ES2643862T3 - Composiciones antimicrobianas que contienen ácidos grasos libres - Google Patents

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Description

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Composiciones antimicrobianas que contienen acidos grasos libres
La presente invencion se refiere a composiciones antimicrobianas que contienen acidos grasos libres y a formulaciones farmaceuticas que contienen los mismos.
Los acidos grasos libres son esencialmente insolubles en agua. Su insolubilidad y el hecho de que son incompatibles con muchos excipientes convencionales han restringido seriamente su uso medicinal hasta la fecha. Aunque las sales de acidos grasos libres son solubles en agua, se sabe que tienen un efecto antimicrobiano muy reducido. Se han utilizado varios procedimientos para "solubilizar" acidos grasos libres, incluyendo el uso de alcoholes y tensioactivos y la derivatizacion por reesterificacion para formar mono-gliceridos y/o procedimientos de etoxilacion y propoxilacion.
Las propiedades antimicrobianas de los acidos grasos libres se conocen desde hace muchos anos (Kabara J. y col. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, julio de 1972; 2 (1): pags. 23 - 28).
Bergson y col. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, noviembre de 2001, paginas 3209 - 3212), informaron que tanto el acido caprico como el acido laurico eran eficaces para matar la levadura Candida albicans.
Sun y col. (Chemico-Biological Interactions 140 (2002), pags. 185-198), identificaron las propiedades superiores como microbicidas de los acidos capnlico, caprico y laurico, concluyendo que el laurico era el mas potente contra las bacterias grampositivas mientras que el capnlico era optimo contra organismos gramnegativos.
Las propiedades antivmcas de los acidos grasos libres fueron notificadas por Halldor y col. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, enero de 1987, pags. 27-31).
El documento WO 03/018049 desvela la actividad antimicrobiana de las apo-protemas de suero de leche en combinacion con acidos grasos libres de grasa de leche. Se ilustra que las propiedades inhibidoras de la adhesion de extractos de leche son atribuibles exclusivamente a la fraccion de protema soluble en agua, y que el componente lipfdico no contribuye a este efecto.
El documento WO 2009/072097 desvela propiedades de composiciones de acidos grasos libres tales como la depresion del punto de fusion y el secuestro que afectan a la potencia antimicrobiana. Tambien se desvelan procedimientos de emulsion utilizados para incorporar mezclas de acidos grasos libres en un aislado de protema de suero de leche.
Sprong y col. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 45, N.° 4, 2001, pags. 1298 - 1301), informa de los efectos microbicidas para la esfingosina y la esfingomielina y un ligero efecto de la liso-fosfatidil etanolamina y la liso-fosfatidil colina, pero no se observo ningun efecto de ninguno de los fosfolfpidos no modificados. Es notable que estos resultados se informan para tiempos de exposicion superiores a 2 horas a 37 °C, al contrario que la presente invencion en la que se muestran efectos microbicidas para combinaciones de lfpidos de membrana y acidos grasos libres, para tiempos de exposicion de menos de 5 minutos.
Jones y col.: Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2003, Vol. 55, N.° 1, pags. 43 - 52 desvela el uso de lecitina en combinacion con colesterol como un recubrimiento de superficie para inhibir la formacion de biopelmulas en dispositivos medicos.
Es un objeto de la invencion proporcionar composiciones antimicrobianas mejoradas que contienen acidos grasos libres.
La invencion proporciona una composicion antimicrobiana en forma de emulsion, como se define en las reivindicaciones adjuntas a la descripcion, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones microbianas en seres humanos o animales.
Tambien se desvela en el presente documento una composicion antimicrobiana que comprende:
(a) uno o mas acidos grasos libres saturados o insaturados que tienen de 4 a 22, preferentemente de 6 a 18 o de 6 a 12, atomos de carbono o una sal o ester farmaceuticamente aceptable de los mismos; y
(b) uno o mas lfpidos de membrana o un derivado hidrolizado del mismo, como agente emulsionante para el acido graso libre o los acidos grasos libres o la sal o ester de los mismos.
El acido graso libre se puede seleccionar entre: acido butrnco (C4:0), valerico (C5:0), caproico (C6:0), heptanoico (C7:0), capnlico (C8:0), pelargonico (C9:0), caprico (C10:0), undecanoico (C11:0), undecilenico (C11:0), laurico C14:0), palmttico (C16:0), palmitoleico (C16:1), margarico (C17:0), estearico (C18:0), oleico (C18:1), linoleico :3), araquidonico (C20:4) y euncico (C22:1).
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El acido graso libre se selecciona preferentemente entre: acidos valerico, caproico, capnlico, pelargonico, caprico, undecanoico, undecilenico, laurico, minstico, palmttico, estearico, oleico, linoleico y linolenico y mezclas de los mismos, y sales y esteres farmaceuticamente aceptables de los mismos. Se prefieren en particular los acidos caproicos, capnlicos, pelargonicos, capricos, undecilenicos y lauricos, especialmente el acido capnlico.
Cuando se usan combinaciones de acidos grasos que incluyen entidades de punto de fusion mas alto tales como acido laurico, se incluyen preferentemente entidades de punto de fusion inferior tales como capnlico u oleico para deprimir el punto de fusion de la combinacion a temperaturas fisiologicas inferiores a las normales.
Los lfpidos de la membrana son componentes ubicuos de todas las membranas celulares en los reinos vegetal y animal. Se caracterizan por estar constituidos por una o, en la mayona de los casos, dos moleculas de hidrocarburo de cadena larga unidas a un grupo principal altamente polar, que es un derivado del glicerol-3-fosfato, un amino- alcohol de cadena larga (esfingosina), un azucar, o un derivado de un esteroide (colesterol). Las propiedades de cada lfpido de la membrana estan dictadas principalmente por la variacion en el grupo principal polar. Casi todos son anfoteros en la medida en que se comportan como acido y como base y, lo que es mas importante, son todos anfipaticos, teniendo un extremo hidrofilo y soluble en agua en el grupo principal polar y un extremo lipofilo soluble en grasa en la cola hidrocarbonada.
Las propiedades fisicoqmmicas de los lfpidos de membrana son bien conocidas y se puede encontrar una revision adecuada de su aparicion y propiedades biologicas en Biochemistry, 3a edicion: Mathews, Van Holde y Ahern: ISBN 0-8053-3066-6, a partir de las cuales se ha recopilado la Tabla 1.
Tabla 1: Clases principales de lfpidos de membrana.
Clases de lfpidos de membrana
Grupo polar principal Lfpidos de membrana
Lecitina / Fosfolfpidos / Glicerofosfolfpidos
Glicerol Acido fosfatfdico Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina Fosfatidilglicerol Fosfatidilinositol Fosfatidilserina
Esfingolfpidos y Glucoesfingolfpidos
Esfingosina Ceramida Esfingomielina
Glucoglicerolfpidos
Sacarido Glucolfpidos Glucoesfingolfpidos Cerebrosidos Gangliosidos Glucoglicerolfpidos Diglicerido de mono-galactosilo
Colesterol
Esteroides Lanosterol
De las cuatro clases principales de lfpidos de membrana, los que contienen fosfato en el grupo polar principal son las mas comunes. Descritos como glicerofosfolfpidos, fosfogliceridos o mas frecuentemente como fosfolfpidos, este grupo constituye la mayor parte de los lfpidos de membrana en las bacterias, plantas y reinos animales. Todos los fosfolfpidos se basan en un esqueleto de glicerol con dos cadenas laterales de acilo hidrofobas sobre los carbonos en sn1 y sn2 y un resto de fosfato en sn3. Las variaciones en la cabeza de fosfato diferencian seis tipos separados de fosfolfpidos comunes, siendo el mas sencillo el acido fosfatfdico y progresando con complejidad creciente a traves de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina y fosfatidil inositol, siendo la fosfatidilcolina la mas prevalente en animales y bacterias.
Los seis fosfolfpidos mencionados anteriormente se encuentran en la lecitina, un lfpido de membrana comercial que se extrae a escala industrial de una diversidad de fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, la soja, el girasol, la colza, el aceite de palma, la yema de huevo y la grasa de mantequilla. El termino "lecitina" se utiliza con frecuencia sinonimo con el componente fosfolfpido principal fosfatidilcolina, que puede purificarse a partir de lecitina pura, como es habitual cuando se requiere un control riguroso de calidad en aplicaciones farmaceuticas. Tambien es posible modificar enzimaticamente la lecitina o cualquiera de sus componentes fosfolfpidos mediante, por ejemplo, la eliminacion de una de las cadenas laterales de hidrocarburo para formar "liso-fosfolfpidos", todos los cuales son igualmente adecuados para su uso en la presente invencion.
Los derivados hidrolizados de lfpidos de membrana incluyen liso-fosfolfpidos y liso-esfingolfpidos que pueden producirse enzimaticamente usando fosfolipasas pancreaticas disponibles en Novozyme, Dinamarca. El
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procedimiento implica la preparacion de una dispersion acuosa de fosfoftpidos o esfingoftpido, la adicion de la enzima fosfolipasa al 2 % en P/V y la incubacion a una temperatura elevada de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 60 °C durante aproximadamente 2 horas. El rendimiento de la membrana hidrolizada puede ser de hasta el 70 %, y el producto puede separarse de la mezcla por separacion de agua sobre la base de una mayor hidrofilia del liso-derivado.
Los ftpidos de membrana usados en la presente invencion pueden extraerse de fuentes vegetales o animales incluyendo semillas oleaginosas, grasa animal, lana, leche y huevos.
La lecitina utilizada en la presente invencion esta deslipidizada. Como se utiliza en el presente documento, el termino "deslipidizado" pretende significar que sustancialmente todo el material lipfdico extrano conjugado, tal como aceite, grasa o material triglicerido, al que los ftpidos de membrana se asocian normalmente en la naturaleza, se elimina. "Sustancialmente todo" en este contexto pretende significar que el ftpido de membrana deslipidizado contiene menos del 10%, preferentemente menos del 5%, mas preferentemente menos del 3%, del material lipfdico extrano conjugado.
El ftpido de membrana desvelado en el presente documento se selecciona preferentemente entre uno o mas de fosfoftpidos, lecitina, glicerofosfoftpidos, esfingoftpidos, glucoesfingoftpidos, glucogliceroftpidos y colesteroles. Los ftpidos de membrana adecuados incluyen lecitina, acido fosfatfdico, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ceramida, esfingomielina, glucoftpidos, glucoesfingoftpidos, cerebrosidos, gangliosidos, glucogliceroftpidos, mono-galactosil diglicerido, lanosterol o colesterol o cualquier combinacion de los mismos. La lecitina se utiliza en las composiciones y composiciones farmaceuticas de la invencion.
En la composicion antimicrobiana de la invencion, se prefiere particularmente una combinacion de uno o mas de los acidos caproico, capnlico, pelargonico, caprico, undecilenico y laurico con lecitina deslipidizada, especialmente acido capnlico con lecitina que esta deslipidizada.
La proporcion de acido graso libre o sal o ester farmaceuticamente aceptable del mismo con respecto al ftpido de membrana puede ser de aproximadamente 0,25:1 a aproximadamente 10:1; o de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 10:1, o de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 5,0:1, o de aproximadamente 1,0:1 a aproximadamente 2,5:1, o de aproximadamente 1,25:1 a aproximadamente 2,5:1, en base peso/peso.
Los acidos grasos libres se ven afectados negativamente cuando estan en contacto con fluidos corporales, tales como sangre, suero o un acido organico o una sal o ester del mismo y/o una sal de acido inorganico. De este modo, la composicion antimicrobiana de la invencion tambien puede comprender uno o mas acidos organicos farmaceuticamente aceptables o una sal o ester farmaceuticamente aceptable de los mismos; y/o una o mas sales de acidos inorganicos farmaceuticamente aceptables.
El acido organico se selecciona preferentemente entre los acidos acetico, piruvico, propionico, glicolico, oxalico, lactico, glicerico, tartronico, malico, maleico, ascorbico, fumarico, tartarico, malonico, giatrico, propenoico, cis o trans butenoico y cftrico y mezclas de los mismos, y sus sales y esteres farmaceuticamente aceptables. La sal de acido inorganico se selecciona preferentemente entre cloruro, sulfato y nitrato.
Los acidos organicos particularmente preferidos son los acidos cftrico y lactico y las sales de sodio y potasio de los mismos, especialmente citrato de sodio.
La concentracion molar del acido organico es preferentemente de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 500 mM, mas preferentemente de aproximadamente 50 mM a 250 mM, y mas preferentemente de aproximadamente 50 mM a 150 mM. El pH de la sal de acido organico esta preferentemente entre 4,0 y 6,5, preferentemente entre 4,0 y 5,5 o entre 4,0 y 5,0.
En la composicion antimicrobiana de la invencion, la lecitina deslipidizada emulsiona el acido graso, lo que la hace dispersable en agua. De este modo, la combinacion ftpido de membrana-acido graso es una emulsion, preferentemente una emulsion de aceite-en-agua, aunque tambien es posible una emulsion de agua-en-aceite.
En una realizacion particularmente preferida, la composicion de la invencion comprende una emulsion de acido capnlico al 0,5 % en lecitina deslipidizada al 0,4 %, que se diluye a continuacion hasta el 50 % de su concentracion utilizando tampon de citrato de sodio 200 mM a pH 4,5, siendo la concentracion final de acido capnlico al 0,25 % emulsionado en lecitina deslipidizada al 0,2 % y dispersada en citrato sodico 100 mM a pH 4,5. Esta composicion se denomina en lo sucesivo en el presente documento "formulacion convencional" y puede usarse convenientemente para demostrar los efectos antimicrobianos de las composiciones de la invencion.
Las composiciones antimicrobianas de la invencion presentan un doble efecto antimicrobiano, en el sentido de que presentan inhibicion de la adhesion microbiana a las superficies de la celula hospedadora y consiguen un efecto microbicida a traves de la disolucion de las membranas celulares microbianas.
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Se ha encontrado inesperadamente que cuando se separan Ifpidos de membrana de restos Ifpidos conjugados, diferentes Kpidos de membrana presentan sorprendentemente diferentes propiedades inhibidoras de la adhesion en celulas microbianas en cultivo planctonico. Aunque no se desea quedar ligado a teona alguna, se sugiere que estas diferencias surgen de variables hidrofobas/hidrofilas caractensticas. Ademas, se ha descubierto que la misma variabilidad anfipatica afecta a la tenacidad de emulsiones formadas con lfpidos de membrana individuales y que estas diferencias pueden explotarse para manipular la velocidad de liberacion de acidos grasos libres microbicidas emulsionados, facilitando grandemente de este modo el diseno de formulaciones microbicidas de accion rapida o lenta con una utilidad superior en aplicaciones medicas.
Como se describe en el presente documento, se pueden obtener propiedades inhibidoras de adhesion superiores y ajustables usando lfpidos de membrana, particularmente fosfolfpidos, colectivamente descritos como lecitinas, despues de haber sido extrafdos y liberados de lfpidos conjugados a los que estan normalmente asociados en su estado natural ambiental de inhibicion de la adhesion microbiana que requiere que el extremo lipofilo del lfpido de membrana este libre de orientarse y conjugarse con restos lipfdicos sobre la superficie celular microbiana. Este procedimiento se impide si los sitios lipofilos estan ocupados por lfpidos no membranosos (trigliceridos por ejemplo).
Una utilidad particular proporcionada por las composiciones desveladas en el presente documento es el descubrimiento de que las diferentes clases y los diferentes miembros de cada clase de lfpidos de membrana tienen diferentes caractensticas de liberacion. La misma dosis del mismo acido graso en la misma cantidad de lfpido de membrana diferente proporcionara el mismo efecto microbicida durante un penodo mas rapido o mas lento dependiendo del lfpido de membrana individual. Esta caractenstica peculiar facilita el uso de combinaciones de diferentes emisiones de lfpidos de la membrana del mismo acido graso para conseguir un efecto de liberacion sostenida durante relativamente penodos utiles.
Una caractenstica de los acidos grasos libres y particularmente del acido graso saturado de cadena corta a media, tal como el acido capnlico, es que se absorben rapidamente a traves de las membranas de la piel y de la mucosa. La absorcion rapida agota la dosis en la superficie epitelial y, en consecuencia, perjudica el efecto microbicida en esa superficie. Por esta razon, los lfpidos de membrana que entregan el efecto microbicida mas inmediato no son necesariamente los mas eficaces en aplicaciones terapeuticas. Como se demuestra a continuacion en el presente documento en el Ejemplo 9, ciertos lfpidos de membrana individuales son mas tenaces que otros, lo que restringe la disponibilidad de su acido graso libre emulsionado, y por consiguiente restringe la velocidad de su efecto microbicida, que restringe igualmente su absorcion en la superficie epitelial. Hay que senalar, sin embargo, que el efecto microbicida total (numeros logantmicos de microorganismos muertos) no se ve afectado.
Tambien se ha encontrado inesperadamente que las composiciones antimicrobianas de la invencion se pueden usar para regular la velocidad de coagulacion de la sangre. Mediante la variacion de la relacion de acido graso libre a lecitina deslipidizada y/o por incorporacion de sales farmaceuticamente aceptables de acidos organicos o inorganicos, u oligosacaridos u otros polfmeros, las formulaciones o bien catalizaran la velocidad de coagulacion de la sangre o bien la suprimiran por completo. Esta propiedad proporciona una gran ventaja en el uso como un agente antimicrobiano de contacto con la sangre.
Como se desvela en el presente documento, se anadio una dispersion acuosa de lfpido de membrana deslipidizado a sangre de oveja fresca a un volumen del 20 %, lo que acelerara la velocidad normal de coagulacion sangumea, reduciendo el tiempo de coagulacion de 6 minutos a menos de un minuto. La adicion de un acido graso, tal como acido capnlico, mediante emulsion hasta una relacion de aproximadamente 1,0 - 1,3 veces el peso del lfpido de membrana deslipidizado, tal como la lecitina, reducira adicionalmente el tiempo hasta la formacion de coagulos, pero a continuacion, a medida que la proporcion de acido graso aumenta, el tiempo de formacion de coagulos aumenta y se observa un efecto anticoagulante cuando el peso del acido graso emulsionado excede en aproximadamente 1,0 - 1,3 veces el peso del lfpido de membrana deslipidizado. Un experto apreciara que el efecto regulador de la sangre dependera no solo de la relacion del acido graso libre al lfpido de membrana deslipidizado, sino tambien de la naturaleza del lfpido de membrana y el acido graso libre usado.
La presencia de una sal organica en la composicion de la invencion, que podna ser necesaria para la amplificacion del efecto microbicida, destruira tambien el efecto pro-coagulacion y, como se ilustra en el presente documento, el uso de un, agente de induccion de viscosidad, tal como el dextrano, extendera los efectos anti-coagulacion hasta el punto en el que sean comparables con una solucion de heparina.
En una realizacion adicional, se puede usar una emulsion de acido graso libre que no exceda de aproximadamente 1,0 -1,3 veces el peso de lecitina deslipidizada para potenciar la velocidad de coagulacion de la sangre y ejercer un efecto antimicrobiano en el sitio de sangrado, mientras que puede usarse una emulsion de acido graso libre que excede de aproximadamente 1,0 - 1,3 veces el peso de lecitina deslipidizada con o sin sales anadidas de acidos organicos para inhibir la formacion de coagulos de sangre y ejercer un efecto microbicida en el sitio de sangrado.
Las composiciones de la invencion que contienen acidos grasos libres emulsionados de lecitina deslipidizada ejercen efectos antimicrobianos ampliamente superiores duales: tanto la inhibicion de la adhesion como el efecto microbicida. Una de las ventajas significativas proporcionadas por el doble efecto antimicrobiano es que las propiedades inhibidoras de la adhesion prevalecen mucho despues de que se haya agotado la carga microbicida. La mayona de los microbicidas son reactivos qmmicamente con el organismo diana y la mayona de las reacciones
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microbicidas son irreversibles en condiciones fisiologicas; una dosis fija de un microbicida tiene por tanto una capacidad reactiva limitada. En combinacion con una sustancia inhibidora de la adhesion, sin embargo, las propiedades inhibidoras de la adhesion persisten despues de que el microbicida se ha agotado y se proporciona proteccion adicional contra cualquier patogeno residual viable.
Ademas de la inhibicion superior y ajustable de la adhesion combinada con el microbicida superior y los efectos reguladores intrmsecos de la coagulacion de la sangre, las composiciones de la invencion son compatibles con la administracion sistemica (contacto sangumeo), en contraste con las composiciones de protemas de la leche desveladas en los documentos WO 03/018049 y WO 2009/072097. Los lfpidos de la membrana y los acidos grasos libres son metabolitos naturales en el cuerpo humano y animal, sus efectos antimicrobianos dependen de la concentracion y cuando entran en la circulacion sistemica se diluyen, se metabolizan y se excretan rapidamente como metabolitos naturales.
El uso de lfpidos de membrana en combinacion con un agente antimicrobiano es contra-intuitivo, ya que la mayona de los agentes antimicrobianos convencionales son inactivados por lecitina y lfpidos de membrana relacionados; la lecitina figura como un agente neutralizante antiseptico aprobado para su uso en la norma europea EN 1499 y 1500 para evaluar el efecto microbicida de los jabones y geles de manos.
Las composiciones de la invencion pueden usarse en el tratamiento o profilaxis de infecciones microbianas en seres humanos o animales. Debido al efecto regulador sobre la coagulacion de la sangre, las composiciones pueden usarse, por ejemplo, en soluciones de bloqueo de cateter y en el cuidado de heridas.
