CN112535735A - 一种可同时放大免疫原性细胞死亡以及增强抗肿瘤效果的联合用药物 - Google Patents

一种可同时放大免疫原性细胞死亡以及增强抗肿瘤效果的联合用药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可同时放大免疫原性细胞死亡以及增强抗肿瘤效果的联合用药物。该抗肿瘤的联合用药物包括作为活性成分的强心苷类化合物和细胞毒性的N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物，所述的强心苷类化合物为临床用药地高辛、洋地黄毒苷、去乙酰毛花苷、毛花苷丙、G毒毛旋花苷、夹竹桃苷和毒毛花苷K中的至少一种。所述的细胞毒性的HPMA聚合物药物接合物为载带顺铂，卡铂，奈达铂，奥沙利铂，乐铂和庚铂中的至少一种的HPMA接合物。本发明利用强心苷类化合物与N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物联合使用，提高了其引起抗肿瘤免疫反应发生的能力，增强了抗肿瘤效果。

Description

一种可同时放大免疫原性细胞死亡以及增强抗肿瘤效果的联 合用药物
技术领域
本发明涉及一种可同时放大免疫原性细胞死亡以及增强抗肿瘤效果的联合用药物组合物及其应用，具体涉及强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物的联合用药物及其应用，属于医药技术领域。
背景技术
癌症的发病人数日益增高，据世界卫生组织报道，在今后的二十年里新发的癌症病例将会接近2500万例。癌症逐渐成为全球发病和死亡的重要原因，严重的危害了人类的健康。虽然当今人们对癌症的治疗手段越来越多样，可以选择的药物也越来越多，但目前大多数癌症仍无法治愈，病人生存期仍然较短。因此任何有效可靠的癌症治疗方法或能提升当前现有治疗方法效力的方法都会对癌症患者的治疗具有实际意义。
免疫原性细胞死亡是近年来提出的一种新的细胞死亡方式，被能促使免疫原性细胞死亡发生的化疗药物杀死的肿瘤细胞能够激活人体本身的免疫系统，产生肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞。在化疗药物杀死化疗敏感的肿瘤细胞后，被激活的免疫应答能够消除剩余的肿瘤细胞，杀死潜在的耐药肿瘤细胞和肿瘤干细胞，能延长病人的生存期，改善病人的预后。然而目前临床上 90%以上的抗肿瘤药物，都无法有效诱导免疫原性的细胞死亡。因此，设计一种联合给药策略可放大免疫原性细胞死亡很有必要。
强心苷类药物被用于治疗心血管疾病已有超过200年的历史了。地高辛是强效的洋地黄类强心苷类药物的代表，是目前最为广泛使用的强心苷类药物之一。近来有研究表明，强心苷类药物能通过作用于 Na+/K+-ATP酶，产生内质网压力，从而诱导内质网中的钙网蛋白的外翻至细胞膜，增强免疫原性，进而放大免疫原性的细胞死亡。但是目前关于强心苷类药物和递药系统联用以及具体在体内如何具体诱导产生何种抗肿瘤免疫反应还未见报道。
N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物作为药物载体的研究开始于上世纪七十年代。其具有生物相容性好，结构易修饰，无毒等特点。目前已有HPMA聚合物作为抗肿瘤药物的载体进入了临床试验。但是还未见其与强心苷类药物联用，以及是否能够联合触发免疫原性细胞死亡激发抗肿瘤免疫反应发生的报道。
发明内容
为了解决现在临床上使用的化疗药物无法诱导免疫原性细胞死亡这一问题。本发明人通过创造性的研究将强心苷类药物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物联用，不仅能显著地增加凋亡肿瘤细胞膜表面的钙网蛋白的表达，同时能够提高肿瘤内树突状细胞的浸润和促进引流淋巴结的树突状细胞的成熟，并且能够显著地提高肿瘤内树突状细胞的浸润和细胞毒性的CD8阳性T淋巴细胞的浸润，显著增强对原位肿瘤和远端肿瘤的抗肿瘤效应。
本发明的目的之一在于克服现有化学药物治疗的缺点和不足，结合化疗和免疫治疗，提供一种可同时放大免疫原性细胞死亡以及增强抗肿瘤效果的联合用药物。
本发明的另一目的在于提供强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物在制备抗肿瘤联用药物中的应用。利用强心苷类药物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物联合使用，强心苷类化合物可以放大细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物引起的免疫原性细胞死亡，显著提高抗肿瘤免疫反应的发生。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种可同时放大免疫原性细胞死亡以及增强抗肿瘤效果的联合应用药物，包括作为活性成分的强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物。
所述的可同时放大免疫原性细胞死亡以及抗肿瘤效果的联合用药物还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体。
所述的可同时放大免疫原性细胞死亡以及抗肿瘤效果的联合用药物可以进一步制成注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。
所述的强心苷类化合物为临床用药地高辛、洋地黄毒苷、去乙酰毛花苷、毛花苷丙、G毒毛旋花苷、夹竹桃苷和毒毛花苷K中的至少一种；优选为地高辛。
