CN104145967B - 血根碱在制备抗真菌生物被膜药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血根碱及其药学上可接受的盐在制备抗真菌生物被膜的药物、医疗器械或医用材料中的应用，所述真菌是念珠菌、新型隐球菌或曲霉菌，所述抗真菌生物被膜为抑制真菌生物被膜的生长增殖/形成或用于抑制/破坏已形成的真菌生物被膜。本发明还涉及利用血根碱在体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法。本发明所用的化合物血根碱即使在低浓度下也能有效地抑制真菌被膜生长，或者抑制已成熟生物被膜，最低有效施用浓度仅为1.25？μmol/L，能应用于临床上抗真菌生物被膜。
Description
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域，具体地说，是血根碱在制备抗真菌生物被膜药物中的应用。
背景技术
血根碱（Sanguinarine）是存在于博落回、白屈菜等植物中的生物碱，其结构式如(I)所示，分子式C20H14NO4 +，分子量332。
(I)
血根碱具有丰富的药用价值，能抑制多种病原菌，并且具有抗肿瘤、杀虫等活性。昆明总医院天然药物研究中心MengF等有关于血根碱抗人类致病真菌的报道（MengF,ZuoG,HaoX,WangG,XiaoH,ZhangJ,XuG.Antifungalactivityofthebenzo[c]phenanthridinealkaloidsfromChelidoniummajusLinnagainstresistantclinicalyeastisolates.JEthnopharmacol.2009;125(3):494-600.）显示血根碱对念珠菌的最低抑菌浓度高达125-500μg/ml（377-1506μM），最低杀菌浓度高达250-750μg/ml（753-2259μM），该结果显示血根碱的抗真菌活性很弱。
生物被膜是一个微生物聚集群体，是微生物与无活力物体或活组织表面接触，由自身产生的细胞外基质包裹着活菌细胞形成的微生态，其具有高度耐药性的特异表型，是相对于单个分散游离状态真菌细胞而言的另一种独特的微生物生存方式。从患者体内取出的导管或生物装置表面可见真菌以生物被膜的形式黏附生长。对体外建立的真菌形成生物被膜的模型进行抗真菌药物敏感性实验时发现，菌株对常用药物均表现为高度耐药。因此，以生物被膜形式生长并表现出高度耐药性的体内导管或生物装置相关性真菌感染给临床治疗带来很大难度，迫使临床医师在进行抗真菌治疗的同时必须从患者体内取出导管或生物装置，从而影响到患者的预后。目前大多数有抗真菌活性的物质并不具有抗真菌生物被膜活性。例如，目前临床最广泛应用的抗真菌药物氟康唑对生物被膜完全没有抑制作用。此外，目前抗真菌作用最强的两性霉素B仅在高浓度时对生物被膜有一定的抑制作用，而在此浓度下会导致受体严重的不良反应，因而不适合被临床应用于抗真菌生物被膜。
因此，迫切需要一种在低浓度下具有抗真菌生物被膜活性的药物。
发明内容
本发明的目的在于寻找一种具有抗生物被膜活性的药物，本发明的目的也在于提供血根碱的新用途。
本发明人一直致力于寻找一种具有抗生物被膜活性的药物，将临床抗真菌活性明确的常用药物氟康唑用于抗真菌生物被膜，结果发现在高达2560μmol/L的浓度下氟康唑都不具备抗生物被膜活性，如图1所示。
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供血根碱及其药学上可接受的盐在制备抗真菌生物被膜药物中的应用。
本发明的再一的目的是，提供血根碱及其药学上可接受的盐在制备抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料中的应用。
本发明的另一的目的是，提供一种体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
所述血根碱及其药学上可接受的盐在制备抗真菌生物被膜药物中的应用。
所述药物还可以包括其他具有抗真菌或抗真菌生物被膜活性的药物组分。
所述药物用于抑制真菌生物被膜的生长增殖(形成)，或用于抑制(或破坏)已形成的真菌生物被膜。
所述血根碱为具有下式(I)结构的化合物：
(I)。
所述的盐选自下组：盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐等。
所述的真菌选自下组：念珠菌、新型隐球菌、和/或曲霉菌。
所述药物中血根碱的含量为0.1-99wt%，较佳地为0.5-90wt％。
所述血根碱及其药学上可接受盐在抗念珠菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25微摩尔/升或微摩尔/千克。
所述血根碱及其药学上可接受盐在抗新型隐球菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25微摩尔/升或微摩尔/千克。
