CN113308386A - 一种缺失mms22基因的白念珠菌减毒菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种白念珠菌减毒菌株，所述白念珠菌减毒菌株为MMS22基因不表达的白念珠菌mms22/mms22缺失株。本发明还公开一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用，所述白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使MMS22基因不表达制得；或者通过制备MMS22蛋白拮抗剂，使MMS22基因表达的蛋白不发挥作用的方法制得。本发明在制备或筛选白念珠菌治疗药物时，以MMS22基因为治疗靶基因，使MMS22基因不表达的药物、或者以MMS22基因表达的蛋白为拮抗对象；或者以MMS22基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株的应用，具体涉及一种白念珠菌减毒菌株、一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用、一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用。
背景技术
白念珠菌（Candida albicans）是一种最重要的人体条件性致病真菌，广泛存在于正常人口腔、呼吸道、肠道及阴道，一般不致病或仅引起轻微的皮肤或粘膜等浅部感染；但当机体免疫功能下降或正常菌群相互制约失调时，其致病能力增强可引起急性、亚急性或慢性侵袭性真菌感染，造成血液系统、呼吸系统等出现深度重症乃至死亡。据统计，白念珠菌导致的侵袭性感染占所有念珠菌感染的40%以上（Chen M, etal., 2018）。当前，免疫受损人群不断增加、临床抗真菌药物的局限性和真菌耐药性问题依然突出（Fisher M C,etal., 2018），导致白念珠菌仍是威胁人类健康的重要真菌病原。
白念珠菌致病机理主要包括菌体形态转换、黏附素、侵袭酶等（Sellam A, etal.,2016）。其中，菌体形态转换对于致病有重要意义：白念珠菌的菌丝形态对于细胞适应寄生环境获取营养、逃逸宿主免疫细胞的吞噬和杀伤，以及侵入深部组织有重要作用，因而具有重要的致病意义；相反，若抑制菌丝的生成，则可显著降低其细胞毒力。
白念珠菌的菌丝生成与多种环境因素相关，如低氧、血清、营养匮乏等均可诱导菌丝生成。目前发现，菌丝发育主要通过两条信号通路，即cAMP/PKA途径和MAPK途径，其下游转录因子分别为Efg1和Cph1，调控菌丝相关特异性基因如HWP1、UME6等转录。此外，菌丝发育受多种调控因子的调节，如BRG1在其中发挥正调控作用，而NRG1则发挥负调控作用抑制菌丝的生成。
DNA损伤修复蛋白对于细胞应对体内外遗传毒性试剂的胁迫有重要意义，可进一步影响白念珠菌在宿主体内的存活和定植能力，如白念珠菌核酸切除修复蛋白RAD23缺失不影响菌丝生成，却明显降低小鼠感染模型中的细胞毒力（Jia F, et al., 2020）。此外，前期发现部分DNA损伤应答相关基因也参与调控菌丝生成：如缺失白念珠菌RAD4能明显抑制菌丝生成，并导致小鼠感染模型中白念珠菌毒力丧失。而白念珠菌MMS22是前期鉴定的一个DNA损伤修复相关蛋白，但其在白念珠菌致病性调控中的作用尚未知，本发明进一步公布了MMS22调控菌丝生成和致病性的重要作用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种白念珠菌减毒菌株、一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用、一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，用于降低白念珠菌酵母-菌丝形态转换率，从而使白念珠菌毒性减弱，以治疗白念珠菌感染。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株为MMS22基因不表达的白念珠菌mms22/mms22缺失株。
进一步的，所述白念珠菌减毒菌株通过胞质分裂相关基因MMS22制得。
进一步的，所述白念珠菌减毒菌株可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使MMS22基因不表达；或者通过制备MMS22蛋白拮抗剂，使MMS22基因表达的蛋白不发挥作用。
