CN107304429A - 调控微生物生物被膜形成的基因靶点及其应用 - Google Patents

调控微生物生物被膜形成的基因靶点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了调控微生物生物被膜形成的基因靶点及其应用，具体地，本发明公开了一种Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的用途，用于制备(i)用于抑制、瓦解或降解微生物生物被膜的制剂或制品；和/或(ii)抗菌药物。在本发明中，抑制Nuo2蛋白的表达，可显著(a)抑制念珠菌属菌株的生长；(b)降低念珠菌属菌株的毒力；(c)抑制念珠菌属菌株的ALS3、HWP1和ECE1基因的表达；(d)抑制念珠菌属菌株生物被膜的形成；和/或(e)瓦解和/或降解念珠菌属菌株已经形成的生物被膜。

Description

调控微生物生物被膜形成的基因靶点及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种调控微生物生物被膜形成的基因靶点及其应用。
背景技术
白色念珠菌是一种人体内重要的机会性致病真菌，广泛分布于人体黏膜、各组织、器官，包括口腔、皮肤、血液、肠道、尿道组织以及肝脏、肾脏、脾脏和肺等，常引起鹅口疮、血流感染、中枢神经系统感染、眼内炎、骨髓炎、泌尿生殖道感染等[1]。白色念珠菌是一种单细胞假丝酵母菌，曾一度认为形态上只具有二相性，包括酵母相和菌丝相，通过后来研究发现还存在第三种状态，即假菌丝态，在外界环境刺激和内部信号分子调控下三种形态之间可以相互转换[2]。其中菌丝相的白色念珠菌更易粘附和侵袭宿主组织，是白色念珠菌在机体内的主要致病形式。在自然界中，白色念珠菌并非以浮游状态或单菌种的方式生长，而是不同种属微生物共同定植于生物或者非生物载体表面，通过分泌一种多糖蛋白复合物细胞外基质(Extracellular Polymeric Substance.EPS)，将自身包裹成菌丝态的微菌落，在环境的影响下形成高度组织化、系统化的微菌落膜性聚合物生物膜，其重要后果是使白色念珠菌对多种唑类药物呈现高度耐药，敏感度下降几十倍甚至几百倍[1]。据研究表明，65％的人类感染性疾病与生物膜的形成有关，白色念珠菌在机体环境中多与细菌混合形成生物膜存在，广泛存在于医疗器械材料表面，如静脉导管，导尿管，隐形眼镜等，还包括供水系统，空调系统和食品加工设备等，其中最常见的是白色念珠菌-金黄色葡萄球菌生物膜混杂在一块并感染重病患者，引发较高的发病率与病死率[2]。
白色念珠菌生物膜的显著特点是高度耐药性，抵御外界不良环境和逃避宿主的免疫机制。其生物膜的耐药机制主要包括渗透障碍、生物膜内真菌对抗菌药物不敏感的特殊生理状态和部分耐药基因的高表达。白色念珠菌发挥致病作用的关键就是在特定环境下诱导下由酵母态向菌丝态转变，而这一生长和形态转变过程基于对体内可利用碳源消耗供能的基础上，这些碳源包括发酵碳源和 非发酵碳源。
白色念珠菌的生物膜是其表面生长的重要结构,是临床上医疗植入物发生血源性白色念珠菌感染传播的主要诱因,也是抗真菌耐药形成的重要因素,它的形成和耐药机制的复杂性决定了生物膜相关性感染的临床治疗极为困难。生物膜的特性决定了生物膜一旦建立后消灭极为困难,因此阻止生物膜的形成是防治生物膜相关性感染的第一步也是很重要的一步。
因此，本领域迫切需要开发一种能够特异性的针对念珠菌属菌株(如白色念珠菌)生物膜的靶向性药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够特异性的针对念珠菌菌属菌株(如白色念珠菌)生物膜的靶向性药物。
本发明第一方面提供了一种Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的用途，用于制备(i)用于抑制、瓦解或降解微生物生物被膜的制剂或制品；和/或(ii)抗菌药物。
在另一优选例中，所述的生物被膜包括念珠菌属(Candida species)菌株的生物被膜。
在另一优选例中，所述的生物被膜为白色念珠菌的生物被膜
在另一优选例中，所述制剂或制品选自下组：医疗器械清除剂、医疗器械清洁剂、医疗器械毒剂、杀菌剂、医疗器械护理剂、或其组合。
在另一优选例中，所述制剂或制品选自下组：微生物生物被膜清除剂、医用导管清洁剂、医用插管清洁剂、医用仪器管道清洁剂、医用器具消毒剂、人工关节清洁剂、抑菌剂、杀菌剂、医用导管护理剂、医用仪器护理剂、或其组合。
