CN118006653A - 一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌、制备方法及其应用，本发明通过人工合成GAP‑hADH1B核苷酸序列，再通过乳酸乳球菌NZ3900感受态的制备及其与重组载体的结合，最后进行重组乳酸乳球菌的筛选与扩大培养。本发明制备方法中所得重组乳酸乳球菌，属于益生菌，对人体无毒副作用，能产生乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶两种生物酶，酶将参与酒精的分解代谢，其作用机制与人体自身代谢机制相符，作用效果在个体之间的差异相对较小，能够高效解酒，缓解酒后不适，减轻酒精中毒症状，减少酒精对肝脏的损害，并且重组乳酸乳球菌培养条件易控制，生长繁殖稳定，可利于批量生产和推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌、制备方法及其应用。
背景技术
酒精作为一种中枢神经抑制剂，过量摄入会对人体健康造成严重危害，如肝脏损伤、胃溃疡、心血管疾病等。因此在生物医学领域，如何有效提高酒精代谢与解毒的效率，降低酒精对人体的影响，一直是研究的重点。
分解酒精主要涉及肝脏中的乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的作用。乙醇在肝脏内首先由乙醇脱氢酶催化氧化成乙醛，再由乙醛脱氢酶催化氧化成乙酸，最后代谢为二氧化碳和水排出体外。如果人体内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性较高，就能更快地代谢酒精，从而缩短解酒时间。
近年来，基因工程和微生物工程技术的发展为酒精分解代谢提供了新思路。一些具有解酒功能的基因被发现并转入到微生物中，从而帮助迅速降低酒精浓度，缓解饮酒带来的不适。与传统的解酒方法相比，重组微生物具有更直观的解酒效果，且使用方便，可广泛应用于各种饮酒场合。然而，目前市场上的解酒微生物产品还存在以下问题：
(1)一些产品的效果并不明显，且个体差异较大，无法有效地降低酒精对人体的影响；
(2)一些产品的安全性无法得到保障，可能对使用者的健康造成潜在威胁；
(3)一些产品的获取步骤不够便捷，难以实现工业化生产或家庭使用。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌、制备方法及其应用。
本发明为实现其技术目的所采用的技术方案是：一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其制备步骤具体如下：
S1、构建含有目的基因的重组载体，具体包括以下步骤：
S1.1、获得插入基因GAP-hADH1B；
将启动子(GAP)与目的基因(hADH1B)的核苷酸序列组合，人工合成GAP-hADH1B核苷酸序列，所述人工合成的GAP-hADH1B核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
S1.2、获得线性化载体；
A、先进行BstYI酶和XbaI酶双酶切；
B、再进行切胶回收纯化；
S1.3、连接插入基因与线性化载体，得重组载体；
S2、重组载体导入至乳酸乳球菌NZ3900，具体包括以下步骤：
S2.1、制备乳酸乳球菌NZ3900感受态；
S2.2、热激转化；
S3、重组乳酸乳球菌的验证，具体包括以下步骤：
S3.1、阳性转化菌的筛选；
S3.2、乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测；
S4、重组乳酸乳球菌的培养，具体包括以下步骤：
取适量验证正确的重组乳酸乳球菌接种于10mL GM17液体培养基，30℃，150rpm过夜培养；
将上述10mL菌液转接于500mL GM17液体培养基，30℃，150rpm过夜培养；
发酵冻干，浓缩为可商品化的重组乳酸乳球菌压片，饮酒后摄入能辅助产生解酒酶，有效降低酒精浓度。
优选地，所述步骤S1.2中BstYI酶和XbaI酶双酶切流程中，先提取pNZ8149质粒，后进行BstYI酶和XbaI酶双酶切，具体流程如下：
①以DNA含量≤1μg计算DNA所需加入体积，反应体系总体积为30μL，加入3μL的10×Buffer Tango和XbaI酶1μL，其余组分用dd H2O补足；轻轻混匀后瞬时离心；37℃酶切过夜(16小时)；
②加100μL Buffer DC纯化(Takara货号9761)，加30μL dd H2O洗脱；后加入14μL的dd H2O，5μL的10×rCutSmart Buffer和1μL的BstYI酶，构成总体积为50μL的酶切体系，轻轻混匀后瞬时离心；60℃酶切3小时。
优选地，所述步骤S1.2中切胶回收纯化具体流程：
配制1％的琼脂糖凝胶电泳，120V电压下电泳30min，在2322bp处切胶回收，所得线性化载体的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
优选地，所述步骤S1.3中得到重组载体具体流程：
计算得线性化载体最适用量为50ng，插入基因最适用量为60ng，利用无缝克隆技术进行连接重组；
