CN114869900A - 一种甘草甜素在改善前列腺癌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请示出了一种甘草甜素在改善前列腺癌中的应用。其中,甘草甜素可以通过促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡以改善前列腺癌;进一步的,甘草甜素通过抑制ABCB1的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌;进一步的,甘草甜素通过抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌;进一步的,甘草甜素通过PI3K/AKT/NF‑κB信号通路抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。本申请示出的技术方案,能够通过甘草甜素促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡以改善前列腺癌。
Description
技术领域
本申请涉及医药技术领域,具体涉及一种甘草甜素在改善前列腺癌中的应用。
背景技术
前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤,该类肿瘤为激素依赖型的肿瘤。前列腺癌在我国发病率表现出每年递增的趋势,且发病率增长速度也逐年上升。
现有对于前列腺癌的治疗方式包括手术治疗和非手术治疗。由于PCa是激素依赖型的肿瘤,对于非手术治疗的患者通常推荐先行雄激素剥夺(ADT)治疗,ADT治疗是通过药物降低人体内雄激素水平从而抑制PCa生长。
然而ADT治疗初期对激素敏感型PCa有较好的效果,但随着时间推移,肿瘤细胞逐渐产生耐药性,最终使激素敏感型PCa转换为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。化疗是CRPC的有效治疗手段之一。多西他赛、卡巴他赛等化疗药物对CRPC患者有一定疗效。虽然化疗一定程度上可延缓PCa进展,但患者仍会像ADT治疗一样对化疗产生耐药性。因此,如何逆转PCa化疗耐药性的产生对于延缓CRPC患者病情发展已成为近年来的一个研究热点。虽然化疗常作为CRPC的医治方法之一,但化疗后产生的多药耐药(MDR)仍不可避免。
发明内容
本申请提供一种甘草甜素在在改善前列腺癌中的应用,能够通过甘草甜素促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡以改善前列腺癌。
第一方面,本申请示出一种甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,所述甘草甜素的结构式为:
在一些实施例中,所述甘草甜素通过促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡以改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素通过抑制ABCB1的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素通过抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素与多西他赛联合使用以降低前列腺化疗耐药细胞对多西他赛的耐药性,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素改善前列腺癌的应用浓度在6.25μmol/L至800μmol/L之间。
在一些实施例中,所述甘草甜素改善前列腺癌的应用浓度优选为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L的其中一种。
第二方面,本申请还示出一种甘草甜素在制备改善前列腺癌的药物中的应用,所述药物包括唯一活性成分的甘草甜素以及药学上可接受的辅料;所述药物用于改善前列腺癌。
第三方面,本申请还示出一种甘草甜素和多西他赛的药物组合物在制备改善前列腺癌的药物中的应用,其特征在于,所述药物包括甘草甜素和多西他赛的药物组合物以及药学上可接受的辅料,所述药物用于降低前列腺化疗耐药细胞对多西他赛的耐药性,进而改善前列腺癌。
以上示出的技术方案,能够通过甘草甜素促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡以改善前列腺癌。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了DTX对C4-2B、DU145、TaxR、DU145R细胞活性的影响;
图2示出了DTX对C4-2B、DU145、TaxR、DU145R细胞克隆形成能力的影响;
图3示出了C4-2B、DU145与TaxR、DU145R细胞ABCB1蛋白表达差异;
图4示出了siRNA转染TaxR、DU145R细胞后ABCB1表达差异;
图5示出了DTX对siRNA转染细胞TaxR、DU145R细胞克隆形成能力的影响;
图6示出了DTX对siRNA转染细胞TaxR、DU145R细胞活性的影响;
图7示出了GLY对TaxR、DU145R细胞活性的影响;
图8示出了GLY对TaxR、DU145R细胞ABCB1表达的影响;
图9示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞克隆形成能力的影响;
图10示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞数目及形态的影响;
图11示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞凋亡率的影响;
图12示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞周期的影响;
图13示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞凋亡蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2表达的影响;
图14示出了不同浓度GLY对TaxR、DU145R细胞通路蛋白的影响;
