CN117625653A - L-山梨糖脱氢酶的基因及其应用 - Google Patents

L-山梨糖脱氢酶的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体的说一种L‑山梨糖脱氢酶的基因及其应用。1)其核苷酸序列为SEQ ID NO.1～8所示核苷酸序列；或，2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基缺失、取代、插入或突变而成且具有L‑山梨糖脱氢酶活性的核苷酸序列。本发明所得编码L‑山梨糖脱氢酶基因可以用来构建高产2‑KGA的工程菌，并且构建有效的重组大肠杆菌全细胞催化L‑山梨糖合成2‑酮基‑L‑古龙酸的转化体系，简化维生素C的生产工艺。

Description

L-山梨糖脱氢酶的基因及其应用
技术领域
本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体的说一种L-山梨糖脱氢酶的基因及其应用。
背景技术
维生素C，又称抗坏血酸，在生物体内具有清除活性氧、促进胶原蛋白生成、产生细胞信号和激活转录因子等多种功能，保护机体免受氧化剂的威胁，是一种广泛存在于动物、植物及一些单细胞生物体内的抗氧化剂，参与体内多种氧化还原反应。我国维生素C生产使用的是“二步发酵法”，利用三株不同的菌株即氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)及普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)进行两步发酵反应，将D-山梨醇转化为维生素C的前体物质2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。研究表明，维生素C第一步发酵中氧化葡糖杆菌的山梨醇脱氢酶(SLDH)将D-山梨醇转化为L-山梨糖。维生素C第二步发酵中，普通生酮基古龙酸菌中的L-山梨糖脱氢酶(SDH)和L-山梨酮脱氢酶(SNDH)是催化L-山梨糖转化为2-KGA的关键酶，SDH可以将L-山梨糖转化成L-山梨酮，然后在SNDH的作用下转化为2-KGA，或者直接将L-山梨糖转化为2-KGA。
然而，2-KGA的工业化生产虽然有非常经典的两步发酵法，但仍存在混菌发酵工艺复杂(涉及到三个菌株两步发酵，操作繁琐，发酵周期长，易发生染菌)；芽孢杆菌(大菌)的伴生机制不明，大菌和普通生酮基古龙酸菌(小菌)之间的调控机理及其之间的信号分子了解甚少，这增加了混菌发酵互生关系研究的难度，限制了发酵工艺的改良与优化。基于巨大芽孢杆菌和酮古龙酸菌之间的相互过程，许多研究人员尝试了各种方法来改进混合培养发酵过程。例如，优化发酵工艺，添加叶酸、L-半胱氨酸、铁载体等辅助因子。但是，它并没有摆脱混合发酵的弊端。众所周知，生物催化在可持续工业化学中起着关键作用。全细胞转化相比生物发酵法具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；将生物生长阶段与生产阶段分开，更有利于催化剂的使用；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。因此采用重组大肠杆菌全细胞作为生物催化剂可以避免复杂的混菌发酵工艺，操作简单，并且与酶法合成方法相比可以避免细胞裂解以及纯化步骤，从而大大降低生产成本。因此，挖掘合适的酶，将L-山梨糖高效特异性地转化为2-KGA，对于维生素C的工业化生产至关重要。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化2-酮基-L-古龙酸生产。
因此，提供一种有效的重组大肠杆菌全细胞催化L-山梨糖合成2-酮基-L-古龙酸的转化体系，对工业上制备维生素C有重要的应用价值。
发明内容：
本发明目的在于提供一种L-山梨糖脱氢酶的基因及其应用。为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种L-山梨糖脱氢酶的基因：
1)其核苷酸序列为SEQ ID NO.1～8所示核苷酸序列；或，
2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基缺失、取代、插入或突变而成且具有L-山梨糖脱氢酶活性的核苷酸序列。
上述SEQ ID NO.1～8任意一个所示基因所编码的蛋白。
一种表达载体或克隆载体，含所述SEQ ID NO.1～8任意一个所示核苷酸序列的表达载体或克隆载体。
一种基因工程菌，含所述的表达载体或克隆载体。
所述基因工程菌的构建方法为：
1)根据对已保藏K.vulgare SPU B805以及K.robustum SPU_B003的全基因组测序结果中注释的L-山梨糖脱氢酶序列设计引物克隆sdh；
2)将上述获得各sdh分别与pET28a(+)质粒连接得到重组表达载体；
3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后得到重组菌株。
一种L-山梨糖脱氢酶的基因的应用，所述含SEQ ID NO.1～8任意一个核苷酸序列构建获得基因工程菌，基因工程菌在生产2-酮基-L-古龙酸的应用。
将含权利要求1所示任意一个核苷酸序列的基因工程菌添加至含有底物L-山梨糖的反应体系中避光下进行反应，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
一种生产2-酮基-L-古龙酸的方法，将含SEQ ID NO.1～8所示任意一个核苷酸序列的基因工程菌添加至含有底物L-山梨糖的反应体系中避光下进行反应，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
