CN101107363A - 具有改良生长特性的植物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改良植物生长特性的方法，其通过调节植物中突变CDKA激酶或其同源物的活性和/或调节编码这类突变CDKA的核酸的表达来实现。此类方法包括将突变的CDKA核酸分子或其突变的功能性变体导入植物。本发明还提供分离的CDKA突变蛋白质和编码这类蛋白质的核酸。本发明还涉及具有改良的生长特性的转基因植物，该植物具有调节的核酸表达，所述核酸编码突变的CDKA激酶。本发明还涉及用于本发明方法中的构建体。

Description

具有改良生长特性的植物及其制备方法
技术领域
本发明一般涉及分子生物学领域，并且涉及改良植物生长特性的方法。更具体的，本发明涉及通过调节编码A型细胞周期蛋白依赖的激酶(CDKA)的植物核酸在植物中的表达和/或通过调节植物CDKA蛋白质在植物中的活性来改良植物生长特性的方法，所述CDKA蛋白质包含T161D型突变或所述CDKA核酸编码这类蛋白质。本发明还涉及具有植物CDKA核酸受调节的表达和/或植物CDKA蛋白质受调节的活性的植物，所述CDKA蛋白质包含T161D型突变或所述核酸编码这类蛋白质并且该植物相对于相应的野生型植物具有改良的生长特性。本发明还提供了带有PSTAIRE基序和T161D型突变的植物CDK，以及编码这类蛋白质的核酸。
背景技术
不断增加的世界人口和提供的可耕种农田面积的缩小促使研究以增加农业效率为方向。作物和园艺改良的常规手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这种选育技术具有若干缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传成分的植物，其并非总是产生自亲本植物传递过来的期望性状。分子生物学的发展已经允许人类操作动物和植物的种质。植物的遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般是DNA或RNA的形式)，随后把该遗传物质引入到植物中。此种技术能够使作物或植物具有多种改良的经济、农艺或园艺性状。具体的经济利益的性状是产量。产量通常定义为作物产生的可衡量经济价值。这可以从数量和/或质量方面定义。作物产量受到植物或作物所经受的特定胁迫的影响。这些胁迫包括环境(非生物)胁迫(例如反常的高温或低温引起的温度胁迫；营养缺陷引起的胁迫；缺水(干旱)引起的胁迫)和生物胁迫(其可由其它植物(种子)、害虫和病原体引起)。不仅可以通过抗击作物或植物所经受的一种或多种胁迫增加作物产量，还可以通过调节植物固有生长机制来增加作物产量。
植物的固有生长机制以高度有序的事件顺序存在，总称为“细胞周期”。影响植物细胞周期(使用重组DNA技术或使用非重组手段)并且由此调节植物的多种生长特性的能力将在例如增强作物、植物育种、产生观赏植物、树木培植、园艺学、林学、藻类或植物的产生领域中具有多种应用(例如用作产生例如药物、抗体或疫苗物质的生物反应器，或用于有机废物的生物转化的生物反应器或在高产量藻类和植物情况下用作燃料)。
细胞周期进程是所有多细胞生物生长和发育的基础并且对于细胞增殖至关重要。细胞周期的主要组分在酵母、哺乳动物和植物中高度保守。细胞周期通常被划分为下列顺序的时期：G0-G1-S-G2-M。DNA复制或合成通常发生在S期(“S”指DNA合成)，在M期发生染色体的有丝分离(“M”指有丝分裂)，以及介于其间的间期G1(DNA复制之前，此期间内细胞生长)和G2(DNA复制之后的时期，此期间内细胞为分裂做准备)。在M期的最后步骤，胞质分裂之后完成细胞分裂。已经退出细胞周期并且成为休眠的细胞称为处于G0期。可以刺激这一期间的细胞在G1期进入细胞周期。在G1、G2和G0中的“G”代表“间期”。细胞周期进程的完成使每个子细胞在细胞分裂期间接受亲本基因组的完整拷贝。
细胞分裂由两个主要的细胞周期事件控制，即DNA合成的起始和有丝分裂的起始。这些关键事件的每一转换是由特定蛋白质复合物(涉及DNA复制和分裂)所代表的限制点控制。在G1/S边界DNA合成需要的基因的表达由哺乳动物和植物细胞中E2F家族转录因子调节(WO96/25494；Muller等人，Genes and Development 15，267-285，2001；De Veylder等人，EMBO J.21，13602-1368，2002)。通过E2F/Rb复合体整合信号并激活细胞周期基因的转录从而调节/引发进入细胞周期。由不同的异源二聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的形成和激活驱动细胞周期不同时期之间的转换以及由此的细胞周期进程，通常称上述异源二聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶为细胞周期蛋白依赖的激酶(CDK)。激活这些激酶的先决条件是与特定细胞周期蛋白的物理缔合，激活时机很大程度上依赖于细胞周期蛋白的表达。细胞周期蛋白结合诱导缔合的CDK的N端叶片(lobe)发生构象改变并且有助于复合体的定位和底物特异性。当与细胞周期蛋白缔合时，单体CDK被激活并由此具有激酶活性。细胞周期蛋白水平在细胞周期中波动而因此代表确定CDK激活时机的主要因子。在细胞周期中含有细胞周期蛋白和CDK的这些复合体的周期性激活介导细胞周期转换(限制点)的时间性调节。调节CDK活性的其它因子包括CDK抑制剂(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)、CDK激活激酶(CAK)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亚基(CKS)(Mironov等人，Plant Cell 11，509-522，1999；Reed，S.I.Progress in Cell CycleResearch 2，5-27，1996)。
在植物中，目前已经研究的两种主要类型的CDK被称为A型和B型CDK。A型CDK调节G1-至-S和G2-至-M的转换，而B型CDK似乎仅控制G2-至-M限制点(Hemerly等人，1995；Magyar等人，1997；Porceddu等人，2001)。此外，已报道存在C型CDK和CDK激活激酶(CAK)(Magyar等人，1997；Umeda等人，1998；Joubès等人，2001)，同样存在D型、E型和F型CDK(Vandepoele等人，Plant Cell 14，903-916，2002)。
已知A型CDK具有保守的三级结构(Goldsmith和Cobb，Curr.Opin.Struct.Biol.4，833-840)，包括与细胞周期蛋白结合有关的高度保守的PSTAIRE基序。CDK的催化核心由N端叶片和C端叶片组成。C端叶片包含一个催化裂(负责ATP和底物结合)并且还包括在许多激酶家族中保守的苏氨酸残基之后命名的，所谓的T环。在人CDK2中，这一苏氨酸残基在位置161，而在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)cdc28中以及在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)cdc2中，其分别位于位置169和167。据报道，该苏氨酸残基的磷酸化引起T环中结构构象改变，其为激酶转换为活性状态所必需的(Gu等人，EMBO J.11，3995-4005)。许多研究描述了T环中保守苏氨酸的突变(Ducommun等人，EMBO J.10，3311-3319，1991；Gould等人，EMBO J.10，3297-3309；Marcote等人，Mol.Cell.Biol.13，5122-5131，1993；Ducommun等人，Mol Cell.Biol.11，6177-6184，1991；Coleman等人，J.Biol.Chem.272，18869-18874，1997；Martinez等人，EMBO J.16，343-354，1997；Gould等人，Mol.Gen.Genet.259，437-448，1998；Booher等人，Mol.Cell.Biol.6，3523-3530，1986；Solomon等人，Mol.Biol.Cell 3，13-27，1992；Lim等人，Mol.Cell.Biol.16，4573-4583，1996)，所有检测的突变显示出对配体的结合(例如细胞周期蛋白或Suc1/ICK)和/或激酶活性具有严重影响，在酵母互补实验中产生缺陷或致死表型。尽管T169E突变(根据酵母cdc28的编号)及其相似物T169D突变模拟磷酸化，已证明带有这样突变的CDK都不能完全补偿酵母。在A型CDK蛋白质活性中具有重要作用的其它残基是位置14的苏氨酸和位置15的酪氨酸。一旦磷酸化这些氨基酸的至少一个，CDK失去活性。WO99/54489描述了使用分别由丙氨酸和苯丙氨酸取代苏氨酸14和酪氨酸15的CDK以增加植物对盐胁迫的耐受性。WO00/52171描述了调节一个或多个植物细胞周期蛋白介导的形态、生化和生理特性或特征的方法，其包括在植物中表达Cdc25磷蛋白磷酸酶。
目前已经令人惊奇地发现包含T161D型突变的A型细胞周期蛋白依赖的激酶(CDKA)在植物中的表达使植物具有改良的生长特性。
发明内容
因此，本发明的一个实施方案提供相对于相应的野生型植物改良植物生长特性的方法，其包括调节具有T161D型突变的A型CDK在植物中的活性和/或调节编码这类A型CDK的核酸的表达，和任选地选择具有改良的生长特性的植物。
有利的，实施本发明的方法得到了相对于相应的野生型植物具有多种改良的生长特性的植物，并且该改良的生长特性至少包括相对于相应的野生型植物增加的产量。
本文所定义的术语“增加的产量”意指分别相对于相应的野生型植物，如下任一项或多项中的增加：(i)植物的一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获)部分、增加的根生物量或任何其他可收获部分增加的生物量；(ii)增加的种子总产量，其包括种子生物量(种子重量)的增加而其可以是每株植物或单个种子基础上种子重量的增加；(iii)每个圆锥花序增加的花(“小花”)数量；(iv)增加的(饱满)种子数；(v)增加的种子大小，其也可能影响种子的组成；(vi)增加的种子体积，其也可能影响种子的组成(包括油、蛋白质和碳水化合物总含量和组成)；(vii)增加的单个种子面积；(viii)增加的单个种子长度和/或宽度；(ix)增加的收获指数，其表示为可收获部分如种子的产量与总生物量的比例；以及(x)增加的千粒重(TKW)，其从所计的饱满种子数和它们的总重量推论出来。增加的TKW可产生自增加的种子大小和/或种子重量。增加的TKW可产生自胚胎大小和/或胚乳大小的增加。
以谷类为例，产量增加可以表现为下列一种或多种：每公顷或英亩植物数量增加、每株植物穗数量的增加、畦数、每畦种子数、粒重、TKW、穗的长度/直径的增加等。以稻为例，产量增加可以表现为下列一种或多种的增加：每公顷或英亩植物数量、每株植物的圆锥花序数量、每个圆锥花序的小穗数量、每个圆锥花序花的数量，种子饱满率的增加((以％)表示为饱满种子数对小花数(种子总数)的比例)、TKW的增加等。产量增加还可产生改变的构造或可以作为改变构造的结果发生。
优选的，实施本发明的方法使植物具有增加的产量，更具体的，具有增加的生物量和/或增加的种子产量。优选的，增加的种子产量包括分别相对于对照植物在下列一种或多种中的增加：(饱满)种子数、种子总重量、种子大小、种子体积、千粒重和收获指数。
因此，本发明提供了相对于相应的对照植物增加植物产量的方法，该方法包括调节CDK或其同源物在植物中的活性，所述CDK或其同源物具有PSTAIRE基序和T161D型突变，和/或调节编码这类CDKA或其同源物的核酸的表达。
