KR101661365B1 - 단구로부터 수상 세포양 분화를 유도하여, 항암 면역 활성을 높이는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물 - Google Patents
단구로부터 수상 세포양 분화를 유도하여, 항암 면역 활성을 높이는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수상 세포양 세포를 유도·활성화하여, 암을 면역 요법에 의해 치료 또는 예방하는 조성물을 제공한다. 이하의 REIC 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 암 면역 활성화제: (a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질; 또는 (b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 수개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지고, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질.
Description
본 발명은 항암 면역 활성을 높이는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물에 관한 것이다.
수상 세포(Dendritic cell: DC)는 생체내에서 가장 강력한 항원 제시 세포이고, T 세포에 항원을 제시하는 것에 의해 면역 응답을 유도하는 것이 알려져 있다. 또한, DC는 T 세포만이 아니라 B 세포, NK 세포, NKT 세포 등과도 직접 작용하고, 면역 반응에서의 중추적 역할을 담당하는 세포인 것이 알려져 있다. 미성숙 DC는 항원 자극을 받는 것에 의해, CD40, CD80, CD86 등의 발현 상승을 따라 높은 T 세포 자극능을 획득하고 말초 림프 조직에 이행하여, 받아들인 항원에 특이적인 T 세포를 활성화하는 것에 의해 면역 응답을 유도한다.
일반적으로, 혈액 전구 세포로부터 수상 세포(양)의 분화를 유도할 수 있는 것으로 확인되는 물질은, 문헌적으로도, 셀 수 있을 정도밖에 없고, 그 대부분이 저명한 사이토카인이다. 예컨대, GM-CSF와 IL-4의 병용에 의한 분화 유도에 대해서 많은 보고가 이루어지고, 수상 세포 분화의 업계 표준(golden standard)으로 되어 있다. 그 외에, 단제 또는 병용에 의해 수상 세포를 분화 유도할 수 있는 물질로서 TNF-알파, IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, HGF(간세포 성장 인자; Hepatocyte growth factor), CD40 리간드, M-CSF, Flt3 리간드, TGF-베타가 보고되어 있다. 이들의 단백질 중, 단제만으로 그 전구 세포로부터 수상(양) 세포를 분화 유도할 수 있는 물질로서는 IL-2, IL-15, HGF, CD40 리간드를 들 수 있다. 이 중 항암 효과가 생체내(in vivo)에서 확인되는 것은 IL-2뿐이다(비특허 문헌 1을 참조).
한편, 세포의 불사화에 관련된 유전자로서, REIC 유전자가 알려져 있고, 암 세포에서는 이 유전자의 발현이 억제되어 있는 것이 보고되어 있다(특허 문헌 1 및 비특허 문헌 2부터 5를 참조).
REIC 유전자는 Dkk 패밀리의 구성원이고, 그 중 Dkk-1이 Wnt 수용체를 통해 Wnt 신호 전달을 저해하는 것이 시사되어 있다(비특허 문헌 6 및 7을 참조). Wnt 유전자는 세포의 성장, 분화, 암화 등의 중요한 생물학적 상황에 다면적인 역할을 다하는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 8을 참조). 따라서, Dkk 패밀리(인간은 현재 4개의 유전자가 알려져 있음)는 대략 마찬가지로 세포의 성장, 분화, 암화에 있어서 중요한 기능을 담당한다고 생각되지만, 대부분은 미해명 상태이다.
특허 문헌 1: 국제 공개 제WO01/038523호 공보
비특허 문헌 1: Zou GM. Et al., Eur Cytokine Netw. 2002 Apr-Jun; 13(2): 186-99.
비특허 문헌 2: Tsuji, T. et al., BiochemBiophys Res Co㎜un 268, 20-4 (2000)
비특허 문헌 3: Tsuji, T. et al., BiochemBiophys Res Co㎜un 289, 257-63 (2001)
비특허 문헌 4: Nozaki, I. et al., Int J Oncol 19, 117-21 (2001)
비특허 문헌 5: Kurose, K. et al., J Urol 171, 1314-8 (2004)
비특허 문헌 6: Bafico, A. et al., Nat Cell Biol 3, 683-6 (2001)
비특허 문헌 7: Hoang, B.H. et al., Cancer Res 64, 2734-9 (2004)
비특허 문헌 8: Moon, R.T. et al., Science 296, 1644-6 (2002)
본 발명은 수상 세포양 세포를 유도·활성화하여, 암을 면역 요법에 의해 치료 또는 예방하는 것을 목적으로 한다.
상기한 바와 같이, 면역학적인 암 치료제로서의 IL-2 단백질은 신세포암 등의 특수한 암종에 있어서 치료 효과를 갖는 것이다. 그러나, 그 투여 적응이 있는 암종 및 그 효과는 한정적인 것이 있는 것도 임상적으로는 주지의 사실이다.
본 발명자 등은 먼저 본 발명자 등이 단리한 REIC(REIC/Dkk-3) 단백질의 암 면역 치료에서의 효과에 대해서 예의 검토하였다. 그 결과, 본 발명자 등은 REIC 단백질이 단구로부터 수상 세포양 세포를 분화 유도시켜, 상기 수상 세포양 세포가 암 항원에 대하는 면역 반응을 야기하여, 암을 치료 또는 예방할 수 있는 것을 발견하고, REIC 단백질을 수상 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암의 치료 또는 예방제로서 이용하는 것에 관한 본 발명을 완성시켰다. 본 발명자 등은 거의 모든 암종에서 발현·분비 저하가 확인되는 REIC 단백질은 이들 여러 가지 암종에 있어서 암 면역 활성화 작용을 갖는 암 치료제로서 사용할 수 있을 가능성이 있는 것, 또한 그 치료 효과에 대해서도 IL-2와 비교하여 우위성을 가질 가능성이 있는 것을 발견하였다. 본 발명자 등은 REIC 단백질 자신이 항암 면역을 유도할 수 있는 것을 증명하고, 생체내에서의 면역·염증 현상에서의 REIC 단백질의 유용성을 확인하였다. 발암의 관점에서 생각하면, 암화가 진행되는 조직 내에서는 REIC 단백질의 농도가 낮은 것으로 생각되고(많은 종류의 암 세포에서는 REIC 단백질의 발현, 분비가 결여, 저하되어 있기 때문에), 이때문에 항암 면역 활성이 암 조직 내에서는 잘 유도되지 않으며, 생체 면역이 암을 놓쳐(암 세포의 면역학적 관용), 암이 증식, 악화되는 것으로 생각된다. REIC 단백질은 이러한 상황 하에 항암 면역 활성화에 의한 암화·발암 예방제로서도 유용하다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 이하의 REIC 단백질을 유효 성분으로서 함유하는, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질; 또는
(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 수개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지고, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질.
[2] 단구가 말초혈 단구인 [1]의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제.
[3] 이하의 REIC 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 암 면역 활성화제:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질; 또는
(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 수개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지고, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질.
[4] 단구가 말초혈 단구인 [3]의 암 면역 활성화제.
[5] [3] 또는 [4]에 기재된 암 면역 활성화제를 함유하는, 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
[6] 이하의 REIC DNA를 유효 성분으로서 함유하는, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA; 또는
(b) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA에 엄격한 조건에서 하이브리드화하는 DNA로서, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
[7] 단구가 말초혈 단구인 [6]의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제.
