CN109260222A - 半胱氨酸基抗菌纳米硫化铁混合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种能抑制和杀灭多种细菌和真菌的广谱高效的以半胱氨酸为硫源的抗菌纳米硫化铁混合物及其制备方法和应用。抗菌纳米硫化铁混合物的制备方法是在溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒的过程中加入半胱氨酸,其中,所述利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用铁源、水或非水溶剂以及碱性溶液作为反应物的步骤。本发明所得的纳米硫化铁混合物在水中分散性好,制备简易,易于磁分离,性质稳定,生物相容性好,抗菌效果期长,且在常规使用时对人体无害,环境友好,生态友好,易于控制,价格便宜,是高效低毒的广谱抗菌材料。
Description
技术领域
本发明涉及生物纳米材料技术领域,尤其涉及一种过氧化物酶或过氧化氢酶酶活性高的抗菌纳米硫化铁混合物的制备方法,具体是一种能抑制和杀灭多种细菌和真菌的广谱高效的以半胱氨酸为硫源的抗菌纳米硫化铁混合物及其制备方法和应用,还涉及包含高效抗菌纳米硫化铁混合物的抗菌药物。
背景技术
高效抗菌材料的开发和应用对于保护人类健康、改善人类生活环境、减少疾病、应对突发生物污染事件都具有重要的意义。
纳米抗菌材料是在无机抗菌材料和纳米材料基础上发展起来的一类新型材料。目前开发与应用较多的是纳米银抗菌剂,具有优异的抗菌效果和热稳定性。但纳米银抗菌剂存在最大的问题是生物系统毒性。同时由于银的价格较贵,一定程度上限制了纳米银抗菌剂的使用。因此开发廉价、无毒的无机纳米抗菌材料具有重要的意义和良好的应用前景。
生物膜感染难以治疗的主要原因之一,常用的抗菌剂很难突破基质屏障杀灭内部细菌,因此造成临床效果不佳。比如口腔变异链球菌易于在牙齿表面形成致龋性生物膜,形成后难以清除,生物膜内变异链球菌难以杀灭并产酸,造成牙齿表面钙溶解脱矿,最终诱发龋齿等疾病,在儿童和成人中均具有很高的患病率,严重影响人们的健康和生活。
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是医学临床上常见的两种病原菌。金黄色葡萄球菌是引起化脓性疾病的致病菌,并且是一种毒力很强的致病菌,可引起局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等,甚至败血症、脓毒血症等全身感染;大肠杆菌是人和动物肠道中一种正常肠道菌群,是一种条件致病菌,在卫生学上常被作为卫生监督的指示菌。随着抗菌药物在医学临床上的广泛应用,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的耐药水平越来越高,出现了多重耐药菌株,给人类和动植物的健康带来极大危害。
铜绿假单胞菌为一种条件致病菌,是医院内发生感染的主要病原菌之一。经常引起术后伤口感染,也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。同时对临床常见药物耐药率高,且易形成生物膜,免受抗菌药物破坏,成为难以治疗的多重耐药菌株。对解决由铜绿假单胞菌引起的健康问题迫在眉睫。
白色念珠菌,是真菌感染最常见的条件致病菌。随着其致病率增高,耐药性增强,白色念珠菌的有效治疗变得愈发困难。在全球范围内,念珠菌每年造成约4000万例感染病症,其中白色念珠菌是主要的感染病原,约占念珠菌感染病例的50%-70%,其中全身性念珠菌症的致死率可达35%。研究表明,白色念珠菌在体内粘膜层及人工器械表面常以生物被膜的形式存在,生物被膜的形成对白色念珠菌的环境适应能力、药物敏感性等生物学特性有较大影响,可使其对药物的抵御能力提高10–1000倍,亦可增强其在宿主细胞免疫系统攻击下的存活能力,治疗相关感染甚至需要将生物被膜感染的植入材料和感染组织全部取出和切除,极大提高了相关疾病治疗的难度和风险。
细菌性阴道病在育龄妇女中较为常见,其发病率远高于念珠菌及滴虫感染。阴道正常菌群以乳酸杆菌为优势菌群,分解粘膜上皮糖原维持阴道酸性环境,多种因素引起的阴道菌群失衡均可诱发细菌性阴道病。厌氧菌及阴道加德纳菌的大量增殖,伴阴道内环境变化及分泌物性质改变,其临床的炎性表现并不明显,可引起宫颈表皮不典型增生、孕妇早产、绒毛膜羊膜炎、胎膜早破等并发症,严重威胁广大妇女的生殖健康。
纳米颗粒已被公认为新型高效抗菌剂。其中以四氧化三铁为代表的纳米材料具有过氧化物模拟酶活性可以提高过氧化氢产生自由基的效率,增强杀菌效果。产生的自由基能够有效降解蛋白质、核酸和多糖。本发明合成的硫化铁纳米颗粒是在以溶剂热法合成四氧化三铁纳米颗粒的过程中添加一种或多种含硫化合物,得到含有过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、氧化酶活性、SOD酶活性等等的硫化铁纳米颗粒。即使在没有过氧化氢存在的条件下,获得的硫化铁纳米颗粒依然具有极好的杀菌效果。同时其本身具有的纳米酶性质介导的过氧化物催化反应降解生物膜基质屏障,有效破坏生物膜结构,杀灭生物膜内部细菌。在杀菌和清除生物膜方面展现出巨大的应用潜力。
发明内容
为了解决传统抗生素的不足之处,本发明提出了一种高效抗菌纳米硫化铁混合物的制备方法,该制备方法包括:在水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒的过程中加入硫源,其中,所述利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用铁源、水或非水溶剂以及碱性溶液作为反应物的步骤。
一方面,本发明提供了一种高效抗菌的纳米硫化铁混合物,所述纳米硫化铁混合物包括纳米级的Fe1-xS和Fe3S4。