图15示出了PI3K、NF-κB信号通路抑制剂对TaxR细胞ABCB1表达的影响;
图16示出了PI3K、NF-κB信号通路抑制剂对DU145R细胞ABCB1表达的影响;
图17示出了PI3K信号通路诱导剂对TaxR、DU145R细胞ABCB1表达的影响;
图18示出了GLY对TaxR、DU145R细胞ABCB1转运体外排功能的影响。
具体实施方式
为使本申请的目的、实施方式和优点更加清楚,下面将结合本申请示例性实施例中的附图,对本申请示例性实施方式进行清楚、完整地描述,显然,所描述的示例性实施例仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。
基于本申请描述的示例性实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请所附权利要求保护的范围。此外,虽然本申请中公开内容按照示范性一个或几个实例来介绍,但应理解,可以就这些公开内容的各个方面也可以单独构成一个完整实施方式。需要说明的是,本申请中对于术语的简要说明,仅是为了方便理解接下来描述的实施方式,而不是意图限定本申请的实施方式。除非另有说明,这些术语应当按照其普通和通常的含义理解。
下面对本申请中涉及的专业术语进行解释。
本申请中所使用的术语“ABCB1转运体”,又称为P糖蛋白(P-gp),P-gp依靠ATP能量转运胞内化疗药物到胞外,继而减少化疗药物在胞内的聚集,使药效降低而使化疗失去效应。
本申请中所使用的术语“甘草甜素”是甘草的主要提取物之一。甘草是一种传统的中药,味甘、平;是补脾益缓急、止痛,解毒的良药。甘草甜素具有抑菌、消炎、解毒等多种功能。
本申请中所使用的术语“多重耐药性(Multidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性,同时对其他结构上无关、作用机理各异的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性。
现有的化疗药物(例如多西他赛、卡巴他赛、长春新碱以及阿霉素等)均可以与ABCB1相结合而发生药物外排。多项实验证实了多种癌变组织中已检测出多量的ABCB1转运体,因此,通过控制ABCB1转运体的活性,可能能够逆转多重耐药性。
目前临床中已有通过竞争性结合ABCB1转运体从而限制ABCB1转运体功能的药物,例如维拉帕米(钙通道抑制剂)、环孢素A(免疫抑制剂)等。然而现有的药物存在毒副作用从而限制其在临床上大规模使用。因此,亟待寻找无毒、较少副作用的新的ABCB1转运体抑制剂。
为此,本申请示出的技术方案,提供了一种甘草甜素,用于改善前列腺癌,本申请示出了一种甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,所述甘草甜素的结构式为:
在一些实施例中,所述甘草甜素通过促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡以改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素通过抑制ABCB1的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素通过抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素与多西他赛联合使用以降低前列腺化疗耐药细胞对多西他赛的耐药性,进而改善前列腺癌。
在一些实施例中,所述甘草甜素改善前列腺癌的应用浓度在6.25μmol/L至800μmol/L之间。
在一些实施例中,所述甘草甜素改善前列腺癌的应用浓度优选为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L的其中一种。
本申请还示出一种甘草甜素在制备改善前列腺癌的药物中的应用,所述药物包括唯一活性成分的甘草甜素以及药学上可接受的辅料;所述药物用于改善前列腺癌。
本申请还示出一种甘草甜素和多西他赛的药物组合物在制备改善前列腺癌的药物中的应用,其特征在于,所述药物包括甘草甜素和多西他赛的药物组合物以及药学上可接受的辅料,所述药物用于降低前列腺化疗耐药细胞对多西他赛的耐药性,进而改善前列腺癌。
具体实现中,本申请示出了相关实验以证实上述实施例。
首先,本申请通过对前列腺癌细胞进行细胞培养,并将甘草甜素对前列腺癌细胞进行干预。
具体实验过程如下:
本申请的实验材料包括:实验细胞。其中,实验所用的人前列腺癌细胞细胞株C4-2B(人前列腺癌细胞)、TaxR(人前列腺癌紫杉醇耐药细胞)、DU145(人前列腺癌细胞)、DU145R(人前列腺癌细胞)均由US California大学Davis分校Allen C.Gao教授惠赠。
本申请的实验材料还包括:实验仪器和实验设备。具体如下表1所示:
表1:实验仪器和实验设备
本申请的实验材料还包括:实验试剂。具体如下表2所示:
表2:实验试剂
本申请的实验用相关试剂配置包括:细胞培养基配置;所述细胞培养基配置方法为在细胞间无菌技术下制作的完全培养基,将配制完成后的培养基存放在100mL离心管,过火焰后封口膜封口,放在4℃冰箱中。
其中,细胞培养基的配方如下表3所示:
表3:
本申请的实验用相关试剂配置包括:100mmol/L甘草甜素母液配置;所述100mmol/L甘草甜素母液配置方法为使用微量秤称取经辐照灭菌的82.3mg甘草甜素粉末,于超净工作台中将其溶于1mL 70%乙醇溶液中,放在振荡器上震30s,配置成100mmol/L的甘草甜素母液。将甘草甜素母液用锡箔纸包裹后存放在4℃冰箱。
在本申请的实验过程中,包括以下步骤:
步骤S101,前列腺癌细胞(C4-2B、TaxR、DU145、DU145R)的培养,包括:
步骤S101-1,前列腺癌细胞的复苏;
将要复苏的细胞从液氮罐内取出,并快速转运至细胞间已调整好温度的37摄氏度的恒温水箱中。快速摇晃细胞使其从冰冻状态融化,放至超净工作台。将细胞悬液移到离心管中,温柔吹打混匀后以900r离心4min,弃上层液后加入新液,吹匀并移至培养瓶。观察细胞无明显异常后将培养瓶置于Thermo Fisher CO2培养箱中进行培养并进行后续实验。
步骤S101-2,前列腺癌细胞的传代;