由于根据本发明的改良植物具有增加的产量，因此，相对于在其生命周期对应阶段的相应野生型植物的生长速度，这些植物很可能表现出增加的生长速度(至少在其部分的生命周期中)。生长速度增加可以是对植物的一个或多个部分或植物的细胞类型(包括种子)特异的，或者可以基本遍布整株植物。具有增加的生长速度的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期意指从干的成熟种子生长到植物产生干的成熟种子(类似于起始物质)的阶段所需的时间。此生命周期可以受到如早期活力、生长速度、开花时间和种子成熟速度等因素的影响。生长速度的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段或者基本遍布整个植物生命周期期间。在植物生命周期的早期阶段增加的生长速度反映了增强的活力。生长速度的增加可以改变植物的收获周期，这使得植物可以比可能的情形更晚播种和/或更早收获。如果生长速度充分增加，可以允许播种相同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，接着播种和收获更多的稻植物，所有这些都在一个常规生长期内)。类似的，如果生长速度充分增加，可以允许播种不同植物物种的更多种子(例如在播种和收获稻植物后，例如接着播种和任选收获大豆、马铃薯或任何其他适当的植物)。在一些植物的情形下，从同一根状茎收获更多次也是可能的。改变植物的收获周期可以使得每英亩每年生物量的产出增加(由于任何特定植物可以生长和收获次数(指在一年中)的增加)。生长速度的增加还使得转基因植物可以比它们的野生型对应物在更广的地域栽培，这是因为生长作物的区域性限制通常决定于种植时(早季)或收获时(晚季)的不利环境条件。如果收获周期缩短，那么可以避免此类不利条件。可以通过生长实验测绘生长曲线，得到多个参数来确定生长速度，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其最大大小的50％所用的时间)以及T-90(植物达到其最大大小的90％所用的时间)等。
本发明方法的实施提供了具有增加的生长速度的植物。因此，本发明提供了增加植物生长速度的方法，该方法包括在植物中调节CDK或其同源物的活性，所述CDK或同源物具有PSTAIRE基序和T161D型突变，和/或调节这类CDKA或其同源物的编码核酸的表达。
与对照植物相比，无论植物是否在无胁迫条件下或植物是否接触多种胁迫，发生产量和/或生长速度的增加。植物一般通过生长更加缓慢来应答所接触的胁迫。在严重胁迫条件下，植物甚至完全停止生长。另一方面，本文将中等胁迫定义为植物所接触的不引起植物完全停止生长且没有能力恢复生长的任何胁迫。根据农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的发展，在栽培的作物植物中通常不会遇到严重胁迫。因而，中等胁迫诱导的受损生长通常是农业所不希望的特征。中等胁迫是植物所接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物所接触的日常生物和/或非生物(环境)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的热或寒冷/冻结温度引起的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫还可以由化学品引起。生物胁迫通常是那些由病原体，如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的胁迫。本文所用的术语“无胁迫条件”是不明显超出植物可能遇到的每日气候和其它非生物条件的那些环境条件。本领域的技术人员应明白指定地域的正常土壤条件和气候条件。
可以在任何植物中有利地改良上述生长特性。
本文所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖代和后代以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花，以及组织和器官，其中前述的每种包含目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的特异性修饰。术语“植物”还包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚胎、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样的，其中前述的每种包含目的基因/核酸。
尤其可用于本发明方法中的植物包括藻类、蕨类植物以及属于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木：秋葵属某种(Abelmoschus spp.)、槭树属某种(Acer spp.)、猕猴桃属某种(Actinidia spp.)、冰草属某种(Agropyron spp.)、葱芹属某种(Alliumspp.)、苋属某种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属某种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、落花生属某种(Arachis spp.)、木波罗属某种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦(Avena sativa)、阳桃(Averrhoacarambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属某种(Brassica spp.)、Cadaba farinosa、大叶茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属某种(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、红花(Carthamus tinctorius)、山核桃属某种(Carya spp.)、栗属某种(Castaneaspp.)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属某种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属某种(Citrus spp.)、椰子属某种(Cocos spp.)、咖啡属某种(Coffea spp.)、Cola spp.、芋(Colocasia esculenta)、榛属某种(Corylus spp.)、山楂属某种(Crataegus spp.)、香瓜属某种(Cucumisspp.)、南瓜属某种(Cucurbita spp.)、菜蓟属某种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蟥属某种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpuslongan)、薯蓣属某种(Dioscorea spp.)、柿树属某种(Diospyros spp.)、稗属某种(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属某种(Fagopyrum spp.)、山毛榉属某种(Fagus spp.)、无花果(Ficus carica)、金桔属某种(Fortunellaspp.)、草莓属某种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属某种(Glycine spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属某种(Helianthusspp.)、木槿属某种(Hibiscus spp.)、大麦属某种(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属某种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属某种(Lathyrus spp.)、浮萍属某种(Lemna spp.)、兵豆(Lensculinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属某种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属某种(Lupinusspp.)、硬皮豆属某种(Macrotyloma spp.)、西印度樱桃(Malpighiaemarginata)、苹果属某种(Malus spp.)、曼密苹果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属某种(Manihot spp.)、人心果(Manilkarazapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木樨属某种(Melilotus spp.)、薄荷属某种(Mentha spp.)、苦瓜属某种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属某种(Musa spp.)、烟草属某种(Nicotianum spp.)、木犀榄属某种(Olea spp.)、仙人掌属某种(Opuntia spp.)、Ornithopus spp.、稻属某种(Oryza spp.)、稷(Panicum miliaceum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、鳄梨属某种(Persea spp.)、香芹(Petroselinumcrispum)、菜豆属某种(Phaseolus spp.)、刺葵属某种(Phoenix spp.)、酸浆属某种(Physalis spp.)、松属某种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属某种(Pisum spp.)、早熟禾属某种(Poa spp.)、杨属某种(Populusspp.)、牧豆树属某种(Prosopis spp.)、李属某种(Prunus spp.)、番石榴属某种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属某种(Quercus spp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属某种(Ribes spp.)、悬钩子属某种(Rubus spp.)、甘蔗属某种(Saccharum spp.)、接骨木属某种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、Sesamum spp.、茄属某种(Solanum spp.)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属某种(Spinacia spp.)、蒲桃属某种(Syzygiumspp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属某种(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麦属某种(Triticum spp.)、越桔属某种(Vaccinium spp.)、野豌豆属某种(Vicia spp.)、豇豆属某种(Vigna spp.)、葡萄属某种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizaniapalustris)、枣属某种(Ziziphus spp.)等。
根据本发明优选的特征，植物是包含大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯或烟草的作物植物。更优选本发明的植物是单子叶植物，如甘蔗，最优选谷类，如稻、玉米、小麦、粟、大麦、黑麦、燕麦或高粱。