在另一优选例中，所述制剂包括微生物被膜抑制剂。
在另一优选例中，所述制剂用于防止形成微生物被膜或抑制已形成的微生物被膜。
在另一优选例中，所述抑制剂包括小分子化合物。
在另一优选例中，所述制剂或所述抗菌药物用于选自下组的一种或多种用途：
(a)抑制念珠菌属菌株的生长；
(b)降低念珠菌属菌株的毒力；
(c)抑制念珠菌属菌株的ALS3、HWP1和ECE1基因的表达；
(d)抑制念珠菌属菌株生物被膜的形成；
(e)瓦解和/或降解念珠菌属菌株已经形成的生物被膜。
在另一优选例中，所述念珠菌属菌株选自下组：白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、或其组合。
在另一优选例中，所述念珠菌属菌株包括白色念珠菌。
在另一优选例中，所述的制剂或药物的剂型为固体剂型、液体剂型或半固体剂型。
在另一优选例中，所述的制剂或药物的剂型选自下组：洗剂、粉剂、膏剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、酊剂、涂覆料、成膜粘合剂。
在另一优选例中，所述的制剂或药物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、和滴剂。
本发明第二方面提供了一种确定测试化合物是否是Nuo2蛋白的抑制剂或促进剂的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在非发酵碳源条件下，在测试化合物的存在下，培养表达ALS3、HWP1、和/或ECE1基因的念珠菌属菌株一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的ALS3、HWP1、和/或ECE1基因的表达量E1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中ALS3、HWP1、和/或ECE1基因的表达量E2；
(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是Nuo2蛋白抑制剂；如果E1显著高于E2，则表示所述测试化合物是Nuo2蛋白促进剂。
在另一优选例中，所述方法还包括比较念珠菌菌株在非发酵碳源条件下的生长情况。
在另一优选例中，所述方法还包括同时观察在非发酵碳源条件下，念珠菌菌株表型的变化情况。
在另一优选例中，所述表型的变化情况包括：生物膜缺陷、ROS增加、和/或菌丝生长被抑制。
在另一优选例中，所述方法还包括比较念珠菌菌株在正常条件下的生长情况。
在另一优选例中，所述念珠菌菌株包括白色念珠菌SN250。
在另一优选例中，所述正常条件指在发酵碳源培养基中培养。
在另一优选例中，所述发酵碳源选自下组：葡萄糖、果糖、甘露糖、或其组合。
在另一优选例中，所述发酵碳源包括葡萄糖和甘露糖。
在另一优选例中，所述非发酵碳源条件指在非发酵碳源培养基中培养，所述非发酵碳源选自下组：柠檬酸、甘露醇、甘油、山梨醇、或其组合。
在另一优选例中，所述非发酵碳源包括甘露醇。
在另一优选例中，所述“显著低于”指E1/E2≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述“显著高于”指E1/E2≥2,较佳地，≥3，更佳地≥4。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的Nuo2蛋白抑制剂施用于念珠菌属菌株，测定其对念珠菌属菌株Nuo2蛋白活性的影响。
在另一优选例中，所述步骤(c)还包括测定步骤(a)中所确定的Nuo2蛋白抑制剂对念珠菌属菌株的生长和/或生物被膜的影响。
在另一优选例中，所述念珠菌属菌株包括白色念珠菌。
本发明第三方面提供了一种筛选抑制念珠菌属菌株生物被膜的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)将Nuo2蛋白与化合物库混合，测定化合物库中的化合物与所述Nuo2蛋白的结合情况；
其中，如果所述测试化合物库中的化合物与所述Nuo2蛋白有结合，则表明所述与Nuo2蛋白结合的化合物为候选化合物。
(b)将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于念珠菌属菌株，测定其对念珠菌属菌株生物被膜的影响
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述念珠菌属菌株包括白色念珠菌。