从箱内取培养瓶,显微镜下进行观察;若满足传代条件则放到超净工作台上。移液器抽走原培养基弃于废液缸。吸取3ml D-hanks冲洗培养瓶4遍,吸取D-hanks液弃于废液缸。取1500μL胰酶溶液于瓶中消化。盖紧瓶盖消毒后置于CO2培养箱中并计时。消化180s后取出并置于镜下查验消化情况,当细胞触手消失,相互之间分离则表明消化完成,抽3mL新液中和。使用移液管吸细胞悬液后再吹打几遍进行混悬,吹打完成后移入事先准备好的无菌15mL容量尖底离心管中。将15mL容量尖底离心管放到离心机以1100r运行5min,离心完成后移液器吸取上清弃至废液缸。移液器分别吸取完全培养基和含有5nmol/L多西他赛(Docetaxel,DTX)的完全培养基轻轻吹打均匀进行重悬,根据需要传代的细胞种类和密度吸取对应的培养基进行稀释。将稀释完成的悬液转移至培养瓶并使其中细胞以一致密度铺于瓶底,放回培养箱。
步骤S102,前列腺癌细胞的计数;
取出培养箱中细胞,观察生长情况,或者根据前序处理评估细胞生长情况。如果已经进行相应时间和药物处理,且对照组和各处理组细胞生长未形成克隆或团块等情况,则可进行细胞计数。将TaxR、DU145R细胞以同样细胞密度平铺于6孔板中,翌日观察细胞是否已经长在皿上和细胞密度,若细胞已贴壁且密度均一则给与相应刺激。给与对照组更换新的培养基,DTX组给与更换含有20nmol/L DTX、10nmol/L DTX的完全培养基,GLY组给与更换含有100μmol/L Gly的完全培养基,GLY+DTX组给与更换含有100μmol/L GLY、20nmol/LDTX、10nmol/L DTX的完全培养基。培养3天后取出培养皿,无菌处理后置于操作台上,弃旧液,D-hanks漂4遍,加入1500μL胰酶,消化结束后再加入3mL完全培养基用以终结消化后转运入5mL EP管中。细胞计数仪进行计数。重复4遍,计算均值,此即为该悬液浓度。
步骤S103,CCK8检测细胞活性实验;
取出细胞,镜下观察,若生长很好,处于对数生长期,铺满培养瓶壁60%以上则可进行下一步的操作:
步骤S103-1,将C4-2B、TaxR、DU145、DU145R、siRNA转染实验的TaxR CTRL、DU145RCTRL、NC、siAB1-1、siAB1-2细胞取出培养箱,再用医用酒精擦拭消毒,最后放到工作台内。
步骤S103-2,按上述传代的方法给与消化、离心、重悬。以上步骤操作完成后进行细胞计数,具体方法详见步骤S102;
步骤S103-3,计数后使每1mL细胞悬液中存在50000个细胞。
步骤S103-4,取96孔圆底培养板,在靠近边缘的孔中每孔加入100μL去离子水以排除在培养箱中的液体蒸发的干扰。
步骤S103-5,空白对照孔加入培养基。
步骤S103-6,将已调整好浓度的细胞悬液铺于板中,每孔加100μL细胞悬液,设置3个以上复孔以避免较大的误差。
步骤S103-7,铺板完成后将96孔圆底培养板向多个不同方向晃动以使细胞均匀铺于孔中。
步骤S103-8,显微镜下观察细胞铺板的均一性,各孔细胞数差异情况,确定各孔铺板细胞无明显差异后放入培养箱。
步骤S103-9,第二天从培养箱取出96孔圆底培养板,细胞贴壁后按照实验目的加药,分别于37℃二氧化碳培养箱中培养,每板的空白对照孔培养基也需更换。
步骤S103-10,换新液后将96孔圆底培养板放回培养箱,72h后取出并在避光的情况下给各孔加定量CCK8液10μ,箱内孵育。
步骤S103-11,120min后将此板放入酶标仪上测450nm处吸光度(OD值)并记录数值。细胞相对活性等于实验孔减去空白孔差值OD值后再除以对照孔与空开孔的OD差值,最后再乘以百分之一百。
步骤S104,集落形成实验;
取对数生长期的C4-2B、TaxR、DU145、DU145R、siRNA转染实验的TaxR、DU145R细胞,观察生长情况。计算细胞消化后的悬液浓度(方法参照步骤S102),加入培养基进行稀释,把细胞悬液稀释为200个/mL。将细胞铺于6孔板中,每孔加细胞悬液2500μL,使每孔含有大约500个细胞,摇晃使平均分布。混匀后将6孔板放置于CO2培养箱,第二天给与6孔板中的细胞换液,更换为含有0.5nmol/L DTX的完全培养基。箱内放14d后取出,弃旧液,D-Hanks液洗2次,每孔加入1000μL甲醇固定0.5h,弃甲醇后每孔加入1mL0.5%结晶紫溶液染色,1h后倒掉染色液并使用双蒸水洗去残留颜色。6孔板放于37℃恒温箱烘干,在显微镜下认定不少于50个细胞聚集为一个克隆并记录细胞群落数目,摄像并统计。
步骤S105,细胞凋亡实验;
步骤S105-1,镜下观察Tax细胞、DU145R细胞,若无异常则进行下一步实验。
步骤S105-2,弃旧液,漂洗3遍,胰酶消化后终止,吹匀,计数仪计数,调整细胞密度为2.5×105个/mL。
步骤S105-3,稀释后的细胞悬液铺于6孔板中,加2mL细胞悬液到每孔,轻晃以使细胞平均分布。
步骤S105-4,第二天细胞已贴壁,分组为对照组(CTRL)组、空白组、FITC组、PI组给与更换新培养基;GLY组给与更换含有200mmol/LGLY的新培养基;DTX组给与更换含有20nmol/L、10nmol/L DTX的新培养基;GLY+DTX组给与更换含有100μmol/LGLY和20nmol/L、10nmol/L DTX的新培养基。之后继续培养72h。
步骤S105-5,将6孔板取出,弃原液,不含EDTA的胰酶消化,加新培养基终止消化,移液装置使散匀,转移至离心管,400g、4℃,离心5min。
步骤S105-6,离心完成后使用冷PBS洗一次,调整细胞浓度至1×106个/mL并转移至2mL EP管中。
步骤S105-7,调整完成后再以4℃下300g离心5min,弃上清,每管加400μL1×AnnexinV结合液并轻柔吹匀。
步骤S105-8,暗室中给对照组、FITC组、GLY组、DTX组、GLY+DTX组每组加试剂盒中的Annexin V-FITC溶液5μL并混匀后锡箔纸包裹后孵育1刻钟。
步骤S105-9,孵育完成后在暗室里给对照组、PI组、GLY组、DTX组、GLY+DTX组每组加试剂盒中的PI溶液5μL并混匀,放置于4℃冰箱孵育5min,上机检测凋亡情况。
步骤S106,细胞周期实验;