可以通过调节CDKA蛋白质的水平来调节CDKA蛋白质的活性。可选的，当CDKA蛋白质水平没有变化时，也可以调节其活性，这可以在例如通过产生突变体改变多肽固有特性时发生。根据本发明优选的特征，引入包含T161D型突变的CDKA蛋白质改变的活性和/或此CDKA编码核酸改变的表达，和/或引入包含T161D型突变的CDKA蛋白质增加的活性和/或此CDKA编码核酸增加的表达。
本文所定义的术语“A型CDKA”或“CDKA”可交换地使用并且包括具有细胞周期蛋白依赖的激酶活性的任何氨基酸序列，而且该序列当用于CDK进化系统树的构建时(如在图1和图2所示)，在A型CDK而非任何其它CDK类群周围聚类，且该氨基酸序列包含PSTAIRE氨基酸序列。本领域熟练的技术人员使用已知技术和制备这样进化系统树的软件，如GCG、EBI或CLUSTAL包，使用默认参数，可以容易地确定是否研究的任何氨基酸序列落入“A型CDK”的定义内(见例如Vandepoele等人，2002)。一旦构建这样的进化系统树，在A型CDK类群聚类的序列被认为落入“A型CDK”或“CDKA”定义之内，并将因此用于操作本发明的方法。优选A型CDK还包含与Genbank登录号CAA42922(SEQ ID NO：8)代表的氨基酸序列或与由SEQ ID NO：2代表的其突变体形式具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的优选顺序为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，确定全序列同一性。优选地，A型CDK属于1类A型CDK(即CDKA；1)。
本文将术语“T161D型突变”定义为对应于人CDC2或小鼠CDKA；1中苏氨酸161的CDK的保守苏氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸。更具体地，术语“具有T161D型突变的CDK”包含由天冬氨酸或谷氨酸对T环中的保守苏氨酸的取代；优选由天冬氨酸取代。蛋白质中由天冬氨酸或谷氨酸对苏氨酸的取代导致引入负电荷，从而模拟了由磷酸化引入的磷酸基团的负电荷。在基因中引入突变产生氨基酸取代的方法是技术领域内众所周知的且包括使用寡核苷酸或通过使用PCR的定点诱变。
CDKA蛋白质中多个结构域是众所周知的(De Bondt等人，Nature 363，595-602，1993)，并且可以使用专门的数据库鉴别，如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letuni等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244；http://smart.embl-heidelberg.de/)、InterPro(Mulder 等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318；http://www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralized profile syntax for biomolecular sequences motifs and itsfunction in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.、Brutlag D.、Karp P.、Lathrop R.、Searls D.编辑，53-61页，AAAI出版，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)，http://www.expasy.org/prosite/)或Pfam(Bateman等人，Nucleic AcidsResearch 30(1)：276-280(2002)，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。
CDK的激酶结构域是S_TKc型(SMART登录号SM00220，Interpro登录号IPR002290)，并且具有Ser/Thr激酶活性。预测的活性位点(VLHRDLKPQNLLI，其中D是预测的催化残基)对应着PROSITE标签PS00108。ATP结合位点(IGEGTYGVVYRARDKVTNETIALK)对应着PROSITE标签PS00107。
搜索和鉴定A型CDK同源物的方法是本领域的技术人员所熟悉了解的。此类方法包括使用本领域熟知的序列比对或比较的算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol. Biol.48；443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2；482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.、Gish，W.、Miller,W.、Myers，E.W.和Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448(1988))，将计算机可读形式的SEQ ID NO 1或2或由GenBank登录号CAA42922代表的序列与在公共数据库如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核苷酸序列数据库(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中获得的序列进行比较。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得。下面提到的同源物是使用BLAST默认参数(BLOSUM62矩阵，空位开放罚分为11且空位延伸罚分为1)鉴定出的，且优选使用全长序列用于分析。这些比对方法也使能够容易地鉴定对应于人CDC2或小鼠CDKA；1(SEQ ID NO：8)中苏氨酸161的保守苏氨酸。
落入“A型CDK或其同源物”定义内的蛋白质的实例包括带有PSTAIRE基序的CDK，例如在表1所列蛋白质。本领域熟练的技术人员知道多种技术可以向这些蛋白质中引入T161D型突变使其用于本发明的方法。
表1：植物A型CDK蛋白质及其GenBank或PIR登录号的实例(修改自Joubès等人，Plant Mol.Biol.43，607-620，2000)
 基因名称     物种 数据库登录号 SEQ ID NO：
 Allce；CDKA；1 洋葱(Allium cepa) BAA21673.1  10
 Antma；CDKA；1 金鱼草(Antirrhinum majus) CAA66233.1  12
 Antma；CDKA；2 金鱼草 CAA66234.1  14
 Arath；CDKA；1 拟南芥(Arabidopsisthaliana) AAA32831.1  16
 Betvu；CDKA；1 甜菜(Beta vulgaris) CAA96384.1  18
 Brana；CDKA；1 欧洲油菜(Brassica napus) AAA92823.1  20
 Cheru；CDKA；1 红叶藜(Chenopodium rubrum) CAA71242.1  22
 Glyma；CDKA；1 大豆(Glycine max) M93140* 24
 Glyma；CDKA；2 大豆 M93139* 26
 Lyces；CDKA；1 (Lycopersicon esculentum) CAA76700.1  28
 Lyces；CDKA；2 番茄 CAA76701.1  30
 Medsa；CDKA；1 紫苜蓿(Medicago sativa) AAB41817.1  32
 Medsa；CDKA；2 紫苜蓿 CAA50038.1  34
 Nicta；CDKA；1 烟草(Nicotiana tabacum) AAB02567.1  36
 Nicta；CDKA；1 烟草 AAB02568.1  38
 Nicta；CDKA；3 烟草 BAA09369.1  40
 Orysa；CDKA；1 稻(Oryza sativa) CAA42922.1  8
 Orysa；CDKA；2 稻 CAA42923.1  42
 Petcr；CDKA；1 香芹(Petroselinum crispum) AAC41680.1  44
 Pethy；CDKA；1 碧冬茄(Petunia hybrida) CAA73997.1  46
 Picab；CDKA；1 欧洲云杉(Picea abies) CAA54746.1  48
 Pinco；CDKA；1 小干松(Pinus contorta) CAA56815.2  50
 Pissa；CDKA；2 豌豆(Pisum sativum) BAA33152  52
 Soltu；CDKA；2 马铃薯(Solanum tuberosum) AAA98856.1  54
 Sesro；CDKA；1 长喙田菁(Sesbania rostrata) CAA99991.1  56
 Triae；CDKA；1 普通小麦(Triticum aestivum) AAD10483.1  58
 Triae；CDKA；2 普通小麦 AAD10484.1  60
 Vigac；CDKA；1 乌头叶豇豆(Vigna aconitifolia) AAA34241.1  62
 Vigun；CDKA；1 长豇豆(Vigna unguiculata) CAA61581.1  64
 Zeama；CDKA；1 玉蜀黍(Zea mays) AAA33479  66
*编码蛋白质的CDS的GenBank登录号
应该理解术语“A型CDK或其同源物”不限于由SEQ ID NO：2代表的序列，而是符合具有细胞周期蛋白依赖的激酶活性、有PSTAIRE结构域、且与SEQ ID NO：8具有至少75％序列同一性标准的任何多肽，只要该CDKA或其同源物包含T161D型突变，可以适用于本发明的方法。优选地，A型CDK或其同源物为SEQ ID NO：8代表的蛋白质的直系同源物。
为了确定A型CDK的激酶活性，一些测定是可用的并且在本领域中众所周知(例如Current Protocols in Molecular Biology，1和2卷，Ausubel等人(1994)，Current Protocols；或者是在线的，例如http://www.protocol-online.org)。简言之，激酶测定通常包括(1)使激酶蛋白质接触含有待磷酸化的靶位点的底物多肽；(2)在适当的条件下，在适当的激酶缓冲液中进行靶位点的磷酸化；(3)在恰当的反应期后将磷酸化的产物从未磷酸化的底物中分离出来。激酶活性的存在或缺乏是通过磷酸化的靶标的存在或缺乏来确定的。另外，可以进行定量测量。纯化的CDK蛋白质，或者含有或富含CDK蛋白质的细胞提取物可以用作激酶蛋白质的来源。组蛋白H1或小肽尤其适合作为底物。肽在磷酸化位点基序中必须含有一个或多个丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。可以在Biochimica etBiophysica Acta 1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位点的汇编。此外，肽底物可以有利地具有净正电荷，利于结合到磷酸纤维素滤器上(使能够将磷酸化的肽从未磷酸化的肽中分离出来并且检测磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位点基序，可以使用通用Ser/Thr激酶底物。例如，肽“ADAQHATPPKKKRKVEDPKDF”(Marshak等人，J.Cell.Biochem.45，391，1991)是A型CDK的特异性底物。为了确定合成肽磷酸化的动力参数，需要肽浓度的范围。对于起始反应，可以使用0.7-1.5mM的肽浓度。对于每种激酶，重要的是要确定活性的最佳缓冲液、离子强度和pH。标准5×激酶缓冲液通常含有5mg/ml BSA(防止激酶吸附于测定管的牛血清白蛋白)、150mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl2。必须根据经验为每种蛋白激酶确定二价阳离子的最佳浓度。CDK测定的合适缓冲液是本技术领域公知的(例如John等人，Protoplasma 161，70-74，1991)。常用的磷酰基(phophoryl)基团供体是放射性标记的[γ-32P]ATP(通常是0.2mM终浓度)。在肽中掺入的32P的量可以通过在闪烁计数器中硝化纤维素干垫上测量活性来确定。