[8] 이하의 REIC DNA를 유효 성분으로서 함유하는 암 면역 활성화제:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA; 또는
(b) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA에 엄격한 조건에서 하이브리드화하는 DNA로서, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
[9] 단구가 말초혈 단구인 [8]의 암 면역 활성화제.
[10] [8] 또는 [9]의 암 면역 활성화제를 함유하는, 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
[11] 이하의 REIC DNA를 함유하는 벡터를 유효 성분으로서 함유하는, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA; 또는
(b) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA에 엄격한 조건에서 하이브리드화하는 DNA로서, 단구로부터의 수상 세포 또는 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
[12] 벡터가 아데노바이러스 벡터인 [11]의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제.
[13] 단구가 말초혈 단구인 [11] 또는 [12]의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제.
[14] 이하의 REIC DNA를 함유하는 벡터를 유효 성분으로서 함유하는 암 면역 활성화제:
(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA; 또는
(b) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA에 엄격한 조건에서 하이브리드화하는 DNA로서, 단구로부터의 수상 세포 또는 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA.
[15] 단구가 말초혈 단구인 [14]의 암 면역 활성화제.
[16] 벡터가 아데노바이러스 벡터인 [14] 또는 [15]의 암 면역 활성화제.
[17] [14]∼[16] 중 어느 하나의 암 면역 활성화제를 함유하는, 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
[18] 벡터가 아데노바이러스 벡터인 [17]의 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
[19] 동물로부터 채취한 단구를 시험관내(in vitro)에서 이하의 REIC 단백질의 존재 하에 배양하는 것을 포함하는, CD14 양성 단구로부터 수상 세포양 세포를 분화 유도하는 방법:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질; 또는
(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 수개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지고, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질.
[20] 단구가 말초혈 단구인 [19]의 방법.
[21] [19] 또는 [20]의 방법에 의해, REIC 단백질에 의해 활성화된 단구로부터 분화 유도된 수상 세포양으로 분화된 세포.
[22] CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR 및 CD14가 양성이고, CD1a가 음성인, [21]의 수상 세포양으로 분화된 세포.
[23] 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 세포 표면의 항원을 해석한 경우에, GM-CSF 및 IL-4를 이용하여 단구로부터 유도된 수상 세포에 비해, CD14가 많이 발현되어 있고, CD1a가 거의 발현되지 않는 [21]의 수상 세포양으로 분화된 세포.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2008-086516호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 정제한 인간 REIC 단백질의 웨스턴 블랏 분석의 결과를 도시하는 사진이다.
도 2는 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단구로부터의 수상 세포양 분화 유도를 도시하는 위상차 현미경 상을 도시하는 사진이다.
도 3은 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도되는 수상 세포양 세포의 전체 세포에 차지하는 비율을 도시하는 도면이다.
도 4는 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단구(CD14 양성 세포)로부터의 수상 세포양 분화 유도를 도시하는 사진이다.
도 5는 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단구의 STAT 활성화를 도시하는 사진이다.
도 6a는 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도된 수상 세포양 세포의 유세포 분석에 의한 해석의 결과를 도시하는 도면이다.
도 6b는 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도된 수상 세포양 세포의 유세포 분석에 의한 해석의 결과를 도시하는 도면이다.
도 7은 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여 실험의 프로토콜을 도시하는 도면이다.
도 8a는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 종양 증식 억제 효과(종양 체적의 시간 경과에 따른 변화)를 도시하는 도면이다.
도 8b는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 종양 증식 억제 효과(종양 중량)를 도시하는 도면이다.
도 8c는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 종양 증식 억제 효과(종양의 사진)를 도시하는 사진이다.
도 9는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 항암 면역 활성의 상승을 도시하는 도면이다.
도 10은 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단핵구로부터의 수상 세포양 분화 유도를 도시하는 도면이다.
도 11은 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 유도된 수상양 세포에서의 CD4+T 세포(림프구)를 이용한 알로제닉(동종 이계) 반응 유도 활성을 도시하는 도면이다.
도 2는 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단구로부터의 수상 세포양 분화 유도를 도시하는 위상차 현미경 상을 도시하는 사진이다.
도 3은 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도되는 수상 세포양 세포의 전체 세포에 차지하는 비율을 도시하는 도면이다.
도 4는 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단구(CD14 양성 세포)로부터의 수상 세포양 분화 유도를 도시하는 사진이다.
도 5는 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단구의 STAT 활성화를 도시하는 사진이다.
도 6a는 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도된 수상 세포양 세포의 유세포 분석에 의한 해석의 결과를 도시하는 도면이다.
도 6b는 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도된 수상 세포양 세포의 유세포 분석에 의한 해석의 결과를 도시하는 도면이다.
도 7은 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여 실험의 프로토콜을 도시하는 도면이다.
도 8a는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 종양 증식 억제 효과(종양 체적의 시간 경과에 따른 변화)를 도시하는 도면이다.
도 8b는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 종양 증식 억제 효과(종양 중량)를 도시하는 도면이다.
도 8c는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 종양 증식 억제 효과(종양의 사진)를 도시하는 사진이다.
도 9는 인간 REIC 단백질의 종양 내 투여에 의한 항암 면역 활성의 상승을 도시하는 도면이다.
도 10은 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 말초혈 단핵구로부터의 수상 세포양 분화 유도를 도시하는 도면이다.
도 11은 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 유도된 수상양 세포에서의 CD4+T 세포(림프구)를 이용한 알로제닉(동종 이계) 반응 유도 활성을 도시하는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물은 REIC DNA 또는 상기 DNA가 코딩하는 REIC 단백질을 유효 성분으로서 함유한다.
REIC DNA의 염기 서열은 서열 번호 1로 표시된다. 또한, REIC DNA가 코딩하는 REIC 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 표시된다.
본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물에 함유되는 REIC DNA를 코딩하는 단백질은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백질이다. 여기서, 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는 상기 아미노산 서열에 대하여 1 또는 복수 또는 수개(1∼10개, 바람직하게는 1∼5개, 더 바람직하게는 1개 또는 2개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열과, BLAST[Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(미국 국립 생물학 정보 센터의 기본 부분 정렬 검색 도구)] 등(예컨대, 디폴트 즉, 초기 설정의 파라미터를 이용하여)을 이용하여 계산했을 때에, 적어도 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 동일성을 갖고 있는 것을 들 수 있다.
REIC DNA를 코딩하는 단백질은 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열 정보에 기초하여 화학 합성에 의해 얻을 수 있다. 또한, 유전자 공학적 방법에 의해 재조합 REIC 단백질로서 얻을 수 있다. 또한, WO01/038523호 공보의 기재에 따라 얻는 것도 가능하다.
본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물에 함유되는 REIC DNA는 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건에서 하이브리드화하는 DNA, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과, BLAST[Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(미국 국립 생물학 정보 센터의 기본 부분 정렬 검색 도구)] 등(예컨대, 디폴트 즉, 초기 설정의 파라미터를 이용하여)을 이용하여 계산했을 때에, 적어도 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 동일성을 갖고 있는 DNA, 또는 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열에 대하여 1 또는 복수 또는 수개(1∼10개, 바람직하게는 1∼5개, 더 바람직하게는 1개 또는 2개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 DNA 등 중 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성을 갖는 단백을 코딩하는 것이다. 여기서, 「엄격한 조건」이란, 예컨대 「1XSSC, 0.1% SDS, 37℃」정도의 조건이고, 보다 엄격한 조건에서는 「0.5XSSC, 0.1% SDS, 42℃」정도의 조건이며, 더 엄격한 조건에서는 「0.2XSSC, 0.1% SDS, 65℃」정도의 조건이다. 또한, 본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물에 함유되는 REIC DNA는 서열 번호 2로 표시되는 단백질을 코딩하는 DNA이다.