50℃金属浴20min，瞬时离心后插入冰中冷却，至此完成插入基因与线性化载体的连接，得重组载体，可直接转化或保存于-20℃冰箱。
优选地，所述步骤S2.1中制备乳酸乳球菌NZ3900感受态具体流程：
G/L-SGM17培养基：GM17肉汤+0.5mol/L蔗糖+2.5％甘氨酸；
洗涤液I：蔗糖0.5mol/L+甘油10％；
洗涤液II：蔗糖0.5mol/L+甘油10％+EDTA 50mmol/L；
A、将乳酸乳球菌NZ 3900单菌落培养至G/L-SGM17中，30℃，150rpm过夜培养；
B、次日取适量菌液接种到新鲜的G/L-SGM17中，以OD600值为0.3时的菌液制备感受态；
C、利用小批量方法制备感受态细胞(冰上操作)，具体流程如下：
①先将菌液用2mL离心管在6000g，4℃条件下离心10min；
②用1mL洗涤液I重悬细胞，相同条件离心10min；
③用1mL洗涤液II重悬细胞，冰浴15min，相同条件离心10min；
④再用1mL洗涤液I重悬细胞，相同条件离心10min；
⑤弃废液后，用40μL洗涤液I重悬细胞，立即用该感受态进行转化。
优选地，所述步骤S2.2中热激转化的具体流程：
A、实验组：在40μL感受态细胞中加入2.5μL重组体系；
B、对照组：在40μL感受态细胞中加入2.5μL空载体；
42℃金属浴90s，冰浴2min，加入1mL复苏培养基；转至1.5mL离心管中，30℃，150rpm进行复苏培养1.5h；
稀释10-4及2×10-4后取120μL涂布于GM17平板，30℃过夜培养。
优选地，所述步骤S3.1中阳性转化菌的筛选具体流程：
用枪头蘸取菌落，溶于20μL dd H2O中，100℃金属浴10min，以此作为模板；
转化菌进行菌落PCR扩增，所述PCR扩增引物为SEQ ID No:5(F:5'-caggatcacttgatgactacgat-3')和SEQ ID No:6(R:5'-gcaacacgtgctgtaatttg-3')；
所述PCR扩增的反应程序：94℃，5min；{98℃，10s；55℃，15s；68℃，1min；}30个循环；12℃，∞；
电泳初步确定阳性转化菌，将相应阳性转化菌的扩增产物测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符，即获得所需重组乳酸乳球菌。
优选地，所述步骤S3.3中乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测具体流程：
A、菌落计数，结果：1麦氏比浊转化菌计数为2.51×108CFU/mL；已知5×106个细菌需用1mL酶活检测提取液，则1麦氏比浊菌液应稀释1/50，使达到约5×106个细菌；即取20μL1麦氏比浊菌液加980μL GM17液体培养基，得1mL转化菌液用于检测酶活；
B、样本处理：取1mL细菌培养液，离心收集细菌，加入1mL提取液，超声破碎细胞，后16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待则；
C、乙醇脱氢酶(ADH)活性检测；
①分光光度计波长340nm处蒸馏水调零；
②空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、40μL试剂二、760μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2，△A空白管＝A1-A2；
③测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL样品上清液、40μL试剂二、760μL试剂一和100μL试剂三，记15s和75s吸光值分别为A3和A4；△A测定管＝A3-A4；△A＝△A测定管﹣△A空白管；
ADH活性计算(按细菌数量)：
定义：25℃中每106个细菌每分钟氧化1nmol NADH为1个酶活单位；
ADH(U/106cell)＝(△A÷∈÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T；
＝1.61×△A÷细菌数量
其中，∈为NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为比色皿光径,取1cm；细菌数量以106计；
D、乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测；
①分光光度计波长340nm处蒸馏水调零；
②工作液按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四＝300μL:100μL:20μL:30μL配制；现用现配，后37℃预热10min；
③在1mL石英比色皿中依次加入200μL蒸馏水、450μL工作液、350μL试剂五，充分混匀，此为空白管；
在1mL石英比色皿中依次加入200μL样品上清液、450μL工作液、350μL试剂五，充分混匀，此为测定管；
④于340nm处测定1min时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴30min，测定31min时吸光值A2，计算△A测定＝△A测定﹣△A测定，△A空白＝△A空白﹣△A空白，△A＝△A测定﹣△A空白；