此外，当含有T161D型突变且在稻(Oryza sativa)中的枝条特异性启动子控制下表达这样的“CDKA或其同源物或衍生物”时，与相应的野生型植物相比，其种子产量增加。可以以许多方式测量种子产量的增加，例如按照种子总重量的增加、从植物收获的饱满种子数的增加或增加的收获指数。
根据本发明的CDKA或其同源物的生物和/或功能活性包括具有至少一种细胞周期蛋白依赖的激酶活性或具有如上所述的植物中增加产量的活性。
本发明还提供分离的A型细胞周期蛋白依赖的激酶(CDKA)突变体，由以下一种或多种组成：
(a)SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO：2代表的蛋白质的同源物和/或衍生物，该同源物或衍生物来自植物且包含T161D型突变；
(c)如在(a)或(b)中定义的氨基酸序列的活性片段，该活性片段包含T161D型突变。
A型CDK蛋白质的“活性片段”包括A型CDK蛋白质的至少100个氨基酸残基，包括PSTAIRE基序和T161D型突变，该连续的残基保留了与包含T161D型突变的天然产生蛋白质相似的生物活性和/或功能活性。
如本文所定义的CDKA或其同源物是由CDKA核酸分子编码的。编码CDKA或其同源物的核酸可以是任何天然或合成的核酸。因此本文定义的术语“CDKA核酸分子”或“CDKA基因”是如上定义的编码CDKA多肽或其同源物的任何核酸分子(包括作为遗传密码简并结果的那些)。CDKA核酸分子的实例包括由SEQ ID NO：1所代表的核酸，以及编码上述同源物的那些核酸。CDKA核酸及其功能性变体可适用于进行本发明的方法，只要它们编码包含T161D型突变的CDKA蛋白质或其同源物。这样的CDKA核酸的功能性变体包括CDKA核酸分子的部分、等位变体、剪接变体和/或能够与CDKA核酸分子杂交的核酸。在功能性变体的范围中，术语“功能性”指的是编码具有细胞周期蛋白依赖的激酶活性且具有T161D型突变的多肽的变体(即部分或杂交序列)。
本发明还提供分离的核酸分子，其由以下一种或多种组成：
a.编码由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的核酸分子；
b.编码由SEQ ID NO：2代表的氨基酸分子的同源物、衍生物或活性片段的核酸分子，该同源物、衍生物或片段来源于植物并且含有PSTAIRE基序和T161D型突变；
c.能够与以上(a)或(b)的核酸杂交的核酸分子，或其互补序列，其中杂交序列或其互补序列编码含有PSTAIRE基序和T161D型突变的植物CDKA蛋白质；
d.根据以上(a)至(c)的任一项核酸的等位变体，该等位变体编码含有PSTAIRE基序和T161D型突变的植物CDKA蛋白质；和
e.根据(a)至(c)的任一项核酸的备选剪接变体，该备选剪接变体编码含有PSTAIRE基序且具有T161D型突变的植物CDKA蛋白质。
本文定义的术语部分指至少包含300个核苷酸的编码CDKA的一段DNA，并且该部分编码的多肽具有细胞周期蛋白依赖的激酶活性、含有PSTAIRE基序和T161D型突变。可以例如，通过对CDKA核酸的一个或多个缺失来制备部分。所述部分可以以分离的形式使用或者它们可以融合到其他编码(或非编码)序列，例如以产生组合了多个活性(其中之一是细胞周期蛋白依赖的激酶活性)的蛋白质。当融合到其他编码序列时，由翻译产生得到的多肽可以大于预测的CDKA片段。优选的功能性部分是CDKA核酸的部分，更优选由SEQ ID NO：1代表的核酸分子的部分。
CDKA核酸分子的另一变体是能够在简化的严格条件下，优选在严格条件下与以上定义的CDKA核酸分子杂交的核酸分子，该杂交序列编码的CDKA多肽含有PSTAIRE基序和T161D型突变。优选的杂交序列能够与SEQ ID NO：1的核酸分子，或编码上述同源物的核酸，或任意上述序列的部分杂交。最优选的杂交序列能够与SEQ ID NO：1的核酸分子杂交。
本文所定义的术语“杂交”是其中基本同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全发生在溶液中，即两条互补核酸都在溶液中。杂交过程还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖珠子或任何其他树脂上。此外杂交过程可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上，或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵列，或称之为核酸芯片)。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成条件的影响。
在诸如Southern杂交和Northern杂交的核酸杂交实验中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是由序列决定的，并且随环境参数而不同。本领域技术人员认识到在杂交和洗涤中可以改变多种参数，而该参数将保持或改变严格条件。
Tm是在限定的离子强度和pH下，50％的靶标序列杂交至完全匹配的探针时的温度。Tm依赖于溶液条件、碱基组成以及探针的长度。例如，较长的序列在较高温度下特异杂交。最大杂交速率是在低于Tm大约16℃至32℃下得到。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交分子的形成；对于高达0.4M的钠浓度，这个作用是明显的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6至0.7℃，而加入50％的甲酰胺虽然使杂交速率降低，但使杂交在30至45℃进行。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大探针，每％碱基错配使Tm降低大约1℃。由杂交分子的类型决定，可以使用下列公式计算Tm：
●DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝ 81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺
●DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
●寡-DNA或寡-RNAd杂交分子：
对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
a或对于其他一价阳离子，但是仅仅在0.01-0.4M范围内精确。
b仅对于在30％至75％范围的％GC精确。
cL＝双链体中碱基对的长度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
注：对于每1％甲酰胺，Tm降低大约0.6至0.7℃，而6M尿素的存在降低Tm大约30℃。
杂交的特异性通常是杂交后洗涤的作用。为了除去非特异性杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性或低于杂交严格性下进行。总体上，如上所述设置核酸杂交测定或基因扩增检测操作的合适的严格条件。也可以选择相差不多的严格条件。通常，选择的低严格条件大约比在限定的离子强度和pH下特异性序列的热解链温度(Tm)低50℃。中等严格条件是低于Tm 20℃的温度，而高严格条件是低于Tm 10℃的温度。例如，严格条件是那些至少与例如条件A-L一样严格的条件；而简化的严格条件是至少与例如条件M-R一样严格的条件。可以使用多种已知技术中的任意一种，例如用含有蛋白质的溶液将膜封闭，添加异源RNA、DNA和SDS至杂交缓冲液中，以及用RNA酶处理，来控制非特异性的结合。
杂交和洗涤条件的实例在表2中列出：
表2：
严格条件  多核苷酸杂交体 杂交长度(bp) 杂交温度和缓冲液 洗涤温度和缓冲液
 A  DNA:DNA ＞或等于50 65℃ 1×SSC；或42℃，1×SSC和50％甲酰胺 65℃；0.3×SSC
 B  DNA:DNA ＜50 Tb*；1×SSC Tb*；1×SSC
 C  DNA:RNA ＞或等于50 67℃ 1×SSC；或45℃，1×SSC和50％甲酰胺 67℃；0.3×SSC
 D  DNA:RNA ＜50 Td*；1×SSC Td*；1×SSC
 E  RNA:RNA ＞或等于50 70℃ 1×SSC；或50℃，1×SSC和50％甲酰胺 70℃；0.3×SSC
 F  RNA:RNA ＜50 Tf*；1×SSC Tf*；1×SSC
 G  DNA:DNA ＞或等于50 65℃ 4×SSC；或45℃，4×SSC和50％甲酰胺 65℃；1×SSC
 H  DNA:DNA ＜50 Th*；4×SSC Th*；4×SSC
 I  DNA:RNA ＞或等于50 67℃ 4×SSC；或45℃，4×SSC和50％甲酰胺 67℃；1×SSC
 J  DNA:RNA ＜50 Tj*；4×SSC Tj*；4×SSC
 K  RNA:RNA ＞或等于50 70℃ 4×SSC；或40℃，6×SSC和50％甲酰胺 67℃；1×SSC
 L  RNA:RNA ＜50 Tl*；2×SSC Tl*；2×SSC
 M  DNA:DNA ＞或等于50 50℃ 4×SSC；或40℃，6×SSC和50％甲酰胺 50℃；2×SSC
 N  DNA:DNA ＜50 Tn*；6×SSC Tn*；6×SSC
 O  DNA:RNA ＞或等于50 55℃ 4×SSC；或42℃，6×SSC和50％甲酰胺 55℃；2×SSC
 P  DNA:RNA ＜50 Tp*；6×SSC Tp*；6×SSC
 Q  RNA:RNA ＞或等于50 60℃ 4×SSC；或45℃，6×SSC和50％甲酰胺 60℃；2×SSC
 R  RNA:RNA ＜50 Tr*；4×SSC Tr*；4×SSC
“杂交分子长度”是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，可以通过比对序列和鉴定本文所述的保守区确定杂交分子长度。
在杂交和洗涤缓冲液中，SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后洗涤15分钟。杂交和洗涤可以另外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠和高达50％甲酰胺。
*Tb-Tr：对于预期长度少于50个碱基对的杂交分子，杂交温度应该比杂交分子的解链温度Tm低5-10℃，根据上述公式确定Tm。
本发明还包括用PNA或修饰的核酸取代任意一个或多个DNA或RNA杂交配偶体。
为了定义严格性水平，可以方便地参考Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York or to Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)。
在杂交和洗涤后，由探针标记的类型决定，可以通过放射自显影(当使用放射性标记探针时)或者通过化学发光、免疫检测、通过荧光或显色检测来检测双链体。或者，可以进行核糖核酸酶保护测定来检测RNA:RNA杂交分子。
CDKA核酸分子或其变体可以来自任何植物或人工来源。可以通过精细的人工操作在组成和/或基因组环境方面对核酸的天然形式进行修饰；在本发明中使用的CDKA核酸具有至少引起T161D取代的突变。核酸优选植物来源的，可以是来自相同的植物物种(例如来自其待引入的植物物种)或来自不同的植物物种。核酸可以分离自单子叶物种，优选分离自禾本科(Poaceae)，更优选分离自稻。更优选从稻分离的CDKA是CDKA；1。最优选从稻分离的CDKA；1以及随后的突变是SEQ ID NO：1所代表的，并且带有T161D型突变的CDKA氨基酸序列是SEQ ID NO：2所代表的。