本发明的实施例还提供一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用。
进一步的，所述白念珠菌治疗药物以MMS22基因为靶点，筛选或制备使MMS22基因不表达的药物。
进一步的，所述白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使MMS22基因不表达制得；或者通过制备MMS22蛋白拮抗剂，使MMS22基因表达的蛋白不发挥作用的方法制得。
本发明的实施例另外还提供一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用。
进一步的，一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）检测MMS22基因缺失对白念珠菌菌丝发育的影响：将白念珠菌野生型菌株与MMS22缺失株过夜培养后，以1：20比例分别转接到液体YPD+15%血清培养基和Spider培养基中，于37℃继续震荡培养1-2h后，显微镜检缺失株菌丝生成情况。此外，将过夜培养物稀释后，涂布到固体YPD+15%血清培养基和Spider培养基，于37℃静置培养3-5d后，观察菌落形态和浸入生长情况；
（2）检测MMS22缺失的白念珠菌毒性情况：大蜡螟幼虫感染实验，分别将10μL 5×105白念珠菌野生型菌株和MMS22缺失株细胞注射大蜡螟幼虫，观察存活率情况；
（3）检测MMS22基因对白念珠菌在组织定植的影响；分别将1×105CFU白念珠菌野生型菌株和MMS22缺失株细胞注射大蜡螟幼虫，分别在5h、24h和48h收集虫体，研磨匀浆后适当稀释涂布YPD平板，30℃培养2天后计数菌落数。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
（1）本发明的白念珠菌治疗药物为以MMS22基因为治疗靶基因，使MMS22基因不表达的药物、或者以MMS22基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以MMS22基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物；以MMS22基因为靶点，筛选或制备使该基因不表达的药物，用于降低白念珠菌酵母-菌丝形态转换率，从而使白念珠菌毒性减弱，以治疗白念珠菌感染，为治疗白念珠菌感染提供了新的药剂和方向。
（2）本发明的实施例验证了白念珠菌减毒株相对于野生型白念珠菌，其菌丝生成能力大幅降低，在大蜡螟幼虫感染实验中白念珠菌的毒性也显著下降。
（3）本发明的一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，通过检测MMS22基因缺失对菌丝生成的影响情况；检测MMS22缺失的白念珠菌毒性情况；检测MMS22基因对白念珠菌在组织定植的影响等过程，探索出了缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的作用，为治疗白念珠菌感染提供了理论基础，为制备或筛选治疗白念珠菌感染药物提供了方向。
附图说明
图1为本发明的实施例1中MMS22缺失导致白念珠菌菌丝生成缺陷的检测结果图；其中，第一排和第二排位固体菌落形态，而第三排和第四排位液体菌丝形态图。
图2为本发明的实施例2中MMS22在调控大蜡螟感染模型中白念珠菌的细胞毒力的检测结果图；其中，图2A为白念珠菌感染的大蜡螟幼虫存活曲线图；图2B为感染白念珠菌大蜡螟幼虫的大体形态图。
图3为本发明的实施例3中MMS22调控白念珠菌在大蜡螟幼虫定植影响结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1 MMS22基因缺失影响白念珠菌菌丝生成
为了证明MMS22缺失对菌丝生成的影响，本发明进行了白念珠菌液体和固体菌丝生成实验。将白念珠菌野生型菌株与MMS22缺失株过夜培养后，以1：20比例分别转接到液体YPD+15%血清培养基和Spider培养基中，于37℃继续震荡培养1-2h后，显微镜检缺失株菌丝生成情况。此外，将过夜培养物稀释后，涂布到固体YPD+15%血清培养基和Spider培养基，于37℃静置培养3-5d后，观察菌落形态和浸入生长情况。