该纳米硫化铁混合物具有一定的粒径和粒形;组分Fe1-xS中,所述S为-2价,所述x为0.1-0.2,说明Fe1-xS中既含有Fe2+又含有Fe3+;所述混合物的颗粒粒径为10-100nm,颗粒粒径处于纳米范围,增强了硫化铁混合物的抗菌活性。
另一方面,本发明提供了一种以半胱氨酸为硫源的抗菌纳米硫化铁混合物的制备方法,所述制备方法包括利用铁源在制备纳米四氧化三铁颗粒的过程中加入硫源的步骤,所述硫源为半胱氨酸;所述铁源与所述半胱氨酸的摩尔比为1:0.01-10。
进一步的,所述铁源与所述半胱氨酸的摩尔比为1:0.02-5,优选1:0.05-2,更优选1:0.06-1,更优选1:0.1-0.8,更优选1:0.2-0.6,更优选1:0.3-0.5,更优选1:0.3-0.4。
进一步的,所述利用铁源制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒的步骤;优选的,所述利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用铁源、水或非水溶剂以及碱性溶液作为反应物的步骤;
更优选的,所述制备方法包括如下步骤:将铁源、水或非水溶剂、碱性溶液和硫源混合得反应液,将反应液经过水热法或溶剂热法制备成为纳米硫化铁混合物。
进一步的,本发明的制备方法包括如下步骤:
(1)将铁源与水或非水溶剂按比例溶解,得反应液A;
(2)向反应液A中加入碱性溶液,搅拌使其溶解,得反应液B;
(3)向反应液B中加入硫源,搅拌使其溶解,得反应液C;
(4)将反应液C加热制备得到纳米硫化铁混合物。
进一步的,所述步骤(4)包括将反应液加热、烘干的步骤。
所述加热的温度为100-500℃,优选200-400℃;加热时间为1-48h,优选12-24h。
任选的,加热完毕后进行醇洗。
所述铁源选自二价铁和/或三价铁,优选氯化铁、硫酸亚铁、硝酸铁、溴化铁中的一种或多种;
所述非水溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的一种或多种;优选的,所述非水溶剂为醇类溶剂;更优选的,所述醇类溶剂为乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的一种或多种;
所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、NH4 +中的一种或多种的溶液,优选,醋酸钠、柠檬酸钠和/或碳酸氢钠的溶液。
所述铁源与水或非水溶剂的摩尔比为1:1-1000;所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/L。
另一方面,本发明还提供了由上述制备方法得到的以半胱氨酸为硫源的抗菌纳米硫化铁混合物。
另一方面,本发明提供了纳米硫化铁混合物在制备抗菌组合物中的应用;优选的,所述菌为细菌或真菌;更优选的,所述细菌选自变异链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、加德纳菌、沙门氏菌中的一种或多种;更优选的,所述真菌选自白色念珠菌或霉菌。
另一方面,本发明还提供了纳米硫化铁混合物在制备由于细菌或真菌感染所致的感染性疾病的药物中或在制备治疗伤口愈合的药物中的应用;优选的,所述纳米硫化铁混合物在制备治疗由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及其多种耐药菌引发的感染性疾病的药物中的应用;更优选的,所述纳米硫化铁混合物在制备治疗由口腔变异链球菌、金黄色葡萄球菌野生菌、MRSA金黄色葡萄球菌、MDR金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、加德纳菌、白色念珠菌等引发的感染性疾病的药物中的应用;最优选的,所述药物含有一种或一种以上医药上可接受的载体或添加剂。
另一方面,本发明还提供了纳米硫化铁混合物在制备人用或兽用治疗或预防药物中的应用。
进一步的,感染性疾病可为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及败血症、脓毒血症中的一种或多种。
进一步的,感染性疾病可为铜绿假单胞菌引起的伤口感染以及褥疮、脓肿、化脓性中耳炎中的一种或多种。
进一步的,感染性疾病可为白色念珠菌引起的全身性念珠菌症。
进一步的,感染性疾病可为加德纳菌引起的宫颈表皮不典型增生、孕妇早产、绒毛膜羊膜炎、胎膜早破中的一种或多种并发症。
进一步的,感染性疾病可为变异链球菌引起的龋齿。
另一方面,本发明还提出了包括抗菌纳米硫化铁混合物的抗菌组合物。
进一步的,抗菌组合物为人用或兽用治疗或预防抗菌药物组合物。
另一方面,本发明还提出了纳米硫化铁混合物作为抗菌、防污、防霉、防腐添加剂在制备牙膏、纺织品、塑料制品、涂料、复合材料、皮革制品、竹木制品中的应用。
另一方面,本发明还提出了一种抗菌药,为纳米硫化铁混合物与如下抗菌化合物通过物理吸附或化学偶联剂偶联制得的:β内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、糖肽类、四环素类以及林可霉素类。
本发明通过在纳米四氧化三铁颗粒的制备过程中加入硫源得到的纳米硫化铁混合物具有极好的杀菌效果,能够有效破坏生物膜结构,杀灭生物膜内部细菌,在杀菌和清除生物膜方面展现出巨大的应用潜力。
本发明通过水热法或溶剂热合成法获得纳米硫化铁混合物。水热法或溶剂热法是在流体参与的高压容器中进行,高温时密封容器中的溶媒(水或溶剂)膨胀充满整个容器,从而产生高压;利用强烈对流将溶解的分子或离子运输到反应釜低温区形成过饱和溶液,继而结晶。水热法或溶剂热法合成的纳米颗粒具有晶粒发展完整、粒度分布均匀、颗粒分散性好且粒度可控制等优点。
本发明具有如下有益效果:
1.本方法合成的纳米硫化铁混合物在水中分散性好,制备简易,易于磁分离,性质稳定,生物相容性好,抗菌效果期长。