可以通过引入遗传修饰(优选在CDKA基因的基因座)调节具有T161D型突变的CDKA多肽或其同源物的活性和/或这类CDKA编码核酸的表达。如本文所定义的基因的基因座意指包括目的基因以及编码区的上游或下游10 kb的区域。
例如，可以通过以下的任何一种(或多种)方法引入遗传修饰：TILLING、定点诱变、定向进化和同源重组或者通过在植物中引入和表达编码A型CDK的多肽或其同源物的核酸，该CDKA或同源物含有PSTAIRE基序和T161D型突变。在引入遗传修饰后，接下来的步骤是选择表达增加的核酸(该核酸编码含有PSTAIRE基序和T161D型突变的CDK多肽)和/或选择活性增加的CDK多肽(所述多肽含有PSTAIRE基序和T161D型突变)，这种表达和/或活性的增加使植物具有改良的生长特性。
也可以使用TILLING技术(靶向诱导基因组局部损害技术)，把遗传修饰引入到CDKA基因的基因座中。这是一种诱变技术，用于产生和/或鉴定，并最终分离核酸分子的诱变变体，所述核酸分子编码包含T161D型突变，能够呈现依赖细胞周期蛋白的激酶活性的A型CDK。TILLING还使能够选择携带这类突变变体的植物。TILLNG将高密度诱变与高通量筛选方法结合起来。TILLING一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei和Koncz(1992)，In：C Koncz，N-H Chua，J Schell编辑，Methods in ArabidopsisResearch.World Scientific，Singapore，16-82页；Feldmann等人，(1994)In：EM Meyerowitz，CR Somerville编辑，Arabidopsis.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，137-172页；Lightner和Caspar(1998)，In：J Martinez-Zapater，J Salinas编辑，Methods on MolecularBiology，82卷，Humana Press，Totowa，NJ，91-104页)；(b)DNA制备和个体合并；(c)目标区域的PCR扩增；(d)变性和退火使能够形成异源双链体；(e)DHPLC，其中集合体中异源双链体的存在检测为色谱图中额外的峰值；(f)鉴定突变个体；和(g)突变体PCR产物的测序。TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum Nature Biotechnol.18，455-457，2000，StempleNature Rev.Genet.5，145-150，2004)。
可以使用定点诱变产生保留了活性(例如依赖细胞周期蛋白的激酶活性)的CDKA核酸或其部分的变体。多种方法可用来实现定点诱变，最常用的是基于PCR的方法(见例如Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology. Wiley编辑，http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
也可以使用定向进化产生CDKA核酸的变体。定向进化由重复的DNA改组组成，继之以适当的筛选和/或选择产生CDKA核酸或其部分的变体，所述CDKA核酸或其部分编码具有改变的生物活性的CDKA多肽或同源物或其部分(Castle等人，(2004)Science 304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
TILLING、定点诱变和定向进化是能够产生新的CDKA等位基因和变体的技术实例，所述CDKA等位基因和变体保留了CDKA功能因而可用于本发明的方法中。
同源重组能够在基因组中限定的选择位置引入选定的核酸。同源重组是生物学中通常使用的常规技术，用于较低等的生物体如酵母或苔藓Physcomitrella。在植物中进行同源重组的方法不仅已在模式植物中有描述(Offringa等人(1990)EMBO J.9，3077-3084)，而且在作物植物，例如稻中也有描述(Terada等人，(2002)Nature Biotechnol.20，1030-1034；或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15，132-138)。待靶向的核酸(其可以是如上文所定义的CDKA核酸分子或其功能性变体)不需要靶向到CDKA基因的基因座中，而可以被引入到例如高表达的区域。待靶向的核酸可以是用于替换内源基因的改良的等位基因，或在内源基因之外额外引入。
引入遗传修饰(在这一情况中不需要在CDKA基因的基因座中)的优选方法是在植物中引入和表达编码包含T161D型突变的CDKA多肽或其同源物的核酸。以上提到的且适用于本发明操作的CDKA多肽或其同源物具有依赖细胞周期蛋白的激酶活性，其与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：8所代表的氨基酸序列具有一定的序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，且该CDK多肽包含PSTAIRE基序和T161D型突变。引入植物的核酸可以是如以上定义的部分或杂交序列。
蛋白质的“同源物”涵盖相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，且与其所衍生自的未修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶。
术语“同源物”涵盖两种特殊形式的同源性，即直系同源序列和旁系同源序列，它们涉及用于描述基因遗传关系的进化概念。优选地，用于本发明的直系同源物和旁系同源物具有与A型CDK相同的结构且在交互BLAST搜索中与SEQ ID NO：8具有最高相似性且包含T161D型突变。
术语“旁系同源”涉及由物种基因组内一个或多个基因复制产生的同源基因。CDKA的旁系同源物可以容易地通过对来自与查询序列相同物种的一组序列进行BLAST分析来鉴定。
术语“直系同源”涉及在不同生物中由于这些基因的祖先关系形成的同源基因。例如，通过实施所谓的交互blast搜索可以容易地找到单子叶植物物种中的直系同源物。这可以通过在任何序列数据库，如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公众可获得的NCBI数据库中，对所讨论的序列(例如，来自拟南芥的SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 16)进行第一次blast完成。如果搜索的是稻的直系同源物，所讨论的序列将再次对例如来自NCBI上可用的稻Nipponbare的28,469全长cDNA克隆进行blast。当起始于核苷酸时可以使用BLASTn或tBLASTX，或者当起始于蛋白质时可以使用BLASTP或TBLASTN，并使用标准缺省值。可以过滤blast结果。之后将过滤结果或未过滤结果的全长序列与所讨论的序列的来源生物(例如拟南芥)的序列进行反向blast(第二次blast)。然后对第一次和第二次blast的结果进行比较。如果第二次blast的最高相似性来自与查询序列所源自的相同物种时，就找到了旁系同源物；如果最高相似性并非来自与查询序列所源自的相同物种时，那么就找到了直系同源物。只要这一同源物含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域并且含有PSTAIRE基序，这样的直系同源物或旁系同源物也可认为是CDKA的同源物。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，接着通过构建相邻连接树以帮助观察相关基因的聚类(clustering)并且鉴定直系同源物和旁系同源物。
同源物可以是蛋白质“取代变体”的形式，即其中氨基酸序列中的至少一个残基已经被除去，并且在其位置上插入不同的残基。氨基酸取代一般是单个残基的，但是取决于对多肽的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大约1到10个氨基酸残基。优选的，氨基酸取代包括保守性氨基酸取代(表3)。为了产生此类同源物，蛋白质的氨基酸可以被具有相似性质(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的特性)的其他氨基酸所置换。保守性替换表是本领域所熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。用于本发明方法中的取代变体是CDKA多肽的取代变体并含有PSTAIRE基序和T161D型突变。
表3：保守性氨基酸取代的实例：
 残基     保守性取代  残基     保守性取代
 Ala     Ser  Leu     Ile；Val
 Arg     Lys  Lys     Arg；Gln
 Asn     Gln；His  Met     Leu；Ile
 Asp     Glu  Phe     Met；Leu；Tyr
 Gln     Asn  Ser     Thr；Gly
 Cys     Ser  Thr     Ser；Val
 Glu     Asp  Trp     Tyr
 Gly     Pro  Tyr     Trp；Phe
 His     Asn；Gln  Val     Ile；Leu
 Ile     Leu，Val
在上述氨基酸性质不是很关键的情况下，可以产生保守性较低的取代。
同源物还可以是蛋白质的“插入变体”的形式，即将其中一个或多个氨基酸残基引入到蛋白质中的预定位点。插入可包括氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，氨基酸序列内的插入将小于氨基或羧基端的融合，约为1到10个残基的数量。氨基或羧基端融合蛋白质或肽的实例包括如用于酵母双杂交系统的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。可用于本发明的方法的插入变体是CDKA多肽的插入变体并且含有PSTAIRE基序和T161D型突变。
蛋白质“缺失变体”形式的同源物的特征在于从蛋白质除去一个或多个氨基酸，并且包含活性片段。
使用本领域熟知的肽合成技术，如固相肽合成等等，或通过重组DNA操作，可以容易的制备蛋白质的氨基酸变体。对DNA序列进行操作以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，在DNA的预定位点产生突变的技术是本领域技术人员熟知的，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。
带有PSTAIRE基序的CDKA多肽或其同源物也可以是衍生物。“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，相对于蛋白质天然存在形式的氨基酸序列(例如，如GenBank登录号CAA42922(SEQ ID NO：8)所示的)，其可以包括天然和非天然存在的氨基酸残基的取代、缺失或添加。蛋白质的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，相对于多肽天然存在形式的氨基酸序列，其可以包括天然发生改变的、糖基化的、酰基化的氨基酸残基或非天然存在的氨基酸残基。相对于其所衍生自的氨基酸序列，衍生物还可包含一个或多个非氨基酸取代基，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报道分子或其他配体，如结合以便于检测的报道分子，以及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸残基。可用于本发明方法的衍生物是CDKA多肽的衍生物并且含有PSTAIRE基序和T161D型突变。
