CN107287173B

CN107287173B - 一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体

Info

Publication number: CN107287173B
Application number: CN201610228365.9A
Authority: CN
Inventors: 丁雪峰
Original assignee: Nanjing Nuoyun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Nuoyun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2036-04-13
Also published as: CN107287173A

Abstract

本发明涉及一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体，属于生物工程领域。以来源于大肠杆菌的MG1655的胸苷磷酸化酶蛋白为基础，通过PCR技术获得了一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体，其发酵上清液在pH7.4条件下，酶活达到3.6U/mg，是突变前胸苷磷酸化酶蛋白的10倍，可有效降低抗爱滋病药物中间体β‑胸苷的生产成本。生产条件要求简单，易于推广应用。

Description

一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体

技术领域

本发明涉及一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体，属于生物工程领域。

背景技术

胸苷是一种重要的医药原料中间体和生化试剂，在生物化工领域的研究和生产中有着十分广泛的应用。胸苷是制备抗爱滋病药——叠氮胸苷(AZT)的重要原料，但要求其含量必须在98％以上，而且其中的5-甲基尿苷的含量不能超过0.3％。目前胸苷的制备主要有化学合成和DNA酶解两种方法：由化学合成法所得到的胸苷粗品中含有油状物，色素，5-甲基尿苷等胸苷衍生物，并且存在光学异构体难以去除；工艺过程中亦需要使用大量有毒有害的有机溶剂，对环境污染亦存在危险。而酶解法通过水解RNA或DNA等天然物质，所得到的胸苷粗品中含有脱氧腺苷(dA)，脱氧胞苷(dC)，脱氧乌苷(dG)，脱氧肌苷(dI)等杂质，分离提取十分复杂。

胸苷磷酸化酶在生物合成核苷药物中具有重要作用。合成出的核苷药物被广泛应用于医药领域，如治疗艾滋病的HIV逆转录酶抑制剂齐夫多定(AZT)、双脱氧肌苷(ddl)、扎西他滨(ddC)等。

胸苷磷酸化酶可特异性作用于β-胸苷，催化β-胸苷可逆磷酸化反应，由β-胸苷生成脱氧核糖-1-磷酸及胸腺嘧啶，亦可由脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶生成β-胸苷。

目前针对胸苷磷酸化酶的研究主要针对以下几个方面：通过基因工程方法获得胸苷磷酸化酶的重组表达工程菌，优化发酵培养基及发酵方法以获得更高蛋白量，基因饱和突变方法、蛋白定向进化以及DNA改组方法获得更高活性的酶蛋白突变体。

发明内容

本发明的发明目的是获得一种新的胸苷磷酸化酶蛋白突变体，从而可以有效提高单位菌体的总酶活，降低抗艾滋病药物中间体β-胸苷的生产成本。

所述的突变体是由大肠杆菌MG1655的胸苷磷酸化酶蛋白出发，通过将其第10位由Leu突变为Ala、第209位由Ala突变为Gly、第210位由Phe突变为Gly、第221位由Ala突变为Val、第413位由Ala突变为Asp得到的。

具体地，本发明公开的胸苷磷酸化酶蛋白突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

同时本发明为了能够使其在大肠杆菌中高效表达，我们进一步通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，得到用以编码这一胸苷磷酸化酶蛋白突变体的核酸序列为SEQ ID NO：3。

并且进一步地，按照图1中所示的方式构建携带有编码序列为SEQ ID NO：3的胸苷磷酸化酶蛋白突变体基因的质粒。

进而，通过以下步骤，实现这一胸苷磷酸化酶蛋白突变体在大肠杆菌中的高效表达。

(1)挑取含有SEQ ID NO.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于高压灭菌后的一级培养基中，30℃，250rpm，过夜培养；

(2)将步骤(1)获得的产品按照1∶100的接种比例接入到高压灭菌后的二级培养基中，于30℃中培养至菌体OD值5-6后，立即将其置于25℃中，震荡，250rpm培养1小时；

(3)向步骤(2)获得的产品中加入IPTG至其终浓度为0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；

(4)将培养液于4℃条件下，12000g下离心20分钟，收集湿菌体。

其中一级培养基由下列物质组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。

二级培养基由下列物质组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。

上述描述中过夜是指12-16小时。

获得湿菌体后，还可以包括以下步骤：(5)然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。本发明中获得的菌体于-70℃保存。

本发明以来源于大肠杆菌的MG1655的胸苷磷酸化酶蛋白为基础，通过PCR技术获得了一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体，其发酵上清液在pH7.4条件下，酶活达到3.6U/mg，是突变前胸苷磷酸化酶蛋白的10倍。

通过使用本发明的优化后的基因序列，及优化后的发酵工艺，来表达胸苷磷酸化酶突变体，能有效提高单位菌体的总酶活，可有效降低抗爱滋病药物中间体β-胸苷的生产成本。只要一般的发酵车间(如氨基酸、维生素生产车间)即可进行投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用。