结果如下：如图1所示，液体YPD+15%血清培养基中，白念珠菌野生型菌株经诱导1.5h后有明显菌丝生成，真菌丝形态细胞比例约87.8%（n=246）；而MMS22缺失株在1.5h时却几乎看不到明显菌丝，真菌丝形态细胞平均为7.2%（n=539），且芽管长度明显短于野生型菌株，如图1中第三排所示；在液体Spider培养基中，MMS22缺失株也表现出明显的菌丝生成障碍了，如图1中第四排所示。此外，在固体YPD+15%血清中，野生型菌株的菌落表面出现明显的皱褶，菌落周围有明显周边菌丝生成，而MMS22缺失株却几乎看不到明显皱褶和周边菌丝的存在，如图1中第一排所示；而在固体Spider培养基中，MMS22缺失株也表现出明显的菌丝生成障碍，如图1中第二排所示。以上结果说明，MMS22的缺失明显抑制了白念珠菌的菌丝生成，可能影响其致病性，图中，WT为野生型菌株。
实施例2 MMS22缺失的白念珠菌毒性显著降低
为了证明MMS22缺失对毒力调控方面的影响，本发明进行了大蜡螟幼虫感染实验。分别将10μL 5×105白念珠菌野生型菌株和MMS22缺失株细胞注射大蜡螟幼虫，观察存活率。结果如图2A和图2B所示，感染野生型菌株的大蜡螟幼虫7天后存活率仅为20%，平均存活期为2.5天；而感染MMS22缺失株的大蜡螟幼虫，7天后存活率平均为90%，与野生型菌株相比差异显著。此外，MMS22缺失株中高表达BRG1基因，显著提高MMS22缺失株的致病性，表现为感染的大蜡螟幼虫7天后存活率为40%，平均存活期约4天。
实施例3 MMS22基因的缺失影响了白念珠菌在组织的定植
为了证明MMS22基因对白念珠菌在内脏定植的影响。分别将1×105CFU白念珠菌野生菌株和MMS22缺失株细胞注射大蜡螟幼虫，分别在5h、24h和48h收集虫体，研磨匀浆后适当稀释涂布YPD平板，30℃培养2天后计数菌落数。结果发现，如图3所示，在感染5h和24h时，野生型组和MMS22缺失株组无明显差异，但在感染48h时，野生型组大蜡螟幼虫中含1943CFU/只，而MMS22缺失株组大蜡螟幼虫含菌落为933CFU/只，与野生型组相比显著降低。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株为MMS22基因不表达的白念珠菌mms22/mms22 缺失株。
2.根据权利要求1所述的一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株通过缺失DNA损伤应答相关基因MMS22制得。
3.根据权利要求2所述的一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使MMS22基因不表达；或者通过制备MMS22蛋白拮抗剂，使MMS22基因表达的蛋白不发挥作用。
4.一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述的一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用，其特征在于，所述白念珠菌治疗药物以MMS22基因为靶点，筛选或制备使MMS22基因不表达的药物。
6.根据权利要求4所述的一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用，其特征在于，所述白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使MMS22基因不表达制得；或者通过制备MMS22蛋白拮抗剂，使MMS22基因表达的蛋白不发挥作用的方法制得。
7.一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用。
8.根据权利要求7所述的一种缺失MMS22基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）检测MMS22基因缺失对白念珠菌菌丝发育的影响：将白念珠菌野生型菌株与MMS22缺失株过夜培养后，以1：20比例分别转接到液体YPD+15%血清培养基和Spider培养基中，于37℃继续震荡培养1-2h后，显微镜检缺失株菌丝生成情况；同时，将过夜培养物稀释后，涂布到固体YPD+15%血清培养基和Spider培养基，于37℃静置培养3-5d后，观察菌落形态和浸入生长情况；
（2）检测MMS22缺失的白念珠菌毒性情况：进行大蜡螟幼虫感染实验，分别将10μL 5×105 白念珠菌野生型菌株和MMS22缺失株细胞注射大蜡螟幼虫，观察存活率情况；
（3）检测MMS22基因缺失对白念珠菌在组织定植的影响：分别将等量白念珠菌野生菌株和MMS22缺失株细胞注射大蜡螟幼虫，分别在5h、24h和48h收集虫体，研磨匀浆后适当稀释涂布YPD平板，30℃培养2天后进行菌落计数。
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