本发明第四方面提供了一种筛选抑制念珠菌属菌株生物被膜的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养念珠菌属菌株一段时间T1，检测测试组所述培养体系中所述线粒体复合物I的形成情况；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中所述线粒体复合物I的形成情况；
(b)如果所述测试组中的所述线粒体复合物I的形成数量Q1显著低于所述对照组中的所述线粒体复合物I的形成数量Q2，则表示所述测试化合物是候选化合物。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(b)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于念珠菌属菌株，测定其对念珠菌属菌株生物被膜的影响。
在另一优选例中，所述“显著低于”指Q1/Q2≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述念珠菌属菌株包括白色念珠菌。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
本发明第五方面提供了一种体外非治疗性的抑制念珠菌属菌株生物被膜的方法，包括步骤：
在Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂存在的条件下，培养念珠菌属菌株，从而抑制所述念珠菌属菌株生物被膜的形成。
在另一优选例中，所述Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的作用浓度为0.01-50mg/L，较佳地，0.02-5mg/L。
在另一优选例中，所述念珠菌属菌株包括白色念珠菌。
本发明第六方面提供了一种抑制念珠菌属菌株生物被膜的药物组合物，包括：
(i)安全有效量的Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂；和
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括其他抗菌剂。
在另一优选例中，所述其他抗菌剂选自下组：唑类(氟康唑、伊曲康唑)、多烯类(两性霉素B、制霉菌素)、5-氟胞嘧啶、棘白菌素(卡泊芬净、西诺芬净、阿尼芬净等及其衍生物)、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的含量为0.0001-99wt％，较佳地为0.001-90wt％，更佳地0.01-50wt％，按组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述的药物用于抑制念珠菌属菌株的生物被膜。
在另一优选例中，所述的药物用于治疗或辅助治疗与念珠菌属菌株感染相关的疾病。
在另一优选例中，所述念珠菌属菌株包括白色念珠菌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了NUO2基因敲除的白色念珠菌在培养基中有一定的生长缺陷。白色念珠菌野生型菌株、NUO2基因敲除菌株以及NUO2基因回补株在YEPD培养基中30℃过夜培养，用PBS清洗并依次按浓度梯度稀释10倍滴板到以YEP(Yeast extract,Peptone)为基质，不同碳源的培养基；其中，A图是本发明菌株在发酵碳源(葡萄糖、甘露糖、果糖)培养基生长情况，基因敲除菌株有部分的生长缺陷；B图是本发明菌株在非发酵碳源(甘露醇、甘油、山梨醇、柠檬酸)培养基中的生长情况，相对于野生型菌株和基因回补菌株，NUO2基因敲除菌株有明显的生长缺陷；C图是本发明菌株的生长趋势，表明NUO2敲除菌株在培养基中有生长缺陷。
图2显示了白色念珠菌NUO2基因敲除菌株在以甘露醇为碳源的培养基中有菌丝生长缺陷。野生型菌株、NUO2基因敲除菌株以及NUO2基因回补株在以SPIDER、YEP(Yeastextract,peptone)为基质，不同碳源的培养基中的菌丝生长情况；其中，A图表明在以发酵碳源为基质的培养基中三组菌株都能正常形成菌丝；B图是以非发酵碳源甘露醇为碳源的培养基中37℃培养5天，NUO2基因敲除菌株不能形成菌丝，而野生型能正常形成菌丝；C图是以甘露醇为碳源的培养基中37℃培养7天，NUO2基因敲除菌株不能形成菌丝。