待细胞长至80%,铺于6cm皿。第二天细胞贴壁后,分组为对照组(CTRL)给与更换新培养基;GLY组给与更换含有100μmol/L GLY的新培养基;DTX组给与更换含有20nmol/L、10nmol/L DTX的新培养基;GLY+DTX组给与更换含有100μmol/L GLY和20nmol/L、10nmol/LDTX的新培养基,再培养72h。取出6cm皿,弃旧液,胰酶消化,中和,吹混均与,移至离心管,2000rpm,4℃下离心5min。离心完成后使用PBS进行重悬,并利用细胞计数仪计数,调整细胞浓度至1×106个/mL并转移1mL细胞悬液至2mL离心管中。调整完成后将离心管在4℃下2000r离心5min,弃上清,每管加入500μL 70%乙醇并轻轻吹打混匀,置于﹣20℃冰箱固定6h。到时间后以1000r离心3min,弃上清,PBS洗一遍后1000r离心3min弃上清,每管加入试剂盒中RNaseA溶液和PI溶液以1:9体积比配制成的染色工作液500μL进行重悬,轻轻混匀后用锡箔纸包裹室温孵育1h。孵育完成后上机测细胞周期。
步骤S107,siRNA实验;
本次转染实验设置阴性对照组(NC)即转染入细胞的是无意义的siRNA;siAB1-1组即第一种干扰ABCB1的siRNA;siAB1-2组即第二种干扰ABCB1的siRNA。按照厂商说明书将其生产的含有siRNA粉末的EP管中加入250μL RNase水配置成可转染的siRNA溶液存放于-20℃冰箱。取出TaxR、DU145R细胞,显微镜下观察细胞形态后按照传代方法使用不含青/链霉素的RPMI1640完全培养基将其铺于6孔板中。铺板完成后放置于CO2培养箱过夜。将5μLsiRNA溶液加入245μL OptiDMEM溶液中待用,将7.5μL Lipofectamine2000溶液加入242.5μL OptiDMEM溶液中,以上两混合溶液再次相互混合并放于冰上孵育5min。孵育完成后将500μL混合液与1500μL不含青/链霉素的RPMI1640完全培养基混合形成可用于转染的2000μLsiRNA溶液。各孔给与更换相对应的siRNA溶液2000μL。将转染操作后的细胞放置于CO2培养箱培养48h即完成转染并可进行后续实验如CCK8、Western Blot等。
步骤S108,Western-blot实验;
步骤S108-1,提取蛋白原液;
细胞蛋白裂解液配比如下表4:
表4:
具体实现中,采用2.5%胰蛋白酶消化细胞,置于2ml洁净离心管中3000rpm 4℃离心5min,预冷的PBS重悬细胞,洗2次,后转移至预先标好的1.5ml EP管中;
每管根据细胞量加入配好的细胞全蛋白裂解液,配置混匀后放置于冰上保存,现配现用;
将上述混合液涡旋振荡器上混匀30s,冰上裂解5min,重复该步骤5次;
将充分裂解好的细胞匀浆12000rpm 4℃离心5min;
吸取上清液至新的EP管中,蛋白定量,分装保存,避免反复冻融。
步骤S108-2,BCA法蛋白定量;
BCA工作液量=(样品数+8)×200μL。
BCA工作液配比如下表5:
表5:
BCA工作液配制完成后混匀。
在96孔板中按下表6添加对应试剂。
表6:
各个样品孔加入18μL ddH2O,之后加入相对应的蛋白原液2μL。
每个孔内加入0.2mL的BCA工作液。
将96孔板放置于37℃,0.5h。
反应结束后将96孔板放进酶标仪内,使用562nm波长计量各孔的OD值。
依据OD值做出蛋白标准曲线,并推算出相关方程计算出各自孔对应的蛋白浓度。
根据蛋白浓度添加相对量的双蒸水使各样品蛋白浓度相同,各样品加入其中的5X上样缓冲液量为各自体积的五分之一。
将上步中样品100℃煮9min使其变性,降温后保存于﹣20℃冰箱。
步骤S108-3,配制SDS-PAGE胶
将干净的玻璃板内侧面相对,边缘相互对齐后安装到配胶架上,10%浓度分离胶各项配比如下表7。
表7:
分离胶配制完成后摇晃均匀,在两玻璃板缝隙的一侧缓缓注入分离胶,避免产生气泡。分离胶加注到合适位置后沿玻璃板一侧边缘缓缓加入去离子水使去离子水到达玻璃板边缘,依靠去离子水重力使分离胶胶线水平,上述操作完后等待分离胶转变成为固体。然后丢弃去离子水。
浓缩胶的配制如下表8:
表8:
将混合好的浓缩胶沿玻璃板一侧近边缘处注入两玻璃板间隙,此时加注速度应较快以免浓缩胶发生凝结。加注满浓缩胶不要停留,以尽可能快的速度垂直向下插入事先准备好的梳子。配制完成后的胶静置半小时左右使其充分凝固。
步骤S108-4,上样与电泳;
从﹣20℃冰箱中取出定量好的实验样品,复温后再震荡混匀,将配制好的有SDS-PAGE胶的玻璃板插入到电泳槽中,两块玻璃板之间和电泳槽里面都要倒入一定体积的电泳液。轻柔拔出梳子,靠近边缘的两个泳道内加入4μL蛋白marker,中间泳道内加入40μg蛋白。盖上电泳槽盖板并连接电源,先以恒压80V方式进行电泳。待marker各线间分离明显则将电压设置为120V,当蛋白marker到达胶的底部时结束电泳。
步骤S108-5,转膜与封闭;
待电泳结束后将SDS-PAGE胶放置于事先准备好的冷的转膜液中。参照蛋白marker和目的蛋白分子量裁剪PVDF膜并剪角做好标记,浸泡于甲醇中5min,浸泡完成后放置于转膜液中。切胶板切下目的蛋白胶条。先后把滤纸、PVDF膜、胶条、滤纸放置于转膜夹子中,操作过程中应使各层紧密相接并避免各层之间气泡的产生。将转膜夹插到转膜槽中的同时避免搞混电极,加4℃的转膜液。因转膜会产生较多热量,故应注意给转膜槽降温。转膜时使用260mA恒定电流转膜1h。转膜完成后取出PVDF膜,将PVDF膜放于PBST溶液中在脱色摇床洗5min。把PVDF膜放置于事先配制好的含有10%脱脂奶粉的封闭液中,摇床上封闭120min。
步骤S108-6,抗体孵育与曝光;
PBST漂洗PVDF膜5遍,每遍10min。一抗稀释比例如下表9。
表9:
将各PVDF膜置于相对应的一抗中孵育10h。回收一抗,PBST漂洗3次,每次8min。按照1:5000的浓度将二抗加入含有2.5%脱脂奶粉的PBS溶液中,放于摇床上孵育120min。孵育完成后弃二抗,使用PBST洗3次,每次7min。将ECL发光液中的两种液体以同体积配成工作液并用锡纸包裹。将PVDF膜放置于曝光机仪器的托盘内,膜上滴加发光工作液后置于仪器内曝光。曝光后的条带使用Image J软件分析。
步骤S109,罗丹明积蓄实验;