ALDH酶活计算(按细菌数量)：
定义：每106个细菌每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位；
ALDH(U/106cell)＝(△A÷∈÷d×V反总×109)÷(细菌数量×V样÷V样总)÷T；
＝26.795×△A÷细菌数量；
其中，∈为NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为比色皿光径，取1cm；细菌数量以106计；
经乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测，检测结果显示：本发明中所述重组乳酸乳球菌能够产生解酒酶(乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶)，且产生的解酒酶活性高。
本发明还提供了一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌，根据所述的制备方法所制备得到。
本发明还提供了一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌在人体摄入酒精后产生解酒酶，降低人体内酒精浓度的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明中所述的重组乳酸乳球菌能产生乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，这两种解酒酶将参与酒精的分解代谢，且其作用机制与人体自身代谢机制相符，从而高效解酒，作用效果在个体之间的差异相对较小。
本发明中所述的重组乳酸乳球菌属于益生菌，对人体无毒副作用，其产生的是生物酶，作用机制明确，能缓解酒后不适，减轻酒精中毒症状，减少酒精对肝脏的损害。
本发明中所述的重组乳酸乳球菌培养条件易控制，生长繁殖稳定，可利于批量生产和推广使用。
具体实施方式
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位，以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
实施例1：
一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其制备步骤具体如下：
S1、构建含有目的基因的重组载体，具体包括以下步骤：
S1.1、获得插入基因GAP-hADH1B；
将启动子(GAP)与目的基因(hADH1B)的核苷酸序列组合，人工合成GAP-hADH1B核苷酸序列，所述人工合成的GAP-hADH1B核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
(ggatctaataaaaactccttaaacatttttagtaaaaaaaattgacactaaataaaaaaagtagtatcatttatattagagataagagatgtctccaataactataaattcattatttatattataccacagcagttgacctgaaacaatgtttcgtattacgaagagtgatatttgtagtagaaaaagagaaattctcatcatctaaataaaaaaacggaggactacatcccatgggtactgcaggcatgcggtaccactagtatgaagaagaagatcatcagcgccatcctgatgtccacagtgatcctgtccgccgccgcccctctgagcggagtttacgccctgacactggatgatgacaagatgtccaccgccggcaaggtgatcaagtgcaaggccgccgtgctgtgggaggtgaagaagcccttttccatcgaggacgtggaggtggcccctcccaaggcctacgaggtgaggatcaagatggtggccgtgggcatctgtcacaccgacgaccacgtggtgtccggcaatctggtgacacccctgcctgtgatcctgggccacgaggccgccggaatcgtggagtccgtgggcgagggcgtgaccaccgtgaagcctggcgacaaggtgatccccctgttcaccccccagtgcggcaagtgcagagtgtgcaagaaccctgagtccaactactgcctgaagaacgacctgggcaaccccagaggcaccctgcaggatggcaccagaaggtttacatgtaggggcaagcctatccaccacttcctgggcacctccaccttttcccagtacaccgtggtggatgagaacgccgtggccaagatcgacgccgccagcccactggagaaggtgtgcctgatcggctgtggcttcagcaccggctacggctccgccgtgaatgtggccaaggtgacccccggcagcacatgtgccgtgttcggcctgggcggcgtgggactgagcgctgttatgggctgcaaggccgctggcgccgccagaatcatcgccgtggatatcaacaaggataagttcgccaaggccaaggagctgggcgccaccgagtgtatcaatcctcaggattacaagaagcccatccaggaggtgctgaaggagatgaccgatggcggcgtggatttctccttcgaggtgatcggcaggctggataccatgatggccagcctgctgtgctgccacgaggcctgtggcacctccgtgatcgtgggcgtgccccctgcctcccagaacctgtccatcaatcctatgctgctgctgaccggcaggacatggaagggcgccgtgtacggcggctttaagtccaaggagggcatccctaagctggtggccgattttatggccaagaagttcagcctggatgccctgatcacacacgtgctgcccttcgagaagatcaacgagggcttcgacctgctgcacagcggcaagagcatcaggaccgtgctgacattttgagagctc)；
提取其质粒，设计引物以PCR扩增的方式获得插入基因GAP-hADH1B；PCR扩增引物为SEQ ID No:2(F:5'-ggaaacgacggatcaggatctggatctaataaaaactccttaaacattt-3')和SEQID No:3(R:5'-agaaagcttgagctctctagagagctctcaaaatgtcagcac-3')；
所述PCR扩增的反应程序：95℃，5min；{95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min；}35个循环；72℃，5min；12℃，∞；
将得到的扩增产物测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列符合所需GAP-hADH1B核苷酸序列，PCR反应液纯化；
S1.2、获得线性化载体；
A、先进行BstYI酶和XbaI酶双酶切；
先提取pNZ8149质粒，后进行BstYI酶和XbaI酶双酶切，具体流程如下：
①以DNA含量≤1μg计算DNA所需加入体积，反应体系总体积为30μL，加入3μL的10×Buffer Tango和XbaI酶1μL，其余组分用dd H2O补足；轻轻混匀后瞬时离心；37℃酶切过夜(16小时)；
②加100μL Buffer DC纯化(Takara货号9761)，加30μL dd H2O洗脱；后加入14μL的dd H2O，5μL的10×rCutSmart Buffer和1μL的BstYI酶，构成总体积为50μL的酶切体系，轻轻混匀后瞬时离心；60℃酶切3小时；
B、再进行切胶回收纯化；
配制1％的琼脂糖凝胶电泳，120V电压下电泳30min，在2322bp处切胶回收，所得线性化载体的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；
(tctagagagctcaagctttctttgaaccaaaattagaaaaccaaggcttgaaacgttcaattgaaatggcaattaaacaaattacagcacgtgttgctttgattgatagccaaaaagcagcagttgataaagcaattactgatattgctgaaaaattgtaatttataaataaaaatcaccttttagaggtggtttttttatttataaattattcgtttgatttcgctttcgatagaacaatcaaatcgtttctgagacgttttagcgtttatttcgtttagttatcggcataatcgttaaaacaggcgttatcgtagcgtaaaagcccttgagcgtagcgtggctttgcagcgaagatgttgtctgttagattatgaaagccgatgactgaatgaaataataagcgcagcgtccttctatttcggttggaggaggctcaagggagtttgagggaatgaaattccctcatgggtttgattttaaaaattgcttgcaattttgccgagcggtagcgctggaaaatttttgaaaaaaatttggaatttggaaaaaaatggggggaaaggaagcgaattttgcttccgtactacgaccccccattaagtgccgagtgccaatttttgtgccaaaaacgctctatcccaactggctcaagggtttgaggggtttttcaatcgccaacgaatcgccaacgttttcgccaacgttttttataaatctatatttaagtagctttatttttgtttttatgattacaaagtgatacactaattttataaaattatttgattggagttttttaaatggtgatttcagaatcgaaaaaaagagttatgatttctctgacaaaagagcaagataaaaaattaacagatatggcgaaacaaaaagatttttcaaaatctgcggttgcggcgttagctatagaagaatatgcaagaaaggaatcagaacaaaaaaaataagcgaaagctcgcgtttttagaaggatacgagttttcgctacttgtttttgataaggtaattatatcatggctattaaaaatactaaagctagaaattttggatttttattatatcctgactcaattcctaatgattggaaagaaaaattagagagtttgggcgtatctatggctgtcagtcctttacacgatatggacgaaaaaaaagataaagatacatggaatagtagtgatgttatacgaaatggaaagcactataaaaaaccacactatcacgttatatatattgcacgaaatcctgtaacaatagaaagcgttaggaacaagattaagcgaaaattggggaatagttcagttgctcatgttgagatacttgattatatcaaaggttcatatgaatatttgactcatgaatcaaaggacgctattgctaagaataaacatatatacgacaaaaaagatattttgaacattaatgattttgatattgaccgctatataacacttgatgaaagccaaaaaagagaattgaagaatttacttttagatatagtggatgactataatttggtaaatacaaaagatttaatggcttttattcgccttaggggagcggagtttggaattttaaatacgaatgatgtaaaagatattgtttcaacaaactctagcgcctttagattatggtttgagggcaattatcagtgtggatatagagcaagttatgcaaaggttcttgatgctgaaacgggggaaataaaatgacaaacaaagaaaaagagttatttgctgaaaatgaggaattaaaaaaagaaattaaggacttaaaagagcgtattgaaagatacagagaaatggaagttgaattaagtacaacaatagatttattgagaggagggattattgaataaataaaagcccccctgacgaaagtcgacatggactgataaagtatagtaaaaacataaaacggaggatattgttgtgaacagagaagagatgactctcttagggtttgaaattgttgcttatgctggagatgctcgctctaagcttttagaagcgcttaaagcggctgaaaatggtgatttcgctaaggcagatagtcttgtagtagaagcaggaagctgtattgcagaggctcacagttctcagacaggtatgttggctcgagaagcttctggggaggaacttccatacagtgttactatgatgcatggtcaggatcacttgatgactacgatcttattaaaagatgtgattcatcacctcatcgaactttataaaagaggagcaaagtaattaatgcataaactcattgaacttattgagaaagggaaacgacggatcaggatct，其中下划线处表示酶切位点)；
S1.3、连接插入基因与线性化载体，得重组载体；
计算得线性化载体最适用量为50ng，插入基因最适用量为60ng，利用无缝克隆技术进行连接重组(试剂盒购自Monad)，重组反应体系如下表所示：
50℃金属浴20min，瞬时离心后插入冰中冷却。至此完成插入基因与线性化载体的连接，得重组载体，可直接转化或保存于-20℃冰箱；
S2、重组载体导入至乳酸乳球菌NZ3900，具体包括以下步骤：
S2.1、制备乳酸乳球菌NZ3900感受态；
G/L-SGM17培养基：GM17肉汤+0.5mol/L蔗糖+2.5％甘氨酸；
洗涤液I：蔗糖0.5mol/L+甘油10％；
洗涤液II：蔗糖0.5mol/L+甘油10％+EDTA 50mmol/L；
A、将乳酸乳球菌NZ 3900单菌落培养至G/L-SGM17中，30℃，150rpm过夜培养；
B、次日取适量菌液接种到新鲜的G/L-SGM17中，以OD600值为0.3时的菌液制备感受态；
C、利用小批量方法制备感受态细胞(冰上操作)，具体流程如下：
①先将菌液用2mL离心管在6000g，4℃条件下离心10min；
②用1mL洗涤液I重悬细胞，相同条件离心10min；
③用1mL洗涤液II重悬细胞，冰浴15min，相同条件离心10min；
④再用1mL洗涤液I重悬细胞，相同条件离心10min；
⑤弃废液后，用40μL洗涤液I重悬细胞，立即用该感受态进行转化；
S2.2、热激转化；
A、实验组：在40μL感受态细胞中加入2.5μL重组体系；
B、对照组：在40μL感受态细胞中加入2.5μL空载体；
42℃金属浴90s，冰浴2min，加入1mL复苏培养基；转至1.5mL离心管中，30℃，150rpm进行复苏培养1.5h；
稀释10-4及2×10-4后取120μL涂布于GM17平板，30℃过夜培养；
S3、重组乳酸乳球菌的验证，具体包括以下步骤：
S3.1、阳性转化菌的筛选；
用枪头蘸取菌落，溶于20μL dd H2O中，100℃金属浴10min，以此作为模板；
转化菌进行菌落PCR扩增，所述PCR扩增引物为SEQ ID No:5(F:5'-caggatcacttgatgactacgat-3')和SEQ ID No:6(R:5'-gcaacacgtgctgtaatttg-3')；