图3显示了白色念珠菌NUO2基因敲除菌株在甘露醇为碳源的培养基中有生物膜生长缺陷。野生型菌株、NUO2基因敲除菌株以及NUO2基因回补株在以SPIDER，YEP(Yeastextract peptone)为基质，不同碳源培养基中生物膜形成情况；A图说明三组菌株在以发酵碳源的培养基中都能正常形成生物膜；B图说明NUO2基因敲除菌株在以甘露醇为碳源的培养基中不能形成生物膜；C图显示在以甘露醇为碳源的培养基中，NUO2基因敲除菌株不能形成生物膜，也不能粘附在硅胶片上；D图是在C图的基础上将硅胶片烘干后称重证明NUO2基因敲除菌株的生物重量，相比于野生型和回补菌株，基因敲除菌株生物膜的重量有明显减少；E图说明在以葡萄糖为碳源的培养基中三株菌株中细胞壁相关基因ALS3，ECE1，HWP1的mRNA水平未见明显区别。在以甘露醇为碳源的培养基 中NUO2基因敲除菌株细胞壁相关基因ALS3，ECE1，HWP1的mRNA水平明显降低；F图 XTT还原法结果说明NUO2基因促进生物膜的代谢活性。
上述各图中，WT为野生型菌株。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，敲除白色念珠菌的NUO2基因后，白色念珠菌菌株的生长明显受到了抑制，并且有严重的生长缺陷。具体地，在非发酵碳源培养基中，敲除白色念珠菌的NUO2基因可显著抑制白色念珠菌的菌丝及其生物被膜的形成，并可瓦解其已形成的生物被膜，还可抑制其毒力因子相关基因(ALS3、HWP1、ECE1)的表达，因此，NUO2基因可作为新型抗真菌病(尤其是抑制微生物生物被膜)的药物靶点。在此基础上，本发明人完成了本发明。
SPIDER培养基：是一种常用培养基，原始配方里的碳源是甘露醇，在本发明中，将SPIDER培养基中的原始碳源更换为本发明所用的碳源。
念珠菌属和白色念珠菌
白色念珠菌(Candida albicans)是念珠菌属的一种，是一种单细胞假丝酵母菌，曾一度认为形态上只具有二相性，包括酵母相和菌丝相，通过后来研究发现还存在第三种状态，即假菌丝态，在外界环境和内部信号分子刺激下三种状态之间可以相互转换。
白色念珠菌发挥致病作用的关键就是在特定环境下诱导下由酵母态向菌丝态转变，而这一生长和形态转变过程基于对体内可利用碳源消耗供能的基础上，这些碳源包括发酵碳源和非发酵碳源。
本发明的发明人通过筛选实验室白色念珠菌的基因敲除文库，发现白色念珠菌呼吸链上线粒体复合物I NUO2敲除菌株在非发酵碳源培养基中培养有明显的生长缺陷、并伴有不能形成菌丝以及生物膜，因此将白色念珠菌线粒体复合物I NUO2基因作为靶点，通过抑制NUO2基因的功能和表达，进而抑制白色念珠菌生物膜的形成，最终大大减弱白色念珠菌生物膜所引起的重大感染疾病。
线粒体呼吸链复合物I NUO2基因
线粒体呼吸链酶也称为线粒体呼吸链复合物、线粒体呼吸链复合酶。线粒体呼吸链位于线粒体内膜上，由5个复合物组成，分别为：NADH(也称为复合物I)、琥珀酸氧化还原酶(也称为复合物II)、细胞色素C氧化还原酶(复合物III)、细胞色素C氧化酶(也称为复合物IV)和ATP合成酶(也称为复合物V)。线粒体复合物Ⅰ，又称烟碱胺腺嘌呤二核苷酸泛琨氧化还原酶(NADH:ubiquinone oxidoreductase)，是一个嵌入到线粒体内膜的L型蛋白，主要作用是将电子从NADH转移到位于膜间隙中与辅酶Q结合的质子。哺乳动物的线粒体复合物Ⅰ包括在所有物种中都非常保守的疏水中心亚基，这个疏水中心由14个来自原核生物的亚基蛋白组成。其中7个亚基由线粒体基因组编码，作用是使质子穿过线粒体内膜到达膜间隙，另外7个亚基与辅基FMN结合来催化NADH氧化反应，将电子从黄素蛋白经NADH转移到铁硫复合物。除了这14个亚基之外，真核生物还包括由细胞核或者线粒体编码的补充亚基，在这些补充亚基中，相对于哺乳动物有两个亚基是白色念珠菌特有的，其中一个是NUO2，另一个是NUO1。
在本发明中，意外的发现，抑制NUO2基因的表达，居然会显著(i)抑制念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)的生长；(ii)降低念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)的毒力；(iii)抑制念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)的ALS3、HWP1和ECE1基因的表达；(iv)抑制念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)生物被膜的形成；和/或(v)瓦解和/或降解念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)已经形成的生物被膜。