2.本方法合成的纳米硫化铁混合物在常规使用时对人体无害,环境友好,生态友好,易于控制,价格便宜,是高效低度的广谱抗菌材料。
3.本方法合成的纳米硫化铁混合物通过破坏细菌细胞膜、引起细菌内部DNA的降解、促进细胞内部ROS的产生、提高细胞内部脂质氧化物的含量达到抑制和杀灭细菌的作用。由于该纳米颗粒的功能特性及其灭菌的特殊机理,这就使得各种菌类很难对其产生抗药性,这种优势是其它生化类抗菌药品所不能相比的。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解,构成本发明的一部分,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁的扫描电镜图
图2为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁的透射电镜图
图3为本发明半胱氨酸不同添加量的纳米硫化铁抗口腔变异链球菌性能示意图
图4为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗口腔变异链球菌性能检测结果示意图
图5为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗口腔生物膜性能检测结果示意图
图6为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗金黄色葡萄球菌野生菌性能检测结果示意图
图7为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗MRSA金黄色葡萄球菌性能检测结果示意图
图8为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗MDR金黄色葡萄球菌性能检测结果示意图
图9为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗大肠杆菌性能检测结果示意图
图10为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗铜绿假单胞菌性能检测结果示意图
图11为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗沙门氏菌性能检测结果示意图
图12为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗加德纳菌性能检测结果示意图
图13为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗白色念珠菌性能检测结果示意图
具体实施方式
为了更清楚的阐释本发明的整体构思,下面结合以下具体实施例进行详细说明,但不限制本发明的保护范围。
实施例1:L-半胱氨酸(L-cysteine)来源的纳米硫化铁混合物的制备方法
将0.82g的无水氯化铁(0.0132mol)溶于40ml的乙二醇中,磁力搅拌器搅拌30分钟,将无水氯化铁充分溶解,制得氯化铁溶液。向上述氯化铁溶液中加入0.36g的三水合醋酸钠,磁力搅拌器搅拌30分钟,使醋酸钠充分溶解,制得混合溶液。向上述混合溶液中加入0.5g的L-半胱氨酸(0.0041mol),搅拌30分钟,使L-半胱氨酸充分溶解,制得反应液。随后将全部反应液倒入反应釜中,将反应釜放入烘箱中,然后将烘箱升温至200℃,保温、加热12h,醇洗三遍,烘干,得到纳米硫化铁混合物。
L-半胱氨酸的加入量分别为0.1g、0.25g、0.5g、0.75g和1.0g,所对应的产品为Cys0.1-nFeS、Cys0.25-nFeS、Cys0.5-nFeS、Cys0.75-nFeS和Cys1.0-nFeS。
L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁混合物Cys0.5-nFeS的扫描电镜图如图1所示,L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁混合物Cys0.5-nFeS的高分辨率透射电镜如图2所示
从图1的扫描电镜图上看,实施例1制得的纳米硫化铁混合物中存在纳米颗粒。图2的透射电镜图证实了纳米片材中存在单晶结构的四硫化三铁。
实施例2:本发明半胱氨酸不同添加量的纳米硫化铁抗口腔变异链球菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)采用平板计数法对实施例1中不同产品(图3中分别以Cys0-nFeS、Cys0.5-nFeS和Cys1.0-nFeS为代表)进行抗菌性能检测;
(2)将以上步骤(1)中各材料用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL的纳米溶液;
(3)LMW液体培养基过夜活化口腔变异链球菌,次日以1:20转接,在37℃,5%CO2恒温培养箱培养4h,待OD600nm达到1.0时用0.1mol/mL醋酸钠溶液将口腔变异链球菌,制备成含菌量约为107cfu/mL的菌悬液;
(4)将步骤(3)制备的菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另将步骤(3)制备的菌悬液100μl分别和步骤(2)中制备的100μl不同纳米溶液加入800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为实验组;
(5)待孵育30分钟后,将各混合液分别接种到LMW琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,24-48h监测平板上的细菌生长情况;