La invencion tambien proporciona una formulacion farmaceutica que comprende una composicion como se define en las reivindicaciones adjuntas a la descripcion, y un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable para ello. La composicion puede estar presente en la formulacion farmaceutica en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 25 % (p/v); o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % (p/v); o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,0 % (p/v).
La formulacion farmaceutica puede estar en cualquier forma adecuada para la administracion a un ser humano o animal, incluyendo por ejemplo, formas adecuadas para administracion oral, topica, enteral, parenteral o mucosa.
La formulacion de la invencion puede usarse como un agente antimicrobiano topico para la prevencion y tratamiento de infecciones de la piel, pelo, unas y membranas externas de los orificios corporales.
La composicion o formulacion de la invencion puede usarse en la construccion de un jabon lfquido o gel de manos para la eliminacion del estado de portador asintomatico de bacterias potencialmente patogenas tales como Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y otras especies comunmente asociadas a infecciones nosocomiales u hospitalarias. Se puede utilizar como un gel para el tratamiento del acne. Puede usarse en forma de un unguento para el tratamiento de hongos dermatofitos de los folfculos pilosos incluyendo el causado por las especies Trychophyton comunmente conocidas como tina. Puede construirse en forma de una pulverizacion para su administracion a la piel como un tratamiento para infecciones causadas por los virus envueltos incluyendo variedades de Herpes que provocan herpes labial y herpes. Puede prepararse en forma de gotas lfquidas para el tratamiento de infecciones del ojo y el ofdo. Puede prepararse en una diversidad de sistemas de entrega farmaceuticamente aceptables para el tratamiento de infecciones de la mucosa incluyendo la mucosa, superficies de la nariz, boca, garganta, bronquiolos y pulmones y el tracto gastrointestinal y genitales. Puede prepararse, por ejemplo, en forma de una pasta de dientes y un enjuague bucal para facilitar la mejora de la higiene dental y eliminar la carga de organismos que causan caries dental, enfermedad de las endas, ulcera aftosa y halitosis. Puede prepararse en una forma adecuada como suplemento de saliva para el alivio de los smtomas de la xerostomia. Puede prepararse como una pulverizacion para la descolonizacion de la boca, la garganta y las membranas nasales, particularmente para la erradicacion del porte asintomatico de especies resistentes a los antibioticos. Puede prepararse en forma de un gel para la prevencion y el tratamiento de infecciones microbianas de los genitales causadas por una diversidad de bacterias, levaduras y virus incluyendo aquellos conocidos por ser los agentes causales de la candidiasis, la vaginosis bacteriana no espedfica, el virus del herpes y el VIH. Puede prepararse en forma de un enema para la prevencion y tratamiento de infecciones del intestino y del intestino inferior, incluyendo aquellas causadas por especies de Clostridium anaerobicas y Desulfovibrio medicamente conocidas como colitis pseudomembranosa y reservoritis.
Los acidos grasos libres emulsionados en lfpidos de membrana pueden usarse para preparar alimentos que ejercen un efecto antimicrobiano en el tracto gastrointestinal, sirviendo para proteger contra patogenos entericos tales como Helicobacter, E. coli, Salmonella, Campylobacter, especies de Clostridium, protozoos y virus envueltos.
Un vefuculo alimentario adecuado para acidos grasos libres emulsionados con lfpidos de membrana es la leche fresca, preferentemente libre de grasa y mas preferentemente leche en polvo desnatada tal como Marvel, disponible en el mercado en Premier International Foods (Reino Unido) Ltd, Spalding, Lincolnshire, Inglaterra.
Se pueden preparar emulsiones separadas de, por ejemplo, acidos capnlico, caprico y laurico como emulsiones al 5,0 % P/V en lecitina deslipidizada al 4,0 % P/V, como se describe en los procedimientos. Las emulsiones individuales pueden combinarse en una proporcion de 1:1:1 o cualquier otra proporcion adecuada tal como 1:2:3.
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Pueden anadirse emulsiones de Kpidos de membrana de otros acidos grasos tales como butmco y/o amulsiones de aceites esenciales tales como menta o vainilla para transmitir aroma y mejorar el sabor.
La leche desnatada en polvo Marvel puede reconstituirse anadiendo la cantidad especificada a agua potable (4 cucharaditas llenas por aproximadamente medio litro). A esto se le puede anadir una cantidad de aproximadamente el 1 % P/V al 15 % P/V de una relacion seleccionada de acidos grasos libres emulsionados con lfpidos de membrana y se mezclan por agitacion. Preferentemente, la cantidad de acido graso emulsionado sera de aproximadamente el 1 % P/V al 10 % P/V y mas preferentemente aproximadamente del 5 % P/V. Sera evidente para un experto en la tecnica que la leche desnatada en polvo puede reconstituirse en menos que el volumen optimo de agua para su uso como leche, en cuyo caso se forma una crema concentrada de productos lacteos a la que se pueden anadir cantidades de acidos grasos emulsionados.
Alternativamente, se puede usar un aislado de protema de suero lacteo como un vehmulo alimentario adecuado: Provon 190 de Glanbia PLC es un aislador de protema de suero adecuado. El aislado de protema de suero de leche puede rehidratarse en agua potable en una cantidad de aproximadamente el 10 % P/V al 20 % P/V, preferentemente de aproximadamente el 15 % P/V. Una vez completamente hidratado, se puede anadir una cantidad de acido graso libre emulsionado con lfpidos de membrana o una mezcla de los mismos y mezclarse por agitacion. Cuando el aislado de protema de suero de leche se usa como vehmulo, la cantidad de acido graso libre emulsionado de lfpidos de membrana anadida puede ser de aproximadamente el 1 % P/V al 20 % P/V, preferentemente de aproximadamente el 5 % P/V al 15 % P/V y mas preferentemente aproximadamente el 10 % P/V.
Los productos de la invencion tienen utilidad como agentes antimicrobianos de contacto con la sangre en los que su capacidad combinada de coagulacion sangumea o anticoagulacion se combina con sus efectos antimicrobianos. Dichos usos incluyen riego quirurgico, cuidado de heridas, soluciones de bloqueo de cateter, revestimiento de cateteres y otros dispositivos quirurgicos tubulares para su insercion en un orificio o cavidad corporal y en seguridad alimentaria.
Una ventaja significativa de los productos de la invencion es que se requieren tiempos de exposicion muy cortos para conseguir un efecto antimicrobiano, generalmente inferior a 1 hora o inferior a 30 minutos o inferior a 10 minutos.
Como se usa en el presente documento y en el uso convencional, el termino antimicrobiano se refiere a cualquier sustancia, componente o composicion de componentes que presentan un efecto antagonista hacia protozoos, bacterias grampositivas y gramnegativas (aerobios y anaerobios), levaduras, hongos, micoplasmas y/o virus, y en particular aquellas especies microbianas que son capaces de causar enfermedades en seres humanos y animales. La enfermedad infecciosa surge de la entrada de especies microbianas patogenas (microorganismos) del medio externo o como resultado de un crecimiento aberrante de microorganismos que estan normalmente presentes en la microflora natural de la piel, el cabello y las membranas mucosas del ojo, nariz, boca, tracto gastrointestinal y los genitales.
Ya sea exogena o endogena, se entiende ampliamente entre los profesionales de la salud que la primera etapa de la patogenia microbiana invoca la adhesion del microorganismo a la superficie del tejido humano o animal. Una vez adherido, la colonizacion tiene lugar a traves de la proliferacion y adherencia posterior, despues de lo cual la produccion de toxinas y la destruccion del tejido huesped dan lugar a los smtomas clasicos de la enfermedad infecciosa. Tambien se acepta ampliamente que si se puede prevenir la adhesion, se puede inhibir la iniciacion del proceso patogeno y muchas enfermedades infecciosas pueden prevenirse o al menos limitarse en el alcance de su proliferacion.
Las propiedades novedosas de la membrana de los acidos grasos libres emulsionados con lfpidos de membrana presentan una gran utilidad en salud humana y animal. En aplicaciones de contacto con la sangre se incluyen fluidos de irrigacion quirurgicos, antimicrobianos hemostaticos en el cuidado de heridas, recubrimientos de cateter y soluciones de bloqueo de cateter para la prevencion de bacteriemia relacionada con cateter; en la mucosa, pueden usarse para replicar el mecanismo antimicrobiano natural del moco sano; en el cuidado topico de la piel, pueden utilizarse para amplificar las defensas antimicrobianas naturales de la piel; en la seguridad alimentaria porque son metabolitos naturales pueden aplicarse directamente a una superficie de alimentos para erradicar patogenos transmitidos por alimentos; y como alimentos medicinales pueden usarse para complementar una dieta para prevenir o tratar infecciones del tracto gastrointestinal.
Irrigacion Quirurgica y Cuidado de Heridas
Durante la intervencion quirurgica es practica comun emplear una diversidad de tecnicas para minimizar la entrada de bacterias, levaduras, mohos y virus potencialmente patogenos. Un problema comun y creciente es la infeccion potencial de una herida abierta por bacterias resistentes a los antibioticos tales como el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA), y muchos otros incluyendo pero no limitado a especies de Enterococcus, Pseudomonas y la levadura Candia albicans. En muchos casos las heridas abiertas se irrigan para limpiarlas de tejido suelto, sangre y otros fluidos corporales y en muchos casos una solucion de solucion salina esteril esta actualmente en uso, aunque esto no ofrece ningun efecto antimicrobiano. El uso de fluidos de irrigacion quirurgicos
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que contienen antibioticos no se recomienda simplemente porque estos tienen el potencial para generar mas especies resistentes a los antibioticos. Igualmente, muchos agentes antisepticos convencionales son inadecuados y potencialmente toxicos en contacto sistemico directo con una herida abierta. Por lo tanto, existe una gran necesidad de un fluido de riego antimicrobiano seguro y eficaz, preferentemente uno que tenga las propiedades opcionales adicionales de inhibir la coagulacion de la sangre durante la microcirugfa y/o un producto complementario que pueda promover la coagulacion sangumea y la curacion despues de la cirugfa. Las composiciones basadas en lfpidos de membrana opcionalmente deslipidizados combinados con acidos grasos libres y/o derivados de los mismos como se describen en el presente documento proporcionan dicha utilidad. Tambien en el cuidado del traumatismo despues de una lesion accidental o durante operaciones militares, las heridas frecuentemente son irregulares, estan sucias y posiblemente sangren profusamente. Hay una gran necesidad de una intervencion de emergencia con productos antimicrobianos que promuevan la coagulacion de la sangre y que se puedan aplicar con seguridad a una herida abierta.
Prevencion de la infeccion relacionada con el cateter
En terminos simplistas, un cateter es un tubo insertado a traves de la piel, en una arteria o vena o a traves de un orificio natural con el fin de drenar fluidos corporales, o para la administracion de farmacos o con el proposito de monitorizar la enfermedad o la manipulacion de instrumentos quirurgicos. Algunos cateteres permanecen durante penodos de tiempo relativamente largos y en muchos casos son susceptibles a la contaminacion microbiana y originan una biopelmula en las superficies interiores y exteriores, lo que potencialmente conduce a la infeccion diseminada del paciente.
El cateter mas comun es un tubo del tracto urinario con un vaso colector para drenar la orina de la vejiga; estos son reconocidos como fuentes importantes de infeccion adquirida en el hospital. Un sistema mas elaborado y complicado es un cateter venoso central (CVC) insertado ya sea a traves de la vena yugular en el cuello y se introduce a traves de la vena cava superior en el corazon, o se inserta a traves de una vena periferica y se introduce a traves de la misma vena que drena en el corazon. Los CVC estan disenados para dejarse durante penodos prolongados de hasta 90 dfas o mas y estan destinados a la administracion repetitiva a largo plazo de farmacos y/o formulaciones nutricionales; en dichas aplicaciones se abren rutinariamente para su administracion y se vuelven a cerrar durante penodos intermitentes durante los cuales el fluido en el lumen del cateter es estatico y susceptible al crecimiento microbiano si esta contaminado. La contaminacion accidental de los CVC es relativamente comun y frecuentemente da lugar a infecciones del flujo sangumeo relacionadas con el cateter que son potencialmente mortales.
La sangre entra en el lumen de un CVC durante procedimientos medicos habituales, donde se aferra al interior y pueden coagular bloqueando el lumen. Un lumen CVC bloqueado requiere el reemplazo del cateter en cirugfa, lo que aumenta considerablemente el tiempo, el coste y la mortalidad del paciente.
Una solucion de bloqueo de cateter (CLS, del ingles catheter locking solution) es un volumen de fluido suficiente para llenar el lumen del cateter entre procedimientos medicos. Un CLS optimo ejercera un efecto antimicrobiano y anticoagulante. En la actualidad hay una serie de formulaciones CLS patentadas en el mercado que estan disenadas para lograr tanto la prevencion de la coagulacion de la sangre como un efecto antimicrobicida. La seleccion de ingredientes activos para construir estas formulaciones CLS esta limitada por el riesgo de infusion intravenosa accidental. El volumen de vacfo de un CVC puede ser de hasta 3,0 ml o mas. En el caso de que un administrador medico se olvidara de que se habfa insertado una solucion de bloqueo y se anadiera accidentalmente una segunda dosis, el primer volumen vacm se infundina directamente en el torrente sangumeo donde podna tener serias implicaciones toxicologicas para el paciente.
Las formulaciones de la presente invencion pueden estar en forma de soluciones de bloqueo de cateter, que pueden lograr un efecto microbicida optimo en menos de 1 hora y tienen propiedades anticoagulantes similares a la heparina sin el uso de ese material en la formulacion. Las soluciones de bloqueo del cateter tienen preferentemente una viscosidad aproximandose a la de la sangre entera para minimizar el potencial de disolucion y mezcla en la punta del cateter. La viscosidad deseada se puede conseguir usando agentes potenciadores de la viscosidad.
Los agentes potenciadores de la viscosidad utilizados habitualmente en preparaciones farmaceuticas incluyen una amplia gama de hidrogeles de origen natural o sintetico. Entre estos se incluyen derivados de celulosa tales como carboximetilcelulosa e hidroxietilcelulosa. Otros polfmeros naturales de origen vegetal incluyen dextrano, alginato, pectina, goma guar y goma arabiga; los polfmeros sinteticos incluyen una gama de carbomeros (acrilatos/polfmeros de acrilato de alquilo C10-30) y poloxameros (copolfmeros tribloque de polioxietileno y polioxipropileno). Por razones de toxicidad residual y eliminacion metabolica, pocos de estos estan aprobados para el uso sistemico habitual en medicina humana. El Poloxamero, Pluronic F68 se ha utilizado en formulaciones nutricionales parenterales, pero el dextrano de origen natural ha logrado un uso mas extenso en cirugfa.
En las formulaciones de la invencion, el dextrano es el agente potenciador de la viscosidad preferido. El dextrano es un polisacarido natural. Un complejo de glucano ramificado de monomeros de glucosa, que es producido por muchas bacterias, incluyendo la especie Leuconstoc, y se ha utilizado como un agente irrigador y anticoagulante en microcirugfa. El dextrano esta disponible en el mercado en una gama de pesos moleculares que van desde 10 Kilo daltons (Kd) hasta 150 Kd. En la invencion, se prefiere el dextrano de 20 Kd a 60 Kd. Mas preferentemente, el
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dextrano de 40 Kd se usa para ajustar la viscosidad de un Kpido de membrana/acido graso libre solucion de bloqueo del cateter para aproximarse a la de la sangre entera: 3,6 - 6,5 cP.
Cuando se usa dextrano de 40 Kd como agente potenciador de la viscosidad, su concentracion en formulaciones debe ser preferentemente de aproximadamente el 5 % al 50 % en peso por volumen, mas preferentemente de aproximadamente el 10% al 40%, y mas preferentemente de aproximadamente el 15% al 30% en peso por volumen sobre la base de la totalidad formulacion.
La Tabla 2 a continuacion proporciona un resumen de las formulaciones CLS patentadas mas comunes actualmente en uso:
Tabla 2: Formulaciones patentadas de CLS actualmente en uso o en desarrollo
Marca propietaria
Ingredientes activos conocidos Eficacia reportada
Duralock MedComp, Filadelfia, EE.UU.
47,6 % de Citrato trisodico Anticoagulante, microbioestatico no microbicida
Zuragen Ash Access Technologies Lafayette, Indiana, Estados Unidos
7 % de citrato de sodio 0,05 % de azul de metileno 0,15 % de metil parabenos 0,015 % de propil parab)nos Anticoagulante Microbicida durante 12 horas
Taurolock Tauropharm AG, Waldebuttelbrunn Alemania
1,35 % de Taurolidina 4 % de citrato de sodio Anticoagulante Microbicida durante 12 horas
Canusal Wockhardt UK LTD Wrexham Gales
0,9 % de solucion salina 200 U.I. de heparina/ml Anti-coagulante No microbicida
La mayona de las soluciones de bloqueo en uso tienen actualmente un efecto microbicida relativamente bajo: reduccion en la viabilidad microbiana de 3 - 4 en escala logantmica en una exposicion de mas de una hora. Como se desvela en el presente documento, un CLS basado en acidos grasos libres emulsionados de lfpidos de membrana presenta un efecto antimicrobiano superior que erradica mas de 6 en escala logantmica en menos de 6 minutos. Los efectos optimos de la anticoagulacion se consiguen modificando la relacion del lfpido de la membrana y el acido graso libre y el uso opcional de un agente que aumenta la viscosidad elimina la migracion de sangre a la punta del cateter. Una mayor seguridad en caso de doble bloqueo accidental esta asegurada por el hecho de que los componentes utilizados en la presente invencion son metabolitos naturales.
Recubrimiento superficial antimicrobiano
Las composiciones de la presente invencion se pueden usar para crear recubrimientos de superficie antiadherentes y antimicrobianos de doble accion atrapando una pelfcula de acido graso libre, sobre cualquier superficie animada o inanimada, incluyendo pero sin limitarse a piel, plastico, caucho, metal o vidrio, donde ejercen un efecto microbicida en la superficie ademas de repeler la adhesion de especies microbianas.
Los recubrimientos activos de superficie antimicrobiana tienen una aplicacion particular en el cuidado de la salud, para la prevencion de la formacion de biopelfculas en instrumentos medicos y en superficies de cateter, y tambien como recubrimiento superficial para estaciones de trabajo, bandejas procedimentales y todas las superficies de contacto del paciente. De forma similar, los recubrimientos de superficie antimicrobianos activos tienen una aplicacion extensa en la industria de productos alimenticios en la que se pueden aplicar a la preparacion de alimentos ya las superficies de envasado para minimizar el transporte de patogenos transmitidos por alimentos tales como Salmonella, Campylobacter, Listeria y E. coli y como se demuestra en el presente documento, tambien pueden aplicarse a la superficie de productos alimenticios, carne, para erradicar estos patogenos en la fuente.
La antisepsia superficial convencional se consigue usando un pano antiseptico que puede contener triclosan, clorhexidina, compuestos de amonio cuaternario o una solucion concentrada de alcohol. Sin embargo, la toxicidad residual de muchos antisepticos convencionales limita su uso en alimentos y superficies animadas.
Cuando se utiliza en aplicaciones de recubrimiento superficial, la composicion de la invencion puede aplicarse en un sistema de entrega farmaceuticamente aceptable, con o sin excipientes. Los sistemas de entrega
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farmaceuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, disolventes organicos disenados para evaporarse en la aplicacion dejando un residuo seco, Kquidos, cremas, geles, pastas, unguentos, polvos o pulverizaciones e incluyen combinaciones de estos con materiales insolubles tales como toallitas fibrosas.
Fortificacion mucosa:
Las membranas mucosas de los seres humanos y los animales son superficies caractensticamente humedas en la interfaz de los orificios corporales naturales y el revestimiento del tracto gastrointestinal y los genitales, incluyen el ojo, la nariz, el ofdo interno, la boca, las superficies nasofarmgeas, traquea, bronquiolos, esofago, estomago, intestino grueso e intestino delgado, recto, vagina y labios externos, los genitales y el revestimiento del tracto urinario. Ademas de estas superficies anatomicamente relacionadas, que son comunes a los seres humanos y animales, hay estructuras mucosas que son unicas a las especies particulares, tales como la bolsa gutural en equidos.
Las membranas mucosas estan cubiertas por una capa de moco, un hidrocoloide viscoso compuesto principalmente de mucinas, un grupo de protemas de alto peso molecular altamente glucosiladas que actuan como una matriz dentro de la cual se dispersan muchos otros materiales biologicamente activos, incluyendo anticuerpos secretores y componentes del sistema inmunitario innato tales como histatinas y estaterinas en la saliva. Ademas de la hidratacion y la lubricacion, el moco es esencial para la prevencion de la entrada de patogenos microbianos potenciales y para la prevencion de la adhesion y colonizacion de las membranas mucosas.
El deterioro de la mucosa y la debilitacion de la integridad del moco pueden surgir como consecuencia de una enfermedad, o como un efecto secundario de la intervencion medica y/o farmaceutica o como consecuencia del estilo de vida. Cuando esto sucede, los afectados padecen una infeccion mucosa recurrente, incluyendo pero no limitado a caries dental, enfermedad periodontal, candidiasis, vaginitis de levadura, vaginosis bacteriana, enteritis y colitis infecciosa. La complejidad del moco ha desafiado todos los intentos de construir replicas exactas que puedan usarse en la terapia de sustitucion. Hay una serie de sustitutos comerciales, que estan disenados para aliviar los smtomas ffsicos predominantes de la sequedad oral. La mayona de estos se basan en hidrogeles tales como la carboximetil celulosa y una composicion de sales para efectuar el tamponamiento y la remineralizacion. Uno se basa en la mucina del intestino de cerdo (Saliva Orthana, AS Pharma, Eastbourne, Reino Unido), pero ninguno se aproxima a los aspectos naturales inhibitorios de la saliva y el moco en general. Las propiedades combinadas inhibidoras de la adhesion y microbicidas de las formulaciones de la invencion, en particular formulaciones de liberacion adaptadas como se desvelan en el presente documento, ofrecen una mimetizacion superior de las propiedades antimicrobianas del moco natural.