毒力相关基因
白色念珠菌的毒力因子主要包括与粘附有关的粘附素、与侵入相关的酶及其表型转换相关蛋白，粘附素是促进白念珠菌粘附于宿主细胞的生物分子，编码白色念珠菌粘附素多肽的基因主要包括Als蛋白家族、Hwp1p等。
Hwp1p是一个独特的粘附素蛋白，它表达在菌丝上并通过共价键与宿主细胞结合。
在本发明中，抑制NUO2蛋白的表达可显著抑制白色念珠菌的重要粘附相 关基因ALS3以及重要菌丝形成相关基因HWP1和ECE1的表达，从而抑制白色念珠菌生物被膜的形成。
生物被膜
如本文所用，术语“生物被膜”、“生物膜”可互换使用，均指微生物共同定植于生物或者非生物载体表面，通过分泌一种多糖蛋白复合物细胞外基质(ExtracellularPolymeric Substance.EPS)，将自身包裹成菌丝态的微菌落，在外环境的影响下形成高度组织化、系统化的微菌落膜性聚合物生物膜，是一种复杂的三维结构。
药物组合物和施用方法
本发明提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成注射剂或粉剂，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法或用冷冻干燥的方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如注射剂、粉剂、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的药物组合物还可与其他抗菌剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地，该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
抑制念珠菌属菌株生物被膜的方法
本发明还提供了一种抑制念珠菌属菌株生物被膜的方法，包括步骤：
在Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂存在的条件下，培养念珠菌属菌株，从而抑制所述念珠菌属菌株生物被膜的形成。
在本发明中，对念珠菌属菌株没有特别限制，一种优选的念珠菌属菌株为白色念珠菌，更优选的，为白色念珠菌SN250。
在本发明中，对Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的作用浓度没有特别限制，在一种优选的实施方式中，Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的作用浓度为0.01-50mg/L，较佳地，0.02-5mg/L。
Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂及其用途
通过各种筛选方法，可筛选出与Nuo2蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
典型地，本发明的抑制剂的例子包括(但并不限于)：下调本发明Nuo2蛋白表达量或活性的小分子化合物，或抑制毒力因子相关基因(ALS3、HWP1和/或ECE1基因表达的小分子化合物，或与Nuo2蛋白结合的小分子化合物，或抑制线粒体复合物I形成的小分子化合物。
本发明蛋白抗体、抑制剂、拮抗剂、受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可用于抑制念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)的生长、降低念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)的毒力、抑制念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)的生物被膜的形成以及瓦解和/或降解念珠菌属菌株(尤其是白色念珠菌)已经形成的生物被膜。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，用于抗真菌病的治疗。在使用本发明的抑制剂时，还可同时使用其他抗菌剂，如唑类(氟康唑、伊曲康唑)、多烯类(两性霉素B、制霉菌素)、5-氟胞嘧啶、棘白菌素(卡泊芬净、西诺芬净、阿尼芬净等及其衍生物)等。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现通过抑制NUO2基因的功能和表达，可显著抑制念珠菌属菌株(如白色念珠菌)生物膜的形成、显著抑制念珠菌属菌株(如白色念珠菌)的生长及其毒力，还可显著瓦解和/或抑制念珠菌属菌株(如白色念珠菌)已形成的生物被膜，最终大大减弱念珠菌属菌株(如白色念珠菌)生物膜 所引起的重大感染疾病。