所述血根碱及其药学上可接受盐在抗曲霉菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25微摩尔/升或微摩尔/千克。
当所述念珠菌生物被膜为成熟生物被膜时，血根碱在药物中的有效浓度为≥2.5微摩尔/升或微摩尔/千克。
当所述新型隐球菌生物被膜为成熟生物被膜时，血根碱在药物中的有效浓度为≥2.5微摩尔/升或微摩尔/千克。
当所述曲霉菌生物被膜为成熟生物被膜时，血根碱在药物中的有效浓度为≥2.5微摩尔/升或微摩尔/千克。
所述药物为涂抹剂、乳剂、膏剂、气雾剂、膜剂。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
所述血根碱及其药学上可接受的盐在制备抗真菌生物被膜的医疗器械或医用材料中的应用。
所述医疗器械包括：医疗导管(如输液管、导尿管)、输氧面罩、鼻氧管、钳、敷料、护创材料、可吸收性止血/防粘连材料、手术用品(如医用的钳、钩、或针)、植入物等。
所述医疗器械的制备方法包括：(1)提供一医疗器械；(2)将包含灭菌有效量血根碱的药物涂覆于医疗器械上，形成抗真菌生物被膜的医疗器械。
所述抗真菌生物被膜包括抑制真菌生物被膜的生长增殖(形成)或用于抑制(或破坏)已形成的真菌生物被膜。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法，在需要抑制的场合，施用血根碱或其药学上可接受的盐，从而抑制真菌生物被膜。
所述血根碱在抗念珠菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25微摩尔/升或微摩尔/千克。
所述血根碱在抗新型隐球菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25微摩尔/升或微摩尔/千克。
所述血根碱在在抗曲霉菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25微摩尔/升或微摩尔/千克。
当待抑制的生物被膜是念珠菌成熟生物被膜时，施用的血根碱的有效浓度为≥2.5微摩尔/升或微摩尔/千克。
当待抑制的生物被膜是隐球菌成熟生物被膜时，施用的血根碱的有效浓度为≥2.5微摩尔/升或微摩尔/千克。
当待抑制的生物被膜是曲霉菌成熟生物被膜时，施用的血根碱的有效浓度为≥2.5微摩尔/升或微摩尔/千克。
本发明优点在于：
提供了一种有效的破坏真菌被膜的方法，本发明所用的化合物血根碱即使在低浓度下也能有效地抑制真菌被膜生长，或者抑制已成熟生物被膜，最低有效施用浓度仅为1.25μmol/L(或μmol/kg)，能应用于临床上抗真菌生物被膜。
附图说明
附图1为本发明氟康唑以0～2560μmol/L浓度单独使用抑制白念珠菌SC5314生物被膜形成的效果；其中，横坐标为氟康唑浓度(μmol/L)，纵坐标为生物被膜形成率(%)。具体实验方法参考实施例6。
附图2是本发明实施例6中血根碱以0～20μmol/L浓度单独使用抑制白念珠菌SC5314生物被膜形成的效果。其中，横坐标为血根碱浓度(μmol/L)，纵坐标为生物被膜形成率(%)。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。
附图3是本发明实施例6中血根碱以0～40μmol/L浓度单独使用抑制白念珠菌SC5314成熟24h生物被膜的效果。其中，横坐标为血根碱浓度(μmol/L)，纵坐标为生物被膜形成率(%)。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。
附图4是本发明实施例6中实验标本的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，化合物血根碱在低浓度下就能够表现出很好的抗真菌生物被膜活性，因此可以非常有效地用于预防真菌形成生物被膜，或抑制和破坏已形成的生物被膜。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“血根碱”为具有如下所示结构的化合物，及其药学上可接受的盐：
其中，优选的代表性的盐包括(但并不限于)：与有机酸或无机酸所形成的盐，例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐等。
术语“抗真菌生物被膜”包括抑制真菌生物被膜的生长增殖(或形成)或用于抑制(或破坏)已形成的真菌生物被膜。
菌株
本发明提供了一种血根碱抑制真菌生物被膜的用途。其中，所述的真菌可以是任何具有被膜的真菌，较佳的例子包括(但并不限于)：念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌等。