所述PCR扩增的反应程序：94℃，5min；{98℃，10s；55℃，15s；68℃，1min；}30个循环；12℃，∞；
电泳初步确定阳性转化菌，将相应阳性转化菌的扩增产物测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符，即获得所需重组乳酸乳球菌；
S3.2、乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测；
A、菌落计数，结果：1麦氏比浊转化菌计数为2.51×108CFU/mL；已知5×106个细菌需用1mL酶活检测提取液，则1麦氏比浊菌液应稀释1/50，使达到约5×106个细菌；即取20μL1麦氏比浊菌液加980μL GM17液体培养基，得1mL转化菌液用于检测酶活；
B、样本处理：取1mL细菌培养液，离心收集细菌，加入1mL提取液，超声破碎细胞，后16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待则；
C、乙醇脱氢酶(ADH)活性检测；
①分光光度计波长340nm处蒸馏水调零；
②空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、40μL试剂二、760μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2，△A空白管＝A1-A2；
③测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL样品上清液、40μL试剂二、760μL试剂一和100μL试剂三，记15s和75s吸光值分别为A3和A4；△A测定管＝A3-A4；△A＝△A测定管﹣△A空白管；
ADH活性计算(按细菌数量)：
定义：25℃中每106个细菌每分钟氧化1nmol NADH为1个酶活单位；
ADH(U/106cell)＝(△A÷∈÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T；
＝1.61×△A÷细菌数量；
其中，∈为NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为比色皿光径,取1cm；细菌数量以106计；
D、乙醛脱氢酶(ALDH)活性检测；
①分光光度计波长340nm处蒸馏水调零；
②工作液按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四＝300μL:100μL:20μL:30μL配制；现用现配，后37℃预热10min；
③在1mL石英比色皿中依次加入200μL蒸馏水、450μL工作液、350μL试剂五，充分混匀，此为空白管；
在1mL石英比色皿中依次加入200μL样品上清液、450μL工作液、350μL试剂五，充分混匀，此为测定管；
④于340nm处测定1min时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴30min，测定31min时吸光值A2，计算△A测定＝△A测定﹣△A测定，△A空白＝△A空白﹣△A空白，△A＝△A测定﹣△A空白；
ALDH酶活计算(按细菌数量)：
定义：每106个细菌每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位；
ALDH(U/106cell)＝(△A÷∈÷d×V反总×109)÷(细菌数量×V样÷V样总)÷T；
＝26.795×△A÷细菌数量
其中，∈为NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为比色皿光径，取1cm；细菌数量以106计；
经乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测，检测结果显示：本发明中所述重组乳酸乳球菌能够产生解酒酶(乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶)，且产生的解酒酶活性高；
S4、重组乳酸乳球菌的培养，具体包括以下步骤：
取适量验证正确的重组乳酸乳球菌接种于10mL GM17液体培养基，30℃，150rpm过夜培养；
将上述10mL菌液转接于500mL GM17液体培养基，30℃，150rpm过夜培养；
发酵冻干，浓缩为可商品化的重组乳酸乳球菌压片，饮酒后摄入能辅助产生解酒酶，有效降低酒精浓度。
实施例2：
在上述实施例的基础上，本发明实施例还提供了一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌，根据所述的制备方法所制备得到。
该实施例中的方案可以与其他实施例中的方案进行选择性的组合使用。
实施例3：
本发明实施例还提供了一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌在人体摄入酒精后产生解酒酶，降低人体内酒精浓度的应用。
该实施例中的方案可以与其他实施例中的方案进行选择性的组合使用。
实施例4：