所述的细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物为载带顺铂，卡铂，奈达铂，奥沙利铂，乐铂和庚铂中的至少一种HPMA聚合物药物接合物；优选为载带顺铂的HPMA聚合物药物接合物。
所述的载顺铂的HPMA聚合物药物接合物优选通过如下方法制备得到：
1）将聚合物单体HPMA，APMA（HPMA：APMA= 80：20 mol%），引发剂2, 2’-偶氮二异丁腈（AIBN），称量至安瓿中，加入溶剂甲醇溶解。按比例（聚合物单体:引发剂:溶剂= 12.5:2:85.5 wt%）通过自由基溶液聚合反应合成HPMA聚合物。透析冻干后得到3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐修饰的HPMA聚合物。
2）将顺铂分散于去离子水中，加热再加入过氧化氢溶液反应2h，冷却过滤后得到羟基衍生化的顺铂。再将羟基衍生化的顺铂溶于二甲基亚砜(DMSO)中，加入丁二酸酐，加热反应24h后，反应液于乙醚中沉出，甲醇洗涤后得到羧基衍生化的顺铂固体。
3）将羧基衍生化的顺铂固体溶于DMSO中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/ N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS) 室温活化30 min后滴入含有3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐修饰的HPMA聚合物的N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)溶液，继续反应24h，反应完毕后透析冻干即得细胞毒性的HPMA聚合物顺铂接合物。
所述的肿瘤包括恶性黑色素瘤，肝癌，肺癌，乳腺癌，结肠癌，鼻咽癌，膀胱癌，宫颈癌，食管癌，胃癌，前列腺癌和淋巴瘤；优选为恶性黑色素瘤。
强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物在制备抗肿瘤联用药物中的应用。
强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物在制备抗肿瘤联用药物中的应用，是将强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物作为活性成分。
所述的强心苷类化合物的有效浓度是0.025~80 μg/ml，细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物所载活性成分含量占高聚物总重的0.1%~90%（w/w），有效浓度是0.1~10 mg/ml。
本发明是将强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物同时加至肿瘤细胞中，或先用强心苷类化合物处理肿瘤再加入细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物，或者先用细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物处理肿瘤细胞再加入强心苷类化合物。
本发明所述的强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物的联合用药物可有效地诱导肿瘤细胞凋亡，从而抑制黑色素瘤的进展。
本发明所述的强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物的联合用药可显著地引起钙网蛋白外翻，提升肿瘤细胞的免疫原性，增强树突状细胞对肿瘤细胞的吞噬和成熟，能有效地引起机体的抗肿瘤免疫反应的发生，实现化疗和免疫治疗的结合。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1. 本发明提供一种放大免疫免疫原性细胞死亡，增强抗肿瘤免疫的方法，涉及强心苷类药物的使用。铂类药物是临床上广泛使用的抗肿瘤药物，但是由于不能有效地诱导钙网蛋白外翻无法引起免疫原性的细胞死亡，故不能在诱导肿瘤凋亡的基础上进一步激发机体杀伤肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应。而将能诱导钙网蛋白外翻的强心苷类药物和载有铂类药物的HPMA聚合物药物接合物联用就可以有效地诱导免疫原性的细胞死亡，结合化疗和免疫治疗，能更有效地治疗肿瘤。
2. 现有的肿瘤治疗方法主要包括手术，化疗和放疗等，其各有优缺点。但由于癌症的高发病率和致死率，现有的治疗方法的效果仍不能令人满意。免疫疗法的出现带来了新的希望，但由于制备成本高昂，导致以PD-L1，CAR-T细胞等免疫疗法的价格昂贵，限制了免疫疗法的应用。本发明提供了一种利用临床上常用的强心苷类药物和细胞毒性的HPMA聚合物药物接合物联合使用的方法，放大免疫原性的细胞死亡，在结合化疗和免疫治疗的同时，扩大了抗肿瘤免疫疗法的应用。未来在临床应用时，可望降低病人的治疗费用。因此该项技术具有巨大的经济价值与社会意义。
3. 本发明中的HPMA聚合物载体具有生物相容性好，无免疫原性，无毒等特点，具有较好的安全性。与游离药物相比，可有效提高药物在肿瘤部位的蓄积。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1表示HPMA聚合物顺铂接合物的合成示意图