本发明的真菌可以位于生物体外，如需要灭菌的医疗器械内壁；也可以位于生物体内，其中，所述的生物包括(但并不限于)：人、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴等。
在本发明中，所用的真菌可以通过常规方法取得或培养，也可以通过市售途径得到，如从患有相应疾病的患者的体细胞或组织中分离，或从任何市售标准菌株的机构或公司，如ATCC购买得到。应理解，在本发明的实施例中所使用的菌株样本仅为示范性的例子，任何可形成生物被膜的真菌均可以用于测试本发明化合物的抗真菌生物被膜活性，而不受实施例范围的限制。
真菌生物被膜
生物被膜是微生物聚集群体，是微生物不可逆地与无活力物体或活组织表面接触，由自身产生的细胞外基质包裹着活菌细胞形成的微生态，其具有高度耐药性的特异表型，是相对于单个分散游离状态真菌细胞而言的另一种独特的微生物生存方式。
从患者体内取出的导管或生物装置表面，可观察到真菌以生物被膜的形式黏附生长。对体外建立的真菌形成生物被膜的模型进行抗真菌药物敏感性实验时发现，菌株对常用药物均表现为高度耐药。因此，以生物被膜形式生长并表现出高度耐药性的体内导管或生物装置相关性真菌感染给临床治疗带来很大难度，迫使临床医师在进行抗真菌治疗的同时必须从患者体内取出导管或生物装置，从而影响到患者的预后。
通常，真菌生物被膜对一般抗真菌药物高度耐药，目前大多数有抗真菌活性的物质并不具有抗真菌生物被膜活性。例如，目前临床最广泛应用的抗真菌药物氟康唑对生物被膜完全没有抑制作用。此外，目前抗真菌作用最强的两性霉素B仅在高浓度时对生物被膜有一定的抑制作用，而在此浓度下会导致受体严重的不良反应，因而不适合被临床应用于抗真菌生物被膜。
抗真菌生物被膜活性
本发明的血根碱作用于真菌，可以有效地起到抑制真菌生物被膜的生长增殖的作用，或起到破坏已形成的真菌生物被膜的作用。
真菌在聚苯乙烯等材料表面形成生物被膜后，对多数抗真菌药耐药，氟康唑单用抗白念珠菌生物被膜的SMIC(SessileMinimumInhibitoryConcentration)值>3200μmol/L，两性霉素B单用抗白念珠菌生物被膜的SMIC值为0.6～2.4μmol/L，具有抗酵母相真菌活性的中药单体化合物大多无抗真菌生物被膜活性。
经实验证明，血根碱在体外具有显著的抗真菌生物被膜活性，不仅能抑制真菌生物被膜的粘附、生长增殖，而且对已形成真菌生物被膜具有抑制作用，SMIC值为5μmol/L～40μmol/L。
在本发明中，用于制备药物或药物组合物的血根碱需要达到一定的浓度，通常为≥1.25μmol/L(或μmol/kg)。较佳地，在本发明的实施例中：
所述血根碱在抗念珠菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25μmol/L(或μmol/kg)；当所述念珠菌生物被膜为成熟生物被膜时，所述血根碱在药物中的有效浓度为≥2.5μmol/L(或μmol/kg)。
所述血根碱在抗新型隐球菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25μmol/L(或μmol/kg)，当所述新型隐球菌生物被膜为成熟生物被膜时，所述血根碱在药物中的有效浓度为≥2.5μmol/L(或μmol/kg)。
所述血根碱在在抗曲霉菌生物被膜药物中的有效浓度为≥1.25μmol/L(或μmol/kg)，当所述曲霉菌生物被膜为成熟生物被膜时，所述血根碱在药物中的有效浓度为≥2.5μmol/L(或μmol/kg)。
应理解，在本发明的实施例中，仅写明了有效抑制真菌生物被膜的生长时，活性成分的最低浓度。结合本领域的公知常识可知，当抗真菌的活性药物组分浓度增大时，所述的抗真菌效果会有一定的改善。因此，任何本领域的技术人员在阅读了本说明书后，通过结合本领域的公知常识，均可以采用高于所述的最低浓度的剂量来抑制真菌生物被膜生长，这种改变同样落于本发明的公开范围内。
抗真菌生物被膜制品
本发明提供的抗真菌生物被膜活性化合物可以直接应用于生物体，也可用于制备药物或药物组合物，以及需要抑制真菌的医疗器械。
所述的药物或药物组合物可以是任何剂型，如汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、膏药、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、微型胶囊、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、软膏剂、橡胶硬膏、膜剂、海绵剂、离子透入剂、透皮吸收剂等；较佳地为涂抹剂，乳剂、膏剂、气雾剂、膜剂等剂型。
所述的药物或药物组合物可直接用于生物体，也可制成涂覆剂而应用于各种需要抑制真菌的医疗器械中，如涂覆于医疗器械上以抑制真菌的活性。所述的医疗器械可以是任何需要抑制真菌的医疗器械，如外科手术器械、眼科手术器械、耳鼻喉科手术器械、口腔科设备、器具及手术器械、矫形外科（骨科）手术器械、妇产科用、计划生育手术器械、注射穿刺器械、烧伤(整形)科手术器械、普通诊察器械、临床检验分析仪器、医用化验和基础设备器具、体外循环及血液处理设备、植入材料、手术室、急救室、诊疗室设备及器具、病房护理设备及器具、消毒和灭菌设备及器具、医用冷疗、低温、冷藏设备及器具、口腔科材料、医用卫生材料及敷料、医用缝合材料及粘合剂、医用高分子材料及制品、介入器材等。
