KR100436077B1

KR100436077B1 - 글루타치온-에스-트랜스퍼라제와 융합된 알코올디하이드로게나제의 생산방법

Info

Publication number: KR100436077B1
Application number: KR10-2001-0071480A
Authority: KR
Inventors: 공광훈
Original assignee: 공광훈
Priority date: 2001-11-16
Filing date: 2001-11-16
Publication date: 2004-06-16
Also published as: KR20030040888A

Abstract

본 발명은 글루타치온-에스-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase)와 융합된 알코올 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase)의 생산방법에 관한 것으로서, 구체적으로 바실러스 스테아로써모필러스로부터 분리한 ADH 유전자를 GST 유전자에 연결시킨 재조합 발현벡터를 제조한 후, 이를 이용하여 숙주세포를 형질전환시켜 재조합 GST-ADH 단백질을 생산하는 방법 및 상기 방법으로 생산된 재조합 GST-ADH 단백질을 제공한다. 본 발명의 생산방법에 따른 재조합 GST-ADH 단백질은 열, pH, 화학적 변성제 등 각종 조건에서 안정성이 우수하기 때문에, 음주운전의 규제, 의료분야, 공업 및 식품제조 공정 등에서 요구되는 알코올 측정을 위한 바이오센서 제조, 각종 알코올류의 생공업적 생산 및 이를 필요로 하는 단백질 공학 연구분야 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

글루타치온-에스-트랜스퍼라제와 융합된 알코올 디하이드로게나제의 생산방법{Method for producing alcohol dehydrogenase fused into glutathione- S-transferase}

본 발명은 글루타치온-에스-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase; 이하 'GST'라 한다)와 융합된 알코올 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase; 이하 'ADH'라 한다)의 생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 바실러스 스테아로써모필러스로부터 분리한 ADH 유전자를 GST 유전자에 연결시킨 재조합 발현벡터를 제조한 후, 이를 이용하여 숙주세포를 형질전환시켜 재조합 GST-ADH 단백질을 생산하는 방법 및 상기 방법으로 생산된 재조합 GST-ADH 단백질에 관한 것이다.

ADH는 많은 유기체에서 생체 내 알코올 대사체계에 중요한 효소로서 하기와 같이 가역적으로 알코올을 알데히드로 산화시키는 반응을 촉매한다.

RCH₂OH + NAD⁺↔ RCHO + NADH + H⁺

상기 ADH는 조효소로서 NAD⁺(H) 또는 NADP(H)를 이용하며, 박테리아, 효모, 식물, 척추동물 및 사람에 이르기까지 거의 모든 생물종에 분포되어 있다. 대부분의 ADH는 활성 부위에 아연 이온을 함유하고 있는 금속단백질(metalloprotein)이나, 아연 대신 철 이온을 함유한 ADH 및 금속 이온을 함유하지 않은 ADH도 보고된 바 있다. 일반적으로 아연을 함유하는 ADH는 이량체 또는 사량체의 구조를 이루고 있으며, 고등 식물 및 포유류에서 발견되는 ADH는 이량체 구조를, 박테리아 및 효모에서 발견되는 ADH는 사량체 구조를 이루고 있는 것으로 보고되었다.

한편, ADH는 음주 운전의 규제, 의료분야, 공업공정 및 식품제조공정 등에서 요구되는 알코올 측정을 위한 바이오센서에 이용되고 있으며, 또한 키랄 알코올을 비롯한 각종 알코올류의 생공업적 생산 등에 이용되고 있다. 알코올 측정을 위한 바이오센서에 ADH를 이용함에 있어서, 국외의 많은 연구그룹에서 알코올 산화효소 고정화 막과 과산화수소 또는 산소전극을 조합한 센서를 연구 또는 개발한 바 있으나, 이는 효소자체가 안정하지 못해 쉽게 불활성화되는 문제점이 있다. ADH를 지지체에 고정하면 어느 정도 안정성이 증가하는 경우도 있으나, 일반적으로 고정화에 의한 효소의 구조변화로 인하여 그 활성 및 특성이 크게 변화하기 때문에 이 또한 문제점이 있다. 따라서, 최적의 알코올 바이오센서를 개발하기 위해서는 열,유기용매, 계면활성제 등 각종 조건에서 안정한 ADH가 절실히 요구된다.

