞，并由此计算杀灭百分比，对10ml样本加上中和缓冲液进行连续稀释和平板计数。

在本文的试验中，细菌、酵母和真菌原种通常在50％甘油中储存于-80℃珠粒上。当需要进行活力/杀微生物试验时，将由这些原种得到的小等份涂覆在适当的营养琼脂上，进行生长和继代培养以确保纯度。在需要肉汤培养物的情况下，用纯琼脂培养物中的接种环对含100ml肉汤的250ml厄伦美氏烧瓶进行接种，并在不断搅动下于37℃旋转培养器中进行培养。

通常用脑心浸液(BHI)肉汤和琼脂或胰蛋白胨大豆琼脂或肉汤(TSB)培养细菌，两者均可商购自英国的Oxoid。TSB具有如下成分：1.5％W/W胰蛋白胨(酪蛋白的胰腺消化物)、0.5％W/W蛋白胨(大豆粕的木瓜酶消化物)、0.5％W/W氯化钠和当要求作为固体培养基时的1.5％W/W的琼脂。使酵母生长在YEPD琼脂或肉汤上(参见上文的粘附试验方法)。

本方法中使用的稀释及中和缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，含137mM氯化钠、2.7mM氯化钾和10mM磷酸盐，向其中添加了3％聚山梨醇酯Tween 80(阴离子表面活性剂)、0.3％卵磷脂和0.5％组氨酸作为中和剂。这些“中和”剂是在欧盟规定下经杀微生物效力的ISO认证的，并且经确认适合在本文中所使用的浓度下中和游离脂肪酸和洗必泰。

一些微生物种极难培养，需要专门的培养基和/或不容易在液体培养物中获得的厌氧条件。例如艰难梭菌是厌氧菌，并且在氧的存在下也会不耐空气而迅速死亡。真菌病原体(如毛癣菌种)以菌丝模式生长，并且不能采用标准的连续稀释程序点查。为了评价本发明产品针对这些菌种的杀微生物效果，采用琼脂稀释技术并评价平板培养物以找到最小抑制浓度，即高于该产物浓度时观察不到生长。

所述技术需要制备10X浓度的测试制剂以在9体积琼脂中进行稀释。将4ml等份的此10X浓缩物加至16ml冷却的无菌琼脂并分配至皮氏培养皿-这代表琼脂培养基中的全强度(100％)制剂，然后可将其表示为琼脂中的杀微生物脂肪酸的百分比浓度。用无菌蒸馏水进一步稀释10X浓缩物并在16ml冷却的琼脂中使用4ml等份的这些稀释物可制备出在琼脂中浓度渐小的系列产物。用无菌环将测试生物体接种到这些琼脂上面，并且将最小抑制浓度确定为测试物的最低稀释度，在此不能检测到生长。

抑制生物膜形成：

生物膜是浮游细菌、酵母和/或真菌对固体表面的附着和粘连。通常是通过由微生物分泌的外多糖促进了附着，并且研究表明其更容易发生在疏水表面(如塑料)上，不易发生在亲水表面(如钢)上。生物膜的形成在医学科学上意义重大，特别是其在留置导管表面上的形成，这可以是与导管有关的血流感染的源头。在医学上，许多不同的微生物种能形成生物膜。然而，其中最重要的是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单孢菌和酵母白色念珠菌。

本文中所用的生物膜形成模型是基于Christensen等人的方法(J.Clin.Microbiol.22:996–1006)，其中通过用结晶紫染色并在570nm波长下测量微孔板读数仪中的染色生物膜的强度(光密度)来测定选定生物体的生长及其在微孔板孔中的生物膜形成。染色强度是生物膜形成程度的量度，并且基于染色强度的减小评价在抑制物质的存在下生物膜形成程度的减小。

本试验中使用的生物体是金黄色葡萄球菌RN4220，为最初来源于NCTC 8325的限制缺陷变种，其在生物膜形成中的亲和力显著，特别是存在加到培养基中以促进该特征的过量水平的氯化钠的情况下，培养基是得自英国Oxoid的3.7％BHI，其中添加了4％W/VNaCl。

用测试样本涂敷Nunc微孔板孔(Nunc International,Rosskilde，丹麦)，并将在补充BHI的新鲜盐水中的晚对数期细菌的1:100稀释物分配给每个测试孔，并培养24小时以促进生物膜形成。

培养期结束时，用无菌蒸馏水淋洗孔三次，并在60℃下干燥一小时以固定粘附的生物膜。使用加到每个孔中的结晶紫的0.4％溶液完成染色，并通过摇板4分钟在其中进行搅动。除去过量的染料，用无菌蒸馏水淋洗板三次并干燥。当干了时，使用ASYS HitechUVM-340读板仪在570nm下(ASYS,Eugendorf，德国)测量每个孔中的染色强度。

止血操作：凝血/抗凝血

止血是血液通过形成血块堵塞伤口而对创伤性损伤作出反应的固有能力，从而防止失血过多，并促进组织修复和伤口愈合。止血还指血液在完好的血管中保持液态并从而履行其主要的生理运输功能的固有能力。止血的这两方面在发生疾病时可变得有缺陷，意外或手术干预期间的疏忽造成的创伤性损伤可使这两方面受到重创。

在医学上，通过加大凝血速率以防止意外创伤后失血或在手术修复期间防止凝血和/或防止在包括导管在内的手术插入的医疗器械上或医疗器械中形成血块而操纵止血机制的能力是极其重要的。本文中为了测定凝血速度，利用美国新泽西州埃迪逊的ITC(International Technidyne Corporation)制造的全血凝仪Hemochron Signature 11。该仪器使用里面可加一滴新鲜血液的定制试管，通过所述装置以光学方式测量血块形成所需的时间并以电子方式记录。

在本文的试验中使用新鲜羊血，其取自颈静脉，使用的是18号针和合适体积的注射器。立即将新鲜血样与一定体积不同浓度的测试物混合，并将一滴装入试管。无菌磷酸盐缓冲盐水用作空白以排除稀释的影响，并使用肝素作为对照抗凝血剂。与未经处理的全血相比，并且与肝素及其它专利抗凝血(anti-clotting，抗凝血)产品的抗凝血效果相比，测量本发明产品的抗凝血效果在数秒内显而易见。在最优形态中，本发明的产品获得的抗凝血效果持续超过1,000秒，这与在类似测试条件下的肝素的5,000I.U相当。

不可能使用Hemochron装置测量加速凝血时间(增强凝血)，因为在大多数情况下，本发明的产品在不到60秒实现凝血，对于仪器来说是“超范围”的。

使用适当体积的新鲜血液与一定体积的测试物混合实现加速凝血时间的比较测量，其中在每种情况下在15ml带刻度的Greiner离心管(美国北卡罗莱纳州的Greiner Bio-one)中的合并体积总共为5ml)。加入新鲜血液后立即将管倒转两次进行混合，并且搁置而不加进一步搅动。当将管稍微倾斜时，明显可见到血块形成，并且一旦形成血块，其完整性将会达到这样的程度，即当将管倒转时，血块将保持悬浮。在每次测试中使用5ml新鲜全血样本(未稀释)作为对照。

分析膜脂和游离脂肪酸

常规分析用高效液相色谱法是分析组合物中的单独膜脂组分(如卵磷脂)的合适方法。程序是分析色谱领域技术人员熟知的。本文中使用得自美国马萨诸塞州米尔福德的Waters Corporation的Waters2420ELSD HPLC系统。Symmetry C8柱(3.0X 150mm，5微米柱)是合适的，具有82％甲醇在含有0.1％三氟乙酸的水中的非线性梯度，并能提供膜脂组分的充分分离。