在另一优选例中，所述的医疗器械包括(但并不限于)：医疗导管(如输液管、导尿管)、输氧面罩、鼻氧管、钳、敷料、护创材料、可吸收性止血/防粘连材料、手术用品(如医用的钳、钩、或针)、植入物等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：抗真菌生物被膜剂的制备
取4gPVA、0.7g山梨甲酸、0.5g甘油加10ml水混匀，浸润溶胀后，加热至90摄氏度使溶解，加入研成极微粉的血根碱，加水20ml，搅拌均匀后，在45摄氏度保温静置，除去气泡。将玻璃板预热至相同温度后，涂膜至厚度约为0.15mm，在70摄氏度干燥，脱模。
实施例2：抗真菌生物被膜乳剂的制备
取蒸馏水8ml置烧杯中，加4g胶粉配成胶浆，将胶浆转移到乳钵中再分次加入12g血根碱，边加边研至初乳形成，然后用少量蒸馏水将初乳分次转移至量杯中，搅拌下滴加尼泊金乙酯醇溶液，最后加蒸馏水至全量，搅匀即得。
实施例3：抗真菌生物被膜膏剂的制备
取原料药物磨成微粉，按一定比例分别加入油相、水相、乳化剂、防腐剂基质，加热水浴搅拌混合，冷却至室温后再次搅拌使血根碱与基质完全混合均匀得膏剂。
实施例4：抗真菌生物被膜气雾剂的制备
将血根碱与水、乙醇按一定比例配置成溶液，在室温下灌入容器内，关紧阀门，然后通过压机压入一定量的抛射剂，待抛射剂液化后过滤压灌入容器内。
实施例5：抗真菌生物被膜医疗器械止血钳的制备
取实施例1-4任一所述的药物均匀涂覆于止血钳表面，使其形成一层抗真菌生物被膜保护涂层。
实施例6：血根碱单用对不同白念珠菌菌株生物被膜的作用
材料和方法
1、试药
血根碱：购自中国药品生物制品检定所。
氟康唑：购自Sigma公司。
两性霉素B：购自Sigma公司。
XTT：购自Sigma公司。
甲萘醌(menadione)：购自Sigma公司。
二甲亚砜(DMSO)：购自Sigma公司。
丙酮：购自Sigma公司。
血根碱用二甲亚砜配成32mmol/L溶液，两性霉素B用二甲亚砜配成9.6mmol/L溶液，氟康唑用二甲亚砜配成320mmol/L溶液，受试药物于-20°C保存。实验前，将药物贮存液取出置35°C温箱融化，充分混匀，分别进行药效学实验。
XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液，用0.22μm孔径的滤器滤过除菌，甲萘醌用100%丙酮配成10mM溶液，XTT、甲萘醌于-80°C保存。实验前，将药物贮存液取出置4°C冰箱、35°C温箱梯度融化，充分混匀，进行药效学实验。
2、菌株
ATCC标准株：白念珠菌(Candidaalbicans)SC5314(可购自ATCC)。
临床株：白念珠菌(C.albicans)由长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌于35°C培养48h后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4°C保存备用。
3、培养液
RPMI1640培养液：RPMI1640(GibcoBRL)10g，NaHCO32.0g，吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonicacid,MOPS)(Sigma)34.5g(0.165M)，加三蒸水900ml溶解，1NNaOH调pH至7.0(25°C)，定容至1000ml，滤过除菌，4°C保存。
沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
YPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。
5、白念珠菌生物被膜制备
实验前，用接种圈从4°C保存的SDA培养基上挑取白念珠菌少量，接种至1mlYPD培养液，于30°C，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至玻璃试管中，离心(3000g，5min，4°C)，吸弃上清液，用1mlPBS吹打混匀，离心(3000g，5min，4°C)，吸弃上清液，重复用PBS洗一次，用1mlRPMI1640培养液吹打混匀，用血细胞计数板计数，调整菌液浓度至106cells/ml，将菌液接种到96孔板1～11号孔，37°C恒温箱中静置培养90min或24h。
6、抗白念珠菌生物被膜药敏板制备
(1)抗白念珠菌生物被膜增殖药敏板制备