图2表示流式细胞术检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对黑色素瘤B16F10细胞细胞周期与凋亡的影响图
图3表示共聚焦显微镜检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对黑色素瘤B16F10细胞钙网蛋白外翻情况的影响图
图4表示流式细胞术检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对黑色素瘤B16F10细胞钙网蛋白外翻情况的影响图
图5表示流式细胞术检测小鼠移植瘤内树突状细胞的比例图
图6表示流式细胞术检测小鼠移植瘤内CD11c+CD80+成熟树突状细胞的比例图
图7表示流式细胞术检测小鼠移植瘤内CD11c+CD86+成熟树突状细胞的比例图
图8表示流式细胞术检测小鼠移植瘤内T淋巴细胞比例图
图9表示流式细胞术检测小鼠移植瘤内T淋巴细胞亚群情况：a. 肿瘤组织内CD3+T细胞表面CD4和CD8受体的表达情况图；b. 肿瘤组织内CD3+CD4+T细胞中Foxp3受体的表达情况图；c. 肿瘤组织内CD3+T细胞中细胞毒性CD8阳性T细胞(CD3+CD4-CD8+)，效应T细胞(CD3+CD4+Foxp3-)及起免疫抑制作用的管理 T细胞(CD3+CD4+Foxp3+)的比例图；d.肿瘤组织内细胞毒性CD8阳性T细胞(CD3+CD4-CD8+)和效应T细胞(CD3+CD4+Foxp3-)与起免疫抑制作用的管理 T细胞(CD3+CD4+Foxp3+)的比值图。
图10表示不同处理组小鼠原位移植瘤的体积增长曲线图
图11表示不同处理组小鼠远端移植瘤的体积增长曲线图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换，组合，改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1 3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺（氨基）修饰的HPMA聚合物的合成
将新蒸的甲基丙烯酰氯30 ml与15 ml二氯甲烷混合，缓缓滴入含有1-氨基-2-丙醇21ml和碳酸钠32 g的二氯甲烷溶液77 ml中，滴加完毕后升至室温，搅拌1h。然后将反应液置于-50℃的低温冷浴槽中1h，产生白色沉淀。过滤后将沉淀用丙酮重结晶，得白色晶体即为HPMA单体。
以2, 2’-偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂甲醇为溶剂，聚合物单体HPMA、3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐（APMA）（HPMA：APMA= 80：20 mol%）通过自由基聚合溶液反应生成HPMA聚合物前体（聚合物单体:引发剂:溶剂= 12.5:2:85.5 wt%）。
按上述比例将AIBN、HPMA及APMA称量至安瓿中，加入适量甲醇溶解，通氮气后熔封，50℃搅拌24h。乙醚中沉淀纯化，除去残存的溶剂及醚溶性沉淀，以去离子水溶解产物，透析，冷冻干燥即得3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐修饰的HPMA聚合物。
实施例2 细胞毒性的HPMA聚合物顺铂接合物的合成
将100 mg顺铂分散于5 ml去离子水中并水浴加热至50℃，搅拌下滴入3 ml 30%过氧化氢溶液并反应2h。冷却过滤得淡黄色羟基衍生化顺铂固体c,c,t-[PtCl2(OH)2(NH3)2]。
将1 ml 含有50 mg羟基衍生化顺铂的二甲基亚砜溶液和含有15 mg丁二酸酐的二甲基亚砜溶液混合，40℃下反应24h，反应液于乙醚中沉出并用甲醇清洗，得到的黄色固体过滤真空干燥后得到羧基衍生化的顺铂固体c,c,t-[PtCl2(OH)(NH3)2(O2CCH2CH2CO2H)]。
用200 μl DMSO溶解 20 mg羧基衍生化顺铂，14.45 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5.56 mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30 min后滴入含有120 mg实施例1中3-（氨基丙基）甲基丙烯酰胺盐（氨基）修饰的HPMA聚合物的4 ml N,N-二甲基甲酰胺溶液，搅拌继续反应24h。反应完毕后转入透析袋，透析冻干干燥即得细胞毒性HPMA聚合物顺铂接合物。药物含量通过称取适量HPMA聚合物顺铂接合物至试管中，加入浓硝酸，120℃油浴加热消解2h后再180℃加热1h，冷却后用2%硝酸水溶液溶解残留粉末。用顺铂标准品同法制得1.625~52 ng/ml浓度不同的标准溶液，采用电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）测定顺铂含量。
实施例3 流式细胞术检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对B16F10细胞细胞周期和凋亡的影响
将黑色素瘤B16F10细胞以5000/孔接种到12孔板中，放入细胞培养箱贴壁24h。分为对照组，地高辛组，顺铂组，顺铂+地高辛组，HPMA聚合物顺铂接合物组和HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组进行试验：
对照组：加入2 ml RPMI1640培养基（含10% FBS）；