Desinfeccion topica y cuidado de la piel
La piel, el pelo y las unas de los mairnferos, que son las superficies externas del cuerpo estan sujetos a una constante contaminacion ambiental. La piel de mamffero helicoidal tiene propiedades antimicrobianas intnnsecas basadas en acidos grasos libres naturales en la piel, y estos pueden ser ventajosamente fortificados por la aplicacion topica de acidos grasos libres emulsionados con lfpidos de membrana deslipidizados como se desvela en el presente documento.
Las bacterias que causan infeccion de la piel incluyen, pero no se limitan a, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Pseudomonas aeruginosa, causando impetigo, Foliculitis, Erysipilis, Celulitis y Fascitis necrotizante. Propionibacterium acne es el agente causante del acne juvenil. Las infecciones de la piel por hongos son causadas principalmente por especies de Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton y enfermedades conocidas colectivamente como Tina (pedis, cruris, capitis, corporis y unguinium), que incluyen la dermatofitosis y las infecciones de las unas. La levadura incluyendo Candida albicans causa intertrigo y Paroniquia; Malassezia furfur causa Tina versicolor (dermatitis seborreica y caspa infecciosa) y es tambien una dolencia comun en los ofdos de los perros. Las infecciones por virus envueltos incluyen el herpes simple de tipo 1 que afecta a las regiones orofaciales y el de tipo 2 que afecta a las regiones genitales. El herpes zoster provoca herpes zoster y el poxvirus causa molusco contagioso. El estado de portador superficial asintomatico de VIH, SARS, hepatitis, gripe porcina, gripe aviar y muchas otras infecciones zoonoticas virales tambien puede eliminarse usando las composiciones de la presente invencion.
Existe una gran preocupacion publica por la creciente incidencia de la infeccion adquirida en el hospital (IAH). Las IAH incluyen infecciones causadas por bacterias resistentes a los antibioticos tales como Staphylococcus aureus resistente a la Meticilina (MRSA) y Enterococcus resistentes a vancomicina (VRE) y otras especies resistentes a multiples farmacos taless como Clostridium difficile y otros patogenos oportunistas menos conocidos, incluyendo Pseudomonas y Candida.
Es bien sabido que la antisepsia de las manos es cntica en la prevencion de la contaminacion cruzada entre los pacientes y el personal de atencion al paciente. La mayona de los establecimientos de cuidado de pacientes usan sistematicamente un gel de alcohol para la antisepsia de las manos. El alcohol es un agente microbicida inmediato y potente. Sin embargo, se evapora en segundos, sin dejar ningun efecto persistente para proteger contra la contaminacion accidental que podna ocurrir inmediatamente despues de la evaporacion. Las emulsiones de lfpidos
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de membrana de acidos grasos libres pueden adaptarse de una manera que proporcione una liberacion sostenida de efecto microbicida y cuando se formulan con alcohol, el efecto es immediate y persistente.
Seguridad alimentaria
Es bien sabido que muchos animales alimentarios albergan patogenos transmitidos por alimentos, principalmente en su intestino, pero tambien en su piel debido a la contaminacion con heces. Los antisepticos y antibioticos convencionales no son adecuados para la aplicacion topica o sistemica a los animales antes del sacrificio, o a su carne despues del sacrificio. Sin embargo, los componentes individuales que constituyen los productos de la presente invencion tienen la ventaja de utilizarse sistematicamente en la nutricion parenteral; en construcciones separadas, por tanto, se ha considerado que no son toxicos, y su idoneidad para su uso topico en carne fresca se desvela en el presente documento.
Los patogenos transmitidos por alimentos incluyen especies de Salmonella, Escherichia, Campylobacter y Clostridium. La eficacia de los productos de la presente invencion in vitro se demuestra en los ejemplos. Los procedimientos de erradicacion de los patogenos transmitidos por los alimentos en el procesamiento primario de la carne incluyen el uso propuesto de lavado de las canales con un agente antimicrobiano adecuado. Otros procedimientos de aplicacion que son relevantes para la inocuidad de los alimentos incluyen el uso de acidos grasos libres emulsionados en lfpidos de membrana como recubrimientos superficiales para el envasado de alimentos utilizando procedimientos similares a los descritos para la aplicacion de recubrimientos de superficie antimicrobianos a dispositivos medicos.
Procedimientos y materiales:
Procedimientos de emulsion
Los acidos grasos libres mayores de C6 son insolubles en medios acuosos. Los lfpidos de membrana son igualmente insolubles en agua pero pueden estar dispersos en el mismo y, en condiciones apropiadas, pueden inducirse combinaciones de acidos grasos libres y lfpidos de membrana para formar emulsiones en agua. Estas son emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, siendo esta ultima la concentracion relativa mas alta de acido graso en peso.
Se puede preparar una emulsion de agua en aceite (acidos grasos libres) disolviendo, por ejemplo, aproximadamente 1 gramo de lfpido de membrana, tal como lecitina opcionalmente deslipidizada, en aproximadamente 2 gramos de acido graso libre. Se agitan durante aproximadamente 10 minutos y despues se anaden aproximadamente 2 gramos de agua destilada esteril, se agita vigorosamente agitando durante 30 segundos y se deja que se hidrate durante 30 minutos. Cuando esta completamente hidratada, la emulsion tiene una consistencia cremosa espesa que se puede diluir adicionalmente con hasta 20 ml de agua, se anaden en alteuotas de 5 ml con agitacion intermedia. Un exceso de agua anadido a esta emulsion hara que se rompa y se invierta en parte o en su totalidad y se convierta en inadecuada para el procesamiento adicional.
Las emulsiones de aceite en agua son mas adecuadas para aplicaciones con alto contenido de agua, tales como vendajes para heridas, soluciones de bloqueo de cateter y desinfeccion de superficie, como se describe a continuacion. Los procedimientos de preparacion de emulsiones de aceite en agua son bien conocidos por los expertos en la tecnica y se desvelan, por ejemplo, en el documento WO2009/072097.
Puede prepararse un ejemplo adecuado de una emulsion de aceite en agua de acido graso libre en lfpidos de membrana suspendiendo una cantidad adecuada de lfpido de membrana, tal como lecitina opcionalmente deslipidizada, en agua destilada esteril, y agitando esto a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos con un agitador magnetico para asegurar una dispersion uniforme. Utilizando un dispositivo de dispersion adecuado, se anade lentamente la cantidad deseada de acido graso libre, tal como acido caproico, o capnlico, o pelargonico, mientras se agita vigorosamente el volumen de lfpido de membrana dispersada. La cantidad de lfpido de membrana (por ejemplo, lecitina) es convenientemente de 0,4 g en 100 ml de agua, a la que se pueden anadir 0,5 g de acido graso libre usando, por ejemplo, una jeringa o pipeta de 5 ml. Un procedimiento de agitacion preferido es un homogeneizador de laboratorio tal como un Ultra-Turax Modelo T18 (IKA Works, Wilmington, nC 28405, EE.UU.) equipado con una herramienta de dispersion 518N-19G, operando a 6.000 a 8.000 rpm. La emulsion resultante es una suspension lfquida fina de color blanco de acido graso libre, que es estable y se puede diluir muchas veces sin desestabilizar la emulsion.
Se puede usar un procedimiento similar para preparar una emulsion de aceite en agua de, por ejemplo, acido caprico o acido undecilenico, a condicion de que los constituyentes se equilibren primero a 37 °C, o por encima de su punto de fusion. Una vez emulsionada, la emulsion permanece estable al enfriar por debajo del punto de fusion del acido graso libre incorporado y puede diluirse adicionalmente para su uso en la formulacion.
Se puede preparar una emulsion de lfpido de membrana de acido laurico de una manera similar siempre que todos los constituyentes se equilibren primero a 50 °C o por encima del punto de fusion del acido laurico, y de nuevo esta emulsion permanecera estable durante el enfriamiento y en disolucion adicional para su uso en la formulacion.
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Los acidos grasos libres tienen un efecto microbicida limitado a temperaturas por debajo de su punto de referencia individual. Este hecho tiene poca significacion para aquellos acidos con puntos de fusion por debajo de temperaturas fisiologicas normales (37 °C), excepto en situaciones en las que pueda ser necesario que dichas emulsiones presenten un efecto en condiciones hipotermicas.
Las mezclas de acidos grasos libres de punto de medicion alto y bajo tienen puntos de fusion deprimidos debido al efecto disolvente del constituyente del punto de fusion inferior. Una combinacion de acido laurico con un punto de fusion de 44 °C y acido caproico con un punto de fusion de -3,4 °C en una relacion 50:50, presentara un punto de fusion combinado de 26 °C, y la mezcla se puede emulsionar como se ha descrito anteriormente a temperaturas superiores 26 °C.
Los acidos grasos libres de mayor punto de fusion tambien pueden disolverse en mezclas de bajo punto de fusion de aceites esenciales u otros aceites neutrales para lograr una depresion del punto de fusion adecuado para el uso antimicrobiano en condiciones fisiologicas. Los aceites esenciales son constituyentes hidrofobos extrafdos de muchas plantas diferentes por destilacion o extraccion con disolvente. Son ampliamente utilizados en el mercado como perfumes y en practicas como la aromaterapia. Los ejemplos mas notables incluyen aceite de clavo, naranja, limon, lavanda, enebro y rosa. Se sabe que muchos de ellos tienen un efecto microbicida por derecho propio; el aceite de balsamo de limon, por ejemplo, se reconoce como un agente viricida eficaz y cuando se usa como disolvente para acidos grasos de punto de fusion mas alto tal como acido laurico, el microbicida combinado y las propiedades viricidas proporcionan una mayor utilidad en aplicaciones medicas.
El aceite de balsamo de limon se disolvera hasta un 40 % en peso de acido laurico a 20 °C y la mezcla se puede emulsionar en lfpidos de membrana tales como lecitina, como se ha descrito anteriormente.
Las emulsiones de aceite en agua de acidos grasos libres o mezclas de los mismos pueden prepararse en concentraciones de lfpido de membrana opcionalmente deslipidizado que oscila entre aproximadamente el 0,1 % y el 10 % y cargas de acidos grasos libres emulsionadas del 0,1 al 10 %. La carga puede ser convenientemente del 4 % de lfpido de membrana tal como lecitina, y el 5 % de acido graso libre o una mezcla de los mismos. Mas preferentemente, se utiliza una carga del 0,4 % de lecitina opcionalmente deslipidizada y el 0,5 % de acido graso libre o una mezcla de los mismos, que puede diluirse adicionalmente para su uso en formulacion.
La eficacia microbicida de cualquier emulsion de lfpidos de membrana de acido graso libre de acuerdo con la invencion se amplifica aumentando el area superficial de la gotita emulsionada; el area superficial relativa aumenta al disminuir el tamano de la gota. El tamano de las gotitas es una funcion de la cantidad de energfa transmitida por la herramienta de dispersion durante el procedimiento de emulsion. Generalmente, se pueden producir gotitas mas finas usando velocidades de homogeneizacion mas altas y el uso de una sonda ultrasonica adyacente al cabezal de emulsion tambien facilitara gotitas mas pequenas y un area de superficie aumentada.
Deslipidizacion de los lipidos de membrana
La deslipidizacion puede conseguirse suspendiendo el lfpido de membrana o el derivado hidrolizado del mismo en un disolvente potar, tal como un alcohol o cetona, a una concentracion de aproximadamente el 10 % p/v y agitando durante aproximadamente 30 minutos durante los cuales se disuelve el lfpido extrano. Los lfpidos de membrana son insolubles en disolventes polares y se asentaran facilmente despues de la agitacion permitiendo que el disolvente polar con su lfpido disuelto sea decantado. El disolvente residual se deja evaporar en, por ejemplo, una campana extractora. Los disolventes adecuados incluyen acetona y etanol.
Ensayo de Adhesion:
Un modelo adecuado de adhesion microbiana e inhibicion de adhesion es proporcionado por la interaccion entre la levadura Candida albicans y las celulas epiteliales bucales humanas recien recogidas desde el interior de la mejilla.
En el procedimiento de ensayo, una poblacion normalizada de Candida fresca de fase logantmica tardfa se expone a una concentracion variable de la sustancia de ensayo durante 10 minutos, despues se combina con una relacion fija de celulas epiteliales bucales (BEC, del ingles Buccal Epithelial Cells) durante 60 minutos, tiempo durante el cual la levadura se adhieren a las BEC en mayor o menor grado, dependiendo de la potencia de la sustancia inhibidora utilizada en el pretratamiento. Despues del penodo de adhesion, la levadura combinada y las BEC se diluyen por un factor de 2X en tampon esteril y se agitan brevemente (5 segundos) en un vortice de laboratorio. Las muestras de montaje humedo de la mezcla se examinaron bajo un microscopio usando un aumento de 400X. Las celulas de levadura adheridas a BEC son claramente visibles y la enumeracion de estas se facilita usando condiciones de campo oscuro; el uso de un diafragma de hemocitometro Neubauer facilita el recuento. En total se evaluan 100 BEC y el numero total de levaduras adheridas se utiliza como el recuento de muestras. El control es equivalente al 100 % de adhesion y la reduccion de este numero en respuesta al artfculo de ensayo o el blanco de protema se indica como porcentaje de inhibicion de la adhesion.
Las celulas epiteliales bucales se recogen de la mucosa de la mejilla interior de los voluntarios frotando un depresor lingual esteril de una manera circular y aclarando las celulas recogidas en 5 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS) esteril. Las BEC se deben recoger preferentemente por la manana antes de comer o cepillarse los
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dientes. Se necesitan donaciones de 4-5 voluntarios para lograr cinco puntos de ensayo.
Las BEC se agrupan y se cuentan usando el recuento microscopico directo con un portaobjetos hemocitometro; se puede conseguir un recuento de 500/ml (por ejemplo). La muestra agrupada se centrifuga a 1.500 rpm durante 3 minutos y se volvio a suspender en un volumen de PBS esteril, calculado para conseguir una concentracion de 500 BEC por ml. Este concentrado se dividio en partes almuotas de 5 ml en tubos de centnfuga de 10 ml y se centrifugo de nuevo a 1.500 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se desecha y los sedimentos de celulas se mantienen en hielo hasta que se utilicen en el resto del ensayo.
La levadura utilizada en estos ensayos es un aislado clmico fresco de Candida albicans; puede usarse ATCC 10231 como alternativa, pero todas las cepas de "tipo" de coleccion de cultivo han perdido cierta virulencia y no se adhieren tan bien como los aislados frescos.
Las celulas de levadura se mantienen en agar de peptona dextrosa de extracto de levadura (YEPD), y se usa un bucle completo de un cultivo puro para inocular un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contiene 100 ml de caldo YEPD esteril. Los matraces inoculados se incuban durante la noche (10-14 horas) a 37 °C en una incubadora orbital a 100 rpm. El YEPD es: 2 % de glucosa P/V, 1 % de extracto de levadura P/V, 1 % de peptona bacteriologica P/V, Agar cuando se requiere a 1-2 % P/V, todos de Oxoid, Reino Unido.
Las celulas de fase logantmica tardfa se cuentan con un portaobjetos hemocitometro y la concentracion se ajusta a 100X la concentracion de ensayo de BEC (40.000/ml en estos ejemplos), usando tampon de lactato de sodio 50 mM pH 4,5. Se lavan almuotas de 2,5 ml de la suspension normalizada de levadura una vez por centrifugacion con tampon de lactato sodico a 4000 rpm y se mantienen como un sedimento pendiente del procedimiento de ensayo como se describe a continuacion. Se prepara una solucion de sustancia de ensayo y blanco de protema en la concentracion requerida en tampon de lactato de sodio 50/100 mM pH 4,5 o tampon de citrato de sodio pH 4,5; a menos que se indique lo contrario, se usaron citratos o tampones de lactato por sf solos como controles para determinar la adhesion total. La albumina serica bovina (BSA) se usa como "blanco" de protema, Sigma-Aldrich A7030; San Luis, Mo, EE.UU. El material es en bruto, «fraccionamiento inicial por choque termico», ya que las fracciones sin choque termico pueden contener inmunoglobulina serica activa que puede contribuir a la inhibicion de la adhesion.
Los sedimentos de levadura lavados anteriores se vuelven a suspender en volumenes de 2,5 ml de soluciones de ensayo, blanco o control y se mantienen a 37 °C durante 10 minutos antes del tratamiento. Cada 2,5 ml de volumen de ensayo, blanco o control (con levadura en suspension) se utiliza despues para volver a suspender un sedimento de BEC lavado anterior. Las suspensiones combinadas se incuban a continuacion con agitacion suave a 37 °C durante 60 minutos. El uso de una incubadora orbital a 50 rpm proporciona un entorno adecuado.
Despues de la incubacion, se anaden 2,5 ml de tampon de lactato de sodio 50 mM a pH 4,5 a cada una de las soluciones de ensayo mezcladas y se someten a un pulso de 5 segundos en un vortice de laboratorio. La finalidad de la disolucion final y del vortice es separar la levadura que se adhieren de forma debil y las celulas de levadura que estan situadas adyacentes, pero no unidas a las bEc. Puede ser necesaria una disolucion adicional para facilitar el recuento de la levadura adherente.
El ensayo se puede realizar como un pretratamiento de BEC invirtiendo el orden de resuspension descrito anteriormente. Las BEC se resuspendieron primero en volumenes de 2,5 ml de tampon de control, ensayo o protema en blanco, mantenidos a 37 °C durante 10 minutos y despues se utilizo para volver a suspender un sedimento de levadura lavada y el procedimiento se completo como se ha descrito anteriormente.
Ensayo del efecto microbicida/microbioestatico:
El ensayo es un ensayo de suspension microbiologico convencional, en el que las concentraciones conocidas de bacterias, levaduras u hongos en fase logantmica tardfa se inoculan en un volumen o peso fijo de una sustancia de ensayo, blanco o control. Despues de un penodo de tiempo establecido se anade una solucion neutralizante para detener el efecto antimicrobiano y la poblacion residual de microorganismos viables se enumera por disolucion en serie y placa de recuento. El procedimiento de recuento es un procedimiento microbiologico convencional y basico para enumerar microorganismos viables y es bien conocido por los expertos en la materia.
En su forma generica, el procedimiento requiere la inoculacion de 1 gramo o 1 ml de muestra de ensayo con 0,1 ml de 18 horas (fase logantmica tardfa) seguida de la agitacion vigorosa para mezclar. Despues de transcurrido el tiempo de exposicion predeterminado, se anaden 9 ml de tampon de neutralizacion y se mezclan. Esto tiene el efecto de detener el efecto microbicida que permite hacer estimaciones confiables del porcentaje de destruccion conseguido por una muestra de ensayo en concreto en el penodo comprendido entre la inoculacion y la neutralizacion. Normalmente, los penodos de exposicion oscilaran entre 30 segundos y 30 minutos y pueden progresar hasta varias horas cuando se requiere ese penodo de tiempo para medir el efecto. Con el fin de enumerar las celulas viables residuales y para calcular el porcentaje de destruccion, se realizan disoluciones en serie y recuentos de placas en la muestra de 10 ml mas tampon neutralizante.
En los ensayos de la presente invencion, las soluciones madre de bacterias, levaduras y hongos se almacenan sistematicamente en perlas en glicerol al 50 % a -80 °C. Cuando se requieren para el ensayo de
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viabilidad/microbicida, se esparcen pequenas alfcuotas de estas poblaciones sobre un agar nutritivo apropiado, se cultivan y subcultivan para asegurar la pureza. Cuando se requieren cultivos de caldo, se inoculan matraces de Erlenmeyer de 250 ml que contienen 100 ml de caldo con un bucle de transferencia desde cultivos de agar puro y se incuban con agitacion constante en una incubadora rotativa a 37 °C.
Las bacterias se cultivan sistematicamente usando caldo de infusion de corazon y cerebro (BHI) y agar o agar de triptona de soja o caldo (TSB), los cuales pueden adquirirse en el mercado en Oxoid, Reino Unido. El TSB tiene los siguientes constituyentes: triptona al 1,5% p/p (digestion pancreatica de casema), peptona al 0,5% p/p (digestion papaica de harina de soja), 0,5 % p/p de cloruro sodico y agar al 1,5 % p/p cuando se requiere como medio solido. Las levaduras se cultivan en agar o caldo YEPD (vease el procedimiento de ensayo de adhesion anteriormente en el presente documento).
Los tampones de disolucion y neutralizacion utilizados en el presente procedimiento son solucion salina tamponada con fosfato (PBS), que contiene cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM y fosfato 10 mM, a la que se le anade polisorbato Tween 80 al 3 % (tensioactivo anionico), 0,3 % de lecitina y 0,5% de histidina como agentes neutralizantes. Estos agentes "neutralizantes" son los prescritos por las Directrices de la UE para la certificacion ISO de la eficacia microbicida y se validaron como adecuados para neutralizar los acidos grasos libres y la clorhexidina a las concentraciones utilizadas en el presente documento.