附图说明

图1为胸苷磷酸化酶突变体Seq ID NO.3表达载体图谱。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。

实施例1

将大肠杆菌MG1655置于LB培养基中培养，控制温度为37.0℃，180rpm培养1天，离心收集沉淀，用DNA提取纯化试剂盒QiAamp Kit(Qiagen，Germany)提取纯化大肠杆菌MG1655基因组DNA。

用Pfu高保真酶对大肠杆菌MG1655基因组DNA进行PCR扩增，所用引物为

1655TP-F 5’ ATGTTTCTCGCACAAGAAATTATTCG 3’

1655TP-R 5’ TTATTCGCTGATACGGCGATAGA 3’

由于大肠杆菌MG1655的DNA的GC含量接近50％，故使用Pfu高保真酶直接扩增。之后将扩增的片段用Taq聚合酶72℃处理10分钟，在DNA 3’端添加碱基A。之后将其连接到pMD19T-simple(Takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至南京金斯瑞生物进行测序。测序得到DNA序列为SEQ ID NO.1，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2

通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。同时，在合成时引入以下位置的五个氨基酸突变：L1OA，A209G，F210G，A221V，A413D，利用Primer Premier(http：//primer3.ut.ee/)和OPTIMIZER(http：//genomes.urv.es/OPTIMIZER/)进行设计，并保证Tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：

合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。

2mM dNTP mix(2mM each dNTP)	5μl
		10×Pfu buffer	5μl
Pfu DNA polymerase(10U/μl)	0.5μl
		ddH2O	使得反应体系总体积至50μl

将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃ 30s，65℃ 45s，72℃ 120s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的DNA序列为SEQID NO.3，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

实施例3

挑取含有SEQ ID NO.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。30℃，250rpm过夜培养。次日取1L三角瓶，按1∶100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。

实施例4

按下列的体系构建标准酶反应液对获得的胸苷磷酸化酶进行活性检测：0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.4)，25mM的胸苷，1mM的EDTA。

用50ml离心管装10ml的标准酶反应液，按5％的湿菌体量加入发酵菌体；将上述的反应液在恒温水浴中振荡反应，反应条件为25℃水浴下反应3小时，反应结束后，将反应液在沸水中10分钟终止反应。将反应液转入离心管中，在12000r/min离心去除沉淀，取上清液用NaOH稀溶液稀释100倍。用紫外分光光度计，测量稀释好的上清液在290nm处吸光值的变化。

用空白液作为对照，按照前述的实验组处理方式进行相同的处理。

酶活单位定义为：在pH 7.4时，25℃下，lmin内OD290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；

结果表明含有五个突变位点的胸苷磷酸化酶活力为3.60U/mg，而突变前仅为0.32U/mg湿菌体，酶活增加约10倍左右。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京诺云生物科技有限公司