地高辛组: 加入2 ml含62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂组：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂+地高辛：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂和62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物和62.4 μg/ml 地高辛的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
孵育48h后，收集上清中的细胞，再用0.25%胰酶消化并收集贴壁的B16F10细胞，合并两部分细胞。细胞经过70%（v/v）乙醇-20℃固定过夜后用20 μg/ml PI（碘化丙啶，购于大连美仑公司）进行染色，并用100 μg/ml Rnase A (核糖核酸酶A，大连美仑公司)去除RNA。用流式细胞仪(FACSCelesta, BD)检测细胞周期分布和凋亡。结果如说明书附图图2所示，
图2表明，HPMA聚合物顺铂接合物和顺铂均能诱导黑色素瘤B16F10细胞发生凋亡。加入地高辛后，凋亡细胞的比例有所增加。
实施例4 共聚焦显微镜检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对B16F10细胞钙网蛋白外翻情况
将B16F10细胞以5000/孔接种到事先铺有盖玻片的12孔板中，放入细胞培养箱贴壁24h。分为对照组，地高辛组，顺铂组，顺铂+地高辛组，HPMA聚合物顺铂接合物组和HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组进行试验：
对照组：加入2 ml RPMI1640培养基（含10% FBS）；
地高辛组: 加入2 ml含62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂组：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂+地高辛：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂和62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物和62.4 μg/ml 地高辛的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
孵育24h后，磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 清洗2次，用5%封闭血清封闭，用抗钙网蛋白的山羊抗兔抗体室温孵育60 min。磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 清洗2次，再用对应的异硫氰酸荧光素标记的二抗继续孵育30 min，磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 清洗2次。用5μg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 室温染色10 min，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)清洗2次后用80%甘油水混合液封片，用共聚焦显微镜 (Carl Zeiss LSM 800, Germany) 观察。结果如图3所示。
图3表明对照组，顺铂和HPMA聚合物顺铂接合物组中的细胞，通过共聚焦显微镜仅能观察到细胞核的蓝色荧光，而无法观察到外翻的钙网蛋白的绿色荧光。地高辛原药，顺铂+地高辛，HPMA聚合物顺铂接合物+地高辛处理后的细胞除了能观察到细胞核的蓝色荧光，还能观察到在细胞膜上外翻的钙网蛋白的绿色荧光。其中HPMA聚合物顺铂接合物+地高辛可以诱导最强的钙网蛋白外翻，具有最明亮的绿色荧光；令人意外的是，其诱导效果甚至强于游离药物联用组
实施例5 流式细胞术检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对B16F10细胞钙网蛋白外翻情况
将B16F10细胞以5000/孔接种到12孔板中，放入细胞培养箱贴壁24h。分为对照组，地高辛组，顺铂组，顺铂+地高辛组，HPMA聚合物顺铂接合物组和HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组进行试验：
对照组：加入2 ml RPMI1640培养基（含10% FBS）；
地高辛组: 加入2 ml含62.4
地高辛组: 加入2 ml含62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂组：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂+地高辛：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂和62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物和62.4 μg/ml 地高辛的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