이에 본 발명자들은 안정성이 우수한 ADH를 생산하기 위한 연구를 계속하던 중, 바실러스 스테아로써모필러스로부터 유래한 ADH를 단독으로 발현시켰을 때 보다 GST와 융합단백질로 발현시켰을 때 안정성이 더욱 우수하다는 것을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 안정성이 우수한 ADH를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 안정성이 우수한 ADH를 제공하는 것이다.

도 1은 pGEX-KG 플라스미드에 ADH 유전자를 삽입하여 pKG-ADH를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2는 PCR에 의해 증폭된 ADH 유전자 단편을 확인하기 위해 전기영동 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

M: 분자량 마커

레인 1 및 2: 증폭된 ADH 유전자

도 3은 pGEX-KG 플라스미드에 삽입된 ADH 유전자를 확인하기 위해 제한 효소 처리하여 전기영동을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.

M: 분자량 마커

레인 1: ADH 유전자(1,041bp)

레인 2: ADH가 삽입되지 않은 pGEX-KG(5,000bp)

레인 3:EcoRⅠ과HindⅢ로 가수분해된 pKG-ADH

도 4는 조추출물로부터 분리 및 정제된 재조합 GST-ADH 단백질을 SDS-PAGE를수행하여 확인한 겔 사진이다.

M: 표준 분자량 마커(Bio-Rad)

레인 1: pKG-ADH를 함유하는 대장균 조추출물

레인 2 및 3: 글루타치온 아가로스 친화 칼럼으로 정제된 재조합 GST-ADH 단백질

도 5는 pH의 변화에 따른 재조합 GST-ADH 단백질 활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

-●-: 아세트산 나트륨 완충용액(pH 4.0 ~ 6.0)

-□-: 인산 칼륨 완충용액(pH 6.0 ~ 8.0)

-■-: 인산 나트륨 완충용액(pH 6.0 ~ 8.0)

-△-: 글리신-수산화나트륨 완충용액(pH 8.0 ~ 10.0)

-▲-: 트리스-염산 완충용액(pH 8.0 ~ 10.0)

도 6은 온도 변화에 따른 재조합 GST-ADH 단백질 활성의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 7a는 소정의 온도에서 30분간 방치 후 잔존 활성을 측정하여 재조합 GST-ADH 단백질의 열에 대한 안정성을 조사한 것을 나타내는 그래프이다.

도 7b는 50℃(-●-), 60℃(-■-), 70℃(-▲-)의 온도에서 시간의 경과에 따른 잔존 활성을 측정하여 재조합 GST-ADH 단백질의 열에 대한 안정성을 조사한 것을 나타내는 그래프이다.

도 8은 재조합 GST-ADH 단백질의 변성시약에 대한 안정성을 조사한 것을 나타내는 그래프이다.

A: 0.2M 구아니딘-염산

B: 0.05% SDS

C: 1% 트리톤 X-100

D: 0.1M 우레아

도 9는 트롬빈을 처리하여 재조합 GST-ADH 단백질로부터 분리한 ADH를 SDS-PAGE를 수행하여 확인한 결과이다.

M : 표준 분자량 마커

레인 1 및 2: 트롬빈 처리 후 재조합 GST-ADH 단백질로부터 분리된 ADH.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

a) 바실러스 스테아로써모필러스의 ADH 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하여 PCR을 수행함으로써 ADH 유전자를 증폭시키는 단계;

b) 상기 증폭된 ADH 유전자를 GST 유전자에 연결시킨 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

c) 상기 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계;

d) 상기 형질전환된 숙주세포를 이용하여 융합단백질 GST-ADH를 발현시킨 후, 이를 수집 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 GST-ADH 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 재조합 GST-ADH 단백질을 제공한다.

나아가, 본 발명은 경우에 따라 선택적으로 상기 재조합 GST-ADH 단백질을 절단하여 ADH만을 수집 및 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

GST는 생체 내에서 다양한 유해독성 물질의 해독작용에 관여하는 효소로서, 지질, 빌리루빈(bilirubin), 헴, 스테로이드 및 담즙염류 등 여러 소수성 및 양친매성 물질의 운반에 관여한다. 또한, 각종 암세포 또는 약제내성세포 등에서 발견되고, 화학요법에서 표적분자 또는 종양마커(cancer marker) 분자로도 알려져 있으며, 진단 등에 이용되고 있다.