Algunas especies microbianas son extremadamente diffciles de cultivar, requiriendo medios especializados y/o anaerobicos que no son facilmente alcanzables en cultivo lfquido. Clostridium difficile por ejemplo es un anaerobio y tambien aerointolerante, que muere rapidamente en presencia de oxfgeno. Los patogenos fungicos como las especies de Trychophyton crecen en modo hifas y no pueden ser enumerados usando el procedimiento convencional de disolucion en serie. Con el fin de evaluar el efecto microbicida de la invencion contra estas especies, se utilizaron tecnicas de disolucion en agar y se evaluo el cultivo en placa para encontrar la concentracion inhibitoria minima, es decir, la concentracion de producto por encima de la cual no se observo crecimiento.
La tecnica requiere la preparacion de concentraciones 10X de la formulacion de ensayo para la disolucion en 9 volumenes de agar. Se anadio una alfcuota de 4 ml de este concentrado 10X a 16 ml de agar esteril enfriado y se dispenso a una placa de Petri - esto representaba la formulacion de concentracion completa (100 %) en el medio de agar, que puede expresarse entonces como el porcentaje de concentracion de acido graso microbicida en agar. Otras disoluciones del concentrado 10X con agua destilada esteril y el uso de alfcuotas de 4 ml de estas disoluciones en 16 ml de agar enfriado permitieron la preparacion de una serie de concentraciones decrecientes del producto en agar. Los organismos de ensayo se inocularon sobre estos agares con un ciclo esteril y la concentracion inhibitoria minima se determino como la disolucion mas baja de la muestra en la que no se detecto crecimiento.
Inhibicion de la formacion de biopelicula:
La biopelicula es una fijacion y acrecion de bacterias planctonicas, levaduras y/u hongos a superficies solidas. La fijacion se facilita generalmente a traves de exopolisacaridos secretados por los microorganismos y los estudios sugieren que ocurre mas facilmente en superficies hidrofobas, tales como plastico, y menos facilmente en superficies hidrofilas tales como acero. La formacion de la biopelfculas es altamente significativa en la ciencia medica, particularmente su formacion en la superficie de los cateteres permanentes, donde puede ser la fuente de las infecciones relacionadas con el flujo sangumeo del cateter. Muchas especies microbianas diferentes son capaces de forma biopelicula, en medicina. Sin embargo, los de mayor importancia son Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudominas aeruginosa y la levadura, Candida albicans.
El modo de formacion de biopelicula utilizado en el presente documento se basa en el procedimiento de Christensen y col. J. Clin. Microbiol. 22: 996-1006, donde el crecimiento de un organismo seleccionado y su formacion de biopelicula en pocillos de placa de microtitulacion se mide mediante tincion con cristal violeta y medicion de la intensidad (densidad optica) de la biopelicula tenida en un lector de placa de microtitulacion a una longitud de onda de 570 nm. La intensidad de la tincion es una medida de la extension de la formacion de biopelicula y su reduccion en la presencia de sustancias inhibidoras se evalua en base a la reduccion de la intensidad de la tincion.
El organismo utilizado en este ensayo es Staphylococcus aureus RN4220, una variante de restriccion deficiente derivada originalmente de NCTC 8325 conocida por su avidez por la formacion de biopelicula, particularmente en presencia de niveles en exceso de cloruro de sodio que se anade al medio de cultivo para promover esta caractenstica, el medio de cultivo es 3,7 % de BHI de Oxoid Reino Unido al que se anade un 4 % de NaCl P/V.
Se recubren pocillos de placa de microtitulacion Nunc (Nunc International, Rosskilde, Dinamarca) con la muestra de ensayo y se dispensan a cada pocillo de ensayo disoluciones 1:100 de bacterias en fase logantmica tardfa en BHI suplementado con solucion salina fresca y se incuban durante 24 horas para facilitar la formacion de biopelicula.
Al finalizar el penodo de incubacion, los pocillos se aclaran tres veces con agua destilada esteril, y se secan durante una hora a 60 °C para fijar la biopelicula adherida. La tincion se consigue utilizando una solucion al 0,4 % de cristal violeta que se anade a cada pocillo y se agita la placa durante 4 minutos. El exceso de tinte se retira y las placas se aclaran tres veces con agua destilada esteril y se secan. Cuando se seca, la intensidad de la tincion en cada pocillo
se mide utilizando una placa ASYS Hitech UVM-340 a 570 nm (ASYS, Eugendorf, Alemania).
Manipulacion de la Hemostasia: Coagulacion/Anticoagulacion de la Sangre
La hemostasia es la capacidad inherente de la sangre para reaccionar a los danos traumaticos mediante la formacion de un coagulo para tapar la herida y asf prevenir la perdida excesiva de sangre y facilitar la reparacion de 5 tejidos y la curacion de la herida. La hemostasia tambien se refiere a la capacidad inherente de la sangre para permanecer ftquida en los vasos sangumeos no danados y cumplir asf sus funciones de transporte fisiologico primario. Ambos aspectos hemostaticos pueden volverse defectuosos en la enfermedad y ambos pueden desbordarse por dano traumatico, ya sea accidentalmente o por defecto durante la intervencion quirurgica.
La capacidad de manipular el mecanismo hemostatico amplificando la velocidad de coagulacion para prevenir la 10 perdida de sangre despues de un traumatismo accidental o prevenir la coagulacion durante la reparacion quirurgica y/o para prevenir la formacion de coagulos en instrumentos medicos insertados quirurgicamente incluyendo cateteres, es de gran importancia en medicina. Para medir la velocidad de coagulacion de la sangre en el presente documento, se utiliza un medidor de coagulacion de sangre entera, Hemochron Signature 11, fabricado por ITC, International Technidyne Corporation, Edison, NJ, EE.UU. El medidor utiliza cubetas personalizadas en las que se 15 puede anadir una gota de sangre fresca y el tiempo necesario para la formacion de coagulos se mide opticamente y se informa electronicamente por el dispositivo.
En el ensayo de la presente invencion, se uso sangre de oveja fresca, que se extrajo de una vena yugular usando un Aguja de calibre 18 y una jeringa de volumen adecuado. Las muestras de sangre frescas se mezclan inmediatamente con un volumen de material de ensayo a concentraciones variables y se inserta una gota en la 20 cubeta. Se usa solucion salina tamponada con fosfato esteril como blanco para obviar los efectos de la dilucion y se usa heparina como un anticoagulante de control. La medicion de los efectos anticoagulantes de los productos de la invencion es evidente en segundos en comparacion con la sangre entera no tratada, y se compara con el efecto anticoagulante de la heparina y otros productos anticoagulantes patentados. En una configuracion optima, los productos de la invencion consiguen un efecto anticoagulante que dura mas de 1000 segundos, que es comparable 25 a 5.000 U.I. de heparina en condiciones de ensayo similares.
La medicion del tiempo de coagulacion acelerado (coagulacion amplificada) no es posible usando el Hemocron como en la mayoffa de los casos los productos de la invencion alcanzan coagulacion en menos de 60 segundos, lo que esta "fuera de escala" para el medidor.
La medicion comparativa de los tiempos de coagulacion acelerados se consigue utilizando volumenes apropiados de 30 sangre fresca mezclada con un volumen de material de ensayo, donde los volumenes combinados totalizaron 5 ml en cada uno de los casos en un tubo de centfffuga Greiner graduado de 15 ml (Greiner Bio-one, Carolina del Norte, EE.UU.). Inmediatamente despues de la adicion de sangre fresca, los tubos se invierten dos veces para mezclar y se dejan reposar sin agitacion adicional. La formacion de coagulos es visible cuando los tubos estan ligeramente inclinados, y una vez que se formo un coagulo su integridad era tal que permaneceffa suspendido cuando los tubos 35 se inverffan. En cada ensayo se usa una muestra de 5 ml de sangre entera fresca (no diluida) como control.
Analisis del ffpido de membrana y del acido graso libre
La cromatograffa ftquida de alto rendimiento analftica habitual es un procedimiento adecuado para analizar los componentes lipfdicos de la membrana individual en una composicion tal como lecitina. El procedimiento es bien conocido por los expertos en la tecnica de la cromatograffa analftica. Se utiliza en el presente documento un sistema 40 Waters 2420 ELSD HPLC de Waters Corporation, Milford, Massachusetts, EE.UU. Una columna Symmetry C8 (3,0 X 150 mm, una columna de 5 micrometros es adecuada con un gradiente no lineal de metanol al 82 % en agua que contiene acido trifluoroacetico al 0,1 % y proporciona una separacion adecuada de los componentes de ftpido de membrana.
Viabilidad de celulas de mamifero.
45 La reduccion en la viabilidad de las celulas de mairftfero en presencia de acidos grasos libres emulsionados con ftpidos de membrana se evaluo utilizando linfocitos B de Raji cultivados en medio RPMI 1640 que contema suero fetal de ternera al 10% y suplemento antibiotico Gibco Penstrep 15140. Las celulas maduras se recogen por centrifugacion a 1.000 rpm durante 3 minutos y se vuelven a suspender en RPMI 1640 sin suplementos con fines de ensayo. La toxicidad se evalua con la absorcion de colorante azul de tripano por las celulas muertas utilizando un 50 contador Invitrogen Celi (Invitrogen inc., Carlsbad, California, EE.UU.). El procedimiento consiste en exponer una poblacion de celulas B Raji a la solucion de ensayo mezclando 100 pl de suspension de ensayo y de celulas en un pocillo de placa de microtitulacion. Despues de un peffodo de exposicion predeterminado, se combinan 10 pl de celulas y mezcla de ensayo con 10 pl de azul de tripano al 0,4 % y 10 pl de esto se anadieron a la camara de una cubeta citometro de celulas y se evaluaron en el contador de celulas descrito anteriormente. Los resultados se 55 proporcionan como un recuento total de celulas y los numeros de estas que estan vivas o muertas basandose en la absorcion o exclusion del colorante; se calcula automaticamente un porcentaje de viabilidad.
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Breve descripcion de los dibujos:
La figura 1 ilustra el efecto inhibidor antimicrobiano del suero sangumeo y la accion contraria de este efecto en combinacion con sales de acidos organicos, como se describe en el Ejemplo 3.
La figura 2 ilustra las propiedades de coagulacion sangumea y anticoagulacion de diversos componentes de un producto de acuerdo con la invencion, como se describe en el Ejemplo 5.
La figura 3 ilustra las propiedades anticoagulacion de una solucion de bloqueo de cateter de acuerdo con la invencion, como se describe en el Ejemplo 7.
La figura 4 ilustra la potencia microbicida comparativa de una solucion de bloqueo de cateter preparada de acuerdo con la invencion y se compara con productos comerciales alternativos, como se describe en el Ejemplo 7.
La figura 5 ilustra las propiedades inhibidoras de biopelfcula de un producto de acuerdo con la invencion, como se describe en el Ejemplo 8.
La figura 6 ilustra la liberacion variable de efecto microbicida conseguida usando diferentes lfpidos de membrana y productos de acido capnlico de acuerdo con la invencion, como se describe en el Ejemplo 9.
La figura 7 ilustra la reduccion en la viabilidad de Candida albicans en respuesta a la liberacion adaptada de las caractensticas de los productos de acuerdo con la invencion, como se describe en el Ejemplo 10.
La figura 8 ilustra la inhibicion de la adhesion de Candida albicans por productos de liberacion adaptados de acuerdo con la invencion, como se describe en el Ejemplo 10.
La figura 9 ilustra la erradicacion de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes de un modelo de herida ex vivo, como se describe en el Ejemplo 12.
La figura 10 es una comparacion de la eficacia ex vivo de un producto de la invencion en citrato de sodio con antimicrobianos de cuidado de heridas convencionales, clorhexidina y sulfadiazina de plata, como se describe en el Ejemplo 12.
La figura 11 ilustra la erradicacion comparativa de la biopelfcula establecida y la eficacia superior de un producto de la invencion sobre soluciones de bloqueo de cateter existentes disponibles en el mercado, como se describe en el Ejemplo 13.
Las aplicaciones y beneficios practicos de la presente invencion se ilustran adicionalmente en los siguientes Ejemplos. A menos que se indique lo contrario, los lfpidos de membrana usados en los Ejemplos se deslipidizan y contienen menos del 3 % de material lipfdico extrano conjugado como se muestra por analisis por HPLC como se describe en los Procedimientos.
Ejemplo 1: Preparacion de composiciones inhibidoras de adhesion de Kpidos de membrana
Los siguientes lfpidos de membrana se adquirieron de Sigma Aldrich, Poole, Dorset, Reino Unido.
Tabla 3: Lipidos de membrana
Lipido de la Membrana
Compuesto/Componente Fuente de origen Codigo
Fosfolfpido
Lecitina en bruto Soja LC
Fosfolfpido
Fosfatidilcolina Soja PTC
Fosfolfpido
Fosfatidiletanolamina Soja PTE
Fosfolfpido
Fosfatidilglicerol Soja PTG
Fosfolfpido
Fosfatidilinositol Soja PTI
Fosfolfpido
Fosfatidilserina Soja PTS
Esfingolfpido
Ceramida Cerebro Bovino C
Esfingolfpido
Esfingomielina Cerebro Bovino SGM
Glucoglicerolfpido
Diglicerido de mono-galactosilo Harina de trigo MGDG
Colesterol
Lanosterol Lana de oveja L
La lecitina en bruto se adquirio de GR Lane Ltd, Gioucester, Reino Unido.
Se prepararon dispersiones acuosas de cada uno de los Ifpidos de membrana anteriores suspendiendo 1,0 gramos en 100 ml de agua destilada esteril (10 mg/ml) y agitando durante 60 minutos con ayuda de un agitador magnetico. La dispersion de ceramida, esfingomielina y lanosterol se consiguio con la ayuda de ultrasonidos y agitacion, 5 mientras que la dispersion de todos los demas lfpidos de membrana se logro relativamente facil con agitacion. Las dispersiones de fosfolfpidos y glucoglicerolfpidos eran relativamente estables, pero otras teman una tendencia a separarse al reposar y por tanto todas las dispersiones se sometieron a 30 segundos de homogeneizacion utilizando un homogeneizador de laboratorio inmediatamente antes de su uso en el ensayo de inhibicion de la adhesion. Un homogeneizador adecuado es un Modelo Ultra-Turax T18 (IKA Works, Wilmington, NC 28405, EE.UU.) equipado 10 con una herramienta de dispersion S18N-19G, operando a 6000 a 8000 rpm.
Las propiedades inhibidoras de adhesion de cada fosfolfpido se sometieron a ensayo como se describe en los procedimientos a concentraciones de 10, 5 y 2,5 mg/ml; las diluciones mas bajas se consiguieron diluyendo la dispersion original con agua destilada esteril. Debido a las limitaciones logfsticas de la recogida de suficientes celulas epiteliales bucales en un momento dado, los ensayos se realizaron en bloques de cinco lfpidos de membrana 15 individuales en dfas separados, y los resultados que se muestran en la Tabla 4 son un material compuesto de estos; el control es la concentracion cero del artfculo de ensayo y la albumina serica bovina (BSA) se utiliza como blanco de protema.
Tabla 4 Candida albicans por cada 100 celulas epiteliales bucales
Codigo del artfculc
0 mg/m 2,5 mg/m 5,0 mg/m 10 mg/m % de inhibicion a 2,5 mg/m
LC
540 387 291 92 28
PTC
540 127 59 0 76
PTE
496 167 74 0 66
PTG
496 114 62 0 77
PTI
519 201 87 0 61
PTS
519 233 102 39 55
C
484 363 282 109 25
SGM
484 379 277 126 21
MGDG
540 261 128 66 51
L
519 306 236 133 41
BSA
496 400 379 303 19
En la evaluacion preliminar de la lecitina pura de diversas fuentes (yema de huevo, soja y girasol), se observo que las propiedades inhibidoras de la adhesion variaban considerablemente, a pesar de que la pureza reportada era 20 aproximadamente la misma. Se razono que el material comprado podna contener grasa extrana o triglicerido y para eliminar esto, el material original se suspendio en acetona al 10 % P/V y se agito durante 30 minutos, despues de lo cual se dejo sedimentar el lfpido de membrana insoluble y se decanto la acetona. La lecitina deslipidizada (DLL, por sus siglas en ingles) se seco en una campana extractora de humos y se evaluaron sus propiedades inhibidoras de adhesion como se ha descrito anteriormente. Los lfpidos de membrana restantes enumerados en la Tabla 4 se 25 deslipidizaron de la misma manera. Los lfpidos de membrana deslipidizados se analizaron por HPLC como se describe en los Procedimientos, y se mostro que todos conteman menos del 3 % material de lfpidos extranos conjugados Los resultados se muestran en la Tabla 5 a continuacion, incluyendo el aumento incremental en el efecto inhibidor de adhesion logrado por la deslipidizacion de lfpidos de membrana individuales.
5
10
15
20
25
Tabla 5: Candida albicans por cada 100 celulas epiteliales bucales
Codigo del artfculc
0 mg/m 2,5 mg/m 5,0 mg/m 10 mg/m % de inhibicion a 2,5 mg/m
LC
540 387 291 92 28
DLL
489 138 48 0 71 (+43)
PTC DL
508 132 0 0 84 (+8)
PTE DL
515 139 0 0 73 (+7)
PTG DL
474 57 0 0 88 (+11)
PTI DL
519 68 0 0 77 (+16)
PTS DL
519 145 62 0 72 (17)
C DL
493 305 118 41 38 (+13)
SGM DL
511 301 133 44 41 (+20)
MGDG DL
516 206 116 0 60 (+9)
DLL
536 247 91 49 54 (+13)
BSA DL
513 431 393 329 16 (-3)
La deslipidizacion por disolvente aumenta las propiedades inhibidoras de adhesion de los Kpidos de la membrana, especialmente de lecitina por un factor de 2,5, lo que la hace coincidir con la de sus componentes individuales: PTC, PTE, PTG, PTI y PTS. La deslipidizacion adicional de los componentes individuales de la lecitina consigue una mejora adicional en las propiedades inhibidoras de la adhesion de estos, aunque menos drastica en comparacion con el efecto conseguido en la deslipidizacion de la lecitina en bruto. Se supone en el presente documento que el procedimiento comercial de aislamiento utilizado para extraer componentes individuales de lecitina da lugar a una deslipidizacion casi completa, por tanto, el efecto inhibidor optimo de estos en relacion con la lecitina "en bruto" y el menor efecto incremental conseguido por la deslipidizacion adicional.
En muchas de las aplicaciones para el producto de la presente invencion, la sustancia inhibidora de la adhesion estara en contacto con suero sangumeo, moco y otros fluidos corporales. Se ha descubierto que las celulas deslipidizadas de lecitina y la mayona de sus constituyentes pierden sus propiedades inhibidoras de adhesion en presencia de Albumina serica bovina (BSA). Tambien se ha descubierto, sin embargo, que la adicion de una sal de acido organico contrarresta este efecto negativo y restaura la mayona de las propiedades inhibidoras de la adhesion al lfpido de membrana combinado y BSA.
En este ejemplo, se usaron soluciones de 100 mM de lactato sodico y citrato sodico. Las sales se prepararon primero como soluciones 200 mM y el pH se ajusto a 4,5, y se usaron alfcuotas de ambos para preparar soluciones al 1 % de albumina serica bovina (es decir, 1 % de BSA en 200 mM de sal sodica de citrato o lactato a pH 4,5). Las disoluciones salinas se utilizaron para diluir una suspension al 1 % de lecitina deslipidizada (DLL) y una suspension al 1 % de fosfatidilcolina (PTC), para conseguir preparaciones de DLL al 0,5% y PTC al 0,5% en lactato de sodio/citrato sodico 100 mM a pH 4,5 con BSA al 5 % en cada uno. Una dilucion adicional de la suspension lipfdica de la membrana al 0,5 % con agua y el uso de esta en diluciones a la mitad de solucion salina que contema BSA al 0,5% proporcionaron una composicion de lfpido de membrana al 0,25% en sal 100 mM con BSA al 0,25%. Se usaron procedimientos similares para preparar soluciones de BSA al 0,25 % y al 0,5 % en agua y en solucion de sal organica 100 mM: los resultados se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6: Candida albicans por cada 100 celulas epiteliales bucales
Codigo del artfculo
0 mg/ml 2,5 mg/ml 5,0 mg/ml 10 mg/ml % de inhibicion a 5 mg/ml
LC:agua
540 387 291 92 46
Tabla 6: Candida albicans por cada 100 celulas epiteliales bucales
Codigo del artfculo
0 mg/ml 2,5 mg/ml 5,0 mg/ml 10 mg/ml % de inhibicion a 5 mg/ml
DLL: agua
489 138 489 0 90
DLL + BSA agua
396 320 280 ND 30
DLL + BSA Citrato de sodio
396 290 144 ND 63
DLL + BSA Lactato de sodio
396 340 164 ND 58
PTC:agua
540 127 59 0 90
PTC + BSA Agua
474 392 344 ND 28
PTC + BSA Citrato de sodio
474 273 162 ND 66
PTC + BSA Lactato de sodio
474 291 138 ND 70
BSA Citrato de sodio
474 393 369 ND 22
BSA Lactato de sodio
474 408 372 ND 21
BSA: agua
496 438 400 362 12
En este ejemplo, con la excepcion de la lecitina en bruto, se demostro que todos los fosfoUpidos de membrana sometidos a ensayo tienen propiedades inhibidoras superiores que inhiben la adhesion de Candida albicans a celulas epiteliales bucales. Cuando se deslipidiza con acetona, la lecitina en bruto es tan inhibidora como sus 5 componentes de fosfolfpidos de membrana principales. En combinacion con albumina serica bovina, el inhibidor de adhesion se elimina, pero se puede restaurar en presencia de soluciones de 100 mM de sales de acidos organicos a pH acido.