孵育48h后，收集上清中的细胞，再用0.25%胰酶消化并收集贴壁的B16F10细胞，合并两部分细胞。细胞经过70%（v/v）乙醇-20℃固定过夜后用20 μg/ml PI（碘化丙啶，购于大连美仑公司）进行染色，并用100 μg/ml Rnase A (核糖核酸酶A，大连美仑公司)去除RNA。用流式细胞仪(FACSCelesta, BD)检测细胞周期分布和凋亡。结果如说明书附图图2所示，
图2表明，HPMA聚合物顺铂接合物和顺铂均能诱导黑色素瘤B16F10细胞发生凋亡。加入地高辛后，凋亡细胞的比例有所增加。
实施例4 共聚焦显微镜检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对B16F10细胞钙网蛋白外翻情况
将B16F10细胞以5000/孔接种到事先铺有盖玻片的12孔板中，放入细胞培养箱贴壁24h。分为对照组，地高辛组，顺铂组，顺铂+地高辛组，HPMA聚合物顺铂接合物组和HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组进行试验：
对照组：加入2 ml RPMI1640培养基（含10% FBS）；
地高辛组: 加入2 ml含62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂组：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
顺铂+地高辛：加入2 ml含100 μg/ml 顺铂和62.4 μg/ml 地高辛的RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组：加入2 ml含100 μg/ml顺铂当量的HPMA聚合物顺铂接合物和62.4 μg/ml 地高辛的 RPMI1640培养基（含10% FBS）；
孵育24h后，磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 清洗2次，用5%封闭血清封闭，用抗钙网蛋白的山羊抗兔抗体室温孵育60 min。磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 清洗2次，再用对应的异硫氰酸荧光素标记的二抗继续孵育30 min，磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 清洗2次。用5μg/ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) 室温染色10 min，磷酸盐缓冲液(pH 7.4)清洗2次后用80%甘油水混合液封片，用共聚焦显微镜 (Carl Zeiss LSM 800, Germany) 观察。结果如图3所示。
图3表明对照组，顺铂和HPMA聚合物顺铂接合物组中的细胞，通过共聚焦显微镜仅能观察到细胞核的蓝色荧光，而无法观察到外翻的钙网蛋白的绿色荧光。地高辛原药，顺铂+地高辛，HPMA聚合物顺铂接合物+地高辛处理后的细胞除了能观察到细胞核的蓝色荧光，还能观察到在细胞膜上外翻的钙网蛋白的绿色荧光。其中HPMA聚合物顺铂接合物+地高辛可以诱导最强的钙网蛋白外翻，具有最明亮的绿色荧光；令人意外的是，其诱导效果甚至强于游离药物联用组
实施例5 流式细胞术检测HPMA聚合物顺铂接合物和地高辛对B16F10细胞钙网蛋白外翻情况
将B16F10细胞以5000/孔接种到12孔板中，放入细胞培养箱贴壁24h。分为对照组，地高辛组，顺铂组，顺铂+地高辛组，HPMA聚合物顺铂接合物组和HPMA聚合物顺铂接合物组+地高辛组进行试验：
对照组：加入2 ml RPMI1640培养基（含10% FBS）；
地高辛组: 加入2 ml含62.4 ），计算肿瘤体积（V），公式为：V=a×b2/2。待肿瘤生长至200~300 mm3时，将动物随机分成6组，每组5只，同时开始给药。
给药方法：
1）对照组：通过瘤内注射50 μl生理盐水一次；
2）顺铂组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂5 mg/kg）一次；
3）地高辛组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含地高辛2 mg/kg）一次；
4）顺铂联合地高辛组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂5 mg/kg和地高辛2mg/kg）一次；
5）HPMA聚合物顺铂接合物组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂当量 5 mg/kgHPMA聚合物顺铂接合物）一次；
6）HPMA聚合物顺铂接合物组联合地高辛组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂当量5 mg/kg聚合物和2 mg/kg 地高辛）。
7天后处死小鼠，手术剥取瘤块，研磨后过40 μm的细胞筛网，得对应的单细胞悬液。首先将细胞悬液4℃下孵育于抗CD16/32的抗体20 min，离心收集细胞。将细胞重悬于含有anti-CD3-FITC, anti-CD4-PerCP, anti-CD8a-APC的1%BSA磷酸盐缓冲液中，继续4℃下孵育60 min。用磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 清洗2次，细胞重悬于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，流式细胞术测定anti-CD3-FITC标记的T淋巴细胞及T淋巴细胞表面表达的CD4，CD8a的情况，结果如图8,9所示。