본 발명은 호열성 균주로부터 분리한 ADH 유전자를 상기 GST 유전자와 융합시켜 재조합 GST-ADH 단백질을 제공한다는 점에 특징이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 호열성 균주로는 ADH를 생산하는 호열성 균주라면 제한없이 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 바실러스 스테아로써모필러스 NCA 1503을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에서는 PCR(polymerase chain reaction: 중합효소 연쇄 반응)을 이용하여 상기 ADH 유전자를 증폭하기 위하여, 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하는 ADH 유전자 증폭용 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다. 상기 ADH 유전자 증폭용 올리고 뉴클레오티드 프라이머는 예를 들면, 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해, 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법, 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법 및 미국 특허 제 4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 적합한 방법으로 제조될 수 있다.

상기 증폭된 ADH 유전자로부터 발현된 ADH 단백질을 GST와 융합된 형태로 발현시키기 위해 사용될 수 있는 발현벡터로는 당업계에서 일반적으로 사용되는, GST 유전자를 함유하는 발현벡터라면 제한없이 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 pGEX-KG 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pGEX-KG 플라스미드는 GST를 발현시키는 유전자를 함유하고 있기 때문에, ADH가 상기 플라스미드 내로 삽입되면 형질전환된 균주에서 ADH는 GST와 융합 단백질의 형태로 발현된다. 따라서, 발현된 융합 단백질(재조합 GST-ADH 단백질)이 GST를 함유하고 있는 특성을 이용하여 상기 융합 단백질을 용이하게 분리 및 정제할 수 있다. 이 때 사용될 수 있는 분리 및 정제 방법으로는 상기 GST와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 이용한 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 글루타치온 친화 크로마토그래피(glutathione affinity column)을 이용하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 PCR을 수행하여 바실러스 스테아로써모필러스 NCA 1503로부터 ADH 유전자를 분리한 다음, pGEX-KG 플라스미드 내의 GST 유전자 하류에 바실러스 스테아로써모필러스로부터 상기 분리된 ADH 유전자를 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하고, 이를 pKG-ADH로 명명하였다. 이후, ADH 유전자가 삽입된 재조합 벡터 pKG-ADH를 숙주세포에 형질전환시켰다. 이 때 사용될 수 있는 숙주세포로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 대장균, 효모 등의 숙주세포를 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 증식이 빠르고, 취급이 용이한 대장균을 사용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에서는 대장균 BL21을 사용하였다. 상기 형질전환 방법은 당업계에서 알려진 모든 방법을 이용할 수 있으나, 본 발명에서는 염화 칼슘(CaCl₂)을 이용한 열충격(heat-shock) 방법을 이용하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 형질전환된 대장균 균주에서 발현된 융합 단백질(재조합 GST-ADH 단백질)을 분리 및 정제하였다. 상기 정제된 재조합 GST-ADH 단백질의 수율은 47%이었으며, 비활성은 36.87 U.㎎이었다. 상기 정제된 재조합 GST-ADH 단백질은 그 자체로 이용될 수 있고, 경우에 따라 선택적으로 GST를 절단하여 ADH만을 이용할 수도 있다. 이 때 GST의 절단은 단백질을 분해하는 여러 효소들을 이용할 수 있으나, 구체적으로 본 발명에서는 트롬빈을 사용하여 ADH를 분리 및 정제하였다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 방법으로 생산된 재조합 GST-ADH 단백질에 대하여 pH, 온도, 열 및 변성시약(detergent agent)에 대한 안정성을 조사하였다. 그 결과, 도 5, 도 6, 도 7a, 도 7b 및 도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질의 안정성이 우수하다는 확인할 수 있었다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다.

다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

바실러스 스테아로써모필러스로부터 분리한 ADH 유전자의 증폭

PCR을 이용하여 바실러스 스테아로써모필러스로부터 ADH 유전자를 분리하기 위하여, DNA 신세사이저 모델 391(DNA synthesizer moder 391, Applied Biosystems 사)을 이용하여 서열번호 1 및 2의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다. 이 때 상기 각 프라이머를 각각 제한효소EcoRⅠ 및HindⅢ의 제한효소 자리를 포함하고, 바실러스 스테아로써모필러스 ADH 유전자의 5' 및 3' 끝 배열을 갖도록 제작하였다. 바실러스 스테아로써모필러스 NCA 1503(KCCM 21203, 한국미생물보존센터)을 LB 브로쓰 배지(pH 7.0)에서 배양시킨 후, 10,000g에서 10분간 원심분리하여 집균하였다. 이후, 20 mM 인산 칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 7.5)을 이용하여 2회 세척한 후, 100 ℃의 물로 5분간 처리하여 게놈 유전자를 얻었다. 이후, 상기 게놈 유전자를 주형으로 하고, 상기 합성된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반응은 94℃에서 1분, 55℃에서 2분, 그리고 72℃에서 3분간의 조건으로 35회 반복 실시하였다. 이후, 도 2에 도시된 바와 같이, 1.0% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 PCR 산물을 확인하였다. 그 결과, 상기 PCR을 통해 증폭된 ADH 유전자의 크기가 1,041 bp임을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