<120> 一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1323

<212> DNA

<213> Escherichia coli MG1655

<400> 1

atgtttctcg cacaagaaat tattcgtaaa aaacgtgatg gtcatgcgct gagcgatgaa 60

gaaattcgtt tctttatcaa cggtattcgc gacaacacta tctccgaagg gcagattgcc 120

gccctcgcga tgaccatttt cttccacgat atgacaatgc ctgagcgtgt ctcgctgacc 180

atggcgatgc gagattcagg aaccgttctc gactggaaaa gcctgcatct gaatggcccg 240

attgttgata aacactccac cggtggcgtc ggcgatgtga cttcgctgat gttggggccg 300

atggtcgcag cctgcggcgg ctatattccg atgatctctg gtcgcggcct cggtcatact 360

ggcggtacgc tcgacaaact ggaatccatc cctggcttcg acattttccc ggatgacaac 420

cgtttccgcg aaattattaa agacgtcggc gtggcgatta tcggtcagac cagttcactg 480

gctccggctg ataaacgttt ctacgcgacc cgtgatatta ccgcaaccgt ggactccatc 540

ccgctgatca ccgcctctat tctggcgaag aaacttgcgg aaggtctgga cgcgctggtg 600

atggacgtga aagtgggtag cggcgcgttt atgccgacct acgaactctc tgaagccctt 660

gccgaagcga ttgttggcgt ggctaacggc gctggcgtgc gcaccaccgc gctgctcacc 720

gacatgaatc aggtactggc ctccagtgca ggtaacgcgg ttgaagttcg tgaagcggtg 780

cagttcctga cgggtgaata tcgtaacccg cgtctgtttg atgtcacgat ggcgctgtgc 840

gtggagatgc tgatctccgg caaactggcg aaagatgacg ccgaagcgcg cgcgaaattg 900

caggcggtgc tggacaacgg taaagcggca gaagtctttg gtcgtatggt agcggcacaa 960

aaaggcccga ccgacttcgt tgagaactac gcgaagtatc tgccgacagc gatgctgacg 1020

aaagcagtct atgctgatac cgaaggtttt gtcagtgaaa tggatacccg cgcgctgggg 1080

atggcagtgg ttgcaatggg cggcggacgc cgtcaggcat ctgacaccat cgattacagc 1140

gtcggcttta ctgatatggc gcgtctgggc gaccaggtag acggtcagcg tccgctggcg 1200

gttatccacg cgaaagacga aaacaactgg caggaagcgg cgaaagcggt gaaagcggca 1260

attaaacttg ccgataaagc accggaaagc acaccaactg tctatcgccg tatcagcgaa 1320

taa 1323

<210> 2

<211> 440

<212> PRT

<213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655

<400> 2

Met Phe Leu Ala Gln Glu Ile Ile Arg Lys Lys Arg Asp Gly His Ala

1 5 10 15

Leu Ser Asp Glu Glu Ile Arg Phe Phe Ile Asn Gly Ile Arg Asp Asn

20 25 30

Thr Ile Ser Glu Gly Gln Ile Ala Ala Leu Ala Met Thr Ile Phe Phe

35 40 45

His Asp Met Thr Met Pro Glu Arg Val Ser Leu Thr Met Ala Met Arg

50 55 60

Asp Ser Gly Thr Val Leu Asp Trp Lys Ser Leu His Leu Asn Gly Pro

65 70 75 80

Ile Val Asp Lys His Ser Thr Gly Gly Val Gly Asp Val Thr Ser Leu

85 90 95

Met Leu Gly Pro Met Val Ala Ala Cys Gly Gly Tyr Ile Pro Met Ile

100 105 110

Ser Gly Arg Gly Leu Gly His Thr Gly Gly Thr Leu Asp Lys Leu Glu

115 120 125

Ser Ile Pro Gly Phe Asp Ile Phe Pro Asp Asp Asn Arg Phe Arg Glu

130 135 140

Ile Ile Lys Asp Val Gly Val Ala Ile Ile Gly Gln Thr Ser Ser Leu

145 150 155 160

Ala Pro Ala Asp Lys Arg Phe Tyr Ala Thr Arg Asp Ile Thr Ala Thr

165 170 175

Val Asp Ser Ile Pro Leu Ile Thr Ala Ser Ile Leu Ala Lys Lys Leu

180 185 190

Ala Glu Gly Leu Asp Ala Leu Val Met Asp Val Lys Val Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Phe Met Pro Thr Tyr Glu Leu Ser Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ile

210 215 220

Val Gly Val Ala Asn Gly Ala Gly Val Arg Thr Thr Ala Leu Leu Thr

225 230 235 240

Asp Met Asn Gln Val Leu Ala Ser Ser Ala Gly Asn Ala Val Glu Val

245 250 255

Arg Glu Ala Val Gln Phe Leu Thr Gly Glu Tyr Arg Asn Pro Arg Leu

260 265 270

Phe Asp Val Thr Met Ala Leu Cys Val Glu Met Leu Ile Ser Gly Lys

275 280 285

Leu Ala Lys Asp Asp Ala Glu Ala Arg Ala Lys Leu Gln Ala Val Leu

290 295 300

Asp Asn Gly Lys Ala Ala Glu Val Phe Gly Arg Met Val Ala Ala Gln

305 310 315 320

Lys Gly Pro Thr Asp Phe Val Glu Asn Tyr Ala Lys Tyr Leu Pro Thr

325 330 335

Ala Met Leu Thr Lys Ala Val Tyr Ala Asp Thr Glu Gly Phe Val Ser

340 345 350

Glu Met Asp Thr Arg Ala Leu Gly Met Ala Val Val Ala Met Gly Gly

355 360 365

Gly Arg Arg Gln Ala Ser Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Val Gly Phe Thr

370 375 380

Asp Met Ala Arg Leu Gly Asp Gln Val Asp Gly Gln Arg Pro Leu Ala

385 390 395 400

Val Ile His Ala Lys Asp Glu Asn Asn Trp Gln Glu Ala Ala Lys Ala

405 410 415

Val Lys Ala Ala Ile Lys Leu Ala Asp Lys Ala Pro Glu Ser Thr Pro

420 425 430

Thr Val Tyr Arg Arg Ile Ser Glu

435 440

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgttcctgg ctcaggaaat catccgtaaa aaacgtgacg gtcacgctct gtctgacgaa 60

gaaatccgtt tcttcatcaa cggtatccgt gacaacacca tctctgaagg tcagatcgct 120

gctctggcta tgaccatctt cttccacgac atgaccatgc cggaacgtgt ttctctgacc 180

atggctatgc gtgactctgg taccgttgct gactggaaat ctctgcacct gaacggtccg 240

atcgttgaca aacactctac cggtggtgtt ggtgacgtta cctctctgat gctgggtccg 300

atggttgctg cttgcggtgg ttacatcccg atgatctctg gtcgtggtct gggtcacacc 360

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