Ejemplo 2:
Preparacion y ensayo de combinaciones microbicidas de lipido de membrana y acido graso libre:
10 El efecto microbicida del acido capnlico al 0,5 % en lecitina deslipidizada al 0,4 %, preparado como se describe en los Procedimientos, frente a una gama de especies microbianas puede demostrarse usando el ensayo de suspension microbicida descrito en los Procedimientos. La potencia de este material es tal que la erradicacion completa de un inoculo en exceso de 6 en escala logantmica se puede prever en menos de 6 minutos. Las especies gramnegativas son ligeramente mas resistentes que las grampositivas, particularmente aquellas conocidas como 15 productoras de limo, tales como Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens, donde se cree que la capa de limo protege del contacto con el acido graso durante algunos minutos adicionales.
La Tabla 7 a continuacion ilustra la reduccion en la viabilidad de una serie de bacterias y levaduras. Debido al hecho de que los inoculos vanan, el ultimo tiempo para alcanzar el 50 % de viabilidad del inoculo se proporciona en la ultima columna (U.T. 50 %), como medida comparativa de la potencia contra esa especie particular.
Tabla 7: Efecto microbicida: Caprilico al 0,5 % en DLL al 0,4 %
Tiempo de exposicion
Organismo
Gram 0 60 120 180 240 300 360 U.T.50%
Staph aureus RN4220
positivo 8,53 5,22 3,71 1,61 0 0 0 <120
Staph epidermidis NCTC 11047
positivo 8,27 4,96 2,67 0 0 0 0 <120
Strep pyogenes NCTC 8198
positivo 7,91 5,32 3,33 1,49 0 0 0 <120
StrepfaecalisNCTC 12697
positivo 8,11 4,98 2,54 1,66 0 0 0 <120
E. coli ATCC 11698
negativo 8,43 7,17 6,2 5,28 3,64 1,79 0 <240
Salmonella typhimurium NCTC 74
negativo 7,76 5,94 3,52 2,27 0 0 0 <120
Klebsiella aerogenes NCTC 9528
negativo 6,93 5,15 3,37 1,99 0 0 0 <120
A.C de Proteus mirabilis
negativo 7,41 6,61 5,89 3,75 1,59 0 0 <240
A.C de Enterobacter Cloacae
negativo 8,62 6,54 4,94 2,32 0 0 0 <180
Pseudomanas aeruginosa ATCC 27853
negativo 8,33 7,13 5,48 4,78 2,92 1,23 0 <240
Pseudomanas fluorescens NCTC 10038
negativo 7,29 6,42 5,13 3,63 1,29 0 0 <240
A.C de Candida albicans
Levadura 6,86 4,39 2,96 0 0 0 0 <120
Candida glabrata NCPF 8750
Levadura 6,74 4,19 2,23 0 0 0 0 <120
A.C de Crypto' neoformans
Levadura 5,97 4,11 2,96 0 0 0 <120
Nota A.C. = Aislado Clmico
Nota: U.T. 50 % es el ultimo tiempo para lograr una reduccion del 50 % en la viabilidad en este ensayo
Los datos numericos que se presentan son numeros logantmicos donde el numero entero es el logaritmo y el decimal el recuento de colonias en ese logaritmo: 6,3 X 105 por ejemplo se presenta como 5,63 y esta convencion se utilizara en todo este documento.
5 Por razones de dificultad en el cultivo o debido a requerimientos especiales de crecimiento, la potencia de la formulacion frente a anaerobios se determina mediante el procedimiento de Concentracion Inhibitoria Minima como se describe en los Procedimientos y los resultados se presentan en la Tabla 8.
Tabla 8: Concentracion Inhibitoria Minima del Caprilico al 0,5 % en DLL al 0,4 % contra anaerobios y patogenos fungicos usando la tecnica de dilucion en agar: El valor de CIM es el % de acido caprilico en la placa de ensayo
Organismo
Notas CIM
Clostridium perfringens ATCC 43150
Anaerobio gramnegativo > 0,1
Clostridium difficile ATCC 43598
Anaerobio gramnegativo (aero intolerante) > 0,1
Bacteroides fragilis ATCC 43859
Anaerobio obligado gramnegativo > 0,2
Fusobacteriumnucleatum NCTC 10652
Anaerobio gramnegativo: agar sangre de Columbia de 3 semanas > 0,3
Desulfovibrio desulfuricans
Anaerobio gramnegativo > 0,1
Porphyromonas gingivalis
Anaerobio obligado gramnegativo > 0,1
Tabla 8: Concentracion Inhibitoria Minima del Capnlico al 0,5 % en DLL al 0,4 % contra anaerobios y patogenos fungicos usando la tecnica de dilucion en agar: El valor de CIM es el % de acido capnlico en la placa de ensayo
Organismo
Notas CIM
Campylobacter jejunii
Microaerofilo gramnegativo > 0,075
Actinobacillus Actinomycetemcomitans
Microaerofilo gramnegativo > 0,1
Corynebacterium diphtheriae
Anaerobio facultativo grampositivo > 0,1
Treponema denticola
Anaerobio obligado > 0,2
Mycobacterium tuberculosis
Bacilo de acido aerobico rapido de 6 semanas en medio de Lowenstein-Jensen >0,2
Ejemplo 3: Antimicrobianos de lipidos de membrana en aplicaciones de contacto con sangre:
En comun con el efecto negativo sobre las propiedades inhibidoras de adhesion, indicado en el Ejemplo 1, la presencia de albumina serica bovina tambien afecta al efecto microbicida. Sin embargo como en el Ejemplo 1, esto 5 puede superarse mediante la incorporacion de una sal de acido organico, a pH acido.
En este ejemplo se usa una emulsion de aceite en agua de acido capnlico al 0,5 % en lecitina deslipidizada al 0,4 %. Las soluciones 200 mM de acidos glicolico, acetico, lactico y cftrico se ajustaron a pH 4,5 usando hidroxido de sodio 200 mM. Se prepararon soluciones al 10% P/V de Albumina serica bovina en cada una de las sales de acidos organicos y en agua como control. Se anadieron alfcuotas de 5 ml de la emulsion capnlica al 0,5 % a alfcuotas de 10 5 ml de cada solucion salina con y sin BSA y en agua con y sin BSA, dando como resultado dispersiones de
emulsion capnlica al 0,25% en lecitina deslipidizada al 0,2% dispersada en solucion salina 100 mM a pH 4,5 en cada muestra de ensayo.
Se selecciono E. coli para este Ejemplo, ya que se ha demostrado que es una de las especies mas resistentes. La bacteria se cultivo en caldo de Infusion de Corazon y Cerebro durante 18 horas a 37 °C. Se inocularon fracciones de 15 10 ml de cada muestra de ensayo en el tiempo cero con 1,1 ml del cultivo durante la noche, y se retiraron 1,0 ml de
las muestras a intervalos de 3 minutos para determinar la viabilidad de los residuos utilizando procedimientos de dilucion en serie y recuento de placas.
Tabla 9: El efecto antimicrobiano se altera por los componentes sanguineos y se restablece mediante la combinacion con sales de acidos organicos Capnlico al 0,25 % en Lecitina deslipidizada al 0,2 % +Albumina serica bovina al 1 - 5 %
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 tiempo de destruc cion
Agua
8,37 4,97 2,23 0 0 0 0 0 0 0 0 9
Agua + BSA
8,37 7,51 6,42 5,98 5,17 4,93 3,72 3,33 2,21 1,49 0 30
Glucolato
8,37 5,25 2,68 0 0 0 0 0 0 0 0 9
Glucolato + BSA
8,37 6,62 5,35 3,79 2,41 1,56 0 0 0 0 0 18
Acetato
8,37 5,94 4,21 1,28 0 0 0 0 0 0 0 12
Acetato + BSA
8,37 7,41 6,93 5,24 4,53 3,47 2,18 1,34 0 0 0 24
Citrato
8,37 4,9 2,7 0 0 0 0 0 0 0 0 12
Citrato + BSA
8,37 6,2 4,5 1,93 0 0 0 0 0 0 0 12
Lactato
8,37 5,29 3,19 0 0 0 0 0 0 0 0 9
Lactato + BSA
8,37 7,1 4,9 1,8 0 0 0 0 0 0 0 12
5
10
15
20
25
30
35
En un diluyente acuoso el efecto de la BSA al 5 % P/V es reducir la potencia del acido capnlico al 0,25 % por un factor de 3: el tiempo de destruccion se prolonga de 9 minutos a 27. En combinacion con sales de sodio 100 mM de acidos de citrato y lactato a pH 4,5, el tiempo de destruccion es de 12 minutos, el del glucolato es de 18 minutos y el del acetato es de 24. Los resultados de la combinacion con citrato y sales de acido de lactato con y sin BSA se presentan en la Tabla 9 anterior y se ilustran en la Figura 1.
Ejemplo 4: Uso en seguridad alimentaria
En este Ejemplo se contaminaron deliberadamente secciones de 1 cm3 de carne fresca con cultivos en fase logantmica de Salmonella enterica y Escherichia coli O157:H7 a temperatura ambiente y se dejaron adherir allf durante 60 minutos. La confirmacion de la contaminacion se obtuvo mecanicamente macerando las secciones de carne en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) esteril y enumerando por dilucion en serie y recuento de placas.
Se preparo un lavado de carcasa adecuado pero no optimo utilizando acido capnlico al 0,5 % en lecitina deslipidizada al 0,4 % y diluyendo X2 con citrato de sodio 200 mM a pH 4,5 como se describe en el Ejemplo 3. El lavado se pulverizo sobre secciones contaminadas de carne vacuna fresca, y el efecto antimicrobiano se evaluo por maceracion mecanica, dilucion en serie y recuento de placas. Los resultados se presentan en la tabla 10 a continuacion:
Tabla 10: Reduccion de la viabilidad de patogenos en la carne vacuna
Minutos
Escherichia coli Salmonella enterica
Sin tratamiento Tratada Sin tratamiento Tratada
0
7,14 6,96 6,91 6,61
30
6,98 5,61 6,37 4,59
60
6,56 3,89 6,71 7,73
90
6,82 2,19 6,52 1,29
120
6,69 ND 6,28 ND
Nota: ND = no detectado
Debe apreciarse que la velocidad de destruccion en una superficie porosa como la carne se prolonga debido a la naturaleza de la superficie y el tiempo requerido para permearla.
Ejemplo 5: Uso de lipidos de membrana para manipular el tiempo de coagulacion de la sangre:
Como se describe en este Ejemplo, los productos de lfpido de membrana usados pueden adaptarse para afectar a la velocidad de coagulacion de la sangre ademas de contribuir con un efecto antimicrobiano significativo.
La velocidad de coagulacion sangumea se determino usando sangre de oveja recien aspirada y un aparato y procedimientos descritos en la seccion Procedimientos. Se uso un medidor de coagulacion de sangre activado para medir los efectos anticoagulacion y una comparacion de tubo visual para evaluar tiempos de coagulacion reducidos.
Se descubrio inesperadamente que una dispersion acuosa de lecitina deslipidizada (DLL) amplificara la velocidad de coagulacion de la sangre de una manera dependiente de la concentracion. Se prepararon concentraciones variables de dispersiones de DLL suspendiendo el peso requerido en un volumen de agua, agitando durante 30 minutos para hidratar y homogeneizando la suspension con un homogeneizador de laboratorio.
La coagulacion de la sangre y/o los efectos anticoagulacion se evaluaron usando una proporcion del 20 % del producto de ensayo a sangre fresca: en la practica se anadieron 4,0 ml de sangre fresca de oveja a tubos que conteman 1,0 ml de producto de ensayo, se invirtieron dos veces mezclar y despues se dejaron en reposo para la evaluacion visual de la reduccion del tiempo de coagulacion o se aplico una sola gota a la cubeta de un aparato activado de coagulacion de la sangre para la evaluacion de efecto anticoagulante (tiempo prolongado para la formacion de coagulos).
A medida que aumenta la concentracion de DLL en el artmulo de ensayo, aumenta la velocidad observada de coagulacion sangumea, es decir, el tiempo de formacion de coagulos disminuye de 360 segundos para la sangre entera a aproximadamente 60 segundos o menos a concentraciones de DLL superiores al 1 %.
5
10
15
20
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45
50
55
La adicion de acido capnlico mediante emulsion en DLL tambien amplificara el efecto de coagulacion hasta un punto en el que la concentracion en peso es igual o ligeramente superior a la concentracion de DLL en peso. A DLL al 0,5% por sf sola, el tiempo de coagulacion es de aproximadamente 125 segundos. La adicion de acido capnlico emulsionado hasta un 0,5 % no afecta significativamente el tiempo de coagulacion. Entre el 0,5 % y el 0,75% de acido capnlico hay una depresion adicional del tiempo de coagulacion de 125 segundos a aproximadamente a 40 segundos (un 70 % menos). A continuacion, sin embargo, el efecto anticoagulante se invierte y el tiempo de coagulacion aumenta con la concentracion creciente de acido capnlico.
Cuando la concentracion de DLL se reduce al 0,25 % con una concentracion creciente de acido capnlico, no hay una reduccion significativa de la coagulacion por encima de la atribuible a la DLL por sf sola. De hecho, a medida que la concentracion de capnlico aumenta entre el 0,75% y el 1,0%, el tiempo de coagulacion se restablece a la normalidad (360 segundos). Aumentar adicionalmente la proporcion relativa de acido capnlico en DLL al 0,25 %, tiene un efecto anticoagulante.
Usando una emulsion de acido capnlico al 0,25% en DLL al 0,25% como patron (STD, del ingles standard), tambien se puede observar que la adicion de concentraciones crecientes de sales de citrato de sodio a pH 4,5 suprime el efecto anticoagulante de DLL en combinacion con acido capnlico. Con una concentracion del 0,5%, el efecto anticoagulante del acido capnlico al 0,25 % en DLL al 0,25 % se ha suprimido completamente y el tiempo de coagulacion se ha restablecido por encima de la normalidad (400 segundos). Un aumento adicional de citrato de sodio en esta composicion tiene un efecto anticoagulante progresivamente creciente - hasta 600 segundos en citrato sodico al 2 % en caprilato al 0,25 % emulsionado en DLL al 0,25 %. Los resultados se ilustran en la Figura 2.
Ejemplo 6: Uso de lipidos de membrana antimicrobianos en la coagulacion amplificada para el cuidado de heridas
La capacidad combinada antimicrobiana y de formacion de coagulos de los productos de la invencion se demuestra en este ejemplo. Puede seleccionarse un ejemplo adecuado de una preparacion de lfpidos de membrana antimicrobianos con propiedades de formacion de coagulos mejorados entre las combinaciones preparadas en el Ejemplo 3. Se uso en el presente documento una dispersion al 0,5% de DLL en agua destilada esteril con acido capnlico al 1,0%. Se observara que no se incluye ninguna sal de acido organico en este ejemplo y se observa ademas que la ausencia del mismo reduce la potencia antimicrobiana pero no limita el efecto de coagulacion. El uso de una carga de acido capnlico relativamente alta compensa la interferencia de los componentes sangumeos con el efecto antimicrobiano.
Se cultivo un inoculo bacteriano de E. coli en caldo de Infusion de Corazon y Cerebro durante 18 horas y se sedimento un volumen de 10 ml de este por centrifugacion a 4.000 rpm durante 10 minutos, el sedimento se suspendio en 1,0 ml del sobrenadante (concentracion X10).
Dos muestras de sangre fresca de 4,0 ml se dispensaron a dos tubos de centnfuga de 15 ml de Greiner y se inocularon ambos con 0,1 ml de suspension concentrada de E. coli, se inoculo al mismo tiempo una muestra de 5,0 ml de albumina serica bovina al 5 % en agua destilada esteril.
Un 1,0 ml de volumen de heparina 400 U.I. y estreptoquinasa 500 U.I. en agua se anadio al primer tubo, y 1,0 ml de preparacion de ensayo al segundo. Ambos tubos se mezclaron por inversion y se incubaron a 37 °C durante 45 minutos. El tubo que contema la preparacion de ensayo se coagulo en aproximadamente 60 segundos; no se detecto coagulo en el tubo de heparina/estreptoquinasa despues de 45 minutos.
Al final de la incubacion de 45 minutos, se anadio 1,0 ml de volumen de heparina 400 U.I. y estreptoquinasa 500 U.I. en agua al tubo coagulado con la preparacion de ensayo y se anadio 1,0 ml de agua destilada esteril al segundo. Ambas muestras se homogeneizaron a 1000 rpm durante 2 minutos utilizando un homogeneizador Ultra Turax. El procedimiento de interrupcion del coagulo duro aproximadamente 15 minutos (60 minutos de exposicion total), despues de lo cual se utilizaron procedimientos de disolucion en serie y recuento de placas para enumerar la viabilidad bacteriana residual en los tres tubos.
El blanco de BSA contema 6,4 x 107 celulas de E. coli viables por ml, la muestra de sangre de control (heparina/estreptoquinasa tratada) contema 8,3 x 105, y no se recuperaron bacterias viables de la muestra de ensayo.
Sera evidente para los expertos en la materia que preparaciones tales como las descritas en este Ejemplo pueden aplicarse a heridas en forma de un lfquido, pulverizacion, gel, polvo o vendaje humedo. Tambien sera evidente para los expertos en la materia que las preparaciones descritas pueden anadirse a otros procoagulantes tales como quitina, caolm o alginato para aumentar su efecto procoagulante y anadir un efecto microbicida.
Ejemplo 7: Uso de lipidos de membrana antimicrobianos con efecto anticoagulante en procedimientos quirurgicos:
El ingreso de agentes potencialmente infecciosos durante procedimientos quirurgicos es una causa de preocupacion de maxima importancia entre los profesionales de la salud. El uso de fluidos de irrigacion con efectos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
antimicrobianos facilita la prevencion de esto. Existen tambien muchos procedimientos quirurgicos en los que la capacidad para prevenir la coagulacion de la sangre es ventajosa, procedimientos de microcirugfa, por ejemplo, donde la coagulacion preventiva puede ser exacerbada por los implementos utilizados y donde el uso de una solucion de irrigacion para lavar sangre y fluidos corporales para evitar la oclusion del sitio es deseable. Una aplicacion especializada es el uso de anticoagulantes lfquidos para llenar el volumen vado de los cateteres permanentes durante los penodos en que el cateter no esta en uso.
En este ejemplo, se prepara una dispersion de lecitina deslipidizada (DLL) al 0,4 % con acido capnlico al 0,5 % en la misma, como se describe en los Procedimientos. La emulsion se diluye hasta el 50 % de su concentracion inicial con citrato de sodio 200 mM a pH 4,5, siendo el resultado acido capnlico al 0,25%, DLL al 0,2% en citrato sodico 100 mM o aproximadamente sal sodica al 2,5% P/V de acido dtrico a pH 4,5. El citrato sodico se prepara ajustando el pH de acido cftrico 200 mM con hidroxido sodico 200 mM a 4,5; esto no es lo mismo que el "citrato trisodico" que se usa habitualmente como un agente anticoagulante, porque no todos los residuos de acido carboxflico han precipitado por adicion de sal.
Como se ha descrito anteriormente, el uso de un agente potenciador de la viscosidad para ajustar la viscosidad de la formulacion para aproximarse a la de la sangre entera proporciona una ventaja distinta en la prevencion de la disolucion de una solucion de bloqueo del cateter en la punta del cateter debido a la turbulencia del flujo sangumeo. El dextrano 40 se usa en el presente documento como un agente potenciador de la viscosidad donde se ha encontrado que la inclusion al 20 % P/V proporciona una viscosidad de aproximadamente 4 cP, siendo la viscosidad de la sangre humana entre 3,6 y 6 cP.
La solucion emulsionada de bloqueo de cateter de acido graso libre/lfpido de membrana usada en el presente documento (ML CLS, del ingles membrane lipid catheter locking solution) tiene los siguientes constituyentes: lecitina deslipidizada al 0,2 % P/V; acido capnlico al 0,25%; dextrano 40 al 20 %, en citrato de sodio 100 nM (2,5 % P/V), pH 4,5. Se dispensaron alfcuotas de esta formulacion a tubos de centnfuga Greiner de 15 ml en las siguientes cantidades: cantidades de 0, 0,25, 0,5, 0,75 y 1,0 ml. A cada una de estas alfcuotas se les anadieron 5,0, 4,75, 4,5 y 4,25 ml de sangre de oveja fresca, respectivamente. Cada tubo se evaluo consecutivamente con sangre fresca anadida inmediatamente despues de ser aspirada. Las respectivas disoluciones en volumen representan el 0, el 5 %, el 10 %, el 15 % y el 20 % en volumen de sangre. Inmediatamente despues de la adicion de sangre, los tubos se invirtieron dos veces para mezclar y se anadio una sola gota al pocillo de ensayo de un medidor de coagulacion de sangre activado por firma de Hemochron.
Se adopto un procedimiento similar utilizando una solucion de 25.000 U.I. de heparina, que al 5 %, 10, 15 % y 20 % proporciono concentraciones de muestra de 1.250, 2.500, 3.750 y 5.000 unidades por ml de volumen de ensayo.