ADH 발현벡터 pKG-ADH의 구축

상기 실시예 1에서 얻은 ADH 유전자를 제한효소EcoRⅠ과HindⅢ를 이용하여 37℃에서 1시간동안 반응시켜 절단하였다. 그리고 나서, 상기 절단된 ADH 유전자를 동일한 효소로 절단한 pGEX-KG 플라스미드에 T4 DNA 라이가제(T4 DNA ligase)를 이용하여 16℃에서 24시간 동안 라이게이션(ligation)시켜 재조합 발현벡터를 제조하였으며, pKG-ADH라 명명하였다. 이후, 50 mM 염화칼슘(CaCl₂)을 이용하여 대장균 BL21(Pharmacia Biotech)을 4℃에서 컴피턴트 세포(competent cell)로 만든 후, 열 충격(heat shock) 방법에 따라 상기 재조합 발현벡터 pKG-ADH로 형질전환시켰다. 그리고 나서, 상기 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여 제한효소EcoRⅠ과HindⅢ로 절단한 다음 1.0% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 형질전환 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 5000bp의 발현벡터(pGEX-KG 플라스미드)와 1,041bp 크기의 ADH 유전자를 확인할 수 있었다. 이상의 재조합 발현벡터 pKG-ADH의 제조과정을 도 1에 도시하였다.

<실시예 3>

재조합 GST-ADH 단백질의 발현

바실러스 스테아로써모필러스로부터 분리한 ADH 유전자가 도입된 형질전환체를 50 ㎕/㎖ 암피실린이 포함된 LB-브로쓰 배지 1ℓ에서 배양하였다. 배양액의OD₆₀₀값이 0.4 내지 0.5 정도 되었을 때 발현유도제인 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 약 3시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 균체를 1% 트리톤 X-100이 포함된 20 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5) 5 ㎖로 2-3회 세척한 후, 라이시스 완충용액(1% 트리톤 X-100, 0.1% β-머캅토에탄올, 0.2 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 5 mM 벤자미딘이 포함된 pH 7.5의 20 mM 인산 칼륨 완충용액) 10 ㎖에 균일화시켰다. 그리고 나서, 초음파 파쇄기를 이용하여 30~40 W, 8% 앰플리튜드의 실험조건으로 4℃에서 15분 동안 세포막을 파괴하였다. 반응이 진행됨에 따라 세포액은 점차로 검푸른 색깔을 띠었으며 혼탁도는 낮아지고 점도는 높아지는 것을 볼 수 있었다. 이후, 상기 세포액을 4℃에서 20,000g로 10분간 원심분리하여 다른 세포 찌꺼기와 단백질을 분리하고 조추출물(crude extract)를 얻었다.

<실시예 4>

재조합 GST-ADH 단백질의 분리 및 정제

상기 실시예 3에서 얻은 조추출물로부터 재조합 GST-ADH 단백질을 GSH 친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 먼저, 상기 조추출물을 20 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)을 이용하여 평형시킨 글루타치온 친화 컬럼(glutathione affinity column)에 흡착시켰다. 이후, 상기 컬럼 내의 불필요한 단백질을 제거하기 위해 200 mM 염화 칼륨이 포함된 20 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)으로 충분히 세척한 후, 10 mM GSH이 포함된 50 mM 트리스/염산(Tris/HCl) 완충용액(pH 8.0)으로 단백질분획을 용출시켰다. 용출된 분획들 중 ADH 활성을 갖는 분획만을 모아서 20 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.5)으로 투석하였다. 상기 정제된 재조합 GST-ADH 단백질을 SDS-PAGE를 수행하여 확인하였으며, 그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 분자량 61,000 Da의 단일 밴드를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 재조합 GST-ADH 단백질의 총단백질량 및 수율 등을 조사하여 하기 표 1에 기재하였다.