여기서, 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 활성이란, 단구에 작용하여 수상 세포양 세포로 분화시키는 활성을 말한다. REIC 단백질 첨가에 의해 수상 세포양 세포가 분화 유도되는지의 여부는 형태적 특징 및 표면 항원에 의해 검출할 수 있다. 즉, 이 수상 세포양 세포의 특징으로서는 형태학적으로 수상 돌기를 갖는다는 것과, 유세포 분석에 의한 해석에 의해, 표면 항원으로서 수상 세포의 마커인 CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR가 양성인 것을 들 수 있다.
REIC DNA는 서열 번호 1의 서열 정보에 기초하여 인간 세포, 인간 조직 등으로부터 얻을 수 있다. 또한, WO01/038523호 공보의 기재에 따라 얻는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은 REIC DNA를 함유하는 벡터도 포함한다. 상기 벡터를 피검체에 도입하는 것에 의해 피검체 체내에서 REIC 단백질이 발현되어 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도 효과, 암 면역 활성화 효과 및 암 면역 활성화 작용에 의한 암의 치료 또는 예방 효과를 발휘할 수 있다.
유전자 치료에서의 원하는 유전자(DNA)의 피검체에의 도입은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 유전자를 피검체에 도입하는 방법으로서 바이러스 벡터를 이용하는 방법 및 비바이러스 벡터를 이용하는 방법이 있고, 여러 가지의 방법이 공지이다(별책 실험 의학, 유전자 치료의 기초 기술, 요도사, 1996; 별책 실험 의학, 유전자 도입 및 발현 해석 실험법, 요도사, 1997; 일본 유전자 치료 학회편, 유전자 치료 개발 연구 핸드북, N·T·S, 1999).
유전자 도입을 위한 바이러스 벡터로서는 아데노바이러스, 아데노 수반 바이러스, 레트로바이러스 등의 바이러스 벡터를 이용한 방법이 대표적인 것이다. 무독화한 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 신드비스바이러스, 센다이바이러스, SV40, 면역부전증 바이러스(HIV) 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 목적으로 하는 유전자를 도입하고, 세포에 재조합 바이러스를 감염시키는 것에 의해 세포 내에 유전자를 도입하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 유전자를 바이러스를 이용한 유전자 치료에 사용할 때, 아데노바이러스 벡터가 바람직하게 이용된다. 아데노바이러스 벡터의 특징으로서 (1) 많은 종류의 세포에 유전자 도입을 할 수 있고, (2) 증식 정지기의 세포에 대해서도 효율적으로 유전자 도입을 할 수 있으며, (3) 원심에 의해 농축이 가능하고, 높은 타이터(10∼11 PFU/㎖ 이상)의 바이러스가 얻어지고, (4) 생체내의 조직 세포에의 직접 유전자 도입에 적합하다는 점을 들 수 있다. 유전자 치료용 아데노바이러스로서는 E1/E3 영역을 결실시킨 제1 세대 아데노바이러스 벡터(Miyake, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 93, 1320, 1996)로부터, E1/E3 영역에 가하고, E2 또는 E4 영역을 결실시킨 제2 세대 아데노바이러스 벡터(Lieber, A., et al., J. Virol., 70, 8944, 1996; Mizuguchi, H. & Kay, M.A., Hum. Gene Ther., 10, 2013, 1999), 아데노바이러스 게놈을 대략 완전히 결실시킨(GUTLESS) 제3 세대 아데노바이러스 벡터(Steinwaerder, D.S., et al., J. Virol., 73, 9303, 1999)가 개발되어 있지만, 본 발명에 따른 유전자를 도입하기 위해서는 특별히 한정되지 않고, 어느 아데노바이러스 벡터에서도 사용 가능하다. 또한, AAV의 염색체에 통합능을 부여한 아데노-AAV 하이브리드 벡터(Recchia, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 2615, 1999)나, 트랜스포손(transposone)의 유전자를 이용하는 것에 의해 염색체에 통합하는 능력을 갖은 아데노바이러스 벡터 등을 이용하면, 장기적인 유전자 발현에도 응용이 가능하다. 또한, 아데노바이러스 파이버의 H1 루프에 조직 특이적인 이행성을 나타내는 펩티드 서열을 삽입하는 것에 의해, 아데노바이러스 벡터에 조직 특이성을 부여하는 것도 가능하다(Mizuguchi, H. & Hayakawa, T., Nippon Rinsho, 7, 1544, 2000).
본 발명에 있어서, REIC DNA를 함유하는 아데노바이러스 벡터를 Ad-REIC로 지칭한다.
또한, 상기 바이러스를 이용하지 않고, 플라스미드 벡터 등의 유전자 발현 벡터가 통합된 재조합 발현 벡터를 이용하여, 목적 유전자를 세포나 조직에 도입할 수 있다. 예컨대, 리포펙션법(lipofection), 인산-칼슘 공침법, DEAE-덱스트란법, 미소 유리관을 이용한 DNA의 직접 주입법 등에 의해 세포 내로 유전자를 도입할 수 있다. 또한, 내포형 리포솜(internal liposome)에 의한 유전자 도입법, 정전기형 리포솜(electorostatic type liposome)에 의한 유전자 도입법, HVJ-리포솜법, 개량형 HVJ-리포솜법(HVJ-AVE 리포솜법), HVJ-E(엔벨로프) 벡터를 이용한 방법, 리셉터 개재성 유전자 도입법, 입자 총으로 담체(금속 입자)와 함께 DNA 분자를 세포로 이입하는 방법, 나출(naked) DNA의 직접 도입법, 여러 가지의 중합체에 의한 도입법 등에 의해서도 재조합 발현 벡터를 세포 내에 받아들이게 하는 것이 가능하다. 이 경우에 이용하는 발현 벡터로서는 생체내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터이면 어떠한 발현 벡터도 이용할 수 있지만, 예컨대 pCAGGS[Gene 108, 193-200 (1991)]나, pBK-CMV, pcDNA3, 1, pZeoSV(인비트로젠사, 스트라테이진사), pVAX1 등의 발현 벡터를 들 수 있다.
REIC DNA를 함유하는 벡터는 적절하게 유전자를 전사하기 위한 프로모터나 인핸서(enhancer), 폴리 A 신호, 유전자가 도입된 세포의 표지 및/또는 선별을 위한 마커 유전자 등을 포함하고 있어도 좋다. 이때의 프로모터로서는 공지의 프로모터를 이용할 수 있다.
본 발명의 REIC DNA를 함유하는 벡터를 피검체에 도입하기 위해서는 유전자 치료제를 직접 체내에 도입하는 생체내법, 및 인간으로부터 어느 종류의 세포를 취출하여 체외에서 유전자 치료제를 상기 세포로 도입하고, 그 세포를 체내에 복귀시키는 생체외(ex vivo)법 등을 이용하면 좋다[닛케이 사이언스, 1994년 4월호, 20-45 페이지; 월간 약사, 36(1), 23-48 (1994); 실험 의학 증간, 12(15), (1994); 일본 유전자 치료 학회편, 유전자 치료 개발 연구 핸드북, N·T·S, 1999].