取无菌96孔板，于每排11号孔加RPMI1640培养液150ml作阳性对照；2～10号孔各加RPMI1640培养液150ml；1号孔分别加RPMI1640培养液298.5l和血根碱溶液1.5ml或RPMI1640培养液297ml和氟康唑溶液3ml或RPMI1640培养液298.8ml和两性霉素B溶液1.2ml。1～10号孔10级倍比稀释，使各孔的血根碱最终药物浓度分别为160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125μmol/L，氟康唑最终药物浓度分别为3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L，两性霉素B最终药物浓度分别为38.4、19.2、9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075μmol/L，各孔中DMSO含量均低于1%；取出培养90min的生物被膜板，用PBS洗3次，取配好的含药物培养液100ml加入到被膜板对应的孔中，12号孔不培养生物被膜，作阴性对照。各药敏板于37°C培养。
(2)抗白念珠菌成熟生物被膜药敏板制备
24h之后，取无菌96孔板，于每排11号孔加RPMI1640培养液150ml作阳性对照；2～10号孔各加RPMI1640培养液150ml；1号孔分别加RPMI1640培养液297ml和血根碱溶液3ml或RPMI1640培养液297ml和氟康唑溶液3ml或RPMI1640培养液298.8ml和两性霉素B溶液1.2ml。1～10号孔10级倍比稀释，使各孔的血根碱最终药物浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.625μmol/L，氟康唑最终药物浓度分别为3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L，两性霉素B最终药物浓度分别为38.4、19.2、9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075μmol/L，各孔中DMSO含量均低于1%；取出培养24h的生物被膜板，用PBS洗3次，取配好的含药物培养液100ml加入到被膜板对应的孔中，12号孔不培养生物被膜，作阴性对照。各药敏板于37°C培养。
7、SMIC值判定
白念珠菌于37°C培养24h后，取出生物被膜板，用PBS轻轻洗3次，每孔加入200mlXTT/menadione(12号孔也加)，避光，37°C孵育2-3h，取出生物被膜板，吸取100mlXTT/menadione至无菌96孔板中，用酶标分析仪于492nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80%被抑制时的药物浓度)。当药物的SMIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：SMIC80值高于最高浓度3200μmol/L时，计为“＞3200μmol/L”；SMIC80值为最低浓度或在最低浓度6.25μmol/L以下时，不作区别，均计为“≤6.25μmol/L”。
上述实验均平行操作5到6次，当SMIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为SMIC80值；当SMIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
实验结果见表1和表2。
表1血根碱、两性霉素B与氟康唑单用对白念珠菌生物被膜增殖的抑制效果
(San表示血根碱，AmB表示两性霉素B，Flu表示氟康唑，下同。)
表2血根碱单用对5株白念珠菌成熟生物被膜的抑制效果
结论：
表1、表2结果显示：血根碱对白念珠菌生物被膜单独用药使用，当血根碱的浓度为5、10、20、40、80、160μmol/L时，均表现出良好的抗白念珠菌生物被膜的增殖作用，当血根碱的浓度为10、20、40、80、160、320μmol/L时，均表现出良好的抗白念珠菌成熟生物被膜作用。
实施例7：血根碱单用对不同新型隐球菌菌株生物被膜的作用
材料和方法
1、试药
血根碱：购自中国药品生物制品检定所。
氟康唑：购自Sigma公司。
两性霉素B：购自Sigma公司。
XTT：购自Sigma公司。
甲萘醌(menadione)：购自Sigma公司。
二甲亚砜(DMSO)：购自Sigma公司。
丙酮：购自Sigma公司。
血根碱用二甲亚砜配成32mmol/L溶液，两性霉素B用二甲亚砜配成9.6mmol/L溶液，氟康唑用二甲亚砜配成320mmol/L溶液，受试药物于-20°C保存。实验前，将药物贮存液取出置35°C温箱融化，充分混匀，分别进行药效学实验。
XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液，用0.22μm孔径的滤器滤过除菌，甲萘醌用100%丙酮配成10mM溶液，XTT、甲萘醌于-80°C保存。实验前，将药物贮存液取出置4°C冰箱、35°C温箱梯度融化，充分混匀，进行药效学实验。