植物中的CDK型激酶具有模块结构，其由N叶片和C叶片组成，含有一个催化裂和T环(De Bondt等人，1993)。因此可期望以保留或改变CDK蛋白质活性的方式进行激酶结构域的基因工程可以产生可用于操作本发明方法的CDKA突变体。只要产生的CDKA含有PSTAIRE基序和T161D型突变，首选的变体类型包括由结构域缺失、堆积或改组产生的那些变体(见例如He等人，Science 288，2360-2363，2000；或US专利5,811,238和6,395,547)。
CDKA多肽或其同源物可以由CDKA核酸分子或基因的备选的剪接变体编码。本文所用的术语“备选的剪接变体”包括核酸序列的变体，其中选择的内含子和/或外显子被切除、替换或添加。这样的变体可以是编码包含T161D型突变的多肽并且其中保留了该蛋白质的生物活性，其可以通过选择地保留该蛋白质的功能区段获得。这样的剪接变体可以在自然中发现或可以人工制备。制备这样的剪接变体的方法是本技术领域内熟知的。首选的剪接变体来自由SEQ ID NO 1代表的核酸。另外首选的是其编码的多肽保留了依赖细胞周期蛋白激酶活性且含有PSTAIRE基序和T161D型突变的剪接变体。
所述同源物还可以由编码CDKA多肽或其同源物的核酸的等位变体编码，优选由SEQ ID NO 1代表的核酸的等位变体，只要由等位变体编码的多肽具有依赖细胞周期的蛋白激酶活性且含有PSTAIRE基序和T161D型突变。天然存在且包括在本发明方法中的等位变体使用这些天然的等位基因，只要这些等位基因包含T161D型突变。等位变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小的插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多数生物天然存在的多态性品系中SNP和INDEL形成了最大类的序列变体。
根据本发明首选的方面，希望增强或增加本发明的CDKA核酸分子或其变体的表达。得到基因或基因产物表达增强或增加的方法在本领域中有详细记载并且包括例如用适当的启动子驱动的过量表达、转录增强子或翻译增强子的使用。可以将用作启动子或增强子元件的分离的核酸引入至多核苷酸非异源形式的适当位置上(一般为上游)，从而上调本发明的CDKA核酸或其变体的表达。例如，可以通过突变、缺失和/或取代来体内改变内源启动子(参见Kmiec，美国专利5,565,350号；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以将分离的启动子以与本发明基因适当的方向和距离引入植物细胞中，从而调控基因的表达。
如果希望多肽表达，通常需要在多核苷酸编码区的3’-端包括多聚腺苷酸化作用区域。多聚腺苷酸化作用区域可以来自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的3’端序列可以来自例如胭脂氨酸合酶或章鱼碱合酶基因，或可选的来自其他植物基因，或次优选的来自任何其他真核基因。
还可以将内含子序列添加到5’非翻译区或部分编码序列的编码序列以增加在胞质中聚集的成熟信使的量。已经表明在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接的内含子能在mRNA和蛋白质水平上使基因表达增加高达1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8，4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1，1183-1200(1987))。当将内含子置于转录单位的5’端附近时，此类内含子的基因表达的增强通常是最大的。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子的使用是本领域公知的。总体参见The Maize Handbook，116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，N.Y.(1994)。
本发明还提供了遗传构建体和载体，以便于引入和/或表达可用于本发明方法中的核苷酸序列。
因此，本发明提供了基因构建体，其包含：
(i)CDKA核酸分子或其功能性变体，该核酸或变体编码含有PSTAIRE基序和T161D型突变的A型CDK；
(ii)能驱动(i)的核酸序列在植物中表达的一个或多个调控序列；和可选的
(iii)转录终止序列。
可以使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术构建可用于本发明方法的构建体。可以将基因构建体插入载体中，该载体是可商购的、适于转化到植物中并适于在转化的细胞中表达目的基因的。
使用包含目的序列(即根据本发明的CDKA核酸或其变体)的载体转化植物。将目的序列有效连接于一个或多个调控序列(至少连接于启动子)。术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”在文中都可以互换使用，且应当取其广义，指能影响与它们连接的序列表达的调节核酸序列。上述术语包括来源于经典真核生物基因组基因的转录调节序列(包括精确转录起始所需的TATA框，含有或不含CCAAT框序列)以及应答发育和/或外界刺激，或以组织特异性方式改变基因表达的另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。该术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在这种情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中的表达。如本文所用的术语“有效连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能起始目的基因的转录。
有利地，可以使用任何类型的启动子驱动核酸序列的表达。启动子可以是诱导型启动子，即应答发育、化学、环境或物理刺激具有诱导的或增加的转录起始。另外的或可选的启动子可以是组成型启动子，即在植物的至少一种组织或器官中显著表达，且在植物的任何生命阶段显著性表达的启动子。另外的或可选的，启动子可以是组织偏好的或细胞偏好的启动子，即其能够在某些组织如叶、根、种子组织等，或甚至在特定细胞中优选地起始转录。能够仅在某些组织或细胞中起始转录的启动子在本文中分别称其为“组织特异性”和“细胞特异性”。
优选的，根据本发明的CDKA核酸或其变体有效连接到枝条特异性启动子。本文所定义的术语“枝条特异性”指的是在枝条中显著性表达，并在植物的任何生命阶段显著性表达的启动子。本文所用术语“枝条”包括植物的全部地上部分，包括茎和枝条、叶、芽、生殖器官，包括枝条衍生的结构，例如匍匐茎、球茎、根茎或块茎。优选地，能够在整个枝条中偏好地表达核酸的枝条特异性启动子是弱启动子。可以例如通过将启动子连接于报告基因并测定报告基因在多种植物组织中的表达来分析启动子的强度和/或表达方式。本领域技术人员已知的一个合适的报告基因是β-葡糖醛酸糖苷酶。接着可以将启动子强度和/或表达方式与充分表征的枝条特异性参考启动子，例如Cab27启动子(弱表达，GenBank AP004700)或推定的原叶绿素酸酯还原酶启动子(强表达，GenBank AL606456)相比较。关于“弱启动子”指驱动编码序列以低水平表达的启动子，即在每个细胞中约1/10,000转录物至约1/100,000转录物，至约1/500,000转录物的水平。相反地，“强启动子”驱动编码序列以高水平表达，或在每个细胞中约1/10转录物至约1/100转录物，至约1/1000转录物。最优选地，能够在整个植物中偏好地表达核酸的启动子是如SEQ ID NO：6代表的来自稻的金属硫蛋白启动子。应该清楚的是本发明的应用不限于由SEQ ID NO：1代表的CDKA核酸，也不限于由SEQ ID NO：6的金属硫蛋白启动子驱动的CDKA核酸的表达。
任选的，还可在引入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。术语“终止子”包括调控序列，其为位于转录单位末端的DNA序列，标志初级转录物的3′加工和多聚腺苷酸化以及转录的终止。其他调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员知晓适合用于实施本发明的终止子和增强子序列。此类序列是已知的，或本领域技术人员可以容易的获得。
本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制序列的起点。一个实例是需要遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(如质粒或黏粒分子)维持的情况。首选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
遗传构建体任选地可包含选择性标记基因。如本文所用，术语“选择性标记基因”包括其在细胞中的表达赋予表型，以利于细胞的鉴定和/或选择的任何基因，所述细胞是用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记，其引入新的新陈代谢性状或允许可视选择。选择性标记基因的实例包括其编码的蛋白质能赋予抗生素抗性的基因(如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、其编码的蛋白质赋予除草剂抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供陈代谢性状的基因(如允许植物利用甘露糖作为唯一碳源的manA)。编码可视标记蛋白质的基因导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、萤光(如萤光素酶)或荧光(绿色荧光蛋白，GFP，及其衍生物)。
本发明还包括通过本发明方法获得的植物或植物细胞。本发明因此提供了可通过本发明方法获得的植物或植物细胞，在该植物或植物细胞中引入了CDKA核酸或其变体，编码含有PSTAIRE基序且具有T161D型突变的CDKA。
本发明还提供了产生具有改良生长特性的转基因植物细胞或转基因植物的方法，其包括在植物中引入和表达编码包含PSTAIRE基序且具有T161D型突变的CDKA核酸或其变体。
更具体的，本发明提供了产生具有改良的生长特性的转基因植物的方法，该方法包括：
(i)向植物或植物细胞中引入编码包含T161D型突变的A型CDK或其同源物的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
可以将核酸直接引入植物细胞或植物本身(包括引入到植物的组织、器官或任何其他部分)。根据本发明首选的特征，优选通过转化将核酸引入植物。
本文所涉及的术语“转化”包括将外源多核苷酸转移入宿主细胞，而不管转移所用的方法如何。无论通过器官发生还是胚胎发生能够随后克隆繁殖的植物组织，可以用本发明的遗传构建体转化，并且从其再生出整株植物。选择的特定组织将根据可用且最适于所转化特定物种的克隆繁殖系统而改变。示例性的靶标组织包括叶盘、花粉、胚胎、子叶、下胚轴、雌配子、胼胝体组织、存在的分生组织(例如，顶端分生组织，腋生的芽和根分生组织)以及诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。可以瞬时或稳定的将多核苷酸引入宿主细胞中，且可保持非整合状态，例如，作为质粒。可选择的，可以将其整合到宿主基因组中。接着可以使用本领域技术人员公知的方法，使用所得的转化植物细胞再生转化的植物。