본 발명에 있어서, 단구는 말초혈 유래 단구, 골수 유래 단구, 비장 세포 유래 단구, 제대혈 유래 단구가 포함되고, 이 중에서도 말초혈 유래의 단구가 바람직하다. 단구는 CD14 양성을 특징으로 하고, 생체로부터 단구를 채취하여, REIC 단백질로 수상 세포양 세포에 유도시키는 경우, CD14의 존재를 지표에 FACS(형광 활성화 세포 분류기: Fluorescent activated cell sorter) 또는 유세포 분석기 등에 의해 채취할 수 있다. 단구의 유래 동물 종은 한정되지 않고, 마우스, 랫트, 모르모트, 햄스터, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 염소, 원숭이, 인간 등의 포유 동물을 이용할 수 있다. FACS에 의한 특정 세포 집단의 단리는 공지의 방법에 의해 행하면 좋다. FACS, 유세포 분석기로서는 예컨대 FACS vantage(Becton Dickinson사 제조), FACS Calibur(Becton Dickinson사 제조) 등을 이용할 수 있다.
단구의 배양은 주지의 인간 림프계 세포의 배양 기술에 의해 행할 수 있다. 배양액으로서는 예컨대 RPMI1640이나 DMEM의 공지의 기본 배지를 이용하면 좋다. 이들 기본 배지에 적당한 항생 물질이나 동물 혈청 등을 첨가하여 배양하면 좋다. 배양 용기는 한정되지 않고, 배양 규모에 따라 시판되는 플레이트, 접시, 플라스크를 적절하게 선택하여 이용할 수 있다.
본 발명은 시험관내에서 단구를 REIC 단백질의 존재 하에 배양하여, 단구를 수상 세포양 세포로 분화 유도시키는 방법을 포함한다. 상기 방법에 있어서는, 예컨대 단구를 104∼107 세포/㎖의 농도로 이용하고, REIC 단백질을 1∼20 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 배양하면 좋다.
수상 세포는 생체내에서 암 면역, 염증 등의 기구에 매우 중요한 역할을 다하고 있다. 본 발명의 방법에 의해 REIC 단백질에 의해 분화 유도된 수상 세포양 세포는 IL-4+GM-CSF에서 유도되는 수상 세포에 형태학적으로 비슷하지만, 엄밀하게는 상이한 신규의 수상 세포양 세포이다. REIC 단백질에 의해 유도되는 수상 세포양 세포는 수상의 형태를 갖고 있다. 또한, 수상 세포의 마커인, CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR가 양성이다. 이 점, 본 발명의 신규의 수상 세포양 세포는 수상 세포로서 분류할 수 있다. 그러나, 수상 세포의 마커인 CD1a는 음성이고, 일반적으로 수상 세포로서는 음성화하는 것이 되는 CD14는 양성이다.
REIC 단백질의 자극에 의해 CD14 양성 단구로부터 유도되는 경우는, 「REIC 단백질에 의해 활성화된, 수상 세포양으로 분화된 세포(REIC activated monocyte with dendritic cell features)」로 지칭한다.
본 발명은 REIC 단백질에 의해 CD14 양성 단구로부터 유도된 수상 세포양 세포를 포함한다.
REIC 단백질에 유도되어 얻어진 수상 세포양 세포는 암 면역 요법에 이용할 수 있다. 즉, 피검체로부터 단구를 채취하고, 상기 단구를 REIC 단백질과 함께 배양하여, 수상 세포양 세포를 유도하고, 얻어진 수상 세포양 세포를 피검체에 복귀시키는 것에 의해 수상 세포양 세포 자체를 암 치료 또는 예방 등에 이용할 수 있다. 이때, REIC 단백질에 의해 유도된 수상 세포양 세포는 암종 비특이적으로 작용하여, 암 면역 치료 효과를 발휘할 수 있지만, 수상 세포양 세포를 유도할 때에 암종 특이적인 종양 항원을 첨가하여도 좋다. 또한, 유도한 수상 세포양 세포를 특정한 종양 항원과 함께 배양하여도 좋다. 수상 세포양 세포를 암종 특이적인 종양 항원으로 자극하는 것에 의해, 종양 특이적으로 암 세포를 공격하는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 REIC 단백질에 의해 유도된 수상 세포양 세포는 CD4+T 세포를 증식시키는 능력을 가져, 피검체의 항암 면역 활성을 증대시킬 수 있다.
수상 세포양 세포는 피내 투여, 피하 투여, 정맥내 투여 또는 림프절내 투여에 의해 투여할 수 있다.
또한, REIC 단백질은 세포외로부터 세포에 작용하여 세포의 분화를 담당하는 사이토카인양 작용을 갖는 것으로 생각되고, 생체내에서 널리, 면역성, 염증성에 관한 기능을 갖는 것으로 생각된다. 따라서, REIC 단백질 또는 그것을 코딩하는 DNA를 피검체에 투여하고, 생체내에서의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 또는 수상 세포양 세포 활성화제로서 이용할 수 있다. REIC 단백질은 피검체 내에서 수상 세포양 세포를 유도하고, 그 결과, 수상 세포양 세포에 의해 피검체 내에서 항암성을 갖는 림프구가 전신성에 활성화되어 암 면역 작용을 발휘한다. 따라서, REIC 단백질 또는 그것을 코딩하는 DNA를 암 면역 활성화제로서 이용할 수 있다. 또한, REIC 단백질에 의해 유도된 수상 세포양 세포는 암 면역 작용을 갖고 있기 때문에, REIC 단백질 또는 그것을 코딩하는 DNA를 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물(암 면역 치료제)로서 이용할 수 있다. 이때, REIC 단백질 또는 그것을 코딩하는 DNA를 단독으로 투여하여도 좋고, 이 경우, 암종 비특이적으로 효과를 발휘한다. 또는, 특정한 종양 항원과 함께 투여하여도 좋다. 이 경우는, 암종 특이적으로 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 치료 또는 예방 대상이 되는 암으로서는 뇌·신경종양, 피부암, 위암, 폐암, 간암, 림프종·백혈병, 결장암, 췌장암, 항문·직장암, 식도암, 자궁암, 유방암, 부신암, 신장암, 신우뇨관암, 방광암, 전립선암, 요도암, 음경암, 고환암, 골·골육종, 평활근종, 횡문근종, 중피종 등을 들 수 있다. 특히, 유방암, 방광암이 바람직하다.
본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물은 REIC DNA, 상기 DNA를 함유하는 벡터, 또는 상기 DNA가 코딩하는 단백질 및 약리학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제 또는 부형제를 함유한다.
본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물은 여러 가지의 형태로 투여할 수 있어, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등에 의한 경구 투여, 또는 주사제, 점적제, 좌약, 스프레이제, 점안제, 경비투여제, 첩부제 등에 의한 비경구 투여를 들 수 있다.
본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물은 국소 투여하는 것도 가능하고, 예컨대 암 부위에 주사에 의해 투여하는 것에 의해 그 효과를 발휘할 수 있다.
바람직하게는, 암 병변 국소에 1회 또는 복수회, 암 병변 전체에 본제가 퍼지도록 직접 주입한다.
본 발명의 단구로부터의 수상 세포양 세포 분화 유도제, 암 면역 활성화제 및 암 면역 활성화 작용을 갖는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물은 제제 분야에서 통상 이용되는 담체, 희석제, 부형제를 함유한다. 예컨대, 정제용 담체, 부형제로서는 젖당, 스테아르산 마그네슘 등이 사용된다. 주사용 수성액으로서는 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 함유하는 등장액 등이 사용되고, 적당한 용해 보조제, 예컨대 알코올, 프로필렌 글리콜 등의 폴리알코올, 비이온 계면활성제 등으로 병용하여도 좋다. 유성액으로서는 참깨유, 대두유 등이 사용되고, 용해 보조제로서는 안식향산벤질, 벤질알코올 등을 병용하여도 좋다.