哺乳动物细胞活力

使用生长在含10％胎牛血清和Gibco Penstrep 15140抗体补充物的RPMI 1640培养基中的Raji B淋巴细胞评价哺乳动物细胞在存在膜脂乳化的游离脂肪酸的情况下的活力减少。通过以1,000RPM离心3分钟获得成熟的细胞，并再悬浮于RPMI 1640中，不加补充物用于测试目的。通过评价死细胞对台盼蓝染料的吸收评估毒性，使用Invitrogen Countess自动细胞计数器(美国加利福尼亚卡尔斯巴德的Invitrogen Inc)。程序涉及通过在微孔板孔中混合100μl测试及细胞悬浮液而使Raji B细胞群暴露于测试溶液。预定暴露期之后，将10μl细胞和测试混合物与10μl的0.4％台盼蓝合并，将此10μl加入到流式细胞仪试管腔中，并在上述的细胞计数器中进行评价。结果提供为总细胞计数，活或死细胞数目是基于染料的吸收或排除；自动计算百分比活力。

附图说明：

图1示出血清的抗微生物抑制效果和此效果与有机酸盐组合的抵消作用，如实施例3中所述。

图2示出根据本发明产品的不同组分的凝血和抗凝血特性，如实施例5中所述。

图3示出根据本发明的导管封管溶液的抗凝血特性，如实施例7中所述。

图4示出根据本发明制备的导管封管溶液与替代的商业产品相比的比较杀微生物效力，如实施例7中所述。

图5示出根据本发明产品的生物膜抑制特性，如实施例8中所述。

图6示出根据本发明使用不同的膜脂和辛酸产品获得的杀微生物效果的可变性释放，如实施例9中所述。

图7示出白色念珠菌响应于根据本发明产品的定制释放特性的活力减少，如实施例10中所述。

图8示出根据本发明的定制释放产品对白色念珠菌的粘附抑制，如实施例10中所述。

图9示出离体伤口模型中的金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的消除，如实施例12中所述。

图10是柠檬酸钠中的本发明产品与常规的伤口护理抗微生物剂洗必泰和磺胺嘧啶银的离体效力比较，如实施例12中所述。

图11示出所建立的生物膜的比较消除和本发明产品超越现有市售的导管封管溶液的优异效力，如实施例13中所述。

在以下实施例中进一步说明本发明的实际应用和优点。除另有说明外，实施例中使用的膜脂是脱脂的，并且含不到3％的结合外来脂质物，如所述方法中描述的HPLC分析中所示。

实施例1：制备膜脂的粘附抑制组合物

以下膜脂购自英国多塞特郡普尔的Sigma Aldrich。

粗卵磷脂购自英国格洛斯特的GR Lane Ltd。

每个以上膜脂的水性分散液的制备方式是将1.0克悬浮在100ml无菌蒸馏水中(10mg/ml)，并借助于磁力搅拌器在其中搅动60分钟。借助于声处理和搅拌获得神经酰胺、鞘磷脂和羊毛甾醇的分散液，而可仅采用搅拌而相对容易地获得所有其它膜脂的分散液。磷脂和甘油糖脂分散液相对稳定，但其它分散液有经搁置而分离的倾向，因此在临用于粘附抑制试验之前使用实验室均化器对所有分散液进行30秒均化。合适的均化器为Ultra-Turax Model T18(IKA Works，威尔明顿，北卡罗来纳州28405，美国)，配有S 18N-19G分散工具，以6,000至8,000RPM操作。

如方法中所述以10、5和2.5mg/ml的浓度测试每种磷脂的粘附抑制特性；通过用无菌蒸馏水稀释初始分散液而获得较低稀释度。由于在任一时间收集足够颊上皮细胞的后勤限制，在不同日子中用五个单独膜脂的块进行试验，表4中所示的结果是这些的综合；对照为零浓度测试物，并使用牛血清白蛋白(BSA)作为蛋白质空白。

在对各种来源(蛋黄、大豆和向日葵)的粗卵磷脂的初步评价中，要指出的是粘附抑制特性相差很大，尽管报道的纯度大致相同。据分析所购买的材料可能含有外来的脂肪或甘油三酯，并且为了将其除去，要将初始材料以10％W/V悬浮在丙酮中并搅拌30分钟，此后使不溶性膜脂沉降并倾析出丙酮。在通风橱中干燥“脱脂”卵磷脂(DLL)，并如前所述评价其粘附抑制特性。按同样的方式使表4中所列的其余膜脂脱脂。如方法中所述通过HPLC分析脱脂膜脂，所有均显示含有不到3％的结合外来脂质物。结果示于下表5，包括通过单独膜脂去脂质化获得的粘附抑制效果的递增。

溶剂去脂质化将膜脂(特别是卵磷脂)的粘附抑制特性提高了2.5倍，使之达到与其单独的组分：PTC、PTE、PTG、PTI和PTS一样。卵磷脂的单独组分的进一步去脂质化可实现这些粘附抑制特性的进一步提高，虽然与由脱脂粗卵磷脂获得的效果相比幅度不那么大。这里假设用于提取卵磷脂的单独组分的商业分离过程导致几乎完全的去脂质化，因此这些相对于“粗”卵磷脂的抑制效果最佳，并且通过另外的去脂质化获得较小的增量效果。

在本发明产品的许多应用中，粘附抑制物质将与血清、粘液及其它体液接触。已发现脱脂卵磷脂和大多数其组分在牛血清白蛋白(BSA)的存在下失去其粘附抑制特性。然而还已经发现，添加有机酸盐会抵消此负面影响，并将大部分的粘附抑制特性恢复至合并的膜脂和BSA。

在本实施例中使用乳酸钠和柠檬酸钠的100mM溶液。首先将盐制成200mM溶液，并将pH调至4.5，使用这两个等份制备牛血清白蛋白的1％溶液(即，在pH 4.5的200mM柠檬酸钠盐或乳酸钠盐中的1％BSA)。使用所述盐溶液稀释脱脂卵磷脂(DLL)的1％悬浮液和磷脂酰胆碱(PTC)的1％悬浮液，以获得在pH 4.5的100mM乳酸钠/柠檬酸钠中的0.5％DLL和0.5％PTC的制剂，每个中具有5％BSA。用水将膜脂悬浮液进一步稀释至0.5％并使用此对半稀释含0.5％BSA的盐溶液，得到0.25％膜脂在100mM盐中的组合物，具有0.25％BSA。采用类似的程序制备BSA在水和在100mM有机盐溶液中的0.25％和0.5％溶液：结果示于表6。

在本实施例中，除了粗卵磷脂外，所有测试的膜磷脂均显示出具有防止白色念珠菌粘附于颊上皮细胞的优异抑制特性。当用丙酮脱脂时，粗卵磷脂如同其主要膜磷脂组分一样具有抑制性。与牛血清白蛋白组合时，粘附抑制特性消除，但在酸性pH值下存在100mM有机酸盐溶液的情况下可以得到恢复。

实施例2：

膜脂与游离脂肪酸的杀微生物组合的制备和测试：

可以使用所述方法中描述的杀微生物悬浮测试说明如所述方法中描述制备的在0.4％脱脂卵磷脂中的0.5％辛酸针对一系列微生物种的杀微生物效果。此物质的效力达到了可以预计在不到6分钟内以超过6个对数水平彻底消除接种物。革兰氏阴性菌种的抗性略大于革兰氏阳性菌种，特别是已知为产生黏液(slime)的菌种，如大肠杆菌和荧光假单胞菌，其中认为黏液层起保护作用，避免几分钟与脂肪酸额外的接触。

下表7示出一系列细菌和酵母的活力减少。因为接种物不同，获得50％接种物活力的最晚时间提供在最后一列(L.T.50％)，作为针对该特定菌种的效力的比较量度。

给出的数值数据是对数数字，其中整数是对数，小数是在该对数下的菌落计数：例如6.3×10⁵表示为5.63，并且在本文件的通篇中采用此约定。

由于培养困难的原因，或因为特殊的生长要求，如所述方法中描述的那样通过最小抑制浓度程序确定制剂针对厌氧菌的效力，结果示于表8。

实施例3：血液接触应用中的膜脂抗微生物剂

与实施例1中报导的对粘附抑制特性的负面影响一样，牛血清白蛋白的存在也影响杀微生物效果。然而，如实施例1中那样，这可以通过在酸性pH值下掺入有机酸盐得以克服。

在本实施例中使用0.5％辛酸在0.4％脱脂卵磷脂中的水包油型乳液。用200mM氢氧化钠将乙醇酸、乙酸、乳酸and柠檬酸的200mM溶液调至pH 4.5。在每一有机酸盐中和在水中制备牛血清白蛋白的10％W/V溶液作为对照。将5ml等份的0.5％辛酸乳液加至5ml等份的在有和没有BSA的水中的有和没有BSA的每一盐溶液中，得到0.25％辛酸乳液在分散于每一测试样本中的pH 4.5的100mM盐溶液中的0.2％脱脂卵磷脂中的分散液。