观察TaxR、DU145R细胞,当其长至80%时,用胰酶消化下来,计数,将其铺于6孔板中,放入37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养,24h待其贴壁后,弃掉培养基,换上加入含不同浓度GLY(100、200、400μmol/L)的培养基,干预72h后,弃掉含GLY的培养基,加入含罗丹明的培养基,罗丹明的最终浓度为5μg/ml,将细胞放入培养箱中避光孵育1h。1h后从培养箱中取出细胞,按细胞传代的方式用胰酶将细胞消化下来,加入培养基终止消化,于1000r/min离心机离心5min,弃掉培养基,加入PBS吹打混匀,继续于1000r/min离心机离心5min,用PBS洗涤细胞重复两次。然后加入250μPBS重悬,上流式细胞仪检测。
步骤S1010,数据统计;
采用SPSS 23.0统计学软件包进行统计分析,计量资料以均值±标准差表示,组间对比采用单因素方差分析或两独立样本t检验分析;计数资料以百分比表示,采用Pearsonχ2检验分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
上述实施例中实验结果如下:
图1示例性示出了DTX对C4-2B、DU145、TaxR、DU145R细胞活性的影响。如图1所示,CCK8实验检测PCa细胞敏感株C4-2B、DU145与耐药株TaxR、DU145的细胞活性。与DTX(0nmol/L)相比,低浓度DTX(1、2nmol/L)就可抑制C4-2B、DU145细胞活性,而高浓度DTX(20、40、80nmol/L)才可抑制TaxR、DU145R细胞活性(P<0.01)。DTX作用于PCa细胞,测得敏感株C4-2B细胞对DTX的IC50值为1.078nmol/L,与之对应的耐药株TaxR细胞对DTX的IC50值为247.2nmol/L,两者相差229倍;敏感株DU145细胞对DTX的IC50值为1.624nmol/L,与之对应的耐药株DU145R细胞对DTX的IC50值为57.75nmol/L,,两者相差36倍。
图2示例性示出了DTX对C4-2B、DU145、TaxR、DU145R细胞克隆形成能力的影响。如图2所示,细胞克隆实验结果表明,DTX(0nmol/L)刺激细胞,C4-2B、TaxR细胞与DU145、DU145R细胞克隆形成能力无差别。DTX(5nmol/L)刺激细胞,C4-2B细胞克隆形成数目少于TaxR细胞,DU145细胞克隆形成数目少于DU145R细胞(P<0.01)。在DTX(0nmol/L)组中,各细胞形成集落体积较大,颜色较深;在DTX(5nmol/L)组中,各细胞形成集落体积较小,颜色较浅。
图3示例性示出了C4-2B、DU145与TaxR、DU145R细胞ABCB1蛋白表达差异。如图3所示,Western blot实验结果表明,与敏感株C4-2B、DU145比较,耐药株TaxR、DU145R高表达ABCB1蛋白(P<0.01)。
图4示例性示出了siRNA转染TaxR、DU145R细胞后ABCB1表达差异。如图4所示,Western blot实验结果表明,与NC组、Ctrl组相比,蛋白表达无明显差别(P>0.05),siABCB1-1、siABCB1-2与Ctrl组比较,ABCB1蛋白表达明显下降(P<0.01)。
图5示例性示出了DTX对siRNA转染细胞TaxR、DU145R细胞克隆形成能力的影响。如图5所示,细胞克隆实验结果表明,转染后的耐药细胞TaxR、DU145R克隆形成能力减弱,对DTX敏感性提高。与Ctrl组相比,siABCB1-1、siABCB1-2组克隆形成数目显著降低(P<0.01)。
因siABCB1-2组ABCB1表达下调更明显、克隆形成数目显著降低,干扰效果更好。综上,选择siABCB1-2组进行后续实验。
图6示例性示出了DTX对siRNA转染细胞TaxR、DU145R细胞活性的影响。如图6所示,CCK8实验检测转染后耐药细胞TaxR、DU145R对DTX的细胞活性,与DTX(0nmol/L)组比较,加药组(10、20、40、80nmol/L DTX)细胞活性有所降低(P<0.01)。测得TaxR细胞NC组、siABCB1-2组对DTX的IC50值分别为242.8nmol/L、26.5nmol/L,两者相差约9倍;DU145R细胞NC组、siABCB1-2组对DTX的IC50值分别为54.06nmol/L、6.451nmol/L,两者相差约8倍。
图7示例性示出了GLY对TaxR、DU145R细胞活性的影响。如图7所示,CCK8实验结果表明,与GLY(0μmol/L)组比较,加药组(100、200、400、800μmol/L GLY)细胞活性降低(P<0.05,P<0.01),GLY100μmol/L细胞活性大于80%。
图8示例性示出了GLY对TaxR、DU145R细胞ABCB1表达的影响。如图8所Westernblot实验结果表明,与Ctrl组比较,GLY(100、200、400μmol/L)组蛋白下调明显(P<0.01)。
根据CCK8实验与Western blot实验,在GLY100μmol/L处因其细胞活性大于80%且ABCB1表达明显下调,故选此浓度进行后续实验。
图9示例性示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞克隆形成能力的影响。如图9所示,细胞克隆实验结果表明,较单独作用,联合给予时效果更显著,克隆能力减弱。与Ctrl组相比,DTX组克隆数目无显著性差异(P>0.05),GLY组克隆形成数目降低(P<0.05),GLY+DTX组形成克隆数目显著降低(P<0.01);与DTX组相比,GLY组克隆形成数目降低(P<0.05),GLY+DTX组克隆数目显著降低(P<0.01);与GLY组相比,GLY与DTX组克隆数目显著降低(P<0.01)。