그 투여량은 증상, 연령, 체중 등에 따라 상이하지만, 수일 또는 수주간 또는 수개월 간격으로 1회당 0.001 ㎎∼100 ㎎을 피하 주사, 근육 주사, 또는 정맥 주사에 의해 투여하면 좋다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.
재조합 인간
REIC
단백질의 조제
재조합 인간 REIC 단백질은 이하의 방법으로 조제하였다.
1. 전장 인간 REIC의 유전자를 코딩하는 플라스미드를 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 CHO 세포에 도입하고, 인간 REIC 안정 발현 클론을 확립하였다. 토탈 107 세포를 2 mM L-글루타민 및 8 μM 퓨로마이신 함유 무단백질 배지(C5467, Sigma)를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 1주일 약하게 진탕시켜 배양하였다. 5 분간, 2,000 rpm의 원심 분리로 CHO 세포 배양을 회수하고, 상청을 모았다(1 L).
2. 40 분간, 4℃, 15000 rpm으로 상청을 원심 분리하였다.
3. 0.22 ㎛의 필터(TP99505, TPP, Trasadingen, 스위스)를 이용하여 상청을 여과하였다.
4. 상청(1 L)에 TALON 수지(#635501 Clontech Laboratories)(베드 부피(bed volume)에 대하여 3 ㎖의 수지)을 첨가하였다.
5. 4℃에서 밤새 약하게 회전시켰다.
6. 4℃, 700 g, 5 분간 원심 분리를 행하여, 수지를 모았다.
7. 상청을 제거하였다.
8. 40 ㎖의 세정 버퍼(50 ㎖의 인산나트륨, 600 mM NaCl)로 TALON 수지를 세정하였다.
9. 4℃, 700 g, 5 분간 원심 분리를 행하였다.
10. 상청을 제거하였다.
11. 상기 8∼10의 단계를 3회 반복하였다.
12. TALON 수지와 15 ㎖의 세정 버퍼를 첨가하여, 재현탁하였다.
13. 3 ㎖의 TALON 수지를 중력 유동 칼럼에 옮겼다.
14. 칼럼에 15 ㎖의 용출 버퍼를 첨가하고, HIS 태그가 있는 단백질을 용출하여, 인간 REIC 단백질을 회수하였다.
15. FPLC(Fast Prtein Liquid Chromatography)에 제공하기 위해, 용출액을 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 M NaCl을 이용하여 투석하였다.
16. FPLC(MonoQ5/50GL 칼럼, GE Healthcare)를 이용하여, 이하의 조건으로 인간 REIC 단백질을 정제하였다.
버퍼
MonoQ 버퍼 A: 20 ㎜ Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 M NaCl
MonoQ 버퍼 B: 20 ㎜ Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl
유속: 1 ㎖/분
유량: 70 ㎖
프랙션 크기: 1 ㎖
17. 프랙션을 항 인간 REIC 항체를 이용하여, SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 최종 조제물은 SDS-PAGE에 의해 순도 95%를 초과하고 있는 것을 확인하였다(도 1).
18. 적절한 프랙션을 회수하였다.
19. PBS를 이용하여 투석하여, 비축 또는 사용하였다.
20. Centriplus YM-50(#4423, milipore)을 이용하여 농축하였다.
21. Bradford법에 의해 단백질 농도를 검정하였다.
22. 단백질의 스톡 용액은 사용할 때까지 -80℃에서 보존하였다.
인간 단구의 조제
인간 PBMC(말초혈 단구)는 건강한 공여자의 혈액으로부터 Ficoll-Paque 원심 분리를 이용한 표준적 방법으로 행하였다. 세포의 회수율을 트리판블루 배제법으로 계측하여, 99% 이상의 생존율인 것을 확인하였다. 단구의 조제를 위해, PBMC를 LGM-3 배지(림프구 증식 배지-3, 혈청 비함유, Lonza)에 재현탁하고, 플라스틱에 부착된 세포(2 시간, 37℃, 10 ㎝ 접시에서 항온처리)를 단구로서 사용하였다. 몇 개의 실험에서는, CD14+ 단구를 CD14+ 자기 활성화 세로 분류 마이크로비드(MACS; MiltenyiBiotec)를 이용하여 분리하였다. 정제한 CD14+ 단구를 LGM-3 배지에 재현탁하였다. 유세포 분석에 의하면, 순도는 항상 95%보다 높았다.
인간 단구의 처리
PBMC는 단독, 또는 재조합 인간 REIC 단백질(10 ㎍/㎖) 또는 GM-CSF(R&D Systems)+IL-4(R&D Systems)(각각 2 ng/㎖)의 존재 하에 배양하였다. 세포는 위상차 현미경으로 관찰하였다.
도 2에 단독 재조합 인간 REIC 단백질 또는 GM-CSF+IL-4 존재 하에 배양한 PBMC의 0, 2 및 7 일째의 위상차 현미경 상을 도시한다. 단독의 0 일째, REIC 단백질 존재 하의 배양 7 일째, GM-CSF+IL-4 존재 하의 배양의 7 일째의 상의 사각 점선부의 확대상을 우측 패널에 도시한다. 도면에 도시하는 바와 같이, PBMC를 REIC 단백질의 존재 하에 배양하는 것에 의해 수상 세포양 세포의 분화가 확인되었다.
각각의 배양 7 일째에서, 수상 세포양 세포의 전체 세포에 차지하는 비율을 측정하였다. 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도되는 수상 세포양 세포의 전체 세포에 차지하는 비율은 이하와 같이 측정하였다. 즉, 3회의 독립된 실험에 있어서, 각각의 군[(-) 군, 인간 REIC 단백질, IL-4+GM-CSF 군]의 수상 세포양 세포(형태학적으로 크며, 수상 돌기를 확인할 수 있는 세포)를 각각 첨가 후 7 일째에, 현미경 하의 랜덤인 총 5 시야에 있어서 각각 100개씩의 세포를 육안으로 확인하여 계측하였다. 결과를 도 3에 도시한다. PBMC 단독으로 배양한 경우의 수상 세포양 세포의 비율은 수%이지만, REIC 단백질 존재 하에 배양한 경우는 약 40%, GM-CSF+IL-4 존재 하에 배양한 경우는 약 60%였다. 또한, REIC 단백질에 의해 유도되는 수상 세포양 세포는 GM-CSF+IL-4에 의해 유도되는 수상 세포와 형태학적으로 유사하다.