(7)结果表明,本发明所制备的纳米硫化铁具有高效的抗菌性能。统计结果如图3所示。
从图3可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗口腔变异链球菌性能,并且产品Cys0.5-nFeS的抗口腔变异链球菌性能最优。
实施例3:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗口腔变异链球菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(3)LMW液体培养基过夜活化口腔变异链球菌,次日以1:20转接,在37℃,5%CO2恒温培养箱中生长4h,待OD600nm达到1.0时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将口腔变异链球菌适当稀释,制备成含菌量约为107cfu/mL的菌悬液;
(4)取口腔变异链球菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到LMW营养琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,24-48h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图4所示。
从图4可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗口腔变异链球菌性能。
实施例4:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗口腔生物膜性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(2)LMW液体培养基过夜活化口腔变异链球菌,次日以1:20转接,在37℃,5%CO2恒温培养箱中生长4h,待OD600nm达到1.0时,将口腔变异链球菌适当稀释,制备成含菌量为104cfu/mL的菌悬液;
(3)取步骤(2)的口腔变异链球菌悬液加入无菌24孔板,并垂直放置经过无菌唾液预处理过的羟基磷灰石片;在培养时间点到达19h、29h和43h将羟基磷灰石片置于步骤(1)制得的0.5mg/mL和0.25mg/mL的纳米溶液中作用10分钟,随后换液培养,对照组不作处理;
(4)培养43h后,取各组羟基磷灰石片表面的生物膜进行超声处理,分散生物膜内部的变异链球菌;
(5)将生物膜悬液梯度稀释并取100uL在LMW营养琼脂平板培养基表面并涂布均匀,将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,24-48h后监测平板上的菌落生长情况;对剩余生物膜进行烘干称重。生物膜CFU以及干重结果如下图5中(A)与(B)所示,其中,图5A为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗口腔生物膜性能检测结果示意图,图5B为本发明实施例1涉及的纳米硫化铁抗口腔生物膜性能检测结果干重示意图。
从图5可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗口腔生物膜性能。
实施例5:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗金黄色葡萄球菌野生菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(3)LB液体培养基过夜活化金黄色葡萄球菌野生菌,次日以1:100转接,在37℃,220rpm摇床恒温培养3h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量为107cfu/mL的菌悬液;
(4)取步骤(3)制得的细菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到LB琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,12-24后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图6所示。
从图6可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗金黄色葡萄球菌野生菌性能。
实施例6:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗MRSA金黄色葡萄球菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(3)LB液体培养基过夜活化MRSA金黄色葡萄球菌,次日以1:100转接,在37℃,220rpm摇床恒温培养3h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量约为107cfu/mL的菌悬液;
(4)取细菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到LB琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,12-24h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图7所示。
从图7可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗MRSA金黄色葡萄球菌性能。