(2)本发明首次发现通过抑制NUO2基因的功能和表达，可显著抑制念珠菌属菌株(如白色念珠菌)毒力相关基因(如ALS3、HWP1和/或ECE1基因)的表达。
因此，本发明具有潜在的广阔应用前景，例如有望开发成抗菌药物，消除念珠菌属菌株(如白色念珠菌)的耐药性，并有望成为新型抗真菌病的药物靶点，可设计一款通过抑制生物膜的形成而减弱病原真菌的毒力作用的菌株，甚至可作为无毒菌株。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，白色念珠菌SN250为常用菌株，可获自中国科学院上海巴斯德研究所。
通用方法和材料
重组质粒构建：回补菌株的构建，先在Candida Genome Data Base数据库中搜索出目的基因序列，通过Seqbuild sequence和Primer5软件设计出异源回补目的基因的质粒图谱，包括同源臂、目的基因片段、筛选标记、酶切位点等。通过PCR技术合成相关片段，在载体pRS316、SSSDNA(鲑鱼精DNA)、LiOAC、PEG600的作用下转化至酿酒酵母W303菌株中进行同源重组构建质粒，将转化得到的转化子经YEPD培养后通过抽提基因组DNA而获得质粒，再经特异性酶切位点外切酶的切开并纯化后电转至大肠杆菌DH5α中，将转化子抽提质粒再经特异性酶切位点外切酶的切开验证和测序验证，转化至目的基因缺失的白色念珠菌(即SN250nuo2缺失株)中(该菌株用同源重组的方法得到)，最后通过菌落PCR验证构建的菌株。
滴板实验：分别将三株菌接在YEPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)培养基中30℃过夜培养，第二天取0.5光密度(OD600nm)菌液用1×PBS清洗两遍，12000rpm离心1min收菌，溶解于1ml 1×PBS中，取5μl菌液滴板，并依次将菌 液稀释10,100，1000倍，分别取菌液5μl滴板，30℃培养两天。
生长动力学实验：分别将三株菌在YEPD培养基中30℃过夜培养，第二天取起始OD600nm＝0.1菌液转接到相对应的不同碳源的培养基中30℃培养，分别取不同的时间点测定OD600nm值计算白色念珠菌的生长情况。
菌丝生长实验：分别将三株菌在YEPD培养基中30℃过夜培养，第二天取起始OD600nm＝0.05菌液转接到相对应的不同碳源的培养基试管中37℃旋转培养6h,再用甲醛固定菌液，显微镜下观察。
生物膜实验：分别将三株菌在YEPD培养基中30℃过夜培养，第二天取起始OD600nm＝0.1的菌液转接到相对应的不同碳源的培养基12孔板中37℃摇床培养2h，用1×PBS清洗两遍，再加入相对应培养基37℃培养24h，加有硅胶片的培养基中菌株会通过形成生物膜而附着在上边，最后通过干燥称量硅胶片的质粒计算生物膜的重量。
XTT减低法测定生物膜生长动力学分析：接菌在YEPD培养基中30℃过夜培养，第二天用BPS清洗两遍后，将菌转接至YEP(不加葡萄糖的YEPD培养基)加甘露醇的培养基中，浓度为1×106个细胞/ml菌悬液100μl加到96孔细胞培养板中，37℃分别培养2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h后弃去培养基，并用PBS清洗未粘附菌，用XTT粉末用0.5g/L林格液溶解，0.22um孔径的滤器过滤除菌，用酶标仪在OD490nm的吸光值下读数。
RNA抽提和实时定量RT-PCR分析[4]：利用65℃热酚法抽提总RNA[5]，然后用Ambion公司无DNA试剂盒。取10μg的RNA进行反转成cDNA,以ACT1为内参，通过定量PCR进行数据收集与分析。
实施例1 白色念珠菌线粒体复合物I NUO2基因敲除株在发酵碳源和非发酵碳源培养基中有生长缺陷
白色念珠菌的生存能力很强，在富营养条件下能够快速的繁衍，而且适应能力也极强，能在多种复杂恶劣的环境中生存。