选择大肠杆菌用于本实施例，因为它已被证明是最具抗性的菌种之一。将细菌在37℃的脑心浸液肉汤中培养18小时。在零时间用1.1ml过夜培养物接种10ml部分的每一测试样本，并以3分钟的时间间隔从中取出1.0ml样本，采用连续稀释和平板计数程序进行残留活力测定。

在水稀释剂中，5％W/V BSA的效果是将0.25％辛酸的效力减少3倍：杀灭时间从9分钟延长至27分钟。与pH 4.5的100mM柠檬酸钠盐和乳酸钠盐组合，杀灭时间为12分钟，乙醇酸盐为18分钟，醋酸盐为24分钟。与有和没有BSA的柠檬酸盐和乳酸盐组合的结果在表9中给出并示于图1。

实施例4：在食品安全方面的用途

在本实施例中，故意在室温下用肠道沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的晚对数期培养物污染1cm³的鲜牛肉块，并使之粘附60分钟。通过在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将肉块物理浸软并通过连续稀释和平板计数点查而确认污染。

如实施例3中所述，使用0.4％脱脂卵磷脂中的0.5％辛酸，并用pH 4.5的200mM柠檬酸钠稀释X2，由此制备合适但非最佳的肉体洗液。将洗液喷到受污染的鲜牛肉块上面，并通过物理浸软、连续稀释和平板计数评价抗微生物效果。结果示于下表10：

应该意识到，在诸如肉的多孔表面上的杀灭速率由于表面的性质和对其进行渗透所需时间的原因而被延长。

实施例5：使用膜脂控制凝血时间：

如本实施例中所述，可以定制膜脂产品，使之除了贡献显著的抗微生物效果外还能影响凝血速度。

采用新鲜抽取的羊血及方法部分中描述的装置和程序测定凝血速度。使用激活的凝血仪测量抗凝血效果，并采用可视管比较以估计凝血时间的减少。

意外地发现，脱脂卵磷脂(DLL)的水性分散液以浓度依赖性方式增大凝血速度。不同浓度的DLL分散液的制备方式是，将所需重量悬浮在一定体积的水中，搅拌30分钟水化，并用实验室均化器均化悬浮液。

采用测试物与新鲜血液的20％比例评定凝血和/或抗凝血效果：在实践中将4.0ml新鲜羊血加到含有1.0ml测试物的管中，倒转两次进行混合，然后或者将其搁置以用于视觉评定凝血时间的减少，或者将单个液滴施加到激活凝血装置的试管中，用于评定抗凝血效果(血块形成时间延长)。

随着测试物中DLL浓度的提高，观察到的凝血速度加快，即，在DLL浓度超过1％的情况下，血块形成时间从对于全血的360秒下降到大约60秒或更短。

通过在DLL中乳化添加辛酸也会增大凝血效果，达到这样的程度，其中重量浓度等于或略超过DLL的重量浓度。0.5％DLL本身的凝血时间为大约125秒。添加多达0.5％的乳化辛酸不会显著影响凝血时间。在0.5％与0.75％辛酸之间，凝血时间进一步减少，从125秒到大约40秒(70％不到)。然而此后抗凝血效果相反，凝血时间随辛酸浓度的增加而增加。

当DLL浓度随辛酸浓度增加而减少到0.25％时，没具超过或在可归因于DLL本身以上的显著凝血减少。事实上，在辛酸浓度增加到0.75％与1.0％之间时，凝血时间恢复正常(360秒)。进一步提高辛酸在0.25％DLL中的相对比例具有抗凝血效果。

使用0.25％辛酸在0.25％DLL中的乳液作为标准物质(STD)也可以观察到，添加pH4.5的浓度增加的柠檬酸钠盐抑制DLL与辛酸组合的抗凝血效果。在0.5％浓度时，0.25％辛酸在0.25％DLL中的抗凝血效果已被完全抑制，并且凝血时间已恢复到高于正常(400秒)。进一步增加此组合物中的柠檬酸钠具有逐渐增加的抗凝血效果—在0.25％DLL中乳化的0.25％辛酸中为2％柠檬酸钠的情况下达到600秒。结果示于图2。

实施例6：抗微生物膜脂在用于伤口护理的增强凝血中的用途

在本实施例中说明本发明产品的抗微生物能力与血块形成能力的结合。可以从实施例3中制备的组合中选择具有增强的血块形成特性的抗微生物膜脂制备的合适例子。这里使用DLL在具有1.0％辛酸的无菌蒸馏水中的0.5％分散液。要注意的是，在本实施例中不包括有机酸盐，并且进一步要注意的是，没有这种物质会减小抗微生物效力，但不会限制凝血效果。使用相对较高的辛酸载量补偿了血液组分对抗微生物效果的干扰作用。

使大肠杆菌的细菌接种物在脑心浸液肉汤中生长18小时，并通过以4,000RPM离心10分钟使此10ml体积物沉降，将团粒再悬浮于1.0ml上清液(浓度X 10)中。

将两个4.0ml的新鲜血液样本分配给两个15ml的Greiner离心管，并用浓大肠杆菌悬浮液对两者进行接种：同时对5.0ml在无菌蒸馏水中包含5％牛血清白蛋白的空白液进行接种。

将1.0ml体积的在水中的400I.U.肝素和500I.U.链激酶加到第一管中，并将1.0ml测试制剂加到第二管中。通过倒转对两个管进行混合，并在37℃下培养45分钟。含有测试制剂的管在大约60秒内凝血；在肝素/链激酶管中经45分钟后检测不到血块。

在45分钟培养结束时，将1.0ml体积的在水中的400I.U.肝素和500I.U.链激酶加到凝血的管中，将测试制剂和1.0ml无菌蒸馏水加到第二管中。使用Ultra Turax均化器将两个样本以1,000RPM均化2分钟。血块破碎程序历时大约15分钟(总共60分钟暴露)，此后采用连续稀释和平板计数程序点查所有三个管中的残留细菌活力。

BSA空白每ml含有6.4X10⁷个存活大肠杆菌，对照血液(经肝素/链激酶处理的)样本含有8.3X10⁵个，而由测试样本未收集到存活细菌。

对本领域技术人员明确的是，如本实施例中所述的制剂可以液体、喷雾剂、凝胶、粉末或湿绷带的形式应用于伤口。本领域技术人员还明确的是，可以将所述制剂添加到其它促凝血剂(如甲壳素、高岭土或海藻酸盐)中以增强其促凝血效果和增加杀微生物效果。

实施例7：具有抗凝血效果的抗微生物膜脂在手术程序中的用途

手术程序期间潜在传染剂的入侵是受到医疗专业人员关注的主要原因。使用具有抗微生物效果的冲洗液有利于对此进行预防。还有在许多手术程序中，能够防止凝血是有利的，例如显微手术程序，其中所用的器械可能会加剧超前凝血，且其中使用冲洗液洗掉血液和体液以防止部位阻塞是可取的。一种专门的应用是在不使用导管期间用抗凝血液体填充留置导管的空隙体积。