所述反应体系为ris-HCl缓冲液中添加吡咯喹啉醌(4,5-二氢-4,5二氧-1-氢吡咯并(2,3-f)喹啉-2，7，9-三羧酸)、5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氯化钙和L-山梨糖；其中，反应体系内吡咯喹啉醌终浓度为0.1～0.8mM、PMS终浓度为10～40mM、氯化钙终浓度为0.5～4.5mM、L-山梨糖终浓度为10～30g/L。
所述Tris-HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷终浓度为40～100mM，所述缓冲液起始pH值为6.0～9.0。
所述含SEQ ID NO.1～8所示任意一个核苷酸序列的基因工程菌的添加至反应体系内，使得体系内的菌体OD600为10～30。
所述反应在20℃～40℃，初始pH6.0～9.0下避光进行。
所述含SEQ ID NO.1～8所示任意一个核苷酸序列的基因工程菌是将工程菌在培养基内培养获得的菌体或离心获得的菌体细胞。
本发明所具有的优点：
本发明利用K.robustum SPU_B003菌株为对象获得sdh1～sdh3的编码L-山梨糖脱氢酶基因以及K.vulgare SPU B805菌株为对象获得sdh4～sdh8的编码L-山梨糖脱氢酶基因；利用上述L-山梨糖脱氢酶基因可以用来构建高产2-KGA的工程菌，并且构建有效的重组大肠杆菌全细胞催化L-山梨糖合成2-酮基-L-古龙酸的转化体系，简化维生素C的生产工艺。
附图说明：
图1为本发明实施例1提的L-山梨糖脱氢酶基因克隆电泳图，其中图中M1：Trans2KPlusⅡDNA Marker，M2：DL 2000plus DNA marker，1-8：L-山梨糖脱氢酶基因(sdh1～sdh8)。
图2为本发明实施例1提的重组质粒电泳图，其中图中M1：Supercoiled DNALadder Marker，1-8：重组质粒(pET28a-sdh1～pET28a-sdh8)。
图3为本发明实施例2提的对重组菌株E.coli BL21(DE3)诱导表达后粗酶液纯化后的SDS-PAGE蛋白电泳图。
图4为本发明实施例5提的L-山梨糖脱氢酶最适反应温度结果图，其中a-h：SDH1～SDH8分别在不同温度下的相对酶活性。
图5为本发明实施例5提的L-山梨糖脱氢酶最适反应pH结果图，其中a-h：SDH1～SDH8分别在不同pH下的相对酶活性。
图6为本发明实施例6提的L-山梨糖合成2-酮基-L-古龙酸途径示意图。
具体实施方式：
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1重组菌株的构建
以保藏的菌株K.vulgare SPU B805(菌株805accession number:CP017622)和K.robustum SPU_B003(菌株003accession number:CP019937)的全基因组测序结果中注释的L-山梨糖脱氢酶序列进行扩增。
扩增体系和条件分别为：
PCR反应体系(50μl)
PCR反应条件:94℃变性5min，之后(94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min)30个循环，72℃延伸10min。
获得不同扩增产物对象的引物分别为
上游引物1(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGGATGTGACCCCCGTCACCGAC(SEQ IDNO.9)
下游引物1(含Hind III酶切位点):CCCAAGCTTTTGCTGGGGCAGAGCGAAAAC(SEQ IDNO.10)
上述引物对应于酮古龙酸菌(Ketogulonigenium robustum)SPU_B003菌株
扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.1所示的引物。
上游引物2(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGGATGTGACGCCCGTCACCGAC(SEQ IDNO.11)
下游引物2(含Hind III酶切位点):CCCAAGCTTTTGCGGAAGGGCGAAGACGTA(SEQ IDNO.12)
上述引物对应于酮古龙酸菌(Ketogulonigenium robustum)SPU_B003菌株
扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.2所示的引物。
上游引物3(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGCAGGTCACCCCCATCACCGAT(SEQ IDNO.13)
下游引物3(含Bam HI酶切位点):CGCGGATCCGCCTGCTGCGGCAGCGCAAA(SEQ IDNO.14)
上述引物对应于酮古龙酸菌(Ketogulonigenium robustum)SPU_B003菌株
扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.3所示的引物。
上游引物4(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGCAAGTGACCCCCGTCACC(SEQ IDNO.15)
下游引物4(含Hind III酶切位点):CCCAAGCTTTTGCTGGGGCAGCGC(SEQ ID NO.16)