结果如图1所示。结果显示，在图1中，A图显示的都是在发酵碳源为唯一碳源的丰富营养培养基条件下，野生型菌株和NUO2基因回补菌株生长非常迅速，结合C图生长趋势曲线可以看出，NUO2基因敲除菌株有一定的生长缺陷；B图显示的是在非发酵碳源(柠檬酸)为唯一碳源的培养基条件下，NUO2基因敲除菌株的生长有很严重缺陷，而在以甘露醇、甘油、山梨醇分别为唯一碳源培养基中生长 速度相对更快一些，但也存在明显的生长缺陷；通过C图可以得出结论，在发酵碳源培养基中，NUO2基因敲除菌株生长速度为正常野生型和回补株的一半，而在非发酵碳源(如甘露醇)培养基中生长24h OD600nm也就达到极限为2。
结果表明，线粒体复合物I亚基Nuo2对白色念珠菌的生长有很重要的作用。
实施例2 白色念珠菌线粒体复合物I NUO2基因敲除株在非发酵碳源培养基中抑制菌丝形成
白色念珠菌的菌丝生长与毒力有很密切地联系，通常调控菌丝生长因子被定义为毒力因子，影响菌丝生长的因素很多。其中线粒体功能在白色念珠菌酵母态转换成菌丝态过程中具有重要作用[6]。
结果如图2所示。结果显示，图2A显示在液体发酵碳源培养基中，NUO2基因敲除菌株能够正常形成菌丝，而相反，2B图显示在以甘露醇为碳源的培养基中NUO2基因敲除菌株不形成菌丝，结合2C图所示基因敲除菌株在YEP和甘露醇的固体培养基中、在诱导菌丝形成环境温度37℃的条件下连续培养7天都没能形成菌丝。
结果表明敲除菌株不能利用甘露醇供能，进而抑制白色念珠菌菌丝的形成。
实施例3 白色念珠菌线粒体复合物I NUO2基因敲除株在非发酵碳源培养基中抑制生物膜的形成并影响毒力因子的表达
结果如图3所示。结果显示，图3A中显示，在发酵碳源培养基中，三组菌株都能够正常形成生物膜。而图3B显示，基因敲除菌株不能很好的利用甘露醇为碳源形成生物膜。图3C图显示，在培养细胞的12孔板底部放入硅胶片作为生物膜形成所吸附的载体，接菌后培养，分别称量硅胶片和其附着生物膜重量，得出生物膜重量。图3D显示，基因敲除菌株生物膜的重量明显低于野生型和基因回补株。白色念珠菌生物膜形成过程首先是酵母细胞的吸附,经过3h～6h形成芽管,完全成熟的白色念珠菌的生物膜需24h～48h的孵育。图3E图的Quantitative RT-PCR实验结果显示，NUO2基因敲除菌株在添加甘露醇为碳源的培养基条件下，白色念珠菌的重要粘附相关基因ALS3以及重要菌丝形成相关基因HWP1和ECE1的表达水平相对显著下降，表明这三个基因的表达下降可能是菌株生物被膜形成能力下降的重要原因。图3F图是XTT分析实验，通过比较在490nm波长处吸收峰的大小，考察NUO2基因敲除前后菌株在甲硫氨酸和半胱氨酸不同浓度条件下来评价细胞 数目和细胞外高分子物质的多少，吸光度数值越高说明形成的生物膜越好；XTT实验分析生物膜生长过程中活力的变化，在0-24h之间，生物膜活力随着生物膜的生长时间延长而增加，24h时达到顶峰，到48h后生物膜活力有下降的趋势。
图2和图3的结果表明，有可能是在甘露醇为碳源培养基中酵母细胞不能很好的利用碳源来供能。白色念珠菌的毒力因子主要包括与粘附有关的粘附素、与侵入相关的酶及其表型转换相关蛋白，粘附素是促进白念珠菌粘附于宿主细胞的生物分子，编码白色念珠菌粘附素多肽的基因主要包括Als蛋白家族、Hwp1p等。
图3的结果进一步说明白色念珠菌NUO2基因能影响白色念珠菌生物膜的形成。
综合以上结论可以得出，白色念珠菌线粒体复合物I亚基Nuo2在非发酵碳源(如甘露醇)条件下对生物膜形成具有决定性作用，而这也正是人体肠道微环境中主要碳源成分，因此NUO2基因有望成为新型抗真菌病的药物靶点，可设计一款通过抑制生物膜的形成而减弱病原真菌的毒力作用的菌株，甚至可作为无毒菌株。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献：
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[5]She,X.,Khamooshi,K.,Gao,Y.,Shen,Y.,Lv,Y.,Calderone,R.,Fonzi,W.,Liu,W.,and Li,D.(2015),Fungal-specific subunits of the Candida albicansmitochondrial complex I drive diverse cell functions including cell wal lsynthesis.Cel l Microbiol,17,1350–1364.