图10示例性示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞数目及形态的影响。如图10所示,显微镜下观察TaxR与DU145R细胞形态,Ctrl组细胞状态良好,贴壁生长;DTX组、GLY组、联合作用组细胞形态发生改变,由多触角形变为单触角、梭形及圆形,细胞变窄小、皱缩,培养液中悬浮颗粒增多,细胞碎片增多。TaxR细胞计数结果表明,与Ctrl组相比,DTX(20nmol/L)组细胞数目无显著性差异(P>0.05),GLY(100μmol/L)组细胞数目降低(P<0.05),GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组细胞数目显著降低(P<0.01);与DTX(20nmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组细胞数目降低(P<0.05),GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组细胞数目显著降低(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY与DTX(100μmol/L+20nmol/L)组细胞数目显著降低(P<0.01)。DU145R细胞计数结果表明,与Ctrl组相比,DTX(10nmol/L)组细胞数目无显著性差异(P>0.05),GLY(100μmol/L)组细胞数目显著降低(P<0.05),GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组细胞数目显著降低(P<0.01);与DTX(10nmol/L)组相比,GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组细胞数目显著降低(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组细胞数目降低(P<0.05)。
图11示例性示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞凋亡率的影响。如图11所示,流式细胞术检测细胞凋亡,TaxR细胞结果显示,与Ctrl组相比,DTX(20nmol/L)组细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05),GLY(100μmol/L)组凋亡率升高(P<0.05),GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组凋亡率显著升高(P<0.01);与DTX(20nmol/L)组相比,GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组凋亡率明显升高(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY与DTX(100μmol/L+20nmol/L)组凋亡率升高(P<0.05)。DU145R细胞结果显示,与Ctrl组相比,DTX(10nmol/L)组细胞凋亡率无明显差异(P>0.05),GLY(100μmol/L)组凋亡率升高(P<0.05),GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组凋亡率明显升高(P<0.05);与DTX(10nmol/L)组相比,GLY与DTX(100μmol/L+10nmol/L)组细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY与DTX(100μmol/L+10nmol/L)组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。
图12示例性示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞周期的影响。如图12所示,流式细胞术检测细胞周期,TaxR细胞结果显示,与Ctrl组相比,DTX(20nmol/L)组和的G1、S、G2期比例无明显差异(P>0.05),GLY(100μmol/L)组G1期升高、S期下降(P<0.05),GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组G1期升高、S期下降(P<0.01);与DTX(20nmol/L)组相比,GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组G1期升高、S期下降(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组G1期升高、S期下降,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。DU145R细胞结果显示,与Ctrl组相比,DTX(10nmol/L)组G1、S、G2期比例无明显差异(P>0.05),GLY(100μmol/L)组G1期升高、S期下降(P<0.05),GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组G1期升高、S期下降(P<0.01);与DTX(10nmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组与GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组G1期升高、S期下降(P<0.05,P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组G1期升高、S期下降,差异有统计学意义(P<0.05)。
图13示例性示出了GLY联合DTX对TaxR、DU145R细胞凋亡蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2表达的影响。如图13所示,与Ctrl组相比,DTX组TaxR和DU145R细胞的Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达均无差异(P>0.05);GLY(100μmol/L)组与GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组Caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01);与DTX(20nmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组Caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+DTX(100μmol/L+20nmol/L)组Caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。