上述引物对应于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)SPU B805菌株扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.4所示的引物。
上游引物5(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGCAAACCGCCATCACCGATGA A(SEQ IDNO.17)
下游引物5(含Hind III酶切位点):CCCAAGCTTTTGCGGCAGGGCGAAGAC(SEQ IDNO.18)
上述引物对应于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)SPU B805菌株扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.5所示的引物。
上游引物6(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGCAGGTAACCCCGATTACCGAT(SEQ IDNO.19)
下游引物6(含Hind III酶切位点):CCCAAGCTTCGGCAGTGCAAAGACATAGAT(SEQ IDNO.20)
上述引物对应于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)SPU B805菌株扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.6所示的引物。
上游引物7(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGCAAACCGCCATCACCGATGAA(SEQ IDNO.21)
下游引物7(含Hind III酶切位点):CCCAAGCTTCTGCGGCAGAGCAAAGAC(SEQ IDNO.22)
上述引物对应于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)SPU B805菌株扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.7所示的引物。
上游引物8(含Nde I酶切位点):GGAATTCCATATGCAAATGACGCCGATTACCGAC(SEQ IDNO.23)
下游引物8(含Hind III酶切位点):CCCAAGCTTTTCGGGAAGGGCAAAGACCCASEQ IDNO.24)
上述引物对应普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)SPU B805菌株扩增获得L-山梨糖脱氢酶序列SEQ ID NO.8所示的引物。
对上述扩增后产物(参见图1)分别经NdeI及HindIII或BamHI双酶切回收sdh基因片段连接到同样经NdeI及HindIII或BamHI双酶切的pET28a载体上，构建表达载体pET28a-sdh1～pET28a-sdh8，将构建好的表达载体分别转化至E.coli BL21(DE3)感受态，经过抗生素筛选转化子并对转化子进行菌落PCR验证(参见图2)，挑取阳性转化子培养后提取质粒并测序。
所述普通生酮基古龙酸菌(K.vulgare)SPU B805保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2016年8月17日，保藏编号为CGMCC No.12858。
所述酮古龙酸菌(K.robustum)SPU_B003保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年7月3日，保藏编号为CGMCC No.7876。
实施例2L-山梨糖脱氢酶的表达及纯化
将上述实施例1获得重组菌株分别在LB培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)中于37℃培养过夜作为种子培养物。然后将1wt％的种子培养物在含有100μg/mL卡那霉素的LB培养基中于37℃培养。
待上述细胞培养至OD600为0.5，然后加入0.1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，25℃诱导14h。通过在8000rpm和4℃下离心20分钟来收获含有不同SDH的细胞。
为了纯化SDH，将细胞沉淀重悬于50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，调整至每毫升100mg细菌重量，然后通过超声裂解，超声破碎条件如下：超声3秒，停止6秒，净超声时间5分钟。在4℃条件下以8500rpm离心10min得到粗酶。
将制备得到的粗酶液分别加载到含有3ml Ni-NTA琼脂糖(GE)的柱上。用15倍柱体积的裂解缓冲液(50mM NaH2PO4、pH 7.5、300mM NaCl和10mM咪唑)洗涤柱子，然后用20柱洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4、pH 7.5、300mM NaCl和20-50mM咪唑)洗脱,最后用10柱体积的洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4,pH 7.5,300mM NaCl和250mM咪唑)洗脱。在每个步骤中，使用考马斯亮蓝色试剂检测蛋白质流出量。收集的部分通过透析(200mM NaCl、20mM Tris和10％甘油)脱盐，即获得各纯化后SDH。八个SDH的条带均在65kDa左右，与相应的理论分子量相似。(图3)