[6]Qu Y,Jel icic B,Pettol ino F,et al.Mi tochondrial Sorting andAssembly Machinery Subunit Sam37 in Candida albicans:Insight into the Rolesof Mi tochondria in Fi tness,Cel l Wall Integri ty,and Virulence.EukaryoticCell.2012；11(4):532-544.doi:10.1128/EC.05292-11.。

Claims (10)

1.一种Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备(i)用于抑制、瓦解或降解微生物生物被膜的制剂或制品；和/或(ii)抗菌药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的生物被膜包括念珠菌属(Candidaspecies)菌株的生物被膜。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述制剂或所述抗菌药物用于选自下组的一种或多种用途：
(a)抑制念珠菌属菌株的生长；
(b)降低念珠菌属菌株的毒力；
(c)抑制念珠菌属菌株的ALS3、HWP1和ECE1基因的表达；
(d)抑制念珠菌属菌株生物被膜的形成；
(e)瓦解和/或降解念珠菌属菌株已经形成的生物被膜。
4.一种确定测试化合物是否是Nuo2蛋白的抑制剂或促进剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在甘露醇作为非发酵碳源条件下，在测试化合物的存在下，培养表达ALS3、HWP1、和/或ECE1基因的念珠菌属菌株一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的ALS3、HWP1、和/或ECE1基因的表达量E1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中ALS3、HWP1、和/或ECE1基因的表达量E2；
(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是Nuo2蛋白抑制剂；如果E1显著高于E2，则表示所述测试化合物是Nuo2蛋白促进剂。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的Nuo2蛋白抑制剂施用于念珠菌属菌株，测定其对念珠菌属菌株Nuo2蛋白活性的影响。
6.一种筛选抑制念珠菌属菌株生物被膜的候选化合物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)将Nuo2蛋白与化合物库混合，测定化合物库中的化合物与所述Nuo2蛋白的结合情况；
其中，如果所述测试化合物库中的化合物与所述Nuo2蛋白有结合，则表明所述与Nuo2蛋白结合的化合物为候选化合物。
(b)将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于念珠菌属菌株，测定其对念珠菌属菌株生物被膜的影响。
7.一种筛选抑制念珠菌属菌株生物被膜的候选化合物的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养念珠菌属菌株一段时间T1，检测测试组所述培养体系中所述线粒体复合物I的形成情况；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中所述线粒体复合物I的形成情况；
(b)如果所述测试组中的所述线粒体复合物I的形成数量Q1显著低于所述对照组中的所述线粒体复合物I的形成数量Q2，则表示所述测试化合物是候选化合物。
8.一种体外非治疗性的抑制念珠菌属菌株生物被膜的方法，其特征在于，包括步骤：
在Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂存在的条件下，培养念珠菌属菌株，从而抑制所述念珠菌属菌株生物被膜的形成。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂的作用浓度为0.01-50mg/L，较佳地，0.02-5mg/L。
10.一种抑制念珠菌属菌株生物被膜的药物组合物，其特征在于，包括：
(i)安全有效量的Nuo2蛋白或其编码基因的抑制剂；和
(ii)药学上可接受的载体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107653216A (zh) * 2017-11-22 2018-02-02 广西医科大学 一种铜绿假单胞菌‑烟曲霉菌混合生物被膜体外模型的制作方法
CN109908126A (zh) * 2019-04-24 2019-06-21 上海市皮肤病医院 半胱氨酸在制备抗真菌生物被膜药物中的应用
WO2020174366A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Universidade Do Minho Antisense oligomers for controlling candida albicans infections

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