Tambien se sometieron a ensayo una solucion de bloqueo de cateter disponible en el mercado, Duralock de MedComp, que contema citrato de sodio al 47 % solamente y una composicion de azul de metileno al 0,05 %, metil parabenos al 0,15 % y propil parabenos al 0,015 % en citrato de sodio al 7 % (0,24 M), que es una replica de la formulacion informada para Zuragen; y Taurolock de Tauropharm AG que comprendfa Taurolidina al 1,35% en citrato de sodio al 4 % (vease la Tabla 2). Se uso solucion salina tamponada con fosfato (PBS) como control de dilucion.
Debe senalarse en el presente documento que el sistema de coagulacion sangumea de Hemochron se basa en un procedimiento de activacion de coagulos que acelera el tiempo de formacion de coagulos; la sangre entera sin aditivos se coagula en menos de 200 segundos en este aparato. Los tiempos en este experimento no son directamente comparables por tanto con los tiempos de coagulacion informados en el Ejemplo 5 donde el valor basal para el tiempo de coagulacion normal se muestra como 360 segundos siendo el tiempo observado para la coagulacion normal (no activada). Tambien hay que senalar en el presente documento que el medidor Hemochron se va 'fuera del intervalo' a 1.000 segundos de tiempo de coagulacion activada y no hay disponibles mas registros de tiempo prolongado.
Los resultados se notifican en la tabla 11 a continuacion y se ilustran en la figura 3.
Tabla 11: Tiempos de coagulacion de sangre activada para diversas soluciones de bloqueo de cateter
% de Incorporacion en sangre entera
0 % 5 % 10 % 15 % 20 %
ML CLS
159 347 537 769 1018
Heparina
159 284 423 601 1023
Duralock
159 300 364 484 722
Zuragen
159 219 265 394 614
5
10
15
20
25
Tabla 11: Tiempos de coagulacion de sangre activada para diversas soluciones de bloqueo de cateter
% de Incorporacion en sangre entera
Taurolock
159 230 310 380 510
Control de PBS
159 163 165 233 296
Nota 1: Las concentraciones de heparina oscilan entre 1.250 U.I. al 5 % y 5.000 U.I.
por ml al 20 %
En terminos de efecto anticoagulante medido, el producto de la invencion de este Ejemplo es mejor que 25.000 U.I. de Heparina y considerablemente mejor que Duralock, Zuragen o Taurolock. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que se trata de tiempos de coagulacion "activados". En la practica, ninguna de las muestras tratadas -aparte del control de PBS- mostraron ningun signo visual de coagulacion incluso despues de varias horas.
El efecto antimicrobiano de la formulacion en este Ejemplo se sometio a ensayo usando procedimientos similares a los usados en el Ejemplo 6, con la excepcion de que los agentes disruptores de coagulos, heparina y estreptoquinasa, se usaron para romper los coagulos en las sangres no tratadas de control.
Se concentraron cultivos de caldo de Infusion de Corazon Cerebro de Staphylococcus aureus, Streptococcus epidermidis, Escherichia coli de 18 h y un cultivo de Candida albicans de 18 horas cultivado en caldo de extracto de levadura Peptona Dextrosa, X10 mediante centrifugacion y se volvieron a suspender en un decimo de volumen de sobrenadante.
Se utilizaron alfcuotas de 2,5 ml de los concentrados bacterianos para inocular 22,5 ml de volumen de sangre de oveja recien aspirada, se mezclo y la sangre se dispenso como volumenes de 5,0 ml, 4,75 ml, 4,5 ml, 4,25 ml y 4,0 ml a tubos de centnfuga Greiner que conteman 0,25 ml, 0,5 ml, 0,75 ml y 1,0 ml de la formulacion de ensayo de este Ejemplo.
Los tubos inoculados se incubaron durante 45 minutos a 37 °C despues de lo cual se anadio 1,0 ml de volumen de heparina 400 U.I. y estreptoquinasa 500 U.I. en agua a todos los tubos y cada uno se sometio a homogeneizacion a velocidad lenta a 1.000 rpm durante 2 minutos: la unica coagulacion visible estaba en los tubos de control. Inmediatamente despues de que hubieran transcurrido 60 minutos, la disolucion en serie y los procedimientos de recuento de placas se utilizaron para evaluar la viabilidad residual en todas las muestras. Con fines comparativos, se repitio el mismo procedimiento con Taurolock, Duralock, Zuragen y Heparina a una carga de dosis maxima de 1,0 ml en 4,0 ml de sangre solamente. Los resultados se presentan en la Tabla 12 y se ilustran en la Figura 4.
Tabla 12: Efecto microbicida comparativo de soluciones de bloqueo del cateter en sangre entera
Escherichia coli Staphylococcus aureus Streptococcus epidermidis Candida albicans
Tiempo cero
7,69 8,71 8,12 6,67
Tiempo de blanco 60 min
8,19 8,9 8,51 6,33
ML CLS al 5%
4,83 3,62 4,17 3,9
ML CLS al 10%
2,58 1,44 1,97 0
ML CLS al 15%
1,62 0 0 0
ML CLS al 20%
0 0 0 0
Taurolock al 20%
6,53 4,15 4,72 5,72
Duralock al 20%
6,97 6,49 7,78 6,54
Zuragen al 20%
5,56 4,91 5,73 4,28
Heparina 25.000 U.I. al 20%
7,92 8,39 8,22 6,94
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
En este ensayo, el 20 % en volumen de ML CLS de acuerdo con la invencion consiguio la erradicacion completa de E. coli (8 en escala logantmica), Staph aureus (8 en escala logantmica), Strep epidermidis (8 en escala logantmica) y Candida albicans (6 en escala logantmica) en una hora en sangre entera: un volumen del 5 % logro una reduccion de aproximadamente 4 en escala logantmica de los inoculos de ensayo al mismo tiempo. De las cuatro preparaciones comparativas (Duralock, Taurolock, Zuragen o Heparina), solo Zuragen y Taurolock tuvieron un efecto microbicida apreciable logrando una reduccion de entre 3 y 4 en escala logantmica en la viabilidad del inoculo de ensayo en una hora; Duralock parece tener un efecto microbioestatico mientras que no pudo atribuirse ninguna inhibicion microbiana a la heparina.
Por lo tanto, la solucion de bloqueo de cateter anterior de acuerdo con la invencion presenta un mejor efecto de coagulacion y un efecto microbicida mucho mayor que los productos convencionales existentes.
Ejemplo 8: Uso de lipidos de membrana en el recubrimiento de superficies antimicrobiano:
Un procedimiento adecuado para aplicar un recubrimiento persistente de un producto de acuerdo con la invencion implica la emulsion de acido capnlico al 1 % en lecitina deslipidizada al 0,8 % preparada como se describe en los Procedimientos. Se anade a la emulsion un volumen equivalente de tampon citrato de sodio 100 mM pH 4,5 para obtener una concentracion final de acido capnlico al 0,5 %, lecitina deslipidizada al 0,4 % en citrato de sodio 50 mM. Despues se anaden lentamente ocho volumenes de etanol absoluto a dos volumenes de la emulsion con agitacion vigorosa constante para fabricar el material de recubrimiento en etanol al 80 %.
Con el fin de recubrir una superficie de plastico es de preferencia utilizar alguna forma de acondicionamiento superficial que pueda incluir un procedimiento conocido como la descarga corona en la que se genera un campo electrico a traves de la superficie que imparte una carga residual que facilita la adhesion del recubrimiento aplicado. Despues del tratamiento corona, la disolucion de etanol descrita anteriormente se pulveriza sobre la superficie y se seca en condiciones de aire forzado a 60 °C. Se pueden aplicar varias capas para construir una capa de recubrimiento antimicrobiano.
Puede aplicarse primero una capa base de lfpido de membrana a una superficie inerte, y una vez secada y recocida se utiliza para "anclar" una segunda capa de acido graso libre emulsionado con lfpido de membrana deslipidizado de acuerdo con la invencion.
En este Ejemplo se aplica una disolucion en disolvente organico de un lfpido de membrana a la superficie de un pocillo de placa de microtitulacion, se seca y se fija calentando a 60 °C seguido de una aplicacion adicional de una suspension acuosa de acido capnlico emulsionada en lecitina deslipidizada preparada como se describe en los Procedimientos. La emulsion de lecitina deslipidizada se seco y se recocio al primer recubrimiento de lecitina por calentamiento a 60 °C durante 3 horas. Las placas tratadas con lecitina deslipidizada, sin acido capnlico se usaron como control y se usaron placas no tratadas para determinar la formacion optima de biopelfcula.
Se preparo una capa base de lecitina deslipidizada (DLL) suspendiendo DLL al 5 % en peso en etanol al 80 %: agua y dispensando alfcuotas de 100 pl de esta a los pocillos de ensayo. Los pocillos para la determinacion de la biopelfcula optima se dejaron sin tratar. Las fracciones de etanol se secaron en una campana de humos y se recocieron a 60 °C durante una hora en un horno. Se preparo una dispersion al 1% P/V de lecitina deslipidizada en agua destilada esteril como se ha descrito en el Ejemplo 1, y se uso un volumen de esta para emulsionar acido capnlico al 0,25 %. Se transfirieron alfcuotas de 100 pl de DLL o DLL + capnlico al 0,25 %, a pocillos previamente recubiertos con DLL y se secaron en un horno a 60 °C durante 3 horas.
Un cultivo de 10 horas de Staphylococcus aureus RN 4220 cultivado en caldo de Infusion de Corazon y Cerebro (BHI), suplementado con cloruro sodico al 4 % se uso como inoculo. El cultivo en fase logantmica intermedia se diluyo al 1 % con BHI suplementado con cloruro de sodio fresco y 200 pl de este se anadieron a los pocillos de la placa de microtitulacion, se cubrieron y se incubaron.
En cada punto de muestreo, se transfirieron 100 pl de cada pocillo a una placa recien preparada para la evaluacion de crecimiento por densidad optica a 570 nm y la placa despues se decanto y se lavo con volumenes copiosos de agua destilada esteril, se seco y se recocio en un horno a 60 °C.
Cuando se seco, se anadieron 100 pl de cristal violeta al 0,4 % a cada pocillo, incluyendo controles no tratados. Despues de 4 minutos, se elimino el exceso de cristal y las placas se lavaron de nuevo con volumenes copiosos de agua para eliminar el exceso de colorante y se secaron de nuevo con la ayuda de un horno a 60 °C. Los resultados se presentan en la tabla 13 y se ilustran en la Figura 5.
TABLA 13: Inhibicion de la formacion de biopelfcula: cultivo de 24 horas
Densidad optica a 570 nm
Crecimiento de control
2,8
Crecimiento planctonico recubierto
2,4
5
10
15
20
25
30
TABLA 13: Inhibicion de la formacion de biopelicula: cultivo de 24 horas
Densidad optica a 570 nm
Biopelfcula no recubierta
0,9
Biopelfcula recubierta con DLL
0,7
DLL + biopelfcula inhibida por Cap
0,1
El crecimiento planctonico no recubierto no se ve afectado por el recubrimiento de DLL inhibidora + acido capnlico. Los pocillos recubiertos con DLL solo (biopelfcula revestida con DLL) estan ligeramente reducidos, pero en comparacion, los pocillos recubiertos con el producto de la presente invencion (DLL + Biopelfcula inhibida por Cap) estan esencialmente libres de cualquier biopelfcula: el recubrimiento por sf mismo capta algo del colorante cristal violeta lo que explica un pequeno aumento en la Densidad Optica en los pocillos de DLL + Cap.
Ejemplo 9: Uso de lipidos de membrana para lograr la liberacion sostenida de acidos grasos libres microbicidas
En aplicaciones terapeuticas se puede obtener una ventaja considerable del uso de combinaciones de emulsiones de lfpidos de membrana con caractensticas de liberacion "adaptadas", lo que facilita un efecto microbicida sostenido en la superficie epitelial.
En este Ejemplo se seleccionaron lfpidos de membrana individuales de cada una de las cuatro clases presentadas en la Tabla 1 y fueron los mismos que los usados en los estudios inhibidores de la adhesion en el Ejemplo 1. Se prepararon dispersiones acuosas al 0,4 % de cada uno y se emulsiono capnlico al 0,2 % en cada uno de los procedimientos descritos en los Procedimientos para la lecitina deslipidizada (DLL). Tambien se realizo una muestra de DLL al 0,4 % con capnlico al 0,2 %. Cada una de las preparaciones de lfpidos de membrana se diluyo hasta el 50 % de su volumen con citrato de sodio 200 mM a pH 4,5 y, por tanto, cada preparacion consistio entonces en acido capnlico al 0,1 % y lfpido de membrana al 0,2 % en citrato de sodio 100 mM a pH 4,5. Debe observarse en el presente documento que esto es menor que la mitad del contenido de acido capnlico microbicida del elemento de ensayo usado en el Ejemplo 3, Tabla 9.
Se uso la levadura Candida albicans en este Ejemplo, y el inoculo se preparo como un cultivo en caldo YEPD de 18 horas como se describe en los Procedimientos. El cultivo de fase logantmica tardfa se centrifugo a 4000 rpm durante 5 minutos y se volvio a suspender en un decimo de volumen de sobrenadante para concentrarlo X 10.
Se dispensaron muestras de 12,0 gramos de cada preparacion de ensayo a tubos de Sterilin y cada uno de ellos se inoculo con alfcuotas de 1,2 ml de cultivo de levadura concentrado. Se retiraron muestras de volumen 1,0 ml de estos tubos inoculados a intervalos temporizados durante el transcurso de una hora y se anadieron a 9,0 ml de tampon de dilucion que contema Tween 80 al 3 % para neutralizar. Se realizaron disoluciones en serie y el recuento de placas para enumerar la viabilidad residual como se describe en los Procedimientos. Los resultados se presentan en la Tabla 14 a continuacion e ilustran en la Figura 6.
Tabla 14:
Caractensticas de liberacion variable de los lipidos de membrana: tiempo de destruccion para > 6 en escala logaritica; Candida albicans
Minutos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Blanco
7,13 6,92 6,86 6,69 7,19 6,67 6,93 7,21 6,73 7,17 6,89 6,78 6,84
DLL
6,39 5,64 4,53 3,21 1,96 0
PTC
6,5 4,84 2,57 1,22 0 0
PTE
7,32 5,41 3,67 1,88 0
PTG
6,76 5,93 5,17 4,53 3,68 2,82 1,95 1,14 0
PTI
7,41 6,11 4,83 3,79 2,32 1,16 0
PTS
6,8 6,36 5,85 5,23 4,53 3,79 3,13 2,61 1,88 1,1 0
C
7,24 7,28 6,89 6,54 6,14 5,96 5,32 4,97 4,65 4,29 3,87 3,74 3,32
SGM
6,84 6,55 6,12 5,85 5,42 4,87 4,22 3,76 3,13 2,79 2,22 1,84 1,33
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tabla 14:
Caracteristicas de liberacion variable de los lipidos de membrana: tiempo de destruccion para > 6 en escala logaritica; Candida albicans
Minutos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
MGDG
7,3 6,66 6,1 5,16 4,34 3,32 1,84 0
L
7,39 6,45 5,86 5,34 4,78 4,21 3,67 2,98 2,33 1,74 1,17 0
Es evidente a partir de los resultados que las emulsiones de accion mas lentas son las de Ceramida y Esfingomielina seguidas de las de Lanosterol, Fosfatidilserina y Fosfatidilglicerol; las emulsiones de accion mas rapida son las de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y la combinacion de fosfolfpidos en lecitina deslipidizada (DLL).
Ejemplo 10: El uso de combinaciones de emulsiones de Kpidos de membrana antimicrobianos para fortificar el moco y conseguir un efecto microbicida "adaptado" en la superficie mucosa:
La fortificacion mucosa implica la hidratacion complementaria, la lubricacion y el efecto antimicrobiano potenciado de las secreciones mucosas del ojo, la nariz, la boca, las superficies nasofanngeas, el tracto gastrointestinal y los genitales. Este Ejemplo describe una preparacion adecuada para la fortificacion de las secreciones mucosas de la boca y la vagina y mas particularmente adecuada para su uso por individuos susceptibles a la candidiasis oral y/o vaginal recurrente) y a otras infecciones bacterianas y vmcas comunes que responden a los productos de la presente invencion.
Ejemplos de Fortificantes de Mucosa:
Parte A: Una emulsion de lfpidos de membrana de accion rapida de acido capnlico (Cap) se basa en Fosfatidilcolina (PTC) al 0,2 % P/V dispersada en agua destilada esteril, hidratada y homogeneizada como se describe en los Procedimientos y utilizada para emulsionar acido capnlico al 0,25 % P/V por el procedimiento descrito.
Parte B: Una emulsion de lfpido de membrana de accion lenta de acido capnlico (Cap) se basa en Esfingomielina (SGM) al 0,2 %, dispersada, hidratada y homogeneizada como se describe y despues utilizada para emulsionar acido capnlico al 0,25 % P/V como se describe en los procedimientos.
Parte C: Se ajusta una solucion 200 mM de acido cftrico a pH 4,5 con hidroxido sodico 200 mM. Se agranadeega un agente de aumento de la viscosidad basado en celulosa (hidroxipropilmetilcelulosa, Methocel E4M de Dow Gmbh, Alemania) al 1 % P/V: el polfmero se tamiza mientras se agita vigorosamente la solucion de citrato sodico y se deja hidratar durante 30 minutos.
Se preparo una preparacion de ensayo de PTC + acido capnlico (PTC + Cap) mezclando cantidades iguales de la Parte A y la Parte C, produciendo una emulsion de acido capnlico al 0,125 % con PTC al 0,1 % en citrato de sodio 100 mM que contiene Methocel al 0,5 % P/V.
Se preparo una preparacion de ensayo de acido SGM + capnlico (SGM + Cap) mezclando cantidades iguales de la parte B y la parte C, produciendo una emulsion de acido capnlico al 0,125 % con SGM al 0,1 % en citrato de sodio 100 mM que contema Methocel al 0,5 % P/V.
Se preparo una preparacion de combinacion de ensayo que comprendfa emulsiones de accion rapida y lenta mezclando PTC + Cap al 30 % con SGM + Cap al 70 % y combinandolo con un volumen igual de parte C (mezcla 30:70), La mezcla 30:70 es una emulsion de acido capnlico al 0,03% en PTC al 0,075% combinado con acido capnlico al 0,07 % en SGM al 0,0875 % en citrato de sodio 100 mM que contiene Methocel al 0,5 %.
Las propiedades microbicidas y de inhibicion de adhesion de las tres preparaciones de ensayo se evaluaron usando el ensayo convencional de viabilidad y de inhibicion de adhesion descrito en los Procedimientos. El inoculo para ambos ensayos fue un cultivo de caldo de Candida albicans de 18 horas, cultivado en medio YEPD y concentrado X 10 por centrifugacion y resuspension en un decimo volumen de sobrenadante.
Se dispensaron muestras de 12,0 gramos de cada preparacion de ensayo a tubos Sterilin y cada una de ellas se inoculo con alfcuotas de 1,2 ml de cultivo de levadura concentrado. Se retiraron muestras de volumen 1,0 ml de estos tubos inoculados a intervalos temporizados durante el transcurso de una hora y se anadieron a 9,0 ml de tampon de dilucion que contema Tween 80 al 3 % para neutralizar. Se realizaron disoluciones en serie y el recuento de placas para enumerar la viabilidad residual como se describe en los Procedimientos. Los resultados se presentan en la Tabla 15 y se ilustran en la Figura 7.
5
10
15
20
25
Tabla 15: Fortificacion mucosa: viabilidad de Candida albicans en preparaciones de liberacion adaptada
Minutos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Blanco
6,81 6,92 6,79 6,85 6,97 6,76 6,84 6,99 6,69 6,95 6,78 6,9
PTC + Cap
6,5 4,84 3,13 1,72 0
SGM + Cap
6,84 6,55 6,12 5,85 5,42 4,87 4,22 3,76 3,13 2,79 2,22 1,8 4
Mezcla 30:70
6,73 5,21 4,14 3,56 3,12 2,8 2,42 2,16 1,89 1,55 1,33 0,89
El PTC + Cap de accion rapida se comporto como se esperaba reduciendo la viabilidad a cero celulas detectables en 20 minutos. El SGM + Cap de actuacion lenta tambien fue como se esperaba, con la viabilidad reducida en 5 en escala logarftmica en 55 minutos. La mezcla 30:70 de combinacion proporciona un buen ejemplo de un perfil de liberacion adaptada, la viabilidad se redujo en mas de 2 en escala logarftmica en 10 minutos, una velocidad que era paralela a la de PTC + Cap de accion rapida, a partir de entonces la velocidad microbicida se ralentizo considerablemente, y se aproximo a la de la SGM + Cap de accion lenta. La mezcla, sin embargo, habfa logrado una reduccion de 1 en escala logarftmica en la viabilidad a los 55 minutos en comparacion con el SGM + Cap solamente.
La evaluacion de las propiedades inhibidoras de la adhesion de las tres preparaciones se realizo usando el modelo de ensayo de celulas epiteliales bucales descrito en los Procedimientos y utilizado en el Ejemplo 1. Para la comparacion, tambien se prepararon preparaciones de los dos ftpidos de membrana, PTC y SGM, al 0,1 % en tampon de citrato de sodio 100 mM pH 4,5 con Methocel al 0,5 % y se incluyeron en el procedimiento de ensayo.