实施例3 L山梨糖脱氢酶酶活性测定
分析酶活性的基本反应液有以下组成：50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)、0.5mM 2,6-二氯吲哚酚钠盐(DCIP)、0.5mM 5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)、0.2mM吡咯喹啉醌(PQQ)、0.5mM CaCl2。
DCIP标准曲线的绘制：分别配制不同浓度DCIP溶液，于600nm处比色，以DCIP浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标作图，即为标准曲线。由DCIP溶液的标准曲线得出线性回归方程为y＝7.1603x+0.1041，x代表DCIP浓度，对应的y值为600nm处吸光值。
将基本反应液加入96孔透明板中，取上述获得纯酶液(20μl)与基本反应液(180μl)混匀后立即用酶标仪(Infinite M200 ProTecan)在30℃下检测600nm处的吸光度变化。
一个酶活性单位定义为在30℃下每分钟氧化1μmol底物的酶量，对应于每分钟减少1μmol DCIP。
结果显示：SDH1比酶活为1.70U/mg；SDH2比酶活为2.90U/mg；SDH3比酶活为5.25U/mg；SDH4比酶活为0.41U/mg；SDH5比酶活为1.03U/mg；SDH6比酶活为2.06U/mg；SDH7比酶活为56.72U/mg；SDH8比酶活为0.89U/mg。
实施例4 L-山梨糖脱氢酶的米氏常数Km值的测定
分别用水配置浓度为0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、85mM、100mM的上述纯化后的L-山梨糖脱氢酶溶液，按上述酶活测定检测方法，分别在各个L-山梨糖脱氢酶的浓度下检测反应液的OD600实时变化值，采用双倒数作图法计算Km值。
结果显示：sdh1的Km值为19.52mM；sdh2的Km值为40.04mM；sdh3的Km值为3.17mM；sdh4的Km值为4.92mM；sdh5的Km值为4.72mM；sdh6的Km值为2.15mM；sdh7的Km值为13.39mM；sdh8的Km值为26.57mM；
实施例5：L-山梨糖脱氢酶最适反应温度、最适反应pH测定
最适反应温度测定：按上述酶活测定检测方法，在Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中，加入20μl上述获得纯酶液，测定脱氢酶在不同温度下(20℃-42.5℃，间隔2.5℃)的酶活力，取酶活最高温度条件为酶催化最适反应温度(图4)。
最适反应pH值测定：按上述酶活测定检测方法，在各酶的最适反应温度条件下，加入20μl上述获得纯酶液，测定在不同pH值缓冲液(50mM HAc-NaAc(pH 5.0–6.0)、50mMK2HPO4-KH2PO4(pH 6.0–7.5)、50mM Tris-HCl(pH 7.5–9.0)和50mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0–10.0))，条件下脱氢酶的酶活力。取酶活最高pH值条件为酶催化最适反应pH值(图5)。
由上述结果显示：sdh1的最适反应温度为30℃、最适反应pH为8.0；sdh2的最适反应温度为30℃、最适反应pH为8.5；sdh3的最适反应温度为32.5℃、最适反应pH为9.0；sdh4的最适反应温度为32.5℃、最适反应pH为7.5；sdh5的最适反应温度为30℃、最适反应pH为9.0；sdh6的最适反应温度为32.5℃、最适反应pH为9.0；sdh7的最适反应温度为30℃、最适反应pH为8.0；sdh8的最适反应温度为32.5℃、最适反应pH为8.0。
实施例6：E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh1～sdh8全细胞催化合成2-酮基-L-古龙酸，具体步骤如下(合成过程如图6所示)
(1)制备全细胞催化剂：将实施例1中制备得到的重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh1～sdh8接种LB液体培养基(LB液体培养基中添加卡那霉素50mg/mL),在37℃，220r/min进行培养，当培养至OD600达到0.6，加入0.4mM IPTG诱导表达。在16℃诱导14h后，8000r/min低温离心10min，收集菌体，用100mM PB(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体，获得全细胞催化剂。
(2)制备2-酮基-L-古龙酸:向含有50mM Tr is-HCl缓冲液(pH 8.0)中添加终浓度为0.5mM吡咯喹啉醌、20mM 5-甲基吩嗪硫酸甲酯、0.5mM氯化钙、30g/L山梨糖和0D600为10的步骤(1)制备得到的全细胞催化剂，得到反应体系；将反应体系在30℃，150r/min避光反应条件下转化4h。