CD14+ 세포 및 CD14 음성 세포는 단독, 또는 재조합 인간 REIC 단백질(1 ㎍/㎖ 또는 10 ㎍/㎖) 또는 GN-CSF+IL-4(각각 2 ng/㎖)의 존재 하에 배양하였다. 세포는 위상차 현미경으로 관찰하였다. 말초혈 단핵구는 단구와 림프구로 구성되어 있고, 이들의 어느 세포로부터 수상 세포양 세포가 분화 유도된 것인지를 밝히기 위해, 시판되는 항 CD14 항체가 부착된 비드를 이용하여, CD14 양성의 단구와 CD14 음성의 림프구에 대해서, 각각 인간 REIC 단백질 첨가에 의한 수상 세포양 분화 유도를 시도하였다. 도 4에 CD14+ 세포로부터의 수상 세포양 분화 유도의 결과를 도시한다. 도 4에 도시하는 바와 같이, CD14 양성의 단구에 있어서만 수상 세포양의 분화 유도가 관찰되고, 도면에 도시되는 바와 같이, 분화 유도된 세포의 빈도는 첨가한 REIC 단백질의 농도에 의존하여 증가하였다. 이상의 것으로부터, 인간 REIC 단백질에 대해서, 말초혈 단구(CD14 양성)를 수상 세포양으로 분화 유도하는 작용이 명백해졌다. 또한 이 작용에는 용량 의존성이 확인되었다.
웨스턴 블랏 분석
인간 REIC 단백질(10 ㎍/㎖) 또는 GM-CSF+IL-4(각각 2 ng/㎖)로 처리한 후, 세포를 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 2번 세정하고, 용해 버퍼(50 mM HEPES, pH 7.4, 250 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 ㎍/㎖ 아프로티닌, 2 mM Na3VO4, 1 mM NaF 및 10 mM β-GP)로 용해하여, 단백질을 추출하였다. 원심 후에, 상청 중의 단백질을 각 실험에서 동등해지도록 조정하고, 등량의 2×SDS 샘플 버퍼로 희석하며, 5 분간 95℃에서 가열 처리하였다. 샘플(10 ㎍ 단백질)을 7.5%의 SDS-PAGE 겔에 제공하고, 폴리비닐리딘 플루오라이드(PVDF) 막에 일렉트로블로팅(electroblotting)하였다. 블랏은 10% 탈지유분, 6% 글리신 및 0.1%의 Tween-20을 함유하는 TBS를 이용하여, 실온에서 1 시간 행하였다. 단백질은 1000배 희석의 토끼 다클론 항 인간 REIC 항체[Abarzua F. et al., Cancer Res. 2005 Nov 1; 65(21): 9617-22], 항 인산화 Stat1(Try701) 항체(#9171, Cell Signaling Technology), 항 인산화 Stat3(Try705) 항체(#9131) 및 항 인산화 Stat5(Try694) 항체(#9351)를 이용하여 확인하였다. 0.1%의 Tween-20 첨가 TBS(T-TBS)로 충분히 세정한 후에, 블랏을 겨자무과 산화효소 결합 2차 항체로 처리하고, T-TBS로 충분히 세정한 후, 증진된 화학발광(enhanced chemiluminescence) 검출법(ECL 키트, Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 발색시켰다.
도 5에 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 말초혈 단핵구의 STAT가 활성화된 결과를 도시한다. 인산화 STAT-1(Tyr), 인산화 STAT-3(Tyr), 인산화 STAT-5(Tyr)의 발현의 상승은 이들 단백질의 활성화를 의미하고, 혈구의 분화시에 중요시되어 있다. 즉, 이 웨스턴 블랏법의 소견은 REIC 단백질이 세포 내 STAT 신호를 통한 혈구 분화능을 갖는 것을 강하게 시사한다. 추가로, REIC 단백질의 STAT 활성화(인산화)에 미치는 작용 패턴은 수상 세포-양성 대조군의 IL-4+GM-CSF 첨가에 의한 것과 상이하다. 이것은 유세포 분석에서의 결과도 함께 REIC 단백질 첨가에 의해 양성 대조군의 수상 세포와는 상이한 수상 세포양 세포가 유도되어 있는 것을 시사한다.
유세포
분석
세포 배양을 냉 PBS의 첨가에 의해 종료시키고, 그 후 10 분간 빙냉하여 항온처리하였다. 계속해서, 파스퇴르 피펫에 의해 세포를 재현탁하여 회수하였다. 부착된 세포는 트립신 처리에 의해 회수하여 부유 세포와 섞었다. 대략 5×105 세포를 100 ㎕의 PBS로 5배 희석한 PE 결합 항체를 이용하여 60 분간 빙상에서 항온처리하였다. 이용한 PE 결합 항체는 CD11c(12-0116, eBioscience), CD14(12-0149), CD1a(12-0019), CD40(12-0409), CD80(12-0809), CD83(12-0839), CD86(12-0869), HLA-DR(12-9956)이었다. 아이소타이프가 동일한 PE 결합 면역 글로불린 G(IgG)(12-4714, 12-4732)를 음성 대조군으로서 이용하였다. 항온처리 후, 세포를 1 ㎖의 PBS로 한번 세정하고, 500 ㎕의 PBS에 재현탁하였다. 그 후, FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson)를 이용하여 104개의 세포를 채취하고, CellQuest 소프트웨어(Becton Dickinson)을 이용하여 분석하였다. 이들 세포의 특징적인 전방 산란(forward scatter) 패턴에 기초하여 적당한 게이트를 설정하고, 게이트 내의 세포만을 분석하였다. 아이소타이프가 동일한 대조군 항체와 함께 항온처리한 대조군 세포보다 높은 평균 형광 인덱스(MFI)를 나타낸 세포를 양성으로 간주하였다. 죽은 세포는 요오드화프로피디움(PI)에 의한 염색 및 /또는 산란 특성에 의해 제거하였다. PI 염색에 의해 99%보다 많은 세포가 생존하고 있는 것을 알았다.
FITC
표지 입자의 엔도시토시스
세포를 회수 후, 세포를 5×106 세포/㎖의 농도로 냉 PBS에 재현탁하였다. 50 ㎍의 FITC 결합 덱스트란(DXFITC; FD40, Sigma)을 현탁액 0.5 ㎖에 첨가하고, 이어서 세포를 1 시간 4℃ 또는 37℃에서 항온처리하였다. 1 ㎖의 냉 PBS로 2회 세정하고, FACSCalibur 유세포 분석기로 취득한 104 세포를 CellQuest 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
도 6a 및 6b에 인간 REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도된 수상 세포양 세포를 유세포 분석에 의해 해석한 결과를 도시한다.
도 6a의 둘러싼 부분의 세포를 이용하여 유세포 분석을 행하였다. 그 둘러싼 부분의 근거는 검체 중의 세포의 잔해를 제거하고, 또한 양성 대조군인 IL-4+GM-CSF 첨가군에 있어서 수상 세포를 깨끗이 모니터할 수 있는 2점이다.
도 6a의 우측 도면에 있어서, CD11c는 골수계 백혈구의 마커(림프구가 아님)이다. 또한, CD14는 단구나 대식 세포의 마커이다. 또한, DX FITC는 FITC의 태그가 있는 덱스트란을 의미한다. 이 물질은 백혈구계 세포의 탐식능(엔도시토시스)의 평가에 자주 이용된다.
따라서, REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도된 세포는 골수계 백혈구 유래이고, IL-4+GM-CSF 첨가에 의해 유도된 수상 세포에 비해 단구계 세포에 가깝고, 또한 수상 세포와 대략 동등한 이물·항원 탐식능을 갖는 수상 세포양 세포이다.
또한, 도 6b에서, CD1a는 수상 세포의 마커의 하나로 비펩티드성의 항원(지질 항원 등)의 제시에 관여하는 것이 된다. 또한, CD40은 수상 세포의 마커의 하나로 CD40 리간드(수상 세포 유도능을 단제라도 갖는다)의 리셉터이다. CD80은 수상 세포의 마커의 하나로 CD86과 함께 T 림프구에 대한 항원 제시에 관여하는 것이 된다. CD83은 수상 세포의 마커의 하나로 성숙 수상 세포의 마커로서 사용된다. CD86은 수상 세포의 마커의 하나로 미숙 수상 세포의 마커로서 사용된다. HLA-DR은 수상 세포의 마커의 하나로 수상 세포의 분화에 따라 강발현한다.