Los sedimentos de celulas de levadura lavadas se volvieron a suspender en volumenes de 2,5 ml de las preparaciones de ensayo (PTC, PTC + Cap, SGM, SGM + Cap, mezcla 30:70 descrita anteriormente y blanco de BSA). Se uso citrato de sodio 100 mM a pH 4,5 para la determinacion de la adhesion de control. Despues de 10 minutos de pre-exposicion, las suspensiones de levadura se utilizaron para volver a suspender los sedimentos de celulas epiteliales bucales lavadas que se habfan recogido y preparado como se describe en los Procedimientos. La levadura y la celula epitelial bucal combinadas en el ensayo, el blanco o el control se incubaron con agitacion suave durante 60 minutos a 37 °C, despues de lo cual se utilizaron recuentos microscopicos directos usando un portaobjetos hemocitometro para enumerar el numero de levaduras adheridas a 100 celulas epiteliales bucales: Los resultados se presentan en la Tabla 16 y se ilustran en la Figura 8.
Tabla 16 Fortalecimiento de la mucosa: Inhibicion de la adhesion en Preparaciones de liberacion adaptada: Candida albicans a Celula Epitelial Bucal
Recuento/100 BEC % de adhesion % de inhibicion
Blanco
509 100 0
PTC
239 47 53
SGM
374 73 27
PTC + Cap
20 4 96
SGM + Cap
266 52 48
Mezcla 30:70
88 17 83
BSA al 0,5 %
425 83 17
Las propiedades inhibidoras de adhesion de PTC al 0,1 % por sf solo y con acido capnlico al 0,125% son considerablemente mejores que las de las preparaciones equivalentes de SGM: como era de esperar la mezcla 30:70 se encuentra a mitad de camino entre los dos.
A partir de los datos de la Tabla 16 tambien es evidente que el acido graso emulsionado tiene un efecto sinergico sobre las propiedades inhibidoras de la adhesion del ftpido de la membrana. El porcentaje de reduccion en la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
adherencia alcanzado con PTC solo (53 %), se reduce en un 43 % adicional en combinacion con acido capnlico.
Debe observarse que, de acuerdo con los datos de viabilidad de la Tabla 16 y como se ilustra en la Figura 7, ninguna de las celulas de levadura en PTC + Cap es viable despues de 20 minutos de exposicion y aproximadamente del 50 % al 60 % de las de las otras dos muestras estan muertos. Bajo el microscopio, sin embargo, las celulas de la levadura parecen estar intactas y aunque se han reducido enormemente hay todavfa unas pocas evidentes que se adhieren a las Celulas epiteliales bucales, lo que sugiere que las celulas muertas son capaces de adhesion y formacion de biopelfcula.
Ejemplo 11: El uso de lipidos de membrana en la antisepsia de la piel y la prevencion de la contaminacion cruzada en hospitales y establecimientos de atencion a pacientes:
Los procedimientos para evaluar los agentes antisepticos de la piel en formulaciones de lavado y gel estan bien establecidos y se describen completamente en los procedimientos oficiales de la UE para la certificacion ISO a tenor de EN 1500 (gel para manos) y EN 1499 (jabon lfquido).
En este Ejemplo, se uso la Escherichia coli relativamente no patogena K12 NCTC 10538 (The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd, Reino Unido: Catalogue of Type Strains ISBN N.° 09510269 3 3). La bacteria se cultiva de forma habitual y se mantiene en agar o caldo de triptona soja (TSB), que puede adquirirse en el mercado de Oxoid, Reino Unido y tiene los siguientes constituyentes: triptona al 1,5 % p/p (digestion pancreatica de casema), peptona al 0,5 % p/p (digestion papaica de la harina de soja), cloruro de sodio al 0,5 % P/P y agar al 1,5 % P/P cuando se requiere como medio solido.
Antes de la prueba, los voluntarios se lavan las manos con un jabon suave no antiseptico; un producto adecuado es E45 Emollient Wash Cream de Boots Healthcare, Reino Unido. Despues de lavar y secar, se sumergen las manos en un vaso de precipitados de 2 litros que contiene 1 litro de cultivo de E. coli de 24 horas en TSB y que contiene no menos de 2 x 108 celulas viables por ml como se confirmo mediante dilucion en serie y recuento de placas. Ambas manos se sumergen en la suspension contaminante hasta los metacarpianos medianos y se mantienen allf durante 5 segundos, y despues se retiran. Se deja escurrir el exceso de fluido contaminante y despues se secan al aire las manos en posicion horizontal durante 3 minutos.
Para asegurar una contaminacion adecuada y establecer un valor previo para enumerar la reduccion, las manos se muestrean sumergiendo las puntas de los dedos y el pulgar de cada mano en 10 ml de PBS esteril en una placa de Petri y se frota contra la base de la placa durante 1 minuto. Despues del muestreo, se tratan las manos con el producto de la presente invencion o Spirigel; se aplican 4 ml de cualquiera de las preparaciones a las manos y se manipulan sobre toda la superficie de ambas manos. Luego se aclaran las manos con agua corriente limpia (potable), que esta templada a aproximadamente 37 °C por un penodo de tiempo de 20 segundos. Despues del enjuague, las manos se mantienen en posicion vertical mientras un asistente seca las palmas y las munecas con una toalla de papel. Las puntas de los dedos y el pulgar se muestrean despues por inmersion en 10 ml de PBS como se ha descrito anteriormente.
Inmediatamente despues del muestreo, antes o despues del lavado, se transfirio asepticamente 1 ml del fluido de muestreo a la superficie de una placa de agar de tSb y se extiende sobre ella y se transfiere asepticamente otro 1 ml a 9 ml de pBs esteril y se mezclan y el procedimiento de disolucion en serie y recuento de placas transcurre como se ha descrito anteriormente.
Se preparo una preparacion de ensayo del producto de la presente invencion, que era una combinacion de acido capnlico en fosfatidilcolina al 30 % y acido capnlico en esfingomielina al 70 % preparado como se describe en los Procedimientos. En este ejemplo, los lfpidos de membrana se prepararon como concentrados al 1 % con acido capnlico al 1 % y se mezclaron a una relacion de 30:70.
Se emplea un agente potenciador de la viscosidad para mejorar la reologfa de la preparacion de ensayo. En ese caso se uso un copolfmero de Carbopol, Pemulen TR-1 de Noveon Inc, Cleveland Ohio, al 0,45 %. El polfmero se anadio a un volumen de etanol absoluto equivalente al 70 % del volumen de preparacion final y se dejo dispersar en el mismo durante 30 minutos. A continuacion se anadio un volumen del 30 % de mezcla 30:70 del producto de la presente invencion como se ha descrito anteriormente al etanol y el polfmero con agitacion constante para facilitar una rapida dispersion.
El producto de ensayo final contiene:
Acido capnlico al 0,045 % en Fosfatidilcolina al 0,045 %: Acido capnlico al 0,105 % en Esfingomielina al 0,105 %: Polfmero de carbopol al 0,45 %; agua al 29,25 %; etanol al 70 %.
Se informa que Spirigel contiene etanol al 70 %, agua al 30 % y una cantidad desconocida de agente potenciador de la viscosidad.
En este ejemplo, tanto el producto de ensayo como el Spirigel se usaron inmediatamente despues de la contaminacion experimental de las manos de los voluntarios para evaluar la descontaminacion y ambos se usaron
5
10
15
20
25
30
35
40
en manos recontaminadas experimentalmente 10 minutos despues de la aplicacion de Spirigel y la preparacion de ensayo de acuerdo con la invencion; los resultados se presentan en la Tabla 17.
Tabla 17: Efecto persistente de lipidos de membrana de liberacion adaptada en la antisepsia de la piel
Spirigel Artfculo de ensayo
Contaminacion previa al tratamiento
6,42 6,69
Contaminacion posterior al tratamiento, es decir, viabilidad residual
3,23 (-3,19) 3,42 (-3,27)
Aplicacion previa 10 min antes de la contaminacion (tratamiento 10 min antes de la contaminacion)
No aplicable No aplicable
Contaminacion: 10 min despues del tratamiento
6,42 6,59
Contaminacion: 10 min despues de la aplicacion, es decir, celulas viables recuperadas para la contaminacion 10 min despues de la aplicacion
5,97 2,67 (-3,3)
Como era de esperar del contenido de alcohol, cuando se usaron inmediatamente despues de la contaminacion ambos productos lograron reducciones de la contaminacion aplicada mayores de 3 en escala logarftmica. Cuando se uso en las manos 10 minutos antes de la contaminacion, sin embargo, el contenido de alcohol de ambos productos se habfa evaporado en el momento en que se aplico la contaminacion, y los resultados muestran que Spirigel no tuvo efecto residual significativo (reduccion de 0,45 en escala logarftmica). La naturaleza persistente de la emulsion de ftpido de membrana de acido graso todavfa estaba presente en las manos en el artfculo de ensayo, y alcanzo una reduccion de mas de 3 en escala logarftmica. El Spirigel tiene un efecto antimicrobiano inmediato pero no persistente, mientras que el artfculo de ensayo de acuerdo con la presente invencion tiene a la vez efectos microbicidas inmediatos y persistentes.
Ejemplo 12: Uso de emulsiones de lipidos de membrana en el cuidado de heridas
Para ilustrar la utilidad potencial del producto de la presente invencion en el cuidado de heridas se usa un modelo ex vivo que emplea secciones recien sacrificadas de pecho de ternera. El pecho tiene una distribucion optima de musculo magro, grasa y colageno y, por consiguiente, se considera que es representativa de todas las superficies potencialmente infectadas de la herida. Las secciones del pecho se cortan inmediatamente despues de la matanza, sin refrigeracion y con la membrana externa de la fascia, que se dividen en condiciones asepticas en cubos de aproximadamente 1 cm cuadrado. Los cubos preparados se "infectan" sumergiendolos en cultivos de bacterias en fase logarftmica tardfa durante un minuto, se secan y se suspenden en una muestra de 37 °C durante una hora para facilitar la adhesion bacteriana y la colonizacion de las superficies de la carne.
Un ejemplo adecuado de una formulacion para el cuidado de heridas es la "formulacion convencional" de la presente invencion (que contiene acido capnlico al 0,5 % en DLL al 0,4 %) diluida 1:1 en tampon citrato de sodio 200 mM a pH 4,5, que consiste entonces en acido capnlico al 0,25 % en DLL al 0,2 % en tampon de citrato sodico 100 mM a pH 4,5.
Las secciones de ensayo de carne infectada se tratan pulverizando la formulacion de cuidado de la herida directamente sobre la superficie infectada y evaluando las muestras de ensayo para determinar la biocarga residual a tiempos de exposicion predeterminados. La infeccion y su erradicacion se confirman por maceracion mecanica de las secciones tratadas y no tratadas en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) esteril y la enumeracion de la carga biologica mediante tecnicas microbiologicas convencionales de disolucion en serie y recuento de placas.
Los resultados tfpicos se presentan en la Figura 9, donde mas de 7 en escala logarftmica de las bacterias que habitualmente infectan heridas, Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes se muestran erradicados en menos de 120 minutos. Debe apreciarse que la velocidad de destruccion en una superficie fisurada tal como una herida se prolonga debido a la naturaleza de la superficie y al tiempo requerido para que la formulacion penetre en el asiento de la infeccion.
En la Figura 10 se presenta una comparacion de la potencia relativa de la formulacion convencional en tampon citrato como se ha indicado anteriormente con los antimicrobianos alternativos y comunmente usados, el gluconato de clorhexidina y la sulfadiazina de plata. A los 100 minutos de exposicion el producto de la presente invencion practicamente ha erradicado 7 en escala logarftmica de Staphylococcus aureus: 1 en escala logarftmica permanece bajo tratamiento con clorhexidina y 3,5 en escala logarftmica con sulfadiazina de plata.
Ejemplo 13
El uso quirurgico de los lipidos de membrana en la prevencion y la interrupcion de la biopelfcula
El Staphylococcus aureus RN4220 es conocido por su capacidad para formar una biopeftcula tenaz en condiciones de laboratorio cuando se cultiva con estres en presencia de cloruro de sodio. El microorganismo se cultivo hasta la fase logarftmica media (10 horas) en caldo de Infusion de Corazon y Cerebro y se utilizaron volumenes de 20
5
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15
20
25
30
35
40
45
microlitros para inocular pocillos de una placa de microtitulacion de 96 pocillos que contema 180 pl de BHI suplementado con cloruro de sodio al 4 %. Cuando se incuba a 37 °C en estas condiciones durante 6 horas se forma un biopelmula apreciable en la base de cada pocillo. La biopelmula se cuantifica decantando el cultivo y lavando los pocillos con agua destilada esteril, despues de lo cual las placas se secan y se tinen con cristal violeta al 0,4 %, se vuelven a lavar y se secan; la Densidad Optica de la biopelmula tenido se mide a 570 nm.
A partir de ejemplos anteriores estara claro que la incorporacion del producto emulsionado de lfpidos de membrana la presente invencion tendra un efecto microbicida, impidiendo el crecimiento y la formacion de la biopelmula. Como se ilustra en el presente documento donde ya existe biopelmula, sin embargo, el contacto con una emulsion de lfpido de membrana y acido graso libre matara con eficacia todas las bacterias viables en la biopelmula e interrumpira la pelmula por sf mismo.
La evaluacion de la reduccion de la viabilidad de una biopelfcula establecida preparada como se ha descrito anteriormente se obtuvo incorporando Alamar Blue al 10% en volumen en caldo BHI fresco y recargando los pocillos de una placa de microtitulacion de 96 pocillos con biopelmula preformada. El Alamar Blue es un indicador redox de Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido. Transmite un color azul intenso a los medios, y cuando se reduce por la actividad metabolica microbiana, el color cambia de azul no fluorescente a rojo altamente fluorescente; la absorcion y la fluorescencia emergente se pueden medir a 570 nm y 600 nm.
Los pocillos de placa de microtitulacion que conteman biopelfcula preformada se trataron con la CLS de lfpido de membrana (ML CLS) utilizado en el Ejemplo 7 y los pocillos similares tambien se trataron con Zuragen, Duralock y Taurosept durante penodos de tiempo que iban desde cero a 60 minutos. Al final de cada penodo de exposicion, las placas se decantaron y lavaron una vez con solucion salina tamponada con fosfato que contema Tween 80 al 3 % y dos veces con agua destilada esteril. Se anadieron 200 pl de bHi que contema Alamar Blue al 10 % a los pocillos y las placas se incubaron durante 60 minutos. No hubo cambio de color detectable en ninguno de los pocillos tratados con la CLS de lfpido de membrana de la presente invencion que indica la erradicacion completa de la viabilidad dentro del biopelmula en menos de una hora. Todos los pocillos tratados con Zuragen, Duralock o Taurosept habfan cambiado de azul a rojo demostrando poca o ninguna reduccion en la viabilidad en el biopelmula establecido. La eficacia de la CLS de lfpido de membrana de la presente invencion y la ineficacia comparable de las otras tres formulaciones en la reduccion de la cantidad real de biopelfcula preformada se pueden demostrar usando procedimientos similares.
Se trataron pocillos de placa de microtitulacion que conteman biopelmula preformada con las cuatro formulaciones durante penodos de tiempo de cero a 60 minutos, se decantaron y se lavaron como se ha descrito anteriormente. Las placas tratadas se secaron y se tineron con cristal violeta al 0,4 %, se secaron y se registro la intensidad de la tincion como una medida de la biopelfcula residual a 570 nm. Los resultados se ilustran en la Figura 11, en la que es evidente que aunque se ha conseguido cierta reduccion en la biopelmula con Zuragen, Duralock y Taurosept, no tiene importancia en comparacion con la erradicacion casi total de la biopelmula obtenida con la CLS de lfpido de membrana (ML CLS) de la presente invencion.
Ejemplo 14
Propiedades inhibidoras de la adhesion comparativa
La lecitina deslipidizada es una sustancia inhibidora de la adhesion mas potente en comparacion con las apoprotemas del suero de leche del documento WO 03/018049, en el que las apoprotemas se general mediante hidrolisis por lipasa de protemas de suero de leche. Para la comparacion inhibidora de la adhesion, se preparo un hidrolizado de protema de suero de leche como se describe en el documento WO 03/018049 usando concentrado de protema de suero de leche Carbelac 80. Tambien se probo simultaneamente un aislado de protema de suero de leche (Provon 190 de Glanbia PLC). Con fines de comparacion completa se preparo una formulacion de acido capnlico al 0,5 % P/V en lecitina desnitrificada al 0,4 % P/V en citrato de sodio 100 mM, pH 4,5, como se describe en los Procedimientos y se incluyo en la secuencia de ensayo. Todos los artmulos de ensayo se dispersaron en tampon de lactato de sodio 100 mM a pH 4,5. Los resultados se presentan en la tabla a continuacion.
Tabla 18 Candida albicans por cada 100 celulas epiteliales bucales
0 mg/ml 2,5 mg/ml 5,0 mg/ml 10 mg/ml 15 mg/ml % de inhibicion a 5mg/ml
Carbelac 80
483 395 320 260 189 33
Provon 190
514 313 277 113 53 46
Digestion por lipasa de Carbelac 80
491 330 154 48 0 68
Lecitina deslipidizada (DLL)
504 130 33 0 0 93
Tabla 18 Candida albicans por cada 100 celulas epiteliales bucales
0 mg/ml 2,5 mg/ml 5,0 mg/ml 10 mg/ml 15 mg/ml % de inhibicion a 5mg/ml
Capnlico al 0,5 % en DLL al 0,4 %
517 46 0 0 0 100
Aunque la lecitina deslipidizada por sf misma es significativamente mejor que la preparacion basada en tres lacteos, la combinacion emulsionada de lecitina deslipidizada y acido capnlico es la mas potente.
Ejemplo 15: Efecto microbicida comparativo
5 La CIM por la tecnica de disolucion en agar tambien se utiliza en el presente documento para demostrar la potencia superior de la "formulacion convencional" descrita anteriormente sobre el producto desvelado en el documento WO2009/072097 que comprende una mezcla de acidos grasos libres emulsionados en el aislado de protema de suero de leche, Provon 190 de Glanbia PLC. El producto del documento WO2009/072097 contiene un 28 % en peso de mezcla de acidos grasos libres, mientras que la formulacion convencional de la presente invencion contiene solo 10 el 0,5% en peso. Con el fin de hacer una comparacion adecuada entre los dos productos, el producto del documento WO2009/072097 se diluyo a 5/28 en agua destilada esteril para obtener una dispersion que comprendfa un 5,0 % de acido graso libre que despues se diluyo adicionalmente y se uso para preparar placas de agar que vanan del 1,0 % de acido graso libre al 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,075 % 0,05 % y 0,025 % (de contenido en acidos grasos).
15 Para una comparacion adicional, se construyo una emulsion usando acido capnlico al 0,5 % en Provon 190 al 0,4 % usando el agente de emulsion del documento WO2009/072097 en lugar de lecitina deslipidizada. Los resultados se muestran en la Tabla 19 a continuacion.
Tabla 19 Valores comparativos de CIM
Organismo de ensayo
Producto del documento WO/2009/072097 Capnlico al 0,5 % en Provon 190 al 0,4 % Formulacion de la invencion que contiene acido capnlico al 0,5 % en DLL al 0,4 %
Staph aureus RN4220
> 0,4 % > 0,7 % > 0,1 %
Staph epidermidis NCTC 11047
> 0,4 % > 0,7 % > 0,1 %
Strep pyogenes NCTC 8198
> 0,4 % > 0,7 % > 0,075 %
Strep faecalis NCTC 12697
> 0,4 % > 0,7 % > 0,075 %
E. coli ATCC 11698
>1,0 % >1,0 % > 0,4 %
Salmonella typhimurium NCTC 74
> 0,8 % > 0,8 % > 0,3 %
Pseudomanas aeruginosa ATCC 27853
>1,0 % >1,0 % > 0,5%
Pseudomanas fluorescens NCTC 10038
>1,0 % >1,0 % > 0,5%
A.C. de Candida albicans
> 0,4 % > 0,7 % > 0,075 %
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 19 Valores comparativos de CIM
Organismo de ensayo
Producto del documento WO/2009/072097 Capnlico al 0,5 % en Provon 190 al 0,4 % Formulacion de la invencion que contiene acido capnlico al 0,5 % en DLL al 0,4 %
Candida glabrata NCPF 8750
> 0,4 % > 0,7 % > 0,1 %
Para los dos estafilococos, los dos estreptococos y la Candida sp, la CIM medida para la formulacion convencional es un cuarto o menos que la del producto del documento WO2009/072097, lo que indica una potencia cuatro veces mayor. En el caso de las dos Pseudomonas sp, E. coli y Salmonella, la CIM medida es de una mitad a un tercio menos que la del producto del documento WO2009/072097 demostrando nuevamente claramente una potencia significativamente mayor. Las CIM medidas para la emulsion de acido capnlico en Provon 190 son significativamente mayores (significativamente menos potentes) que la formulacion convencional de la presente invencion.
Ejemplo 16
Efecto comparativo microbicida e inhibidor de la adhesion de diferentes acidos grasos libres en forma tanto emulsionada como libre
Los acidos grasos en forma libre (no emulsionados) tienen un efecto microbicida relativamente pequeno principalmente debido a su insolubilidad en medio acuoso. La emulsion en lfpidos de membrana como se describe en este documento expande el area superficial relativa del acido graso y facilita su dispersion en medio acuoso. El agente de emulsion de lfpidos de membrana tambien facilita el contacto y la transferencia del acido graso a una superficie celular microbiana. Como se ilustra en los Ejemplos anteriores, la lipofilia variable entre diferentes lfpidos de membrana afecta a la velocidad del efecto microbicida. En general, los lfpidos de membrana son agentes de emulsion superiores, que presentan un efecto microbicida superior como se ha demostrado en el Ejemplo 15. Como se demuestra en el presente documento la potencia superior del acido graso libre emulsionado con lfpidos de membrana se extiende a traves de una gama de acidos grasos microbicidas.