2、菌株
ATCC标准株：新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)ATCC32609、ATCC56992(可购自ATCC)。
临床株：新型隐球菌(C.neoformans)9406204、9701041、0208558均由上海长海医院真菌室提供，分别采自该医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，新型隐球菌于35°C培养一周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4°C保存备用。
3、培养液
DMEM高糖培养基：购自Invitrogen公司。
沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
YPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。
5、新型隐球菌生物被膜制备
实验前，用接种圈从4°C保存的SDA培养基上挑取新生隐球菌少量，接种至1mlYPD培养液，于30°C，200rpm振荡培养，活化24h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至玻璃试管中，离心(3000g，5min，4°C)，吸弃上清液，用1mlPBS吹打混匀，离心(3000g，5min，4°C)，吸弃上清液，重复用PBS洗一次，用1mlDMEM培养液吹打混匀，用血细胞计数板计数，调整菌液浓度至107cells/ml，将菌液接种到96孔板，37°C恒温箱中静置培养90min或24h。
6、抗新型隐球菌生物被膜药敏板制备
(1)抗新型隐球菌生物被膜增殖药敏板制备
取无菌96孔板，于每排11号孔加DMEM培养液150ml作阳性对照；2～10号孔各加DMEM培养液150ml；1号孔分别加DMEM培养液298.5ml和血根碱溶液1.5ml或DMEM培养液297ml和氟康唑溶液3ml或DMEM培养液298.8ml和两性霉素B溶液1.2ml。1～10号孔10级倍比稀释，使各孔的血根碱最终药物浓度分别为160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125μmol/L，氟康唑最终药物浓度分别为3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L，两性霉素B最终药物浓度分别为38.4、19.2、9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075μmol/L，各孔中DMSO含量均低于1%；取出培养90min的生物被膜板，用PBS洗3次，取配好的含药物培养液100ml加入到被膜板对应的孔中，12号孔不培养生物被膜，作阴性对照。各药敏板于37°C培养。
(2)抗新型隐球菌成熟生物被膜药敏板制备
24h之后，取无菌96孔板，于每排11号孔加DMEM培养液150ml作阳性对照；2～10号孔各加DMEM培养液150ml；1号孔分别加DMEM培养液297ml和血根碱溶液3ml或DMEM培养液297ml和氟康唑溶液3ml或DMEM培养液298.8ml和两性霉素B溶液1.2ml。1～10号孔10级倍比稀释，使各孔的血根碱最终药物浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.625μmol/L，氟康唑最终药物浓度分别为3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L，两性霉素B最终药物浓度分别为38.4、19.2、9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075μmol/L，各孔中DMSO含量均低于1%；取出培养24h的生物被膜板，用PBS洗3次，取配好的含药物培养液100ml加入到被膜板对应的孔中，12号孔不培养生物被膜，作阴性对照。各药敏板于37°C培养。
7、SMIC值判定
新型隐球菌于37°C培养24h、48h、72h后，取出生物被膜板，用PBS轻轻洗3次，每孔加入200mlXTT/menadione(12号孔也加)，避光，37°C孵育2-3h，取出生物被膜板，吸取100mlXTT/menadione至无菌96孔板中，用酶标分析仪于492nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80%被抑制时的药物浓度)。当药物的SMIC80值超过血根碱测定浓度范围时，按以下方法进行统计：SMIC80值高于最高浓度3200μmol/L时，计为“＞3200μmol/L”；SMIC80值为最低浓度或在最低浓度6.25μmol/L以下时，不作区别，均计为“≤6.25μmol/L”。