图8表明加入地高辛后能显著地增加HPMA聚合物顺铂接合物引起的T淋巴细胞浸润，HPMA聚合物顺铂接合物联合地高辛后引起的T淋巴细胞浸润是HPMA聚合物顺铂接合物组的3.1倍。进一步分析HPMA聚合物顺铂接合物联合地高辛组和HPMA聚合物顺铂接合物组的T细胞亚型，由图9d可知，在HPMA聚合物顺铂接合物联合顺铂引起的浸润T淋巴细胞中，其细胞毒性的CD3+CD4-CD8+ T细胞与免疫抑制性CD3+CD4+Foxp3+管理T细胞比例是HPMA聚合物顺铂接合物组的3.6倍，表明其能引起更有效的抗肿瘤免疫反应。
实施例8 HPMA聚合物顺铂接合物联合地高辛处理对小鼠移植瘤模型生长的影响
B16F10细胞用RPMI1640培养基（含10%FBS）培养于含5%（v/v）CO2，37℃细胞培养箱中，然后用0.25% 胰酶（含0.02%（m/v）EDTA）消化B16F10细胞，用磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 洗一次后并计数。再用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)重悬细胞，将细胞密度调整至1×106/ml。用无菌注射器皮下接种0.1 ml细胞悬液于C57BL/6小鼠右侧大腿处（周龄7~8周，购于四川成都达硕生物科技有限公司），记为原位肿瘤。5天后，按同法制备细胞悬液，细胞密度调整至5×105/ml。用无菌注射器皮下接种0.1 ml细胞悬液于上述C57BL6小鼠左侧大腿处，记为远端肿瘤。用游标卡尺测量移植瘤的长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积（V），公式为：V=a×b2/2。待肿瘤生长至100~200 mm3时，将动物随机分成6组，每组5只，同时开始对右侧原位肿瘤给药，而左侧远端肿瘤不给药。
给药方法：
1）对照组：通过瘤内注射50 μl生理盐水一次；
2）顺铂组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂5 mg/kg）一次；
3）地高辛组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含地高辛2 mg/kg）一次；
4）顺铂联合地高辛组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂5 mg/kg和地高辛2 mg/kg）一次；
5）HPMA聚合物顺铂接合物组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂当量 5 mg/kgHPMA聚合物顺铂接合物）一次；
6）HPMA聚合物顺铂接合物组联合地高辛组：通过瘤内注射50 μl生理盐水（含顺铂当量5mg/kg聚合物和2mg/kg 地高辛）。19天后处死小鼠，记录左右两侧肿瘤体积生长曲线，结果如图10，11所示。
结果表明相比于HPMA聚合物顺铂接合物组，HPMA聚合物顺铂接合物联用地高辛后能更有效的抑制原位肿瘤的生长。此外，HPMA聚合物顺铂接合物联用地高辛能够更有效地抑制远端肿瘤的生长。说明HPMA聚合物顺铂接合物联用地高辛这一放大免疫原性细胞死亡，增强抗肿瘤免疫的方法，结合了化疗和免疫治疗，不仅能更有效地抑制给药部位的肿瘤生长，还能够通过引起的抗肿瘤免疫反应抑制远端的未给药肿瘤的生长。这为治疗潜在的无法给药的肿瘤病灶提供了一种新的方法。

Claims (8)

1.一种放大免疫原性细胞死亡、增强抗肿瘤效果的联合用药物，其特征在于：包括作为活性成分的强心苷类化合物和细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物，所述联合用药物应用于抗肿瘤治疗。
2.根据权利要求1中所述的放大免疫原性细胞死亡增强抗肿瘤效果的联合用药物，其特征在于：所述的强心苷类化合物为临床用药地高辛、洋地黄毒苷、去乙酰毛花苷、毛花苷丙、G毒毛旋花苷、夹竹桃苷和毒毛花苷K中的至少一种。
3.根据权利要求1中所述的放大免疫原性细胞死亡增强抗肿瘤效果的联合用药物，其特征在于所述的细胞毒性的HPMA聚合物药物接合物为载带顺铂，卡铂，奈达铂，奥沙利铂，乐铂和庚铂中的至少一种的接合物，所载活性成分质量占聚合物总重的0.1%~90%。
4.如权利要求3所述的具有细胞毒性的HPMA聚合物药物接合物，其特征在于：所述聚合物的平均分子量为15~100 kDa。
5.根据权利要求1中所述的放大免疫原性细胞死亡增强抗肿瘤效果的联合用药物，其特征在于：所述的肿瘤包括恶性黑色素瘤，肝癌，肺癌，乳腺癌，结肠癌，鼻咽癌，膀胱癌，宫颈癌，食管癌，胃癌，前列腺癌和淋巴瘤。
6.根据权利要求3所述的抗肿瘤的联合用药物，其特征在于：所述的抗肿瘤联合用药物进一步制成注射剂的形式。
7.细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物和强心苷类化合物在制备抗肿瘤联用药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物和强心苷类化合物在制备抗肿瘤联用药物中的应用，其特征在于：是将细胞毒性的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺HPMA聚合物药物接合物和强心苷类化合物作为活性成分。
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