CN111500516A - 一种缺失hof1基因的白念珠菌减毒菌株的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种白念珠菌减毒菌株，所述白念珠菌减毒菌株为HOF1基因不表达的白念珠菌hof1/hof1缺失株。本发明还公开一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用，所述白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使HOF1基因不表达制得；或者通过制备HOF1蛋白拮抗剂，使HOF1基因表达的蛋白不发挥作用的方法制得。本发明另外还公开一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，包括以下步骤：检测HOF1基因缺失对白念珠菌在宿主细胞内存活的影响情况；检测HOF1缺失的白念珠菌毒性情况；检测HOF1基因对白念珠菌在内脏定植的影响。本发明为治疗白念珠菌感染提供了新的药剂和方向。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株的应用，具体涉及一种白念珠菌减毒菌株、一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用、一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用。
背景技术
白念珠菌（Candida albicans）是一种最重要的人体病原真菌，广泛存在于正常人口腔、呼吸道、肠道及阴道，一般不致病或仅引起轻微的皮肤或粘膜等浅部感染；而当机体免疫功能下降或正常菌群相互制约失调时，其致病能力增强可引起急性、亚急性或慢性侵袭性真菌感染，造成血液系统、呼吸系统等出现深度重症乃至死亡。据统计，白念珠菌导致的侵袭性感染占所有念珠菌感染的40%以上（Chen M, etal., 2018）。当前，免疫受损人群不断增加、临床抗真菌药物的局限性和真菌耐药性问题依然突出（Fisher M C, etal.,2018），导致白念珠菌仍是威胁人类健康的重要真菌病原。
白念珠菌致病机理主要包括菌体形态转换、黏附素、侵袭酶等（Sellam A, etal.,2016）。其中，菌体形态转换对于致病有重要意义：白念珠菌的菌丝态对于细胞逃逸宿主免疫细胞的吞噬和杀伤，以及侵入深部组织有重要作用，因而具有更强的致病能力；相反，若抑制菌丝的生成，则可显著降低其细胞毒力。但近期还发现白念珠菌DNA损伤应答途径，参与调控形态转换和抵抗宿主的固有免疫，预示着与致病过程存在密切联系。
在人体内，固有免疫是抵抗病原体感染的第一道防线，巨噬细胞和中性粒细胞吞噬入侵病原体，产生的活性氧（ROS）可损伤其DNA而杀伤入侵病原体。所以正确和及时地感应并修复损伤DNA的能力，对于病原体在宿主内的定植和致病有重要意义，如研究发现ROS可对入侵的白念珠菌造成DNA损伤胁迫并激活其检验点激酶Rad53（Dantas Ada S, etal.,2015）；而缺乏超氧化物歧化酶或过氧化氢酶（SOD5、CTA1）会导致白念珠菌对巨噬细胞抵抗能力减弱，系统感染中的毒力下降（da Rosa J L, etal., 2013；Li C X, etal., 2015）。此外，新型隐球酵母检验点激酶Rad53和Chk1（Jung K W, etal., 2015）也被报道参与毒力调控。
直接的DNA损伤修复蛋白也被证实与毒力存在联系：如白念珠菌重组修复蛋白Rad52和非同源末端连接蛋白Lig4的缺失，均会导致系统感染中毒力丧失（Bellido A,etal., 2018）；白念珠菌组蛋白乙酰基转移酶Rtt109参与维持基因组稳定性，但同时也发现其缺失导致细胞和小鼠感染实验中的毒力显著减弱，且与活性氧存在直接联系（da RosaJ L, etal., 2010）。近期的研究还报道很多白念珠菌DNA损伤修复相关基因如RAD3、CAD26以及FZD1、NOC3等在与巨噬细胞互作中表达显著上调（O’Meara T R, etal., 2010），预示这些DNA损伤修复基因在白念珠菌侵染宿主过程中可能发挥重要作用。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种白念珠菌减毒菌株、一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用、一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，用于降低白念珠菌酵母-菌丝形态转换率，从而使白念珠菌毒性减弱，以治疗白念珠菌感染。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株为HOF1基因不表达的白念珠菌hof1/hof1缺失株。
进一步的，所述白念珠菌减毒菌株通过胞质分裂相关基因HOF1制得。
进一步的，所述白念珠菌减毒菌株可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使HOF1基因不表达；或者通过制备HOF1蛋白拮抗剂，使HOF1基因表达的蛋白不发挥作用。
本发明的实施例还提供一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用。