上述实验均平行操作5到6次，当SMIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为SMIC80值；当SMIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
实验结果见表3和表4。
表3：血根碱单用对5株新型隐球菌菌株生物被膜生长增殖的SMIC80值
表4：血根碱单用对5株新型隐球菌菌株成熟生物被膜的SMIC80值
结论：
表3、表4结果显示：血根碱对5株新型隐球菌菌株生物被膜的增殖、成熟生物被膜进行单独用药，当血根碱浓度为5、10、20、40、80、160μmol/L时，表现出良好的抗新型隐球菌生物被膜增殖作用，当血根碱浓度为10、20、40、80、160、320μmol/L时，表现出良好的抗新型隐球菌成熟生物被膜作用。
实施例8：血根碱单用对不同曲霉菌菌株生物被膜的作用
材料和方法
1、试药
血根碱：购自中国药品生物制品检定所。
氟康唑：购自Sigma公司。
两性霉素B：购自Sigma公司。
XTT：购自Sigma公司。
甲萘醌(menadione)：购自Sigma公司。
二甲亚砜(DMSO)：购自Sigma公司。
丙酮：购自Sigma公司。
血根碱用二甲亚砜配成32mmol/L溶液，两性霉素B用二甲亚砜配成9.6mmol/L溶液，氟康唑用二甲亚砜配成320mmol/L溶液，受试药物于-20°C保存。实验前，将药物贮存液取出置35°C温箱融化，充分混匀，分别进行药效学实验。
XTT用灭菌的PBS配成0.5mg/ml的饱和溶液，用0.22μm孔径的滤器滤过除菌，甲萘醌用100%丙酮配成10mM溶液，XTT、甲萘醌于-80°C保存。实验前，将药物贮存液取出置4°C冰箱、35°C温箱梯度融化，充分混匀，进行药效学实验。
2、菌株
临床株：烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)7544、060796、YQA、YQB均由上海长海医院真菌室提供，分别采自该医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。
3、培养液
RPMI1640培养液：RPMI1640(GibcoBRL)10g，NaHCO32.0g，吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonicacid,MOPS)(Sigma)34.5g(0.165M)，加三蒸水900ml溶解，1NNaOH调pH至7.0(25°C)，定容至1000ml，滤过除菌，4°C保存。
沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
YPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。
4、仪器
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。
5、烟曲霉菌生物被膜制备
将烟曲霉菌菌接种至SDA斜面，35°C，培养一周。按本方法活化两次后，加适量RPMI1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使烟曲霉菌菌孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至105cells/ml，将菌液接种到96孔板，37°C恒温箱中静置培养90min或24h。
6、抗烟曲霉菌生物被膜药敏板制备
(1)抗烟曲霉菌生物被膜增殖药敏板制备
取无菌96孔板，于每排11号孔加RPMI1640培养液150ml作阳性对照；2～10号孔各加菌液150ml；1号孔分别加RPMI1640培养液298.5ml和血根碱溶液1.5ml或RPMI1640培养液297ml和氟康唑溶液3ml或RPMI1640培养液298.8ml和两性霉素B溶液1.2ml。1～10号孔10级倍比稀释，使各孔的血根碱最终药物浓度分别为160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625和0.3125μmol/L，氟康唑最终药物浓度分别为3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L，两性霉素B最终药物浓度分别为38.4、19.2、9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075μmol/L，平行制备两块这样的药敏板，各孔中DMSO含量均低于1%；取出培养90min的生物被膜板，用PBS洗3次，取配好的含药物培养液200ml加入到被膜板对应的孔中，12号孔不含药物，作阴性对照。各药敏板于37°C培养。
(2)抗烟曲霉菌成熟生物被膜药敏板制备