实施例7:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗MDR金黄色葡萄球菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(3)LB液体培养基过夜活化MDR金黄色葡萄球菌,次日以1:100转接,在37℃,220rpm摇床恒温培养3h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量约为109cfu/mL的菌悬液;
(4)取细菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到LB琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,12-24h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图8所示。
从图8可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗MDR金黄色葡萄球菌性能。
实施例8:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗大肠杆菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(3)LB液体培养基过夜活化大肠杆菌,次日以1:100转接,在37℃,220rpm摇床恒温培养3h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量约为109cfu/mL的菌悬液;
(4)取细菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到LB琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,12-24h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图9所示。
从图9可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗大肠杆菌性能。
实施例9:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗铜绿假单胞菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(3)LB液体培养基过夜活化铜绿假单胞菌,次日以1:100转接,在37℃,220rpm摇床恒温培养3h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量约为109cfu/mL的菌悬液;
(4)取细菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到LB琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,12-24h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图10所示。
从图10可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗铜绿假单胞菌性能。
实施例10:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗沙门氏菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液;
(3)沙氏液体培养基过夜活化沙门氏菌,次日以1:100转接,在37℃,220rpm摇床恒温培养3h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量约为107cfu/mL的菌悬液;
(4)取细菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到沙氏琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,12-24h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图11所示。
从图11可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗沙门氏菌性能。
实施例11:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗加德纳菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米溶液;
(3)BHI液体培养基过夜活加德纳菌,次日以1:100转接,在37℃,5%CO2恒温培养箱培养5h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量约为108cfu/mL的菌悬液;
(4)取细菌悬液100μl加入900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到哥伦比亚血平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养,48h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图12所示。
从图12可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗加德纳菌性能。
实施例12:本发明实施例1涉及的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁抗白色念珠菌性能检测方法,检测方法包括如下步骤:
(1)平板计数法对实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁进行抗菌性能检测;