DU145R细胞WB实验结果表明,与Ctrl组相比,DTX(10nmol/L)组蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),GLY(100μmol/L)组与GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组Caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01);与DTX(10nmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组Caspase3、Bax蛋白表达升高(P<0.01),GLY+DTX(100μmol/L+10nmol/L)组Caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY与DTX(100μmol/L+10nmol/L)组Caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)。
图14示例性示出了不同浓度GLY对TaxR、DU145R细胞通路蛋白的影响。如图14所示,Western blot实验结果表明,与Ctrl组相比,加药组(100、200、400μmol/L GLY)PI3K、AKT蛋白表达无明显变化,p-PI3K、p-AKT、NF-kBp65蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。
图15示例性示出了PI3K、NF-κB信号通路抑制剂对TaxR细胞ABCB1表达的影响。如图15所示,加入PI3K信号通路抑制剂沃曼霉素(WM)后,Western blot实验结果表明,与Ctrl组相比,WM(10μmol/L)组、GLY(100μmol/L)组、GLY+WM(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与WM(10μmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组、GLY+WM(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+WM(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),GLY和WM共同作用比单独作用时效果更显著。
加入NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082(BAY)(10μmol/L)后,western blot实验结果表明,与Ctrl组相比,Bay(10μmol/L)组、GLY(100μmol/L)组、GLY+Bay(100μmol/L+10μmol/L)组NF-κBp65、p-ikBα、ABCB1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01);与Bay(10μmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组、GLY+Bay(100μmol/L+10μmol/L)组NF-κBp65、p-ikBα、ABCB1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+Bay(100μmol/L+10μmol/L)组NF-κBp65、p-ikBα、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);GLY和Bay共同作用比单独作用时效果更显著。GLY表现出和Bay相同的作用,共同下调ABCB1的表达,具有协同作用。
图16示例性示出了PI3K、NF-κB信号通路抑制剂对DU145R细胞ABCB1表达的影响。如图16所示,加入WM(10μmol/L),western blot实验结果表明,与Ctrl组相比,WM(10μmol/L)组、GLY(100μmol/L)组、GLY+WM(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与WM(10μmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组、GLY+WM(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+WM(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01),GLY和WM共同作用比单独作用时效果更显著。
加入Bay(10μmol/L),western blot实验结果表明,与Ctrl组相比,Bay(10μmol/L)组、GLY(100μmol/L)组、GLY+Bay(100μmol/L+10μmol/L)组NF-κBp65、p-ikBα、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01);与Bay(10μmol/L)组相比,GLY(100μmol/L)组、GLY+Bay(100μmol/L+10μmol/L)组NF-κBp65、p-ikBα、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,GLY+Bay(100μmol/L+10μmol/L)组NF-κBp65、p-ikBα、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);GLY和Bay共同作用比单独作用时效果更显著。GLY表现出和Bay相同的作用,共同下调ABCB1的表达,具有协同作用。