本发明实施例还提供了其中一种替代技术方案：
在不改变获得插入基因GAP-hADH1B正确核苷酸序列的前提下，对引物设计和PCR扩增反应程序的改进和优化；
利用连接酶连接插入基因与线性化载体，从而获得重组载体；
利用电转化技术将重组载体导入乳酸乳球菌NZ3900感受态中；
以其他原核生物为媒介，先将重组载体转入其他原核生物，后诱导表达。
该实施例中的方案可以与其他实施例中的方案进行选择性的组合使用。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构、等效流程或等效功能变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明专利的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，其制备步骤具体如下：
S1、构建含有目的基因的重组载体，具体包括以下步骤：
S1.1、获得插入基因GAP-hADH1B；
将启动子与目的基因的核苷酸序列组合，人工合成GAP-hADH1B核苷酸序列，所述人工合成的GAP-hADH1B核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；
S1.2、获得线性化载体；
A、先进行BstYI酶和XbaI酶双酶切；
B、再进行切胶回收纯化；
S1.3、连接插入基因与线性化载体，得重组载体；
S2、重组载体导入至乳酸乳球菌NZ3900，具体包括以下步骤：
S2.1、制备乳酸乳球菌NZ3900感受态；
S2.2、热激转化；
S3、重组乳酸乳球菌的验证，具体包括以下步骤：
S3.1、阳性转化菌的筛选；
S3.2、乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测；
S4、重组乳酸乳球菌的培养，具体包括以下步骤：
取适量验证正确的重组乳酸乳球菌接种于10mL GM17液体培养基，30℃，150rpm过夜培养；
将上述10mL菌液转接于500mL GM17液体培养基，30℃，150rpm过夜培养；
发酵冻干，浓缩为可商品化的重组乳酸乳球菌压片，饮酒后摄入能辅助产生解酒酶，有效降低酒精浓度。
2.根据权利要求1所述的一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：所述步骤S1.2中BstYI酶和XbaI酶双酶切流程中，先提取pNZ8149质粒，后进行BstYI酶和XbaI酶双酶切，具体流程如下：
①以DNA含量≤1μg计算DNA所需加入体积，反应体系总体积为30μL，加入3μL的10×Buffer Tango和XbaI酶1μL，其余组分用dd H2O补足；轻轻混匀后瞬时离心；37℃酶切过夜；
②加100μL Buffer DC纯化，加30μL dd H2O洗脱；后加入14μL的dd H2O，5μL的10×rCutSmart Buffer和1μL的BstYI酶，构成总体积为50μL的酶切体系，轻轻混匀后瞬时离心；60℃酶切3小时。
3.根据权利要求1所述的一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，所述步骤S1.2中切胶回收纯化具体流程：
配制1％的琼脂糖凝胶电泳，120V电压下电泳30min，在2322bp处切胶回收，所得线性化载体的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
4.根据权利要求1所述的一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，所述步骤S1.3中得到重组载体具体流程：
计算得线性化载体最适用量为50ng，插入基因最适用量为60ng，利用无缝克隆技术进行连接重组；
50℃金属浴20min，瞬时离心后插入冰中冷却，至此完成插入基因与线性化载体的连接，得重组载体，可直接转化或保存于-20℃冰箱。
5.根据权利要求1所述的一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，所述步骤S2.1中制备乳酸乳球菌NZ3900感受态具体流程：
G/L-SGM17培养基：GM17肉汤+0.5mol/L蔗糖+2.5％甘氨酸；
洗涤液I：蔗糖0.5mol/L+甘油10％；
洗涤液II：蔗糖0.5mol/L+甘油10％+EDTA 50mmol/L；
A、将乳酸乳球菌NZ 3900单菌落培养至G/L-SGM17中，30℃，150rpm过夜培养；
B、次日取适量菌液接种到新鲜的G/L-SGM17中，以OD600值为0.3时的菌液制备感受态；
C、利用小批量方法制备感受态细胞，具体流程如下：
①先将菌液用2mL离心管在6000g，4℃条件下离心10min；
②用1mL洗涤液I重悬细胞，相同条件离心10min；
③用1mL洗涤液II重悬细胞，冰浴15min，相同条件离心10min；
④再用1mL洗涤液I重悬细胞，相同条件离心10min；
⑤弃废液后，用40μL洗涤液I重悬细胞，立即用该感受态进行转化。
6.根据权利要求1所述的一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，所述步骤S2.2中热激转化的具体流程：