在本实施例中，如所述方法中描述制备其中乳化有0.5％辛酸的0.4％脱脂卵磷脂(DLL)的分散液。用pH 4.5的200mM柠檬酸钠将乳液稀释到其初始浓度的50％，结果为在100mM柠檬酸钠中0.25％辛酸、0.2％DLL，或pH 4.5的大约2.5％W/V的柠檬酸的钠盐。通过用200mM氢氧化钠将200mM柠檬酸调至pH 4.5制备柠檬酸钠；这与“三柠檬酸钠”不一样，后者通常用作抗凝血剂，因为并非所有的羧酸残基均已被盐化出来。

如上文所述，使用增粘剂将制剂的粘度调节到接近于全血的粘度，这在防止由于血流紊流致使导管封管溶液在导管尖端处稀释方面提供了独特的优点。这里使用右旋糖酐40作为增粘剂，其中已发现掺入20％W/V提供大约4cP的粘度，人血粘度在3.6cP与6cP之间。

这里使用的游离脂肪酸/膜脂导管封管溶液(ML CLS)具有如下成分：在100mM(2.5％W/V)柠檬酸钠中0.2％W/V脱脂卵磷脂；0.25％辛酸；20％右旋糖酐40，pH 4.5。按如下量将等份的此制剂分配给15ml的Greiner离心管：0、0.25、0.5、0.75和1.0ml量。分别向这些的每个中加入5.0、4.75、4.5和4.25ml等份的新鲜羊血。用刚抽取后加入的新鲜血液连续评价每个管。按血液体积计的各体积稀释度为0、5％、10％、15％和20％。刚加血后，将管倒转两次进行混合，并将单个液滴加到Hemochron Signature激活凝血仪的测试孔中。

采用类似的程序，使用5％、10％、15％和20％的25,000I.U.肝素溶液得到每ml测试体积为1,250、2,500、3,750和5,000个单位的样本浓度。

还测试了：得自MedComp的市售导管封管溶液Duralock，其只含有47％柠檬酸钠；和0.05％亚甲基蓝、0.15％对羟基苯甲酸甲酯和0.015％对羟基苯甲酸丙酯在7％(0.24M)柠檬酸钠中的组合物，其是报道制剂Zuragen的仿制品；和得自Tauropharm AG的Taurolock，在4％柠檬酸钠中包含1.35％甲双二嗪：(参见表2)。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为稀释对照物。

这里要注意的是，Hemochron凝血系统依靠加速血块形成时间的血块激活过程；在此装置中，没有添加剂的全血在不到200秒内凝结。本实验中的时间线因此与实施例5中记录的凝血时间没有直接的可比性，后者中正常凝血时间的基线显示为360秒，是针对正常(非激活)的凝血观察到的时间。这里还要注意的是，Hemochron仪在1,000秒激活凝血时间的情况下“超范围”，记录更长的时间是不能的。

结果记录在下表11中并示于图3。

就测量的抗凝血效果来说，本实施例的发明产品优于25,000I.U.的肝素，并且显著地优于Duralock、Zuragen或Taurolock。然而再次要注意的是，这些是“激活”凝血时间。在实践中，除了对照PBS外，没有经处理的样本甚至在数小时过后显示出任何可视的凝血标志。

采用类似于实施例6中所用的程序测试本实施例中的制剂的抗微生物效果，不同的是使用血块破碎剂肝素和链激酶破碎对照未经处理的血液中的血块。

通过离心将金黄色葡萄球菌、表皮链球菌、大肠杆菌的18小时脑心浸液肉汤培养物和在酵母提取物蛋白胨葡萄糖肉汤中生长的白色念珠菌的18小时培养物浓缩X10，并再悬浮于十分之一体积的上清液中。

使用2.5ml等份的细菌浓缩物接种22.5ml体积的新鲜抽取的羊血，混合，并以5.0ml、4.75ml、4.5ml、4.25ml和4.0ml体积将血液分配给含0、0.25ml、0.5ml、0.75ml和1.0ml体积的本实施例的测试制剂的Greiner离心管。

将接种管在37℃下培养45分钟，接着该时间过后将在水中1.0ml体积的400I.U.肝素和500I.U.链激酶加到所有管中，并且对每个管以1,000RPM进行慢速均化2分钟：唯一可见的凝血是在对照管中。刚过60分钟后，采用连续稀释和平板计数方法评定所有样本中的残留活力。为便于比较，用Taurolock、Duralock、Zuragen和肝素以仅在4.0ml血液中为1.0ml的最大加载剂量重复同样的程序。结果在表12中给出并示于图4。

在本测试中，根据本发明的20体积％的ML CLS在一小时内实现了完全消除全血中的大肠杆菌(8个对数)、金黄色葡萄球菌(8个对数)、表皮链球菌(8个对数)和白色念珠菌(6个对数)：5体积％在相同的时间中实现了测试接种物的大约4个对数的减少。四个比较制剂(Duralock、Taurolock、Zuragen或肝素)中，只有Zuragen和Taurolock具有明显的杀微生物效果，在一小时内实现了测试接种物活力的3至4个对数的减少；Duralock似乎具有抑微生物效果，虽然没有可归因于肝素的微生物抑制作用。

因此，根据本发明的上述导管封管溶液显示出比现有的常规产品显著优越的抗凝血效果和好得多的杀微生物效果。

实施例8：膜脂在抗微生物表面涂层中的用途

施加根据本发明产品的持久性涂层的合适方法涉及乳化在如所述方法描述制备的0.8％脱脂卵磷脂中的1％辛酸。将等体积的pH 4.5的100mM柠檬酸钠缓冲液加入到乳液中，得到在50mM柠檬酸钠中为0.5％辛酸、0.4％脱脂卵磷脂的最终浓度。然后在不断用力搅拌的情况下将八体积的无水乙醇缓慢加入到两体积的乳液中，制成在80％乙醇中的最终涂敷材料。

为了涂敷塑料表面，优选采用一些形式的表面修整，这可以包括被称为电晕放电的过程，其中在整个表面上产生电场而赋予促进所施加涂层的粘附的剩余电荷。电晕处理后，将上述的乙醇溶液喷洒在表面上，并在60℃强制通风条件下干燥。可施加若干涂料以构造抗微生物涂层的层。

可首先对惰性表面施加膜脂基底层，一经干燥和韧化，根据本发明将其用于“固定”第二层脱脂膜脂乳化的游离脂肪酸。

在本实施例中，将膜脂的有机溶剂溶液施加于微孔板孔的表面上，通过在60℃加热进行干燥和固定，接着进一步施加乳化在如所述方法描述制备的脱脂卵磷脂中的辛酸的水性悬浮液。通过在60℃加热3小时将脱脂卵磷脂乳液干燥并韧化到第一卵磷脂涂层上。将经没有辛酸的脱脂卵磷脂处理的板用作对照，并使用未经处理的板确定最佳的生物膜形成。

脱脂卵磷脂(DLL)基底层的制备方式是，将5重量％的DLL悬浮在80％乙醇:水中，并将100μl等份的此物质分配给测试孔。不对用于测定最佳生物膜的孔进行处理。在通风橱中干燥乙醇组分，并在60℃烘箱中韧化一小时。如实施例1中所述在无菌蒸馏水中制备脱脂卵磷脂的1％W/V分散液，并将此体积物质用于乳化0.25％辛酸。将100μl等份的DLL或DLL+0.25％辛酸转移到DLL预涂敷的孔中，并在60℃烘箱中干燥3小时。

使用生长在脑心浸液肉汤(BHI)并补充以4％氯化钠的金黄色葡萄球菌RN 4220的10小时培养物作为接种物。用补充了新鲜氯化钠的BHI将中对数期培养物稀释到1％，并将200μl此物质加入到微孔板孔中，覆盖并培养。

在每个样本点，将每一孔中100μl物质转移至新鲜板，用于在570nM下通过光密度评定生长，然后倾析板，并用大量的无菌蒸馏水洗涤，在60℃烘箱中干燥和韧化。

当干了时，向包括未经处理的对照在内的每个孔中加入100μl的0.4％结晶紫。4分钟后，排掉过量的晶体，并再次用大量的水洗涤板以除去过量的染料，并再次借助于60℃烘箱进行干燥。结果在表13中给出并示于图5。

未涂敷的浮游生物生长在很大程度上不受抑制性DLL+辛酸的涂层的影响。单独用DLL涂敷的孔(DLL涂敷的生物膜)略有减少，但相比之下，用本发明的产品涂敷的孔(DLL+Cap抑制的生物膜)基本上没有任何生物膜：涂层本身吸收了一些结晶紫染料，这是DLL+Cap孔的光密度小幅增加的原因。

实施例9：使用膜脂实现杀微生物游离脂肪酸的缓释

在治疗应用中，使用具有“定制”释放特性的膜脂乳液组合可获得相当的优点，其有助于在上皮表面保持持久的杀微生物效果。

在本实施例中，从表1中给出的四类的每一类中选择单独的膜脂，并且与在实施例1中的粘附抑制研究中使用的相同。采用针对脱脂卵磷脂(DLL)的方法中描述的程序制备每个的0.4％水性分散液，并将0.2％辛酸乳化在每个之中。还制备了具有0.2％辛酸的0.4％DLL样本。用pH 4.5的200mM柠檬酸钠将每一膜脂制剂稀释到其体积的50％，则因此每一制剂由pH 4.5的100mM柠檬酸钠中的0.1％辛酸和0.2％膜脂组成。这里要注意的是，这还不到实施例3、表9中使用的测试物的杀微生物辛酸含量的一半。

在本实施例中使用酵母白色念珠菌，制备的接种物为所述方法中描述的18小时YEPD肉汤培养物。以4,000RPM离心晚对数期培养物5分钟，并再悬浮于十分之一体积的上清液中至浓缩物X 10。

将12.0克每一测试制剂的样本分配给Sterilin管，并用1.2ml等份的浓酵母培养物对这些中的每一个进行接种。在一小时的过程中以定时间隔从这些接种的管中取出1.0ml体积的样本，并添加到9.0ml含3％Tween 80的稀释缓冲液中以进行中和。如所述方法中描述的那样实施连续稀释和平板计数以点查残留活力。结果在下表14中给出并示于图6。

由结果显而易见的是，最慢效的乳液为神经酰胺和鞘磷脂，接下来是羊毛甾醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油；最速效的乳液为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂在脱脂卵磷脂(DLL)中的组合。

实施例10：在粘膜表面使用抗微生物膜脂乳液的组合以进行粘液防御和实现“定制的”杀微生物效果：

粘膜防御涉及眼、鼻、口、鼻咽表面、胃肠道和生殖器的粘膜分泌物的补充水化、润滑及增强的抗微生物效果。本实施例描述的制剂适合口和阴道粘膜分泌物的防御，特别最适合对经常性的口腔和/或阴道鹅口疮及其它常见的细菌和病毒感染敏感且对本发明产品有反应的个人使用。

粘膜防御剂的实施例：

A部分：辛酸(Cap)的速效膜脂乳液基于分散在无菌蒸馏水中的0.2％W/V磷脂酰胆碱(PTC)，如所述方法中描述的那样经水化和均化，并用于通过所描述的程序乳化0.25％W/V辛酸。

B部分：辛酸(Cap)的慢效膜脂乳液基于如所述方法中描述的那样分散、水化和均化的0.2％鞘磷脂(SGM)，然后如所述方法中描述的那样用于乳化0.25％W/V辛酸。

C部分：用200mM氢氧化钠将柠檬酸的200mM溶液调至pH 4.5。以1％W/V添加基于纤维素的增粘剂(羟丙基甲基纤维素，德国DowGmbh的甲基纤维素E4M)：筛入聚合物，同时用力搅拌柠檬酸钠溶液，并使之水化30分钟。

PTC+辛酸(PTC+Cap)的测试制剂的制备方式为，将等量的A部分和C部分混合，产生0.125％辛酸与0.1％PTC在含0.5％W/V甲基纤维素的100mM柠檬酸钠中的乳液。

SGM+辛酸(SGM+Cap)的测试制剂的制备方式为，将等量的B部分和C部分混合，产生0.125％辛酸与0.1％SGM在含0.5％W/V甲基纤维素的100mM柠檬酸钠中的乳液。

包含速效和慢效乳液的测试组合制剂的制备方式为，将30％PTC+Cap与70％SGM+Cap混合，并将此与等体积的C部分合并(30:70共混物)，该30:70共混物是在0.075％PTC中的0.03％辛酸与在含0.5％甲基纤维素的100mM柠檬酸钠中的0.0875％SGM中的0.07％辛酸合并的乳液。

采用如所述方法中描述的标准活力及粘附抑制试验评定所有三个测试制剂的杀微生物和粘附抑制特性。两试验的接种物均为白色念珠菌的18小时肉汤培养物，其生长在YEPD培养基中，并通过离心和再悬浮于十分之一体积的上清液中浓缩X 10。

将每一测试制剂样本12.0克分配给Sterilin管，并用1.2ml等份的浓酵母培养物对这些中的每一个进行接种。在一小时的过程中以定时间隔从这些接种的管中取出1.0ml体积的样本，并添加到9.0ml含3％Tween 80的稀释缓冲液中以进行中和。如所述方法中描述的那样实施连续稀释和平板计数以点查残留活力。结果在表15中给出并示于图7。

速效PTC+Cap的表现如预期的那样，在20分钟内将活力减少到可检测的细胞为零。慢效SGM+Cap也如预期的那样，在55分钟内活力减少为5个对数。30:70共混物组合提供了“定制释放”曲线的良好实例，在10分钟内活力减少超过2个对数，这一速率与速效PTC+Cap的相似，此后杀微生物速率明显放缓，并接近慢效SGM+Cap的速率。然而与单独的SGM+Cap相比，共混物在55分钟时达到了超过1个对数的活力减少。

采用在所述方法中描述并在实施例1中使用的颊上皮细胞模型进行三个测试制剂的粘附抑制特性评定。为比较起见，还制备了在pH 4.5的100mM柠檬酸钠缓冲液中为0.1％且具有0.5％甲基纤维素的两种膜脂PTC和SGM的制剂，并将它们包括在测试程序中。

将洗过的酵母细胞团粒再悬浮于2.5ml体积的测试制剂(PTC、PTC+Cap、SGM、SGM+Cap、上述的30:70共混物和BSA空白)中。使用pH 4.5的100mM柠檬酸钠测定对照粘附。预暴露10分钟后，使用酵母悬浮液再悬浮如所述方法中描述的那样获得和制备的洗过的颊上皮细胞团粒。在37℃下温和搅动60分钟以培养在测试、空白或对照中合并的酵母和颊上皮细胞，此后使用血球计幻灯片进行直接显微镜计数以点查粘附于100个颊上皮细胞的酵母数：结果在表16中给出并示于图8。

0.1％PTC本身和与0.125％辛酸的粘附抑制特性大大优于SGM的同等制剂：可预计30:70共混物位于这两者的中间。

由表16中的数据也显而易见的是，乳化的脂肪酸对膜脂的粘附抑制特性具有协同作用。与辛酸的组合将单独用PTC(53％)获得的粘附减少百分比进一步减少43％。

要注意的是，根据表16中的活力数据和如图7所示，20分钟暴露后在PTC+Cap中没有存活的酵母细胞，在其它两个样本中大约50％至60％的酵母细胞死亡。然而在显微镜下，酵母细胞似乎是完好的，并且虽然大幅度减少，但仍有一些明显粘附于颊上皮细胞，表明死亡细胞能够粘附和形成生物膜。

实施例11：膜脂在皮肤消毒和防止医院及医护机构中的交叉污染方面的用途

评价洗液和凝胶制剂中的皮肤消毒剂的方法已经非常成熟，并在欧盟的ISO官方认证程序EN 1500(洗手凝胶)和EN 1499(液体皂)中有完全描述。

在本实施例中，使用相对非致病性大肠杆菌K12NCTC10538(The NationalCollections of Industrial and Marine Bacteria Ltd,UK:Catalogue of TypeStrains ISBN No 0951026933)。细菌通常培养和保持在蛋白胨大豆琼脂或肉汤(TSB)上，其可从英国的Oxoid商购获得并具有如下成分：1.5％W/W胰蛋白胨(酪蛋白的胰腺消化物)、0.5％W/W蛋白胨(大豆粕的木瓜酶消化物)、0.5％W/W氯化钠和当要求作为固体培养基时的1.5％W/W的琼脂。