图17示例性示出了PI3K信号通路诱导剂对TaxR、DU145R细胞ABCB1表达的影响。如图17所示,加入10μmol/L PI3K信号通路诱导剂740Y-P。TaxR细胞western blot实验结果表明,与Ctrl组相比,GLY(100μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,740Y-P(10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达升高,GLY+740Y-P(100μmol/L+10μmol/L)组p-AKT蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,740Y-P(10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达升高(P<0.01);与740Y-P(10μmol/L)组相比,GLY+740Y-P(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。DU145R细胞western blot实验结果表明,与对照组(Ctrl)相比,GLY(100μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,740Y-P(10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达升高,GLY+740Y-P(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与GLY(100μmol/L)组相比,740Y-P(10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达升高(P<0.01);与740Y-P(10μmol/L)组相比,GLY+740Y-P(100μmol/L+10μmol/L)组p-PI3K、p-AKT、ABCB1蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。
图18示例性示出了GLY对TaxR、DU145R细胞ABCB1转运体外排功能的影响。罗丹明123积蓄实验检测GLY对ABCB1转运体外排功能,TaxR细胞结果显示,与Ctrl组相比,GLY加药组(100、200、400μmol/L)罗丹明123进入细胞内比例增加,荧光强度增强,抑制了转运体的外排功能(P<0.05,P<0.01)。DU145R细胞结果显示,与Ctrl组相比,GLY加药组(100、200、400μmol/L)罗丹明123进入细胞内比例增加,荧光强度增强,转运体的外排功能被抑制(P<0.01)。
以上利用PCa化疗耐药细胞TaxR、DU145R与非耐药细胞C4-2B、DU145之间的对比选出ABCB1作为研究靶点。甘草甜素调节ABCB1的作用使得其与DTX的联合应用可恢复TaxR,DU145R对DTX的敏感性从而逆转耐药。揭示了甘草甜素调节ABCB1和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的关联性和作为潜在逆转化疗药物的可能性。本发明中,甘草甜素对ABCB1的抑制作用揭示了甘草甜素作为ABCB1抑制剂的潜在可能性,同时也表明甘草甜素在辅助治疗化疗耐药前列腺癌方面具有重要的应用价值。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,但本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围
为了方便解释,已经结合具体的实施方式进行了上述说明。但是,上述示例性的讨论不是意图穷尽或者将实施方式限定到上述公开的具体形式。根据上述的教导,可以得到多种修改和变形。上述实施方式的选择和描述是为了更好的解释原理以及实际的应用,从而使得本领域技术人员更好的使用所述实施方式以及适于具体使用考虑的各种不同的变形的实施方式。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,其特征在于,所述甘草甜素通过促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡以改善前列腺癌。
3.根据权利要求2所述的甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,其特征在于,所述甘草甜素通过抑制ABCB1的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
4.根据权利要求3所述的甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,其特征在于,所述甘草甜素通过抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
5.根据权利要求4所述的甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,其特征在于,所述甘草甜素通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路抑制ABCB1转运体的表达以促进前列腺癌化疗耐药细胞凋亡,进而改善前列腺癌。
6.根据权利要求1所述的甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,其特征在于,所述甘草甜素与多西他赛联合使用以降低前列腺化疗耐药细胞对多西他赛的耐药性,进而改善前列腺癌。
7.根据权利要求1~6任一项所述的甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,其特征在于,所述甘草甜素改善前列腺癌的应用浓度在6.25μmol/L至800μmol/L之间。
8.根据权利要求7所述的甘草甜素在改善前列腺癌中的应用,其特征在于,所述甘草甜素改善前列腺癌的应用浓度优选为6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L的其中一种。
9.一种甘草甜素在制备改善前列腺癌的药物中的应用,其特征在于,所述药物包括唯一活性成分的甘草甜素以及药学上可接受的辅料;所述药物用于改善前列腺癌。
10.一种甘草甜素和多西他赛的药物组合物在制备改善前列腺癌的药物中的应用,其特征在于,所述药物包括甘草甜素和多西他赛的药物组合物以及药学上可接受的辅料,所述药物用于降低前列腺化疗耐药细胞对多西他赛的耐药性,进而改善前列腺癌。
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