进一步的，所述白念珠菌治疗药物以HOF1基因为靶点，筛选或制备使HOF1基因不表达的药物。
进一步的，所述白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使HOF1基因不表达制得；或者通过制备HOF1蛋白拮抗剂，使HOF1基因表达的蛋白不发挥作用的方法制得。
本发明的实施例另外还提供一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用。
进一步的，一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）检测HOF1基因缺失对白念珠菌在宿主细胞内存活的影响情况：进行白念珠菌与巨噬细胞共培养实验，将5×105巨噬细胞接种到12孔板中，于37℃、5%CO2中过夜培养，以1：1比例分别加入白念珠菌野生型菌株和HOF1缺失株，2h后洗去未结合的白念珠菌，其中部分巨噬细胞用0.01% SDS裂解后，适当稀释并涂布YPD平板；其余的细胞继续培养6h，用同样的方法裂解细胞并涂布平板；所有平板于30℃培养2天后统计菌落数，比较野生菌菌株和HOF1缺失株的生长情况；
（2）检测HOF1缺失的白念珠菌毒性情况：小鼠毒理实验，分别将1×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射Balb/c小鼠，观察存活率情况；同时，分别将2×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射Balb/c小鼠，并观察存活率；通过检测濒死小鼠肾脏切片，观察感染野生型菌株和HOF1缺失株的小鼠肾脏内是否有菌丝态细胞存在；
（3）检测HOF1基因对白念珠菌在内脏定植的影响；分别将2×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射3只五周龄的Balb/c小鼠，48h后取右肾，研磨匀浆后适当稀释涂布YPD平板，30℃培养2天后计数菌落数；检测感染野生型菌株的小鼠及感染HOF1缺失株的小鼠的肾脏含菌量。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
（1）本发明的白念珠菌治疗药物为以HOF1基因为治疗靶基因，使HOF1基因不表达的药物、或者以HOF1基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以HOF1基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以HOF1基因为靶点，筛选或制备使该基因不表达的药物，用于降低白念珠菌酵母-菌丝形态转换率，从而使白念珠菌毒性减弱，以治疗白念珠菌感染，为治疗白念珠菌感染提供了新的药剂和方向。
（2）本发明的实施例中验证了白念珠菌减毒株相对于野生型白念珠菌，其在巨噬细胞内的存活能力大幅降低，在小鼠系统感染实验中白念珠菌的毒性也显著下降。
（3）本发明的一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，通过检测HOF1基因缺失对白念珠菌在宿主细胞内存活的影响情况；检测HOF1缺失的白念珠菌毒性情况；检测HOF1基因对白念珠菌在内脏定植的影响等过程，探索出了缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的作用，为治疗白念珠菌感染提供了理论基础，为制备或筛选治疗白念珠菌感染药物提供了方向。
附图说明
图1为本发明的实施例1中HOF1缺失导致白念珠菌在巨噬细胞存活能力下降的检测结果图；其中，图1A为白念珠菌与巨噬细胞共培养细胞形态图；图1B为白念珠菌与巨噬细胞共培养2h后存活数统计图；图1C白念珠菌与巨噬细胞共培养6h后存活数统计图。
图2为本发明的实施例2中HOF1在调控小鼠系统感染中白念珠菌的细胞毒力的检测结果图；其中，图2A为低浓度白念珠菌感染的小鼠存活曲线图；图2B为高浓度白念珠菌感染小鼠存活率曲线图；图2C为高浓度白念珠菌感染导致的濒死小鼠肾脏切片糖原染色（PAS）结果图。
图3为本发明的实施例3中HOF1调控白念珠菌在小鼠肾脏的定植的计数菌落数的结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1 HOF1基因缺失对白念珠菌在宿主细胞内存活的影响
为了证明HOF1缺失的白念珠菌在与宿主细胞互作方面的作用，本发明进行了白念珠菌与巨噬细胞（RAW264.7）共培养实验。将 5×105 巨噬细胞接种到 12 孔板中，于37℃、5%CO2 中过夜培养，以1：1比例分别加入白念珠菌野生型菌株和HOF1缺失株，2h 后洗去未结合的白念珠菌，其中部分巨噬细胞用0.01% SDS裂解后，适当稀释并涂布YPD平板；其余的细胞继续培养6h，用同样的方法裂解细胞并涂布平板。所有平板于 30℃培养 2 天后统计菌落数，比较野生菌菌株和HOF1缺失株的生长情况。
结果如下：白念珠菌与巨噬细胞共培养 2h 后，如图1A和图1B所示，与野生型菌株相比，HOF1缺失株存活数显著降低；存活率约为野生型菌株的35%；继续培养 6h 后，HOF1缺失株的存活能力与野生型菌株相比，进一步下降，存活率约为野生型的7%，如图1C所示，与野生型菌株相比，HOF1缺失株存活数进一步降低，这些结果均表明HOF1在白念珠菌与巨噬细胞互作中发挥重要作用。
实施例2 HOF1缺失的白念珠菌毒性显著降低