在进行测试前，志愿者用温和的非消毒皂洗手；合适的产品是得自英国BootsHealthcare的E45润肤洗手霜。洗涤和干燥后，将手浸入2升烧杯当中，所述烧杯含有1升在TSB中生长的大肠杆菌的24小时培养物，并且每ml含有不少于2x10⁸个存活细胞，如通过连续稀释和平板计数确认。将双手直到中间掌的部分浸泡在污染的悬浮液中，并在其中保持5秒，然后取出。使过量的污染液流出，然后在水平位置将手风干3分钟。

为了确保充分的污染并确立点查减少的预值，将每只手的指尖和拇指浸入皮氏培养皿中的10ml无菌PBS里，并刮擦板底1分钟，由此对手进行取样。取样后用本发明的产品或Spirigel对手进行处理；将任一种制剂4ml施加到手上，并处理到双手的整个表面积上。然后以大约37℃微温的干净(饮用)自来水淋洗手达20秒的一段时间。淋洗后将手保持在直立的位置，这时助理人员用纸巾将手掌和手腕弄干。然后如上所述通过在10ml PBS中浸泡的方式对指尖和拇指取样。

刚取样后，在洗涤之前或之后将1ml取样液无菌转移到TSB琼脂板的表面上并在其上进行涂抹，将另1ml无菌转移到9ml无菌PBS中并混合，并如前所述进行连续稀释和平板计数过程。

制备本发明产品的测试制剂，其为如所述方法中描述的那样制备的磷脂酰胆碱中的辛酸(30％)与鞘磷脂中的辛酸(70％)的组合。在本实施例中，制备的膜脂为具有1％辛酸且以30:70比例共混的1％浓缩物。

使用增粘剂改善测试制剂的流变性。在这种情况下，以0.45％使用得自俄亥俄州克利夫兰的Noveon Inc的卡波普(Carbopol)共聚物Pemulen TR-1。将聚合物加到一定体积的无水乙醇(相当于最终制剂体积的70％)中，并使之在其中分散30分钟。然后将30％体积的如上所述本发明产品的30:70共混物加入到乙醇和聚合物中，不断搅拌以促进快速分散。

最终测试产品含有：

0.045％磷脂酰胆碱中的0.045％辛酸:0.105％鞘磷脂中的0.105％辛酸:0.45％卡波普聚合物；29.25％水；70％乙醇。

Spirigel据报道含有70％乙醇、30％水和未知量的未知增粘剂。

在本实施例中，在实验污染志愿者手之后立即使用测试产品和Spirigel以评价去污作用，在施加Spirigel和根据本发明的测试制剂后，两者均在实验再污染的手上使用10分钟；结果在表17中给出。

由醇含量可预计，当在污染后立即使用时，两产品均实现了施加污染超过3个对数的减少。然而当污染前10分钟在手上使用时，两产品的醇含量已经在施加污染时蒸发，结果显示Spirigel没有显著的残留效果(0.45个对数减少)。测试物中脂肪酸的膜脂乳液的持久性仍然存在于手上，并实现了超过3个对数的减少。Spirigel具有直接但不持久的抗微生物效果，而根据本发明的测试物具有直接和持久的杀微生物效果。

实施例12：膜脂乳液在伤口护理中的用途

为了说明本发明产品在伤口护理中的潜在效用，使用采用了新鲜屠宰的牛腩块的离体模型。腩部具有瘦肌肉、脂肪和胶原的最佳分布，并因此被认为可代表所有可能的感染创面。屠宰后立即切除腩块，无需冷冻，并且保持外部筋膜完好，在无菌条件下将这些分成大约1cm见方的小方块。按下述方式使制备的小方块“感染”，将它们在细菌的晚对数期培养物中浸没一分钟，在37℃环境中干燥并悬挂一小时以促进细菌的粘附和在肉表面上的定殖。

伤口护理制剂的合适例子为以1:1稀释在pH 4.5的200mM柠檬酸钠缓冲液中的本发明的“标准制剂”(在0.4％DLL中含0.5％辛酸)，则其由在pH4.5的100mM柠檬酸钠缓冲液中的0.2％DLL中的0.25％辛酸组成。

这样处理测试的感染肉块，将伤口护理制剂直接喷到受感染的表面上，并评价测试样本在预定暴露时间下的残留生物负荷。在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中物理浸软经处理和未经处理的块，并通过标准的微生物学连续稀释和平板计数技术点查生物负荷，由此确认感染及其消除。

典型的结果示于图9，其中显示在不到120分钟内，常见的伤口感染细菌金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌的消除超过7个对数。应该意识到，在有裂缝的表面(如伤口)上的杀灭速率由于表面的性质和制剂对感染部位进行渗透所需时间的原因而被延长。

图10中给出在上面的柠檬酸盐缓冲液中的标准制剂与替代性常用抗微生物剂葡萄糖洗必泰和磺胺嘧啶银的相对效力比较。在100分钟暴露情况下，本发明产品几乎消除了7个对数的金黄色葡萄球菌：在洗必泰处理下留有1个对数，用磺胺嘧啶银留有3.5个对数。

实施例13

膜脂在防止和破坏生物膜中的手术用途

已知金黄色葡萄球菌RN4220在实验室条件下，当在氯化钠的存在下进行应力培养时能够形成韧性的生物膜。在脑心浸液肉汤中将生物体培养到中对数期(10小时)，使用20微升体积接种含补充以4％氯化钠的180μl BHI的96孔微孔板的孔。当在这些条件下于37℃培养6小时的情况下，在各孔的基底处形成明显的生物膜。倾析培养物并用无菌蒸馏水洗涤孔，此后将板干燥并用0.4％结晶紫染色，再次洗涤并干燥，由此对生物膜进行定量；在570nm测量染色生物膜的光密度。

由前面的实施例可明确的是，掺入本发明的膜脂乳化产品将具有杀微生物效果，防止其生长和生物膜形成。然而如本文所示，在已经存在生物膜的情况下，与膜脂和游离脂肪酸的乳液接触将会有效地杀灭生物膜中所有存活的细菌并破坏膜本身。

评定如上所述生成的确定生物膜的活力减少的方式是，在新鲜BHI肉汤中以10体积％掺入阿尔玛蓝，并再填充带有预先形成的生物膜的96孔微孔板的孔。阿尔玛蓝是得自英国佩斯里的Invitrogen Ltd的氧化还原指示剂。它赋予培养基以深蓝色，并且在通过微生物代谢活动还原时，颜色由非荧光蓝变为高度荧光红；可以在570nm和600nm测量吸光度和出现的荧光度。

用实施例7中所用的膜脂CLS(ML CLS)处理含预先形成的生物膜的微孔板孔，并且还用Zuragen、Duralock和Taurosept处理类似的孔，处理时间段从零到60分钟不等。在每次暴露期结束时，倾析板并用含3％Tween 80的磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，用无菌蒸馏水洗涤两次。向孔中加含10％阿尔玛蓝的200μl BHI，将板培养60分钟。在用本发明的膜脂CLS处理的任何孔中没有可检测到的颜色变化，表明在不到一小时内生物膜内的活力完全消除。用Zuragen、Duralock或Taurosept处理的所有孔从蓝色变到红色，表明在确定的生物膜中没有活力减少或者活力减少不多。

采用类似的程序可表明本发明的膜脂CLS在减少预先形成的生物膜的实际量方面的效力，其它三种制剂则相比无效。

如前所述，用四种制剂处理含预先形成的生物膜的微孔板孔，时间段从零到60分钟，倾析并洗涤。干燥经处理的板并用0.4％结晶紫染色，干燥，染色强度为残留生物膜的量度，在570nm记录。结果示于图11，其中显而易见的是，虽然用Zuragen、Duralock和Taurosept实现了一些生物膜的减少，但与用本发明的膜脂CLS(ML CLS)实现的生物膜完全消除相比，前者是不重要的。