A、实验组：在40μL感受态细胞中加入2.5μL重组体系；
B、对照组：在40μL感受态细胞中加入2.5μL空载体；
42℃金属浴90s，冰浴2min，加入1mL复苏培养基；转至1.5mL离心管中，30℃，150rpm进行复苏培养1.5h；
稀释10-4及2×10-4后取120μL涂布于GM17平板，30℃过夜培养。
7.根据权利要求1所述的一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，所述步骤S3.1中阳性转化菌的筛选具体流程：
用枪头蘸取菌落，溶于20μL dd H2O中，100℃金属浴10min，以此作为模板；
转化菌进行菌落PCR扩增，所述PCR扩增引物为SEQ ID No:5(F:5'-caggatcacttgatgactacgat-3')和SEQ ID No:6(R:5'-gcaacacgtgctgtaatttg-3')；
所述PCR扩增的反应程序：94℃，5min；{98℃，10s；55℃，15s；68℃，1min；}30个循环；12℃，∞；
电泳初步确定阳性转化菌，将相应阳性转化菌的扩增产物测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符，即获得所需重组乳酸乳球菌。
8.根据权利要求1所述的一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，所述步骤S3.3中乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测具体流程：
A、菌落计数，结果：1麦氏比浊转化菌计数为2.51×108CFU/mL；已知5×106个细菌需用1mL酶活检测提取液，则1麦氏比浊菌液应稀释1/50，使达到约5×106个细菌；即取20μL 1麦氏比浊菌液加980μL GM17液体培养基，得1mL转化菌液用于检测酶活；
B、样本处理：取1mL细菌培养液，离心收集细菌，加入1mL提取液，超声破碎细胞，后16000g，4℃离心20min，取上清液置冰上待则；
C、乙醇脱氢酶活性检测；
①分光光度计波长340nm处蒸馏水调零；
②空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、40μL试剂二、760μL试剂一和100μL试剂三，迅速混匀后于340nm测定吸光值变化，分别记录15s和75s时吸光值，分别记为A1和A2，△A空白管＝A1-A2；
③测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL样品上清液、40μL试剂二、760μL试剂一和100μL试剂三，记15s和75s吸光值分别为A3和A4；△A测定管＝A3-A4；△A＝△A测定管﹣△A空白管；
ADH活性计算：
定义：25℃中每106个细菌每分钟氧化1nmol NADH为1个酶活单位；
ADH(U/106cell)＝(△A÷∈÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T；
＝1.61×△A÷细菌数量
其中，∈为NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为比色皿光径,取1cm；细菌数量以106计；
D、乙醛脱氢酶活性检测；
①分光光度计波长340nm处蒸馏水调零；
②工作液按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四＝300μL:100μL:20μL:30μL配制；现用现配，后37℃预热10min；
③在1mL石英比色皿中依次加入200μL蒸馏水、450μL工作液、350μL试剂五，充分混匀，此为空白管；
在1mL石英比色皿中依次加入200μL样品上清液、450μL工作液、350μL试剂五，充分混匀，此为测定管；
④于340nm处测定1min时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴30min，测定31min时吸光值A2，计算△A测定＝△A测定﹣△A测定，△A空白＝△A空白﹣△A空白，△A＝△A测定﹣△A空白；
ALDH酶活计算：
定义：每106个细菌每分钟生成1nmol的NADH定义为1个酶活单位；
ALDH(U/106cell)＝(△A÷∈÷d×V反总×109)÷(细菌数量×V样÷V样总)÷T；
＝26.795×△A÷细菌数量；
其中，∈为NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d为比色皿光径，取1cm；细菌数量以106计；
经乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶酶活检测，检测结果显示：本发明中所述重组乳酸乳球菌能够产生解酒酶，且产生的解酒酶活性高。
9.一种可分解酒精的重组乳酸乳球菌，根据权利要求1-8任一项所述的制备方法所制备得到。
10.一种根据权利要求9所述的可分解酒精的重组乳酸乳球菌在人体摄入酒精后产生解酒酶，降低人体内酒精浓度的应用。
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