24h之后，取无菌96孔板，于每排11号孔加RPMI1640培养液150ml作阳性对照；2～10号孔各加菌液150ml；1号孔分别加RPMI1640培养液297ml和血根碱溶液3ml或RPMI1640培养液297ml和氟康唑溶液3ml或RPMI1640培养液298.8ml和两性霉素B溶液1.2ml。1～10号孔10级倍比稀释，使各孔的血根碱最终药物浓度分别为320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.625μmol/L，氟康唑最终药物浓度分别为3200、1600、800、400、200、100、50、25、12.5和6.25μmol/L，两性霉素B最终药物浓度分别为38.4、19.2、9.6、4.8、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075μmol/L，平行制备两块这样的药敏板，各孔中DMSO含量均低于1%；取出培养24h的生物被膜板，用PBS洗3次，取配好的含药物培养液200ml加入到被膜板对应的孔中，12号孔不含药物，作阴性对照。各药敏板于37°C培养。
7、SMIC值判定
烟曲霉菌于37°C培养24h、48h后，取出生物被膜板，用PBS轻轻洗3次，每孔加入200mlXTT/menadione(12号孔也加)，避光，37°C孵育2-3h，取出生物被膜板，吸取100mlXTT/menadione至无菌96孔板中，用酶标分析仪于492nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为SMIC80(生物被膜生长80%被抑制时的药物浓度)。当药物的SMIC80值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：SMIC80值高于最高浓度3200μmol/L时，计为“＞3200μmol/L”；SMIC80值为最低浓度或在最低浓度6.25μmol/L以下时，不作区别，均计为“≤6.25μmol/L”。
上述实验均平行操作5到6次，当SMIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为SMIC80值；当SMIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
实验结果见表5和表6。
表5：血根碱单用对4株烟曲霉菌菌株生物被膜生长增殖的SMIC80值
表6：血根碱单用对4株烟曲霉菌菌株成熟生物被膜的SMIC80值
结论：
表5、表6结果显示：血根碱对烟曲霉菌生物被膜的增殖、成熟生物被膜进行单独用药，当血根碱浓度为5、10、20、40、80、160μmol/L时，表现出良好的抗烟曲霉菌生物被膜增殖作用，当血根碱浓度为10、20、40、80、160、320μmol/L时，表现出良好的抗烟曲霉菌成熟生物被膜作用。
应理解，在本发明的实施例中，仅写明了有效抑制真菌生物被膜的生长时，活性成分的最低浓度。结合本领域的公知常识可知，当抗真菌的活性药物组分浓度增大时，所述的抗真菌效果会有一定的改善。因此，任何本领域的技术人员在阅读了本说明书后，通过结合本领域的公知常识，均可以采用高于所述的最低浓度的剂量来抑制真菌生物被膜生长，这种改变同样落于本发明的公开范围内。
Claims (8)
1.血根碱在药学上可接受的盐在制备抗真菌生物被膜药物中的应用;所述的真菌为念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌中的一种或两种以上组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是涂抹剂、乳剂、膏剂、气雾剂或膜剂。
3.血根碱在药学上可接受的盐在制备抗真菌生物被膜的医用材料中的应用;所述的真菌为念珠菌、新型隐球菌、曲霉菌中的一种或两种以上组合。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗真菌生物被膜的医用材料的制备方法为：将包含灭菌有效量血根碱的药物涂覆于医用材料上，形成抗真菌生物被膜的医用材料。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述血根碱为具有下式(I)结构的化合物：
(I)。
6.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐或醋酸盐。
7.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述抗真菌生物被膜为抑制真菌生物被膜的生长增殖/形成或用于抑制/破坏已形成的真菌生物被膜。
8.一种体外非治疗性抑制真菌生物被膜的方法，其特征在于，在需要抑制的场合，施用血根碱在药学上可接受的盐，从而抑制真菌生物被膜;所述真菌是念珠菌、新型隐球菌或曲霉菌。
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