实施例14

比较的粘附抑制特性

与WO 03/018049中的乳清载脂蛋白相比，脱脂卵磷脂是更有效力的粘附抑制物质，其中载脂蛋白是通过乳清蛋白的脂酶水解产生的。为比较粘附抑制，如WO 03/018049中所述使用Carbelac 80乳清蛋白浓缩物制备乳清蛋白水解物。同时还测试乳清分离蛋白(得自Glanbia PLC的Provon 190)。为全面比较的目的，如所述方法中描述的那样在pH 4.5的100mM柠檬酸钠中制备0.5％W/V辛酸在0.4％W/V脱脂卵磷脂中的制剂，并将其包括在测试次序中。将所有测试物分散在pH 4.5的100mM乳酸钠缓冲液中。结果在下表18中给出。

虽然脱脂卵磷脂本身显著优于三种基于牛奶的制剂，但脱脂卵磷脂与辛酸的乳化组合是最有效力的。

实施例15：比较的杀微生物效果

这里也使用通过琼脂稀释技术的MIC显示上文描述的“标准制剂”相比WO2009/072097中公开的产品(得自Glanbia PLC的Provon190)的优异效力，后者包含游离脂肪酸乳化在乳清分离蛋白中的共混物。WO2009/072097的产品含有28重量％的游离脂肪酸共混物，而本发明的标准制剂只含0.5重量％。为了在两种产品之间作出合适的比较，将WO2009/072097的产品在无菌蒸馏水中稀释5/28以得到包含5.0％游离脂肪酸的分散液，然后将其进一步稀释并用于制备从1.0％游离脂肪酸到0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.075％、0.05％和0.025％(脂肪酸含量)不等的琼脂板。

为进一步比较，用0.4％Provon 190中的0.5％辛酸构建乳液，使用WO2009/072097中的乳化剂而不是脱脂卵磷脂。结果示于下表19。

对于两种葡萄球菌、两种链球菌和念珠菌属来说，针对标准制剂测定的MIC为WO2009/072097产品值的四分之一或更小，表明效力大四倍。在两种假单胞菌属大肠杆菌和沙门氏菌的情况下，测定的MIC比WO2009/072097产品值小二分之一到三分之一，再次清楚地显示出显著较大的效力。对辛酸在Provon 190中的乳液测定的MIC显著高于本发明的标准制剂的值(显著较低的有效力)。

实施例16

乳化和游离形式的不同游离脂肪酸的杀微生物效果和粘附抑制效果的比较

游离形式(未乳化)的脂肪酸具有相对较小的杀微生物效果，这主要是由于它们在水性培养基中的不溶性。本文中所述的膜脂乳化增大了脂肪酸的相对表面积，并促进其在水性培养基中分散。膜脂乳化剂也有利于脂肪酸接触微生物细胞表面并向微生物细胞表面转移。如前面的实施例中所示，不同膜脂之间可变的亲脂性影响杀微生物作用速度。在一般情况下，膜脂是优异的乳化剂，显示出优异的杀微生物效果，如实施例15中所示。如本文中所示，膜脂乳化的游离脂肪酸的优异效力可推广至一系列杀微生物脂肪酸。

如所述方法中描述的那样，以0.5％W/V制备七种不同游离脂肪酸在0.4％W/V脱脂卵磷脂中的七种单独的乳液。在高于单独游离脂肪酸熔点的温度下制备乳液：己酸、辛酸和壬酸在室温(20℃)下；在37℃下制备癸酸和十一烯酸，在50℃下乳化月桂酸，在60℃下乳化肉豆蔻酸。50％己酸和50％月桂酸的共混物的熔点低于28℃，如40％月桂酸在香蜂草油中的共混物一样，并且在37℃下对这些进行乳化。

采用所述方法中描述的杀微生物悬浮测试评价游离非乳化形式和乳化在脱脂卵磷脂中的每种单独脂肪酸及其共混物的比较杀微生物效果。评价游离非乳化脂肪酸的杀微生物效果因其不溶性而受挫。非乳化形式的掺杂被认为是必要的，以便说明乳化形式的效力的指数增长。在水中制备0.5％W/V的每种游离脂肪酸并用力搅动以进行分散，接着立即移取1.0ml等份至测试容器，之后才用测试生物体接种。测试生物体为在脑心浸液肉汤上生长至晚对数期的金黄色葡萄球菌RN 4220。结果在下表20中给出。

非乳化形式的游离脂肪酸在6分钟的测试期间至多实现1个对数的活力减少。膜脂乳化剂(脱脂卵磷脂)同样产生很小的杀微生物效果，或者没有杀微生物效果。相比之下，除了乳化的肉豆蔻酸外，所有其它脂肪酸及其共混物在脱脂卵磷脂中的同等重量乳液在不到4分钟内将测试接种物中6.94至7.87个对数的残留活力减少到零。

无论是游离脂肪酸本身还是脱脂膜脂本身在本测试的时间范围内均没有任何可检测到的杀微生物效果。两者的乳化组合使得能够产生脂肪酸的协同杀微生物效果。

还采用所述方法中描述的颊上皮细胞试验测试用于上面杀微生物评价中的相同测试物的粘附抑制特性。

脱脂卵磷脂本身在测试中实现了81％的粘附抑制。己酸、辛酸、壬酸、癸酸和十一烯酸的乳液实现了超过99％的抑制，月桂酸和肉豆蔻酸的乳液实现了超过86％的抑制。所有非乳化的游离脂肪酸实现不到17％的抑制。辛酸的粘附抑制效果在乳化形式中例如增大14倍。

在表21中使用的测试物浓度下，粘附抑制效果基本上被内在的杀微生物效果所掩盖。已经表明大多数微生物细胞将因暴露于乳化的脂肪酸的杀微生物效果而死亡，并且必须假定这将影响粘附。

对比游离酸或非乳化膜脂，可以使用低于乳化的游离脂肪酸的最小抑制浓度(MIC)的浓度获得可归因于乳液的粘附抑制效果增大的更适当的量度。本发明制剂中辛酸的MIC大于0.1％。

在无菌蒸馏水中将0.5％辛酸在0.4％脱脂卵磷脂中的制剂(如上所用)稀释5倍以获得0.1％辛酸在0.08％脱脂卵磷脂中的浓度，并进一步稀释一半以获得0.04％DLL中的0.05％辛酸。将这些稀释物连同相同浓度的DLL和非乳化的游离辛酸一起在如上的颊上皮细胞试验中进行测试。结果在表22中给出。

如表22中所示，以低于其MIC(0.1％和0.05％)的浓度添加辛酸将0.08％DLL和0.04％DLL两种情况下的粘附抑制效果都增大三倍。

实施例17：对哺乳动物细胞的拮抗效果的减少

哺乳动物细胞膜易被游离脂肪酸破坏，其破坏方式无异于它们对微生物细胞膜的影响。所述效果不是常规的细胞毒性，因为其涉及到浅表细胞的表面损伤，并不干扰代谢过程或核酸复制。体内体液对此有显著的改善。通过向游离脂肪酸的膜脂乳液中添加额外量的游离膜脂可增强针对哺乳动物细胞膜损伤的保护。保护效果并不局限于使用膜脂。如本文中所示，奶清乳清分离蛋白也作为防止哺乳动物细胞损伤的合适但并非最佳的屏障。

测试物是如所述方法中描述制备的0.5％辛酸在0.4％脱脂卵磷脂中的乳液，并与也如所述方法中描述制备的等体积的pH 4.5的200mM柠檬酸钠合并。在pH 4.5的200mM柠檬酸钠中制备0.4％和0.8％脱脂卵磷脂的分散液，并以等体积与辛酸在脱脂卵磷脂中的等份乳液合并，以得到悬浮在pH 4.5的00mM柠檬酸钠水溶液中的0.25％辛酸在0.2％脱脂卵磷脂中的乳液，向其中进一步分散0.2％或0.4％量的脱脂卵磷脂，这些被描述为测试+0.2％DLL或测试+0.4％DLL。