(2)将实施例1制备的L-半胱氨酸来源的纳米硫化铁用无菌双蒸水溶解成浓度为5mg/mL和2.5mg/mL的纳米溶液;
(3)YPD液体培养基过夜活化白色念珠菌,次日以1:100转接,在37℃,220rpm摇床恒温培养24h,待OD600nm达到0.8时,用0.1mol/mL醋酸钠溶液将细菌适当稀释,制备成含菌量约为107cfu/mL的菌悬液;
(4)取细菌悬液100μl加入含900μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液中混匀作为对照组;另取两份800μl的0.1mol/mL醋酸钠溶液,均加入100μl的步骤(3)制备的菌悬液,同时分别加入100μl的步骤(2)制备100μl的5mg/mL和2.5mg/mL的纳米硫化铁溶液,混匀作为实验组;
(5)待30分钟后,将各混合液分别接种到YPD琼脂平板培养基表面并涂布均匀;
(6)将涂好的各平板倒置于37℃,5%恒温培养箱中进行培养,16-24h后监测平板上的菌落生长情况。统计结果如图13所示。
从图13可看出,跟对照组溶液相比,本发明实施例1所生成的纳米硫化铁混合物具有明显的抗白色念珠菌性能。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述,各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。
以上所述仅为本发明的实施例而已,并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种以半胱氨酸为硫源的抗菌纳米硫化铁混合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括利用铁源在制备纳米四氧化三铁颗粒的过程中加入硫源的步骤,所述硫源为半胱氨酸;所述铁源与所述半胱氨酸的摩尔比为1:0.01-10。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述铁源与所述半胱氨酸的摩尔比为1:0.02-5,优选1:0.05-2,更优选1:0.06-1,更优选1:0.1-0.8,更优选1:0.2-0.6,更优选1:0.3-0.5。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,所述利用铁源制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒的步骤;
优选的,所述利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用铁源、水或非水溶剂以及碱性溶液作为反应物的步骤;
更优选的,所述制备方法包括如下步骤:将铁源、水或非水溶剂、碱性溶液和硫源混合得反应液,将反应液经过水热法或溶剂热法制备成为纳米硫化铁混合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将铁源与水或非水溶剂按比例溶解,得反应液A;
(2)向反应液A中加入碱性溶液,搅拌使其溶解,得反应液B;
(3)向反应液B中加入硫源,搅拌使其溶解,得反应液C;
(4)将反应液C加热制备得到纳米硫化铁混合物。
5.根据权利要求3-4任一所述的制备方法,其特征在于,
所述铁源选自二价铁和/或三价铁,优选氯化铁、硫酸亚铁、硝酸铁、溴化铁中的一种或多种;
和/或,所述非水溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的一种或多种;优选的,所述非水溶剂为醇类溶剂;更优选的,所述醇类溶剂为乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的一种或多种;
和/或,所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、NH4 +中的一种或多种的溶液,优选,醋酸钠、柠檬酸钠和/或碳酸氢钠的溶液。
6.根据权利要求3-5任一所述的制备方法,其特征在于,所述铁源与水或非水溶剂的摩尔比为1:1-1000;
和/或,所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/L。
7.一种以半胱氨酸为硫源的抗菌纳米硫化铁混合物,其特征在于,所述纳米硫化铁混合物通过权利要求1-6任一所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的纳米硫化铁混合物在制备抗菌组合物中的应用;
优选的,所述菌为细菌或真菌;
更优选的,所述细菌选自变异链球菌、金黄色葡萄球菌野生菌、MRSA金黄色葡萄球菌、MDR金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、加德纳菌、沙门氏菌中的一种或多种;
更优选的,所述真菌选自白色念珠菌或霉菌。
9.权利要求7所述的纳米硫化铁混合物在制备由于细菌或真菌感染所致的感染性疾病的药物中或在治疗伤口愈合的药物中的应用;
优选的,所述纳米硫化铁混合物在制备治疗由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及其多种耐药菌引发的感染性疾病的药物中的应用;
更优选的,所述纳米硫化铁混合物在制备治疗由口腔变异链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、加德纳菌、白色念珠菌等引发的感染性疾病的药物中的应用。
10.一种抗菌组合物,其特征在于,所述组合物包含权利要求7所述的纳米硫化铁混合物。
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