<실시예 5>

ADH 활성 측정

상기 실시예 4에서 정제된 재조합 GST-ADH 단백질의 효소 활성을 하기와 같은 방법에 따라 측정하였다. 먼저, 1 mM NAD⁺, 100 mM 에탄올을 포함하는 100 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.8)을 항온기를 이용하여 60℃로 온도를 일정하게 유지시킨 후, 상기 정제된 효소액(재조합 GST-ADH 단백질)을 넣어 1 ㎖가 되도록 하였다. 이후, ADH 효소 활성 반응의 생성물인 NADH의 양을 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer)를 이용하여 340 nm에서 시간에 흐름에 따라 흡광도를 측정하였다. ADH 활성의 1 unit은 표준 활성 반응 조건에서 NADH 1 μmol의 발생을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였으며, 그 결과(총활성 및 비활성)를 하기 표 1에 기재하였다.

형질전환된 대장균에서 생산되는 재조합 GST-ADH 단백질의 정제정도

	총활성(unit)	총단백질(㎎)	비활성(unit/mg)	수율(%)	정제(fold)
조추출물	495.05	402.48	1.23	100	1
정제된 재조합 GST-ADH 단백질	232.28	6.3	36.87	47	30

상기 표 1에 기재된 바와 같이, 조추출물에서 에탄올에 대한 ADH의 비활성은 1.23U/mg인 반면, 조추출물로부터 정제된 재조합 GST-ADH 단백질의 비활성은 36.87U/mg으로 30배가 증가한 것을 볼 수 있다. 이는 바실러스 스테아로써모필러스 NCA 1503으로부터 정제한 ADH의 에탄올에 대한 비활성이 30 unit/mg라고 보고한 사코다 등(Sakoda H. and Imanaka T.,J. Bacteriol., 174: 1397-1402, 1992)의 연구결과보다 높은 수치이다. 또한, 정제된 재조합 GST-ADH 단백질의 수율은 47%이었다.

<실시예 6>

재조합 GST-ADH 단백질의 특성 분석

a) 기질 특이성

하기 표 2에 나열된 여러 가지 기질을 사용하여 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질의 기질에 대한 특이성을 조사하였다. 표준 활성 반응 혼합물에 각각의 기질을 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가하여 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 실시하여 ADH의 활성을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

재조합 GST-ADH 단백질의 기질 특이성

기질	비활성 (U/㎎)	상대 활성(relative activity)(%)
메탄올	1.57	4.01
에탄올	36.7	93.90
1-프로판올	29.11	74.48
2-프로판올	32.45	83.03
1-부탄올	10.33	26.43
2-부탄올	39.08	100
3-부탄올	18.30	46.82
1-펜탄올	29.75	76.12
2-펜탄올	36.82	94.21
3-펜탄올	0.11	0.28
이소아밀 알코올	7.26	18.57
크로틸 알코올	16.25	41.58
2,2,2-트리클로로에탄올	0.37	0.94

상기 표 2에 기재된 바와 같이, 재조합 GST-ADH 단백질은 에탄올, 2-부탄올 및 2-펜탄올에 대해서 높은 비활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 상기 표 2의 결과로부터 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질이 선상의 구조(linear structure)를 가진 기질에 대해 높은 활성을 보이며, 특히 메틸 그룹(methyl group)이 한 개 치환된 알코올에 대해 높은 활성을 보임을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

b) pH의 영향

pH의 변화가 재조합 GST-ADH 단백질의 활성에 미치는 영향을 측정하기 위해, pH 4.0 내지 pH 6.0의 범위는 아세트산 나트륨(sodium acetate) 완충용액을, pH 6.0 내지 pH 8.0의 범위는 인산 나트륨(sodium phosphate) 완충용액 및 인산칼륨(potassium phosphate) 완충용액을, pH 8.0 내지 pH 10.0의 범위는 트리스-염산 완충용액과 글리신-수산화나트륨 완충용액을 사용하였다. 표준 활성 반응 조건에서 100 mM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.8) 대신, 각각의 pH 범위에 해당하는 상기 완충용액들을 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가하여 ADH 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 재조합 GST-ADH 단백질의 최고 활성은 pH 9.0에서 나타났다. 구아글리아디 등의 연구결과에 의하면 바실러스 스테아로써모필러스에서 정제한 ADH는 pH 8.0에서 최고활성을 보이고, pH 10.0에서는 급격히 효소활성이 줄어들어 10% 이하의 활성을 나타냈다(Guagliardi, A.,et al.,Int. J. Biochem. Cell Bio., 28: 239~246, 1996). 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질도 상기 바실러스 스테아로써모필러스의 ADH와 유사한 양상을 보이고 있으나, pH 10.0에서도 60% 이상의 높은 활성을 보여 훨씬 안정함을 확인할 수 있었다. 이로부터, 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질이 융합 단백질의 형태로 발현되어 본래의 효소보다 pH의 변화에 대해 안정하다는 것을 알 수 있다.