在乳清分离蛋白(WPI)(得自Glanbia PLC的Provon 190)的柠檬酸钠分散液中制备相同乳液的类似悬浮液，牛血清白蛋白的目的是为了进行比较。这些被描述为测试+0.2％或测试+0.4％WPI或BSA。

如所述方法中描述生长Raji B淋巴细胞，并如所述方法中描述使用InvitrogenCountess细胞活力仪评定暴露于各测试溶液60分钟后的活力。结果在下表23中给出。

60分钟后测试物中的％细胞存活具有16％。相比之下，由细胞培养基中的Raji B细胞组成的对照物只损失8％的活力，而为pH 4.5的100mM柠檬酸钠的缓冲液空白甚至更少，减少为4％。随着添加0.2％和0.4％游离膜脂(脱脂卵磷脂)，测试中的％细胞存活从16％增加到77％和93％，并且虽然不是很有效，但添加游离WPI使细胞存活从16％增加到63％和67％。牛血清白蛋白在针对细胞损伤的保护方面的有效性相当低。

在膜脂乳液的水性分散液中掺入游离膜脂对膜脂乳液的杀微生物特性没有显著的影响。如所述方法中描述生长的酵母白色念珠菌的晚对数期培养物每ml含有1.33X10⁷个存活细胞。这用于以1∶10稀释度接种等份上面的每种测试物，使得每ml测试物含有超过6个对数的酵母细胞。经长达10分钟的时间段取出样本，并采用所述方法中描述的程序评定残留活力。如下表24所示，在不到5分钟内，可检测到的活力被所有测试物消除。

实施例18：在医疗食品中的用途

如所述方法中描述的那样将辛酸、癸酸和月桂酸的单独乳液制备为乳化在4.0％脱脂卵磷脂中的5.0％W/V脂肪酸。单独乳液以1:1:1比例混合。

按生产商的说明使用90％的水体积冲泡得自英国林肯郡斯伯丁的PremierInternational Foods (UK)Ltd的Marvel脱脂奶粉。一旦充分水化，添加10％体积的单独乳化的游离脂肪酸的合并混合物并通过搅拌混合，使总体积到100％。

使用得自英国Oxoid的Anaerogen低氧气包，在厌氧罐中的补充以5％去纤维蛋白羊血的哥伦比亚血液琼脂上生长幽门螺杆菌。如所述方法中描述在脑心浸液琼脂上生长鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌K12。

采用在所述方法中描述的琼脂稀释的最小抑制浓度(MIC)法测定补充以三种单独乳化的游离脂肪酸的冲泡奶的杀微生物效力。在无菌蒸馏水中制备冲泡脱脂奶稀释物，使得在凉琼脂中进一步稀释等份的这些物质所提供的琼脂的合并游离脂肪酸浓度从1％到0.1％变化，增量为0.1％，以及从0.1％到0.01％变化，增量为0.01％。将三种测试生物体的培养物接种到这些板上面，并根据培养要求进行培养：螺杆菌在低氧压下，沙门氏菌和大肠杆菌在有氧条件下，均为37℃。

最小抑制浓度为观察不到生长的最低稀释度，对于螺杆菌，其大于0.5％，对于沙门氏菌和大肠杆菌，其大于0.1％。

Claims (30)

1.一种抗微生物和凝血调节组合物在制备用于以下血液接触应用的药物中的用途，所述血液接触应用选自由手术冲洗、伤口护理、导管封管溶液、涂覆导管及其它用于插入体孔或体腔的管状手术器械所组成的群组，所述组合物为乳液形式且包含：

(a)一种或多种具有4至22个碳原子的饱和或不饱和游离脂肪酸或其药学上可接受的盐；和

(b)一种或多种脱脂的膜脂，作为所述游离脂肪酸或其盐的乳化剂。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述游离脂肪酸选自戊酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、十一烯酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸及其混合物，及其药学上可接受的盐。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述游离脂肪酸选自己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烯酸和月桂酸中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述游离脂肪酸是辛酸。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述膜脂选自磷脂。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述膜脂选自鞘脂。

7.如权利要求1所述的用途，其中所述膜脂选自甘油磷脂。

8.如权利要求1所述的用途，其中所述膜脂选自卵磷脂、鞘糖脂、甘油糖脂和胆固醇中的一种或多种。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述膜脂选自磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、卵磷脂、神经酰胺、鞘磷脂、糖脂、羊毛甾醇和胆固醇中的一种或多种。

10.如权利要求1所述的用途，其中所述膜脂选自磷脂酰胆碱。

11.如权利要求9所述的用途，其中所述糖脂选自鞘糖脂、甘油糖脂中的一种或多种。

12.如权利要求9所述的用途，其中所述糖脂选自脑苷脂、神经节苷脂、单半乳糖甘油二酯中的一种或多种。

13.如权利要求1所述的用途，其中所述膜脂是选自磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸和卵磷脂中的一种或多种的磷脂。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述膜脂是卵磷脂。

15.如权利要求1-5、9中任一项所述的用途，其中所述组合物包含选自己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烯酸和月桂酸中的一种或多种的游离脂肪酸与选自一种或多种磷脂的膜脂的组合。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述组合物包含辛酸与脱脂卵磷脂的组合。

17.如权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述组合物中组分(a)与组分(b)的比例按重量与重量计为0.25:1至10:1。

18.如权利要求17所述的用途，其中所述组合物中组分(a)与组分(b)的比例按重量与重量计为0.5:1至10:1。

19.如权利要求17所述的用途，其中所述组合物中组分(a)与组分(b)的比例按重量与重量计为0.5:1至5.0:1。

20.如权利要求17所述的用途，其中所述组合物中组分(a)与组分(b)的比例按重量与重量计为1.0:1至2.5:1。

21.如权利要求17所述的用途，其中所述组合物中组分(a)与组分(b)的比例按重量与重量计为1.25:1至2.5:1。

22.如权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的有机酸或其药学上可接受的盐；和/或一种或多种药学上可接受的无机酸盐。

23.如权利要求22所述的用途，其中所述有机酸选自乙酸、丙酮酸、丙酸、乙醇酸、草酸、乳酸、甘油酸、丙醇二酸、苹果酸、马来酸、抗坏血酸、富马酸、酒石酸、丙二酸、戊二酸、丙烯酸、顺或反丁烯酸和柠檬酸及其混合物，及其药学上可接受的盐。

24.如权利要求22所述的用途，其中所述有机酸是柠檬酸或乳酸或所述有机酸的药学上可接受的盐是有机酸的钠盐或钾盐。

25.如权利要求24所述的用途，其中所述有机酸的药学上可接受的盐是柠檬酸钠。

26.如权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述药物用作导管封管溶液。

27.如权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述药物在用于涂敷导管或其它用于插入体孔或体腔的管状手术器械表面的制剂中用作抗微生物和凝血调节剂。

28.如权利要求1-14中任一项所述的用途，其中所述药物用作手术冲洗液。

29.一种抗微生物和凝血调节的导管封管溶液，包含：如权利要求1所限定的组合物和药学上可接受的增粘剂，其中所述增粘剂是葡聚糖，其中权利要求1所限定的组合物包括组分(a)和组分(b)，

其中，所述组分(a)是辛酸，所述组分(b)是脱脂卵磷脂，并且所述组分(a)和组分(b)的比大于1.0。

30.一种抗微生物和凝血调节的导管封管溶液，包含：如权利要求1所限定的组合物和药学上可接受的增粘剂，其中所述增粘剂是葡聚糖，其中权利要求1所限定的组合物包括组分(a)和组分(b)，

其中，所述组分(a)是辛酸，所述组分(b)是脱脂卵磷脂，并且所述组分(a)和组分(b)的比在1.0-1.3之间。