따라서, REIC 단백질 첨가에 의해 분화 유도된 세포는 IL-4+GM-CSF 첨가에 의해 유도된 수상 세포에 유사한(동일하지 않음) 마커 발현 패턴을 나타낸다.
다른 시험관내 실험의 결과도 함께 결론을 내면, REIC 단백질 첨가에 의해, 말초혈 CD14 양성 단구로부터 수상 세포양의 세포가 분화 유도된다. 이 세포는 형태학적으로 말초혈 단구와 상이하고, 또한 IL-4+GM-CSF 첨가에 의해 유도되는 수상 세포와도 상이하다.
도 6에 도시하는 결과는 인간 REIC 단백질 및 REIC 단백질에 의해 유도된 수상양 세포가 (IL-4+GM-CSF에 의한 치료나 IL-4+GM-CSFDC와 마찬가지로) 생체내에서의 항원 탐식·항원 제시능을 보다 높이는 것에 의해 항암 면역을 활성화시키는 것을 도시한다.
생체내
실험에 의한
REIC
단백질의 종양 억제 효과의 검정
RM9 세포(1×106개)를 마우스(C57BL6, 수컷)의 피하에 주입하였다. 주입 후 7, 9, 11, 13, 15, 17 및 19 일째(주입 후 7 일째를 REIC 단백질의 투여 시작으로 함)에 REIC 단백질[100 ㎍(300 ㎕)] 또는 대조군으로서 PBS(300 ㎕)를 형성된 종양 전체에 주입하였다. 21 일째에 마우스를 희생으로 하고, 피하 종양에서의 치료 효과를 판정하여, 항암 면역 활성을 측정하였다. 생체내 실험의 프로토콜을 도 7에 도시한다. 종양의 크기는 처리 후 수일 후에 측정하였다. 종양 체적은 1/2×(최소 직경)2×(최대 직경)에 의해 구하였다.
도 8a에 치료 후의 종양 체적의 시간 경과적 변화를 도시한다. 또한, 도 8b에 마우스로부터 채취한 종양의 중량을 도시한다. 또한, 도 8c에 마우스로부터 채취한 종양의 사진을 도시한다. 도 8a∼8c에 도시하는 바와 같이 인간 REIC 단백질의 투여에 의해 종양 증식을 억제할 수 있었다.
시험관내
세포 용해 분석에 의한
REIC
단백질의 항암 면역 활성 상승 효과의 검정
도 7에 도시하는 방법에 의해 처리한 마우스 또는 대조군 마우스(REIC 단백질의 투여 시작 후 14 일째)로부터 지라 세포를 채취하고, 상기 지라 세포를 이펙터로서 RM9 세포(표적)와 함께 96웰 바닥이 둥근 플레이트에서 배양하였다. 이펙터/표적비(E/T비)는 100:1, 50:1, 25:1 또는 12.5:1이었다. 5×103의 표적 세포를 하나의 웰에 첨가하였다. 상청을 회수하고, 용해한 RM9 세포로부터 방출된 젖산 탈수소 효소를 비방사성 세포 독성 분석(CytoTox96, Promega)을 이용하여 측정하였다. 용해 세포의 비율은 이하의 식에 의해 계산하였다.
(실험에서의 방출-이펙터의 자발적 방출)/(표적의 최대 방출-표적의 자발적인 방출)×100(%)
도 9에 마우스 지라 세포의 RM9 세포에 대한 항암 세포 면역 활성의 해석의 결과를 도시한다. 도 9에 도시하는 바와 같이, REIC 단백질을 투여한 경우, 이펙터 비의존적으로 용해 세포의 비율이 상승하고 있고, REIC 단백질에 항암 세포 면역 활성를 상승시키는 효과가 있는 것이 판명되었다.
본 실시예에 있어서, 데이터는 평균 ±SEM으로 나타내었다. 비쌍체 스튜던트 t-테스트(unpaired Student t-test)를 2군 사이의 통계 분석을 위해 이용하였다. p값이 <0.05인 경우에 유의차가 있는 것으로 하였다.
인간
REIC
단백질 첨가에 의한
말초혈
단핵구로부터의 수상
세포양
분화 유도
REIC 단백질의 첨가군, IL-4 단독의 첨가군, GM-CSF 단독의 첨가군, IL-4+GM-CSF의 첨가군 사이에서, 분화 유도되는 수상 세포양 세포의 전체 세포에 차지하는 비율에 대해서 비교하였다. 도 10은 종축에 수상 세포양 세포의 비율(Percentage of cells with dendritic cell-like feature)(형태학적으로 크고, 돌기를 확인할 수 있는 수상 세포양 세포의 전체 세포에 차지하는 비율)를 나타내고, 각각의 첨가 후 7 일째에 현미경 하에 육안으로 확인함으로써 랜덤으로 계측하였다.
도 10에 도시하는 바와 같이, 인간 REIC 단백질을 첨가한 군에서는 IL-4 단독의 첨가군 및 GM-CSF 단독의 첨가군에 비해 수상 세포양 세포에의 분화 유도가 통계학적으로 유의하게 많았다(*로 도시함).
이들의 것으로부터, 도 10에 도시하는 바와 같은 농도에 있어서 인간 REIC 단백질이 인간의 말초혈 단구로부터 수상 세포양의 세포를 분화 유도할 능력은 사이토카인으로서 알려진 IL-4나 GM-CSF 각각 단독의 경우와 비교하여 유의하게 높다. 즉, 인간 REIC 단백질은 IL-4나 GM-CSF라는 각 사이토카인과 비교하여 수상 세포양 세포의 분화 유도라는 점에서의 우위성, 보다 높은 유용성을 갖는다.
인간
REIC
단백질 첨가에 의해 유도된
수상양
세포에서의
CD4
+
T 세포(림프구)를 이용한 알로제닉(동종
이계
) 반응 유도 활성
REIC 단백질에 의해 유도된 수상양 세포의 항암 면역 기능을 평가하기 위해, CD4+T 세포(림프구)를 이용한 알로제닉(동종 이계) 반응 유도 활성을 평가하였다. 0 일째에, CD14+ 단구를 회수하기 위한 MicroBeads(Miltenyi Biotec)를 이용하여 말초혈 단핵구로부터 CD14+ 단구를 회수하고, 인간 REIC 단백질 및 IL-4+GM-CSF를 각각 첨가하였다. 7 일째에 각각의 세포를 회수하여, REIC 단백질에 의해 유도된 수상양 세포 및 IL-4+GM-CSF에 의해 유도된 수상 세포(양성 대조군용)로 하였다. 또한, 7 일째에, CD4+T 세포를 회수하기 위한 MicroBeads(Miltenyi Biotec)를 이용하여 수상 세포의 공여자와 HLA-DR이 공통되지 않는 공여자의 말초혈 단핵구로부터 CD4+T 세포를 선택·회수하였다. 이 CD4+T 세포에 있어서, 형광을 발하는 화학물질 CFSE를 농도 0.05 μM로 첨가하여 5 분간 실온에서 배양하는 것에 의해 세포 라벨링을 행하고, 알로제닉 미접촉(naive) CD4+T 세포로서 이용하였다. 마찬가지로, 7 일째에, 96웰 바닥이 둥근 플레이트의 1웰에 대해, REIC 단백질에 의해 유도된 수상양 세포(6.25×103개), 또는 양성 대조군으로서의 IL-4+GM-CSF에 의해 유도된 수상 세포(6.25×103개)를 CD4+T 세포(1×105개)와 공배양하였다. 음성 대조군으로서, CFSE 라벨링한 CD4+T 세포뿐인 배양도 행하였다. 배양 조건은 37℃, 5% CO2, 95% 대기 하에 인큐베이터 안에서 4 일간 공배양하였다. 11 일째에, 형광 현미경 하의 랜덤인 시야에 있어서, CFSE가 양성의 림프구의 수를 계측하였다. 결과를 도 11에 도시한다.