植物物种的转化目前是相当常规的技术。有利的，可以使用任意的一些转化方法将目的基因引入到合适的祖代细胞中。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学品、直接注射DNA到植物中、基因枪轰击、使用病毒或花粉转化以及显微注射。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu等人(1987)Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(Shillito等人，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；显微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185)；DNA或RNA包被颗粒轰击(Klein等人，(1987)Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。优选使用任何用于稻转化的熟知方法，通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化产生表达本发明的CDKA的转基因稻植物，所述稻转化的方法例如在以下任何文献中描述的方法：公开的欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6，271-282，1994)，公开内容以其全文在此引用作为参考。在谷物转化情形下，首选方法如在Ishida等人(Nature Biotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129，13-22，2002)所述，公开内容以其全文在此引用作为参考。
通常在转化以后，选择存在与目的基因共转移的由植物可表达基因编码的一个或多个标记的植物细胞或细胞群，接着将转化的材料再生成整株植物。
DNA转移和再生之后，可例如使用Southern分析评价推定的转化植物中目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组成。可选的或另外的，可使用Northern和/或Western分析监控新引入DNA的表达水平，两种技术都是本领域普通技术人员所熟知的。
可通过多种方法繁殖产生的转化植物，如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以自交产生纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物可通过传统的育种技术进一步繁殖。
产生的转化生物可以是多种形式的。例如，它们可以是转化细胞与未转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如，所有被转化以含有表达盒的细胞)；转化与未转化组织的嫁接体(例如，在植物中，嫁接到未转化的接穗中的转化的根茎)。
本发明显然延及由文中描述的任何方法产生的任何植物细胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本发明还延及包括由任何上述方法产生的原代转化或转染的细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一的要求是该后代表现出与由本发明方法在亲代中产生相同的基因型和/或表型特征。
本发明还包括含有分离的植物CDK核酸或其变体的宿主细胞，所述核酸或其变体编码包含T161D型突变的A型CDK。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。
本发明还延及本发明植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根茎、块茎和鳞茎。本发明另外涉及来源于，优选直接来源于此类植物的可收获部分的产物，如干的颗粒或粉、油、脂肪和脂肪酸、淀粉和蛋白质。
本发明还包括在CDKA蛋白质中的T161D型突变对于改良植物生长特性的用途，这类改良的生长特性如以上所定义。
本发明还包括CDKA核酸或其变体的用途，以及CDKA多肽或其同源物的用途，该CDKA或同源物包含T161D型突变，或该CDKA核酸或变体编码这类蛋白质。此类的用途之一涉及改良植物的生长特性，具体而言改良产量，特别是种子产量。种子产量可以包括下列一种或多种：增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子重量、增加的收获指数等。
CDKA核酸或其变体，或CDKA多肽或其同源物可以用在育种方案中，其中鉴定了与CDKA基因或其变体遗传连锁的DNA标记。CDKA或其变体，或CDKA或其同源物可以用来定义分子标记。随后可以将此DNA或蛋白质标记用在育种方案中以选择具有改良的生长特性的植物。CDKA基因或其变体可以是，例如由SEQ ID NO：1所代表的核酸，或编码任意本文所定义的同源物的核酸。
还发现包含T161D突变的CDKA的等位变体可以用于标记辅助的育种方案中。此类育种方案有时需要通过植物的诱变处理，例如使用EMS诱变引入等位变异；可选的，该方案可以从收集无意产生的所谓“天然”来源的等位变体开始。之后通过例如PCR进行等位变体的鉴定。接着是选择步骤，用于选择所讨论序列的优良等位变体，其在植物中产生改良的生长特性。通常通过监控含有所讨论序列的不同等位变体(例如SEQ IDNO：1的不同等位变体，或编码任意上述同源物的核酸的不同等位变体)的植物的生长特性来进行选择。监控生长特性可以在温室或野外进行。此外可选的步骤包括使其中已鉴定优良等位变体的植物与另一植物杂交。例如，这可用于产生目标表型特征的组合。
还可使用本发明的CDKA核酸或其变体作为探针对其为部分的基因进行遗传和物理作图，以及作为那些基因有关性状的标志。此类信息可用于植物育种，以开发具有期望表型的品系。CDKA核酸或其变体的此类用途仅需要长度至少为15个核苷酸的核酸序列。CDKA核酸或其变体可用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。可使用CDKA核酸或其变体探测限制性消化的植物基因组DNA的Southern印迹。然后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1：174-181)对所得的带型进行遗传分析，以构建遗传图谱。此外，该核酸可用于探测含有限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的Southern印迹，所述基因组DNA来自代表亲本和确定的遗传杂交后代的一组个体。记录DNA多态性的分离，并用来计算CDKA核酸或其变体在先前使用该群体获得的遗传图谱中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在遗传作图中植物基因来源的探针的生产和用途在Bernatzky和Tanksley(Genetics 112，887-898，1986)中有描述。众多出版物描述了使用上述方法或其变通形式对特定的cDNA克隆进行遗传作图。例如，可使用F2杂交群体、回交群体、随机交配群体、近等基因系及其他的个体组作图。这类方法是本领域技术人员熟知的。
核酸探针也可用于物理作图(即将序列置于物理图上；参见Hoheisel等人，在：Non-mammalian Genomic Analysis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页，以及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，核酸探针可用于直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)。虽然现在的FISH作图方法偏向于使用大的克隆(几kb到几百kb；参见Laan等人(1995)Genome Res.5：13-20)，但是灵敏度的提高允许使用较短的探针进行FISH作图。
可以使用核酸进行多种基于核酸扩增方法的遗传和物理作图。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16，325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和生产引物对用于扩增反应或引物延伸反应。此类引物的设计是本领域技术人员所熟知的。在使用基于PCR的遗传作图方法中，需要鉴定在对应于此核酸序列的区域之上作图的亲代之间的DNA序列差异。但是这对作图方法通常不是必要的。
可以以此方式产生、鉴定和/或分离具有改变的依赖细胞周期蛋白的激酶活性、呈现改良的生长特性的改良植物。
本发明的CDKA核酸或其变体，或CDKA多肽或其同源物还可以用作生长调节剂。由于已经表明这些分子可用于改良植物的生长特性，它们也是有用的生长调节剂，如除草剂或生长刺激物。本发明因此提供了用作生长调节剂的组合物，其包含CDKA或其变体，或CDKA多肽或其同源物，连同合适的载体、稀释剂或赋形剂，所述CDKA或同源物包含T161D突变，或该CDKA或变体编码这样的蛋白质。
根据本发明的方法产生如上所述的具有改良生长特性的植物。这些有利的生长特性也可与其他经济学上有利的性状组合，如进一步增加产量的性状、对各种胁迫的耐受性、修饰各种结构特征和/或生化和/或生理学特征的性状。
附图说明
本发明现在将参考以下附图进行描述，其中：
图1给出带有PSTAIRE基序的细胞周期蛋白依赖的激酶(或A型CDK)的系统发生树。
图2详细显示了图1的A型CDK的聚类。
图3详述了用于实施本发明方法的序列的实例。SEQ ID NO 1和SEQID NO 2代表了在实施例中使用的CDKA的核苷酸和蛋白质序列。在SEQID NO：1中用粗体显示起始和终止密码子，SEQ ID NO：1和2中用粗体下划线显示突变。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4是用来分离CDKA；1核酸的引物序列。SEQ ID NO：5代表用于本发明的表达盒，其包括金属硫蛋白启动子(内参PRO0109，核苷酸1-1208)，突变的CDKA的编码序列(内参CDS0644-1(核苷酸1285-2170))和终止子(核苷酸2275-2709)。SEQ IDNO：6是金属硫蛋白启动子的序列。
实施例
现在将参考以下实施例描述本发明，所述实施例仅意在说明。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术按照(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和2(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)中描述的标准方案进行。植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D Croy的PlantMolecular Biology Labfax(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
实施例1：基因克隆
使用标准技术克隆稻CDKA；1并随即诱变引入T161D取代。接着在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶通过PCR扩增CDKA；1突变体(内部编码CDS0644-7)，所用引物为Prm04553(SEQ ID NO 3，正义)和Prm04554(SEQ ID NO 4，反向互补)，其含有用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法纯化产生的PCR片段。然后进行Gateway操作的第一步，BP反应，在此期间，PCR片段与pDONR201质粒体内重组以产生“进入克隆”(entry clone)(根据Gateway术语)，p06。质粒pDONR201作为Gateway技术的部分购自Invitrogen。
实施例2：载体构建和稻的转化
继之在LR反应中使用进入克隆p06和用于稻转化的目的载体p03390。该载体包含T-DNA边界内的功能性元件：植物选择性标记；可视标记表达盒；旨在与已克隆到进入克隆中的目的序列进行LR体内重组的Gateway盒。用于枝条特异性表达的稻金属硫蛋白启动子位于该Gateway盒的上游。