结果显示：重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh1全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为16.48g/L，转化率为54.93％，时空转化率为4.12g/L/h；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh2全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为14.27g/L，转化率为47.57％，时空转化率为3.57g/L/h；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh3全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为12.79g/L，转化率为42.63％，时空转化率为3.20g/L/h；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh4全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为11.98g/L，转化率为39.93％，时空转化率为3.00g/L/h；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh5全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为15.74g/L，转化率为52.47％，时空转化率为3.94g/L/h；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh6全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为16.48g/L，转化率为54.93％，时空转化率为4.12g/L/h；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh7全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为16.48g/L，转化率为54.93％，时空转化率为4.12g/L/h；重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-sdh8全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的产量为11.07g/L，转化率为36.9％，时空转化率为2.77g/L/h。
综上，2-KGA的时空转化率范围为2.77g/L/h至4.12g/L/h，八株重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-sdh全细胞转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的时空转化率均高于已报道的传统两步发酵法(2.24g/L/h)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.2
SEQ ID NO.3
SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.5
SEQ ID NO.6
SEQ ID NO.7
SEQ ID NO.8

Claims (10)

1.一种L-山梨糖脱氢酶的基因，其特征在于：
1)其核苷酸序列为SEQ ID NO.1～8所示核苷酸序列；或，
2)在1)限定的核苷酸序列基础上经碱基缺失、取代、插入或突变而成且具有L-山梨糖脱氢酶活性的核苷酸序列。
2.一种权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于：权利要求1所述基因所编码的蛋白。
3.一种表达载体或克隆载体，其特征在于：含权利要求1所述SEQ ID NO.1～8任意一个所示核苷酸序列的表达载体或克隆载体。
4.一种基因工程菌，其特征在于：含权利要求3所述的表达载体或克隆载体。
5.一种权利要求1所述L-山梨糖脱氢酶的基因的应用，其特征在于：所述含权利要求1所示任意一个核苷酸序列构建获得基因工程菌，基因工程菌在生产2-酮基-L-古龙酸的应用。
6.按权利要求5所述的L-山梨糖脱氢酶的基因的应用，其特征在于：将含权利要求1所示任意一个核苷酸序列的基因工程菌添加至含有底物L-山梨糖的反应体系中避光下进行反应，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
7.一种生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，将含权利要求1所示任意一个核苷酸序列的基因工程菌添加至含有底物L-山梨糖的反应体系中避光下进行反应，制备得到2-酮基-L-古龙酸。
8.按权利要求7所述的生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，所述反应体系为ris-HCl缓冲液中添加吡咯喹啉醌(4,5-二氢-4,5二氧-1-氢吡咯并(2,3-f)喹啉-2，7，9-三羧酸)、5-甲基吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氯化钙和L-山梨糖；其中，反应体系内吡咯喹啉醌终浓度为0.1～0.8mM、PMS终浓度为10～40mM、氯化钙终浓度为0.5～4.5mM、L-山梨糖终浓度为10～30g/L。
9.按权利要求8所述的生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中三羟甲基氨基甲烷终浓度为40～100mM，所述缓冲液起始pH值为6.0～9.0。
10.按权利要求7-9任意一项所述的生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，所述含权利要求1所示任意一个核苷酸序列的基因工程菌的添加至反应体系内，使得体系内的菌体OD600为10～30。
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