为了证明HOF1缺失对毒力调控方面的影响，本发明进行了小鼠毒理实验。分别将1×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射Balb/c小鼠，观察存活率-，结果如图2A所示，发现野生型菌株从第5天开始死亡，直至12天所有感染野生型菌株的小鼠全部死亡；而感染HOF1缺失株的小鼠直至21天的观察期结束，全部保持存活，显示毒力显著降低；此外，本发明还分别将高浓度的（2×106）白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射Balb/c小鼠并观察存活率（如图2B所示），野生型菌株注射小鼠后，受感染的小鼠第二天开始死亡，到第三天所有小鼠均死亡，显示平均存活天数为2天；而受HOF1缺失株感染的小鼠，表现出较长的存活周期，直至12天时所有小鼠全部死亡，平均存活期为10.5天；显示毒力显著降低。
通过检测濒死小鼠肾脏切片，如图2C所示为高浓度白念珠菌感染导致的濒死小鼠肾脏切片糖原染色（PAS）结果，箭头所示为菌丝态细胞，显示野生型菌株和HOF1缺失株均可以形成菌丝。本发明发现感染野生型菌株和HOF1缺失株的小鼠肾脏内都可以看到明显菌丝态细胞存在，说明HOF1调控毒力的作用并不是通过影响菌丝生成而实现的。这一结果充分说明HOF1在白念珠菌毒力调控中发挥重要作用，其缺失导致细胞毒力极显著下降。
实施例3 HOF1基因的缺失影响了白念珠菌在肾脏的定植
为了证明HOF1基因对白念珠菌在内脏定植的影响。分别将2×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射3只五周龄的Balb/c小鼠，48h后取右肾，研磨匀浆后适当稀释涂布YPD平板，30℃培养2天后计数菌落数。结果如图3所示，感染野生型菌株的小鼠，肾脏含菌量为8.1×105/g；而感染HOF1缺失株的小鼠，肾脏含菌量仅为1.6×103/g。这一结果说明，HOF1基因的缺失显著影响了白念珠菌在肾脏的定植能力。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株为HOF1基因不表达的白念珠菌hof1/hof1 缺失株。
2.根据权利要求1所述的一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株通过胞质分裂相关基因HOF1制得。
3.根据权利要求2所述的一种白念珠菌减毒菌株，其特征在于，所述白念珠菌减毒菌株可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使HOF1基因不表达；或者通过制备HOF1蛋白拮抗剂，使HOF1基因表达的蛋白不发挥作用。
4.一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述的一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用，其特征在于，所述白念珠菌治疗药物以HOF1基因为靶点，筛选或制备使HOF1基因不表达的药物。
6.根据权利要求4所述的一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在制备或筛选白念珠菌治疗药物方面的应用，其特征在于，所述白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使HOF1基因不表达制得；或者通过制备HOF1蛋白拮抗剂，使HOF1基因表达的蛋白不发挥作用的方法制得。
7.一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用。
8.根据权利要求7所述的一种缺失HOF1基因的白念珠菌减毒菌株在毒力调控方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）检测HOF1基因缺失对白念珠菌在宿主细胞内存活的影响情况：进行白念珠菌与巨噬细胞共培养实验，将5×105巨噬细胞接种到12孔板中，于37℃、5%CO2中过夜培养，以1：1比例分别加入白念珠菌野生型菌株和HOF1缺失株，2h后洗去未结合的白念珠菌，其中部分巨噬细胞用0.01% SDS裂解后，适当稀释并涂布YPD平板；其余的细胞继续培养6h，用同样的方法裂解细胞并涂布平板；所有平板于30℃培养2天后统计菌落数，比较野生菌菌株和HOF1缺失株的生长情况；
（2）检测HOF1缺失的白念珠菌毒性情况：小鼠毒理实验，分别将1×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射Balb/c小鼠，观察存活率情况；同时，分别将2×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射Balb/c小鼠，并观察存活率；通过检测濒死小鼠肾脏切片，观察感染野生型菌株和HOF1缺失株的小鼠肾脏内是否有菌丝态细胞存在；
（3）检测HOF1基因对白念珠菌在内脏定植的影响；分别将2×106白念珠菌野生菌株和HOF1缺失株细胞注射3只五周龄的Balb/c小鼠，48h后取右肾，研磨匀浆后适当稀释涂布YPD平板，30℃培养2天后计数菌落数；检测感染野生型菌株的小鼠及感染HOF1缺失株的小鼠的肾脏含菌量。
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