LR重组步骤之后，将产生的含有表达盒SEQ ID NO：5的表达载体p017转化进入农杆菌株LBA4404中，并且随后转化到稻植物中。使转化的稻植物生长，接着检测实施例3中所述参数。
实施例3：转化体的评估：生长测量
产生大约15到20个独立的T0转化体。将初级转化体从组织培养箱转移到温室中生长，并收获T1种子。4个事件得以保留，其中T1后代发生3∶1的转基因存在/缺乏分离。对于这些事件中的每一个，通过可视标记筛选10个包含转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)，以及10个缺乏转基因的T1幼苗(失效合子)。将选择的T1植物转移到温室中。每个植物具有一个唯一的条形码标签以将表型数据与对应植物明确联系起来。所选择的T1植物在10cm直径花盆的土壤中在下列环境状态下生长：光周期＝11.5小时、日光强度＝30,000勒克斯或更多、日间温度＝28℃或更高、夜间温度＝22℃、相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的失效合子在随机位置上并排生长。从播种期到成熟期，使植物几次通过数字成像箱。在每个时间点上从至少6个不同的角度取得每株植物的数字图像(2048×1536像素，一千六百万色)。
收获成熟的初级圆锥花序、装袋并贴上条码标签，然后在37℃烤箱中干燥三天。随后将圆锥花序脱粒并且收集所有的种子。使用鼓风装置将饱满外壳和空外壳分开。在分离后，使用可商购的计数器对两批种子进行计数。弃去空外壳。在分析天平上称重饱满的外壳并且使用数字成像测量种子的截面积。此方法得到下述一组种子相关参数。
这些参数是使用图像分析软件以自动方式从数字图像中得到，并且进行统计分析。将修正不平衡设计的双因素ANOVA(方差分析)用作统计模型用于植物表型特征的全面评估。对用本发明基因转化的所有植株全部事件的所有测量参数进行F测验。进行F检验以检查基因对所有转化事件的效应，并检验基因的总效应，亦称之为整体基因效应。如果F检验的值显示数据具有显著性，则结论是有“基因”效应，意味着不仅基因的存在或定位引起了效应。真实整体基因效应的显著性阈值设置为F测验的5％概率水平。
为了检查基因在事件中的效应，即品系特异性效应，在每一事件中使用来自转基因植物和相应无效植物的数据组进行t检验。“无效植物”或“无效分离子”或“无效合子”是与转基因植物以相同方式处理，但是转基因已经与其分离的植物。也可以将无效植物描述为纯合的阴性转化植物。将t检验显著性的阈值设定为10％概率水平。一些事件的结果可以高于此阈值或低于此阈值。这是基于这种假设，即基因可以仅在基因组中的某些位置中具有效应，并且这一位置依赖性效应的发生并非罕见。本文中此类基因效应也称为“基因的品系效应”。通过比较t值和t分布得到p值，或者备选的，通过比较F值和F分布得到p值。p值给出了无效假设(即没有转基因效应)为正确的概率。
将在第一个实验中得到的数据使用T2植物在第二个实验中证实。选择3个品系进一步分析。通过监控标记基因表达来筛选T1中来自阳性植物(杂合子和纯合子)的一批种子。对于每一个选择的事件，随后保存几批杂合种子用于T2评估。在每批种子中，在温室中种植等量的阳性和阴性植物用于评估。
在T2代中评估总数为120个的转化植物，即每个事件有40个植物，其中有20个为转基因阳性且20个为阴性。
由于进行了具有重叠事件的两个实验，进行组合分析。这可用于检查两个实验效应的一致性，并且如果在这种情形下，可用于从两个实验中收集证据从而增加结论的可信性。使用的方法是考虑到数据的多级结构(即实验-事件-分离子)的混合模型方法。通过比较卡方分布的似然比测定得到p值。
实施例4：转化体的评估：与产量有关参数的测量
当对上述种子进行分析时，发明人发现用编码包含T161D型突变的A型CDK的CDK基因构建体转化的植物比缺乏CDKA转基因的植物具有增加的饱满种子数、增加的种子总重量和增加的收获指数。
在T2代中再次得到在T1代植物中所得的阳性结果。表4中的数据显示了生物量和TKW的总增加％(从T2代的单个品系的数据计算而来)和各自的p值。在与T1代结果的组合分析中重新评估这些T2数据，并且得到的p值表明观察到的效应具有显著性(表4)。
表4
T1代 T2代 组合分析
参数 总增加％  F检验的p值 总增加％  F检验的P值  P值
饱满种子数 62  0.0012 16  0.0230  0.0000
种子总重量 60  0.0019 15  0.0392  0.0002
  收获指数 82  0.0000 14  0.0110  0.0000
饱满种子数
通过计算分离步骤后保留的饱满外壳数确定饱满种子数。4个测试品系中的3个显示饱满种子数的增加，总计为186％。转基因植物相对于相应的无效分离子产生饱满种子数为62％的总增加，该增加具有统计显著性(p值0.0012)。在T2代，3个测试品系的2个有增加。T2品系的平均增加为14％，这意味着增加也是统计显著性的(p值为0.023)。T1和T2数据的组合分析也确定整体基因效应具有高显著性(p值为0.0000)。
种子总产量
通过对从植物收获的所有饱满外壳称重测量每株植物的种子总产量(种子总重量)。4个转基因T1品系中的3个显示种子总重量的增加，其在43％至178％之间变化。平均而言，种子产量的增加为60％，且如来自F检验的P值为0.0019所证明，由转基因的存在对种子产量产生的这一整体效应具有显著性。也在T2代中观察到这些结果。3个测试的品系产量增加在14％和48％之间，平均值为28％。平均增加(15％)具有统计显著性(p值为0.0392)，且T1和T2植物的组合分析也显示存在整体基因效应(p值为0.0002)。
收获指数
本发明中的收获指数在本文中定义为种子总产量与地上面积(mm2)之间的比率，乘以因子106。所有4个测试的品系显示增加的收获指数范围在9％至229％之间。收获指数(总增加为82％)具有显著性的整体基因效应(与转基因的存在相关的效应)，其F检验的p值为0.0000具有统计显著性。在T2植物中获得相似的效果。收获指数显示17％的总增加(p值为0.0110)。同样的，T1和T2数据的组合分析显示整体基因效应(p值为0.0000)。
此外，有种子总数增加的趋势。4个T1品系中的3个显示种子总数的增加(总增加为15％)，这些结果在T2代中被证实(总增加9％)，且根据组合分析这些增加表现为显著性(p值为0.0211)。

Claims (28)

1.相对于相应的对照植物，改良植物生长特性的方法，其包括调节含有T161D型突变的A型CDK在植物中的活性，和/或调节编码这类A型CDK的核酸的表达，以及任选地选择具有改良的生长特性的植物。
2.权利要求1的方法，其中通过优选在编码A型CDK基因的基因座引入遗传修饰来实现所述活性的调节。
3.权利要求2的方法，其中通过定点诱变、同源重组、定向进化和TILLING之一实现所述遗传修饰。
4.改良植物生长特性的方法，包括在植物中导入和表达编码含有T161D型突变的A型CDK的核酸。
5.权利要求4的方法，其中所述编码含有T161D型突变的A型CDK的核酸在植物中是过表达的。
6.根据权利要求4或5中任一项的方法，其中编码含有T161D型突变的A型CDK的所述核酸来源于植物，优选来自单子叶植物，更优选来自禾本科，最优选该核酸来自稻。
7.根据权利要求4到6中任一项的方法，其中编码含有T161D型突变的A型CDK的所述核酸有效连接于能够在枝条中优势表达所述核酸的启动子。
8.根据权利要求7的方法，其中所述启动子具有与SEQ ID NO：6的稻金属硫蛋白启动子相似的表达谱。
9.根据权利要求1到8中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性为相对于相应的野生型植物增加的产量。
10.根据权利要求9的方法，其中所述增加的产量为增加的种子产量。
11.根据权利要求10的方法，其中所述增加的种子产量选自下列中的任一项或多项：(i)增加的种子重量；(ii)增加的种子总数；(iii)增加的饱满种子数；(iv)增加的收获指数。
12.根据权利要求1到11中任一项的方法可获得的植物、植物部分或植物细胞。
13.构建体，其包含：
(i)CDKA核酸分子或其功能性变体，该核酸或变体编码包含PSTAIRE基序和T161D型突变的A型CDK；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列在植物中表达的一个或多个调控序列；和任选的
(iii)转录终止序列。
14.根据权利要求13的构建体，其中所述调控序列能够在枝条中驱动表达。
15.根据权利要求14的构建体，其中所述调控序列具有与SEQ ID NO：6的稻金属硫蛋白启动子相似的表达谱。
16.使用根据权利要求13到15的任一项的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
17.生产具有改良的生长特性的转基因植物的方法，该方法包括：
(i)向植物或植物细胞中导入编码包含T161D型突变的A型CDK或其同源物的核酸；
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
18.向植物中导入编码含有T161D型突变的A型CDK的核酸而产生的具有改良的生长特性的转基因植物、植物部分或植物细胞。
19.根据权利要求12、16或18的植物、植物部分或植物细胞，其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗，或其中该植物是谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、燕麦或高粱。
20.根据权利要求12、16、18或19的任一项的植物可收获的部分和/或来自所述植物的产物。
21.根据权利要求20的可收获部分，其中所述可收获部分是种子。
22.含有T161D型突变的A型CDK的用途，或者编码这样的CDK的核酸的用途，所述用途为改良植物的生长特性，特别是改良产量，尤其是种子产量中。
23.根据权利要求22的用途，其中所述种子产量包括下列的一项或多项：增加的种子总数、增加的饱满种子数、增加的种子总重量和增加的收获指数。
24.编码含有T161D型突变的A型CDK的核酸作为分子标记的用途。
25.分离的核酸分子，选自以下组成的组：
(i)编码由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的核酸分子；
(ii)编码由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列的同源物、衍生物或活性片段的核酸分子，所述同源物、衍生物或活性片段来源于植物并且包含PSTAIRE基序和T161D型突变；
(iii)能够与上述(i)或(ii)的核酸或其互补链杂交的核酸分子，其中杂交序列或其互补链编码包含PSTAIRE基序和T161D型突变的植物CDKA；
(iv)根据(i)至(iii)中任一项的核酸的等位变体，该等位变体编码含有PSTAIRE基序和T161D型突变的植物CDKA蛋白质；和
(v)根据(i)至(iii)中任一项的核酸可选的剪接变体，该可选的剪接变体编码包含PSTAIRE基序且含有T161D型突变的植物CDKA蛋白质。
26.分离的A型CDK突变体，选自以下组成的组：
(i)由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列；
(ii)由SEQ ID NO：2代表的蛋白质的同源物和/或衍生物，该同源物或衍生物来源于植物并且包含T161D型突变；
(iii)如在(i)或(ii)中定义的氨基酸序列的活性片段，该活性片段包含T161D型突变。
27.包含核酸分子的组合物，所述核酸分子编码含有T161D型突变的植物来源的A型CDK。
28.包含具有T161D型突变的植物来源的A型CDK的组合物。
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