도 11은 REIC 단백질에 의해 유도된 수상양 세포(REIC/Dkk-3Mo)가 공배양에 의해 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의하게 많은(*로 도시함) CD4+T 세포를 증식시키는 능력이 있는 것을 도시하고 있다. 또한, 그 능력은 양성 대조군인 IL-4+GM-CSF에 의해 유도된 수상 세포와 통계학적으로 동등한 것이 나타났다. 즉, 본 실시예에 의해, 인간 REIC 단백질 및 REIC 단백질에 의해 유도된 수상양 세포가 IL-4+GM-CSF에 의한 치료나 IL-4+GM-CSFDC와 마찬가지로 임상의 장소에서 항암 면역을 높여 암을 치료한다는 점에서, 매우 유용한 수단이 되는 것이 나타났다.
REIC 단백질은 IL-2나 종래부터 수많이 알려져 있는 면역 활성 작용을 갖는 사이토카인군과 비교하여,
(1) 단제라도 항암 면역 활성화에 의한 항종양 효과를 갖고,
(2) REIC 유전자 발현이 많은 암종에 있어서 결여·저하되어 있다는 REIC 단백질 그 자체의 특성에 의해, REIC 단백질 제제는 넓은 범위의 암종에 대하여 유효하며,
(3) REIC 단백질에 의한 항암 면역 활성화에 의해, 투여한 암 국소뿐만 아니라, 암 전이소의 개선이나 예방이라는 작용을 기대할 수 있고,
(4) 기존의 여러 가지 암 항원 단백질과 본제를 동시에 투여하는 것에 의해, 수상양 세포 등의 분화 유도를 통해 항암 면역을 계통적으로 활성화시켜, 발암 그 자체를 예방하는 것이 가능해진다
라는 효과를 갖는다.
REIC 단백질은 암 면역 요법제로서 이용할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 취입하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Momotaro-Gene Inc.
<120> A pharmaceutical agent for inducing dendritic cell like cells from monocytes and
enhancing anti cancer immune activity
<130> PH-3857-PCT
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<160> 2
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1053)
<400> 1
atg cag cgg ctt ggg gcc acc ctg ctg tgc ctg cta ctg gcg gcg gcg 48
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
gtc ccc acg gcc ccc gcg ccc gct ccg acg gcg acc tcg gct cca gtc 96
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20 25 30
aag ccc ggc ccg gct ctc agc tac ccg cag gag gag gcc acc ctc aat 144
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35 40 45
gag atg ttc cgc gag gtt gag gaa ctg gtg gag gac acg cag cac aaa 192
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Val Glu Asp Thr Gln His Lys
50 55 60
ttg cgc agc gcg gtg gaa gag atg gag gca gaa gaa gct gct gct aaa 240
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
gca tca tca gaa gtg aac ctg gca aac tta cct ccc agc tat cac aat 288
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85 90 95
gag acc aac aca gac acg aag gtt gga aat aat acc atc cat gtg cac 336
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100 105 110
cga gaa att cac aag ata acc aac aac cag gct cga caa atg gtc ttt 384
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Ala Arg Gln Met Val Phe
115 120 125
tca gag aca gtt atc aca tct gtg gga gac gaa gaa ggc aga agg agc 432
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130 135 140
cac gag tgc atc atc gac gag gac tgt ggg ccc agc atg tac tgc cag 480
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145 150 155 160
ttt gcc agc ttc cag tac acc tgc cag cca tgc cgg ggc cag agg atg 528
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165 170 175
ctc tgc acc cgg gac agt gag tgc tgt gga gac cag ctg tgt gtc tgg 576
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180 185 190
ggt cac tgc acc aaa atg gcc acc agg ggc agc aat ggg acc atc tgt 624
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195 200 205
gac aac cag agg gac tgc cag ccg ggg ctg tgc tgt gcc ttc cag aga 672
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210 215 220
ggc ctg ctg ttc cct gtg tgc ata ccc ctg ccc gtg gag ggc gag ctt 720
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Ile Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225 230 235 240
tgc cat gac ccc gcc agc cgg ctt ctg gac ctc atc acc tgg gag cta 768
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245 250 255
gag cct gat gga gcc ttg gac cga tgc cct tgt gcc agt ggc ctc ctc 816
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260 265 270
tgc cag ccc cac agc cac agc ctg gtg tat gtg tgc aag ccg acc ttc 864
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275 280 285
gtg ggg agc cgt gac caa gat ggg gag atc ctg ctg ccc aga gag gtc 912
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290 295 300
ccc gat gag tat gaa gtt ggc agc ttc atg gag gag gtg cgc cag gag 960
Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305 310 315 320
ctg gag gac ctg gag agg agc ctg act gaa gag atg gcg ctg ggg gag 1008
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu
325 330 335
cct gcg gct gcc gcc gct gca ctg ctg gga ggg gaa gag att tag 1053
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340 345 350
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20 25 30
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35 40 45
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Val Glu Asp Thr Gln His Lys
50 55 60
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85 90 95
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100 105 110
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Ala Arg Gln Met Val Phe
115 120 125
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130 135 140
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145 150 155 160
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165 170 175
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180 185 190
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195 200 205
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210 215 220
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Ile Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225 230 235 240
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245 250 255
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260 265 270
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275 280 285
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
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Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305 310 315 320
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu
325 330 335
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340 345 350
1/4
Claims (23)
- 삭제
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- 동물로부터 채취한 단구를 시험관내(in vitro)에서 이하의 REIC 단백질의 존재 하에 배양하는 것을 포함하는, CD14 양성 단구로부터 수상 세포양 세포를 분화 유도하는 방법:
(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질. - 제11항에 있어서, 단구가 말초혈 단구인 방법.
- 제11항 또는 제12항에 기재된 방법에 의해, REIC 단백질에 의해 활성화된 단구로부터 분화 유도된 수상 세포양으로 분화된 세포.
- 제13항에 있어서, CD11c, CD40, CD80, CD86, HLA-DR 및 CD14가 양성이고, CD1a가 음성인 수상 세포양으로 분화된 세포.
- 제13항에 있어서, 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 세포 표면의 항원을 해석한 경우에, GM-CSF 및 IL-4를 이용하여 단구로부터 유도된 수상 세포에 비해, CD14가 많이 발현되어 있고, CD1a가 거의 발현되지 않는 수상 세포양으로 분화된 세포.
- 제13항에 기재된 수상 세포양으로 분화된 세포를 함유하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
- 제14항에 기재된 수상 세포양으로 분화된 세포를 함유하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
- 제15항에 기재된 수상 세포양으로 분화된 세포를 함유하는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물.
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