Se prepararon siete emulsiones separadas de siete acidos grasos libres diferentes al 0,5 % P/V en lecitina desnitrificada al 0,4 % P/V como se describe en los procedimientos. Se prepararon emulsiones a temperaturas por encima de los puntos de fusion de los acidos grasos libres individuales: caproico, capnlico y pelargonico a temperatura ambiente (20 °C); caprico y undecilenico a 37 °C, el acido laurico se emulsiono a 50 °C y minstico a 60 °C. Una mezcla de un 50 % de acido caproico y un 50 % de acido laurico tiene un punto de fusion de menos de 28 °C al igual que una mezcla de acido laurico al 40 % en aceite de balsamo de limon, y estos se emulsionaron a 37 °C.
Se evaluo el efecto microbicida comparativo de cada acido graso individual y su mezcla en forma libre no emulsionada y emulsionada en lecitina deslipidizada usando la prueba de suspension microbicida descrita en los procedimientos. La evaluacion del efecto microbicida de los acidos grasos libres no emulsionados se ve frustrada por su insolubilidad. La inclusion de la forma no emulsionada se considero necesaria para ilustrar el incremento exponencial de la potencia en la forma emulsionada. Cada acido graso libre se preparo al 0,5 % P/V en agua y se agito vigorosamente para dispersar seguido del pipeteado inmediato de alfcuotas de 1,0 ml a los contenedores de ensayo, antes de la inoculacion con el organismo de ensayo. El organismo de ensayo fue Staphylococcus aureus RN 4220 cultivado hasta la fase logantmica tardfa en el caldo de Infusion de Corazon y Cerebro. Los resultados se presentan en la tabla a continuacion.
Tabla 20: Efecto microbicida comparativo
Acidos grasos libres o mezclas de los mismos al 0,5 % P/V no emulsionados en el ensayo y al 0,5 % P/V emulsionados en lecitina deslipidizada al 0,4 % P/V en el ensayo.
Tiempo de Exposicion en Segundos a los 37 °C
Acido graso o mezcla
0 60 120 180 240 300 360
Acido caproico libre
7,87 7,17 6,82 7,57 6,93 6,47 6,73
Acido caproico emulsionado
7,87 6,21 4,89 2,53 0 0 0
Tabla 20: Efecto microbicida comparativo Acidos grasos libres o mezclas de los mismos al 0,5 % P/V no emulsionados en el ensayo y al 0,5 % P/V emulsionados en lecitina deslipidizada al 0,4 % P/V en el ensayo.
Tiempo de Exposicion en Segundos a los 37 °C
Acido capnlico libre
6,94 6,79 6,83 6,21 6,33 5,89 6,17
Acido capnlico emulsionado
6,94 5,32 3,71 0 0 0 0
Acido pelargonico libre
6,94 6,55 6,31 5,96 5,67 5,83 5,27
Acido pelargonico emulsionado
6,94 4,63 2,99 1,81 0 0 0
Acido caprico libre
6,94 6,32 6,48 6,73 6,36 5,97 6,11
Acido caprico emulsionado
6,94 4,79 3,44 2,19 0
Acido undecilenico libre
7,87 7,19 6,99 6,57 6,83 6,67 6,31
Acido undecilenico emulsionado
7,87 4,97 2,69 0 0 0 0
Acido laurico libre
7,87 7,35 7,77 7,41 7,98 7,23 7,65
Acido laurico emulsionado
7,87 5,79 4,63 3,86 2,55 0 0
Acido minstico libre
7,38 7,27 7,84 6,93 7,11 6,26 6,84
Acido minstico emulsionado
7,38 6,46 5,81 5,21 4,98 3,69 2,99
laurico caproico Libre 50:50
7,38 6,99 7,18 6,74 6,37 6,95 6,81
Laurico:caproico emulsionado
7,38 6,76 5,32 3,17 2,98 0 0
Laurico al 40 % en aceite de balsamo de limon
7,38 7,21 7,76 7,39 6,95 6,87 6,49
Laurico al 40 % emulsionado en Aceite de balsamo de limon
7,38 5,92 3,13 2,77 0 0 0
Lecitina deslipidizada al 0,4 % P/V
7,33 7,92 7,41 6,83 7,14 7,66 6,95
Se realizaron determinaciones en blanco en todos los ensayos suspendiendo el inoculo en solucion salina tamponada con fosfato a 37 °C y no se detecto ninguna reduccion en la viabilidad del inoculo durante el penodo de exposicion de seis minutos en ninguna secuencia de ensayo.
Los acidos grasos libres en forma no emulsionada consiguen en el mejor de los casos una reduccion de 1 en escala logantmica en la viabilidad durante el penodo de ensayo de 6 minutos. El agente emulsionante lip^dico de la membrana (lecitina deslipidizada) ejerce igualmente poco o ningun efecto microbicida. En comparacion, con la 5 excepcion del acido minstico emulsionado, las emulsiones equivalentes en peso de todos los otros acidos grasos y mezclas de los mismos en lecitina deslipidizada reducen la viabilidad residual en un inoculo de ensayo de 6,94 a 7,87 en escala logantmica a cero en menos de 4 minutos.
Ni los acidos grasos libres por sf solos ni el lfpido de membrana deslipidizado por sf mismo tienen ningun efecto microbicida detectable dentro del marco temporal del presente ensayo. Una combinacion emulsionada de los dos 10 permite el efecto microbicida del acido graso sinergicamente.
Los mismos elementos de ensayo utilizados en la evaluacion microbicida anterior se sometieron a ensayo tambien para determinar sus propiedades inhibidoras de la adhesion usando el ensayo de celulas epiteliales bucales descrito en los Procedimientos.
Tabla 21: Efecto inhibidor de la adhesion comparativo
Acidos grasos libres o mezclas de los mismos al 0,5 % P/V no emulsionados en el ensayo y al 0,5 % P/V emulsionado en lecitina deslipidizada al 0,4 % P/V en el ensayo.
Acido graso o mezcla
Recuento del blanco/100 BEC Recuento del ensayo/100 BEC % de adhesion % de inhibicion
Acido caproico libre
429 380 89 11
Acido caproico emulsionado
503 0 0 100
Acido capnlico libre
429 400 93 7
Acido capnlico emulsionado
503 0 0 100
Acido pelargonico libre
429 360 84 16
Acido pelargonico emulsionado
503 2 0,3 99,7
Acido caprico libre
429 386 90 10
Acido caprico emulsionado
503 0 0 100
Acido undecilenico libre
521 448 86 14
Acido undecilenico emulsionado
508 0 0 100
Acido laurico libre
474 450 95 5
Acido laurico emulsionado
508 56 11 89
Acido minstico libre
474 436 92 8
Acido minstico emulsionado
508 68 13 87
laurico caproico Libre 50:50
474 450 95 5
Laurico:caproico emulsionado
508 0 0 100
Laurico al 40 % en aceite de balsamo de limon
526 460 87 13
Laurico al 40 % emulsionado en Aceite de balsamo de limon
526 0 0 100
Lecitina deslipidizada al 0,4 % P/V
497 96 19 81
La lecitina deslipidizada por sf sola en el ensayo alcanza un 81 % de inhibicion de la adhesion. Las emulsiones caproicas, capnlicas, pelargonicas, caprasicas y undecilenicas logran una inhibicion superior al 99 %, y las emulsiones de acido laurico y minstico alcanzan una inhibicion superior al 86 %. Todos los acidos grasos libres no emulsionados alcanzan menos del 17% de inhibicion. El efecto inhibidor de la adhesion del acido capnlico, por 5 ejemplo, se amplifica por un factor de 14 en forma emulsionada.
A las concentraciones del producto de ensayo utilizado en la Tabla 21, el efecto inhibidor de la adhesion esta esencialmente inundado por el efecto microbicida intnnseco. Se ha demostrado que la mayona de las celulas microbianas estaran muertas como resultado de la exposicion al efecto microbicida del acido graso emulsionado, y debe suponerse que esto influira en la adhesion.
10 Se puede obtener una medida mas apropiada del efecto inhibidor de adhesion amplificado atribuible a emulsiones frente a lfpidos de membrana de acidos libres o no emulsionados usando una concentracion por debajo de la Concentracion Inhibitoria Minima (CIM) del acido graso libre emulsionado. La CIM del acido capnlico en la formulacion de la presente invencion es mayor del 0,1 %.
Una formulacion de capnlico al 0,5 % en lecitina deslipidizada al 0,4 % (como se ha utilizado anteriormente) se 15 diluye en un factor de 5 en agua destilada esteril para conseguir una concentracion de capnlico al 0,1 % en lecitina deslipidizada al 0,08 % y se diluye adicionalmente a la mitad para conseguir capnlico al 0,05 % en DLL al 0,04 %. Estas disoluciones junto con las mismas concentraciones de DLL y acido capnlico libre no emulsionado se sometieron a ensayo en el ensayo de celulas epiteliales bucales como anteriormente. Los resultados se presentan
5
10
15
20
25
en la Tabla 22.
Tabla 22: Efecto inhibidor de la adhesion a dosis baja Acido capnlico al 0,1 % P/V y al 0,05 % P/V no emulsionado en el ensayo y al 0,1 % P/V y al 0,05 % P/V emulsionado en DLL al 0,08 % P/V y al 0,04 % P/V respectivamente en el ensayo, junto con DLL no emulsionada al 0,08 % y al 0,04 %.
Recuento del blanco/100 BEC Recuento del ensayo/100 BEC % de adhesion % de inhibicion
Acido capnlico libre al 0,1 %
489 466 95 5
Acido capnlico libre al 0,05 %
487 459 94 6
DLL al 0,08 %
533 421 85 15
DLL al 0,04 %
509 453 87 13
Capnlico al 0,1 % en DLL al 0,08 %
499 255 51 49
Capnlico al 0,05 % en DLL al 0,04 %
513 303 59 41
Como se ilustra en la Tabla 22, la adicion de acido capnlico a concentraciones por debajo de su CIM (0,1 % y 0,05 %) amplifica el efecto inhibidor de la adhesion de la DLL al 0,08 % y la DLL al 0,04 % en mas de un factor de tres en ambos casos.
Ejemplo 17: Reduccion del efecto antagonista en celulas de mamiferos
Las membranas celulares de mamHferos son susceptibles a la alteracion por los acidos grasos libres de una manera no distil a su efecto sobre las membranas celulares microbianas. El efecto no es la toxicidad celular clasica ya que se relaciona con dano superficial celular y no interfiere con el proceso metabolico o la replicacion de acidos nucleicos. Mejora significativamente por los fluidos corporales en vivo. La proteccion contra el dano de la membrana celular de mairnfero puede aumentarse anadiendo cantidades adicionales de lfpido de membrana libre a una emulsion de lfpido de membrana de un acido graso libre. El efecto protector no se limita al uso de lfpidos de membrana. Como se ilustra en el presente documento, el aislado de protema de suero de suero de leche tambien sirve como una barrera adecuada, aunque no optima, contra el dano de celulas de mamnfero.
El artmulo de ensayo es una emulsion de acido capnlico al 0,5 % en lecitina deslipidizada al 0,4 % preparada como se describe en los Procedimientos y combinada con un volumen igual de citrato sodico 200 mM a pH 4,5 preparado tambien como se describe en los Procedimientos. Se prepararon dispersiones de lecitina deslipidizada al 0,4 % y al 0,8 % en citrato de sodio 200 mM a pH 4,5 y se combinaron en volumenes iguales con almuotas del emulsion de acido capnlico en lecitina deslipidizada para obtener emulsiones de acido capnlico al 0,25 % en lecitina deslipidizada al 0,2 % en suspension en una solucion acuosa de citrato de sodio 100 mM a pH 4,5 a la que se anaden cantidades adicionales de lecitina deslipidizada al 0,2 % o al 0,4 %, estas se describen como Ensayo + DLL al 0,2 % o Ensayo + DLL al 0,4 %.
Se prepararon suspensiones similares de la misma emulsion en dispersiones de citrato de sodio de un aislado de protema de suero (APS) (Provon 190 de Glanbia PLC) y con suero bovino con fines comparativos. Estos se describen como Ensayo + APS o BSA al 0,2 % o Ensayo + APS o BSA al 0,4 %.
Se cultivaron linfocitos B Raji como se describe en los Procedimientos y la viabilidad despues de una exposicion de 60 minutos a las diversas soluciones de ensayo se evaluo utilizando un medidor de viabilidad celular Invitrogen Countess como se describe en los Procedimientos. Los resultados se presentan en la tabla 23 a continuacion.
Tabla 23 Reduccion de la viabilidad celular a una exposicion de 60 minutos a los elementos de ensayo Linfocitos B Raji
control Blanco de tampon Ensayo Ensayo + DLL al 0,2 % Ensayo + DLL al 0,4 % Ensayo + APS al 0,2 % Ensayo + APS al 0,4 % Ensayo + BSA al 0,2 % Ensayo + BSA al 0,2 %
% Viable a T cero
78 72 75 77 73 76 79 75 71
% Viable a T 60 min
72 69 12 59 68 48 53 19 21
Tabla 23 Reduccion de la viabilidad celular a una exposicion de 60 minutos a los elementos de ensayo Linfocitos B Raji
control Blanco de tampon Ensayo Ensayo + DLL al 0,2 % Ensayo + DLL al 0,4 % Ensayo + APS al 0,2 % Ensayo + APS al 0,4 % Ensayo + BSA al 0,2 % Ensayo + BSA al 0,2 %
% de supervivencia celular
92 96 16 77 93 63 67 25 30
El porcentaje de supervivencia celular en el artfculo de ensayo es solo del 16% despues de 60 minutos. En comparacion, el control que consistfa en celulas B Raji en medio de cultivo celular, perdio solo un 8 % de viabilidad y el blanco de tampon que era citrato de sodio 100 mM a pH 4,5 fue aun menor con una reduccion del 4 %. Con la 5 adicion de lfpido de membrana libre al 0,2 % y al 0,4 % (lecitina deslipidizada) el porcentaje de supervivencia celular en el ensayo aumento del 16% al 77% y al 93%, y aunque no tan eficaz, la adicion de APS libre aumento la supervivencia celular del 16 % al 63 % y al 67 %. La albumina serica bovina fue considerablemente menos eficaz para proteger contra el dano celular.
La inclusion de lfpido de membrana libre en una dispersion acuosa de emulsion de lfpido de membrana no tiene 10 efecto significativo sobre las propiedades microbicidas de la emulsion de lfpido de membrana. Un cultivo en fase logantmica tardfa de la levadura Candida albicans cultivada como se describe en los Procedimientos contema 1,33 X 107 celulas viables por ml. Esto se uso para inocular alfcuotas de cada artfculo de ensayo anterior a una disolucion de 1:10 de modo que cada ml de artfculo de ensayo contema mas de 6 en escala logantmica de celulas de levadura. Las muestras se retiraron durante penodos de tiempo de hasta 10 minutos y se evaluaron para determinar la 15 viabilidad residual utilizando los procedimientos descritos en los Procedimientos. Como se ilustra en la Tabla 24 a continuacion, la viabilidad detectable fue erradicada en menos de 5 minutos por todos los artfculos de ensayo.
Tabla 24 Efecto microbicida del lfpido de membrana libre en las emulsiones de lfpido de membrana. superior a 6 en escala logantmica. Candida albicans.
Tiempo de destruccion
control Blanco de tampon Ensayo Ensayo + DLL al 0,2 % Ensayo + DLL al 0,4 % Ensayo + APS al 0,2 % Ensayo + APS al 0,4 % Ensayo + BSA al 0,2 % Ensayo + BSA al 0,2 %
Tiempo Min
NA NA <5 <5 <5 <5 <5 >5 >5
Ejemplo 18: Uso en un alimento medico
Se prepararon emulsiones separadas de acido capnlico, caprico y laurico como acido graso al 5,0% P/V emulsionado en lecitina deslipidizada al 4,0 % como se describe en los Procedimientos. Las emulsiones individuales 20 se mezclaron en una relacion de 1:1:1.
Se reconstituyo leche desnatada en polvo Marvel de Premier International Foods (Reino Unido) Ltd, Spalding, Lincolnshire, Inglaterra, usando el 90 % del volumen de agua de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez completamente hidratada se anadio el 10% en volumen de la mezcla combinada de acidos grasos libres emulsionados separadamente y se mezclaron por agitacion, llevando el volumen total al 100 %.
25 Se cultivo Helicobacter pylori en agar sangre de Columbia suplementado con sangre de oveja desfibrinada al 5 % en un tarro anaerobico utilizando paquetes de gas de bajo oxfgeno Anaerogen de Oxoid Reino Unido. Se cultivaron Salmonella typhimurium y E. coli K12 en agar de infusion de Corazon y Cerebro como se describe en los Procedimientos.
La eficacia microbicida de la leche reconstituida suplementada con los tres acidos grasos libres emulsionados se 30 determino usando el procedimiento de Concentracion Inhibitoria Minima (CIM) de disolucion en agar descrito en los procedimientos. Las disoluciones de la leche desnatada reconstituida se prepararon en agua destilada esteril de modo que las disoluciones adicionales de alfcuotas de estas en agar enfriado proporcionaron un agar con concentraciones combinadas de acidos grasos libres que variaban del 1 % al 0,1 % en incrementos del 0,1 % y del 0,1 % al 0,01 % en incrementos del 0,01 %. Los cultivos de los tres organismos de ensayo se inocularon sobre estas 35 placas y se incubaron de acuerdo con los requerimientos de cultivo: Helicobacter con baja tension de oxfgeno, Salmonella y E. coli en condiciones aerobias todas a 37 °C.
La Concentracion inhibitoria minima, que es la disolucion mas baja a la que no se observo crecimiento, fue superior al 0,5 % para Helicobacter y superior al 0,1 % tanto para Salmonella como para E. coli.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion antimicrobiana en forma de una emulsion que comprende:
    (a) uno o mas acidos grasos libres saturados o insaturados que tienen de 4 a 22 atomos de carbono; y
    (b) Ifpido de membrana deslipidizado, que es lecitina deslipidizada, como agente emulsionante para el o los acidos grasos libres
    para su uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones microbianas en seres humanos o animales; en la que "deslipidizado" tiene por objeto significar que sustancialmente todo el material lipfdico extrano conjugado, tal como aceite, grasa o material de triglicerido, al que los lfpidos de membrana normalmente estan asociados en la naturaleza, se retira "substancialmente todo" en este contexto, teniendo por objeto significar que el lfpido de membrana deslipidizado contiene menos del 10 %, preferentemente menos de 5 %, mas preferentemente menos del 3 %, de material lipfdico extrano conjugado.
  2. 2. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el acido graso libre se selecciona entre los acidos valerico, caproico, capnlico, pelargonico, caprico, undecanoico, undecilenico, laurico, minstico, palmttico, estearico, oleico, linoleico y linolenico y mezclas de los mismos.
  3. 3. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que el acido graso libre se selecciona entre uno o mas de los acidos caproico, capnlico, pelargonico, caprico, undecilenico y laurico.
  4. 4. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en la que el acido graso libre es acido capnlico.
  5. 5. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 que comprende acido capnlico y lecitina deslipidizada.
  6. 6. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la relacion del componente (a) al componente (b) puede ser de aproximadamente 0,25:1 a aproximadamente 10:1; o de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 10:1, o de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 5,0:1, o de aproximadamente 1,0:1 aproximadamente 2,5:1, o de aproximadamente 1,25:1 a aproximadamente 2,5:1, en base peso/base.
  7. 7. Una composicion para su uso de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, que comprende adicionalmente uno o mas acidos organicos farmaceuticamente aceptables o una sal o ester farmaceuticamente aceptable de los mismos; y/o una o mas sales de acidos inorganicos farmaceuticamente aceptables.
  8. 8. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en la que el acido organico se selecciona entre los acidos acetico, piruvico, propionico, glicolico, oxalico, lactico, glicerico, tartronico, malico, maleico, ascorbico, fumarico, tartarico, malonico, glutarico, propenoico, cis o trans butenoico y cttrico y mezclas de los mismos, y sales y esteres farmaceuticamente aceptables de los mismos.
  9. 9. Una composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el acido organico es acido cftrico o lactico o la sal de sodio o potasio de los mismos; en la que, preferentemente, la sal de acido organico es citrato sodico; y/o en la que la sal de acido inorganico se selecciona entre cloruro, sulfato y nitrato.
  10. 10. Una formulacion farmaceutica que comprende una composicion como se define en cualquier reivindicacion anterior y un vehfculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones microbianas en seres humanos o animales.
  11. 11. Una formulacion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que la composicion esta presente en una cantidad de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 25 % (p/v); o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % (p/v); o de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 1,0 % (p/v).
  12. 12. Una formulacion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10 u 11, en una forma adecuada para la administracion a un ser humano o animal, especialmente en una forma adecuada para la administracion oral, topica, enteral, parenteral o mucosa.
  13. 13. Una formulacion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que las infecciones microbianas se asocian a la mucosa humana o animal.
  14. 14. Una formulacion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que las infecciones microbianas son afecciones asociadas a la cavidad oral.
  15. 15. Una formulacion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reclamaciones 10 a 12, en la que la formulacion esta indicada para el tratamiento topico de infecciones cutaneas.
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