c) 온도의 영향

재조합 GST-ADH 단백질 활성에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해, 표준 활성 반응 조건에서 항온기를 이용하여 온도를 25℃에서 75℃까지 변화시키면서 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 재조합 GST-ADH 단백질의 최고 활성은 70℃에서 나타났고, 특히 76℃에서도 79%의 높은 활성을 보였다. 이는 바실러스 스테아로써모필러스의 ADH가 65℃에서 최고활성을 보인다는 구아글리아디 등의 연구 결과(Guagliardi, A.,et al.,Int. J. Biochem. Cell Bio., 28: 239~246, 1996)를 고려할 때, 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질이 본래의 ADH보다 온도에 대해 더 안정하다는 것을 나타내는 것이다.

d) 열에 대한 안정성

본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질의 열에 대한 안정성을 조사하기 위해, 효소액(재조합 GST-ADH 단백질)을 25℃에서 85℃까지 5℃씩 증가시킨 각 온도에서 30분 동안 가열한 다음, 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 실시하여 표준 활성 반응조건에서 ADH의 잔존 활성(remaining activity)을 측정하였으며, 그 결과를 도 7a에 도시하였다. 또한, 효소액(재조합 GST-ADH 단백질)을 50℃, 60℃ 및 70℃의 각 온도에서 6시간 동안 가열하면서 30분 단위로 효소액을 취하여 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 실시하여 표준 활성 반응조건에서 ADH의 잔존 활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 7b에 도시하였다. 이 때, 상기 두 방법 모두 열을 가한 효소액을 얼음 위에서 1분간 냉각한 후 잔존 활성을 측정하였다.

도 7a에 도시된 바와 같이, 재조합 GST-ADH 단백질이 60℃까지의 온도에서는 30분 동안 가열하여도 전혀 실활되지 않았고, 65℃ 이상에서는 온도가 증가함에 따라 효소활성이 급격히 감소하였으나, 85℃에서도 완전히 실활되지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7b에 도시된 바와 같이, 재조합 GST-ADH 단백질은 50℃에서는 6시간까지도 활성을 그대로 유지하였고, 60℃에서는 5시간까지 50%의 활성을 유지하였으나, 70℃에서는 시간이 흐름에 따라 급격히 효소의 활성이 감소함을 볼 수 있었다. 상기 두 실험 결과로부터, 재조합 GST-ADH 단백질이 열에 대해 안정성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

e)변성 시약에 대한 안정성

0.05% SDS, 1% 트리톤 X-100, 0.1M 우레아 및 0.2M 구아니딘-염산을 이용하여 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질의 변성시약에 대한 안정성을 조사하였다. 효소액(재조합 GST-ADH 단백질)에 상기 각 변성시약을 첨가하여 실시예 5와 동일한 방법에 따라 표준 활성 반응 조건에서 효소활성을 측정하고, 1시간 및 5시간 후에 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 각 변성시약을 첨가했을 때 모두 50% 이상의 효소활성을 보임을 확인할 수 있었다. 특히, 0.2M 구아니딘-염산 및 0.1M 우레아의 경우, 변성시약 첨가 후 시간이 경과하여도 비교적 효소활성이 잘 유지됨을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질이 변성시약에 대해 매우 안정하다는 사실을 알 수 있다.

<실시예 7>

재조합 GST-ADH 단백질로부터 ADH의 분리 및 정제

융합단백질의 형태로 발현된 재조합 GST-ADH 단백질로부터 GST를 절단하기 위해, 트롬빈을 이용하는 쿤리앙 구안(KunLiang Guan) 등의 방법(Guan, K. and Dixon, J. E.,Anal. Biochem., 192: 262-267, 1991)을 이용하였다. 트롬빈 절단완충용액으로는 150 mM 염화나트륨, 2.5 mM 염화칼슘, 0.1% β-머캅토에탄올을 포함하는 50 mM 트리스/염산 완충용액(pH 8.0)을 이용하였다. 효소액(재조합 GST-ADH 단백질)에 6 ㎍/㎖ 트롬빈을 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 처리하였다. 그리고 나서, GSH 아가로스 칼럼을 4℃에서 트롬빈 절단 완충용액을 이용하여 평형을 유지시킨 후, 상기 트롬빈을 처리한 효소액을 흡착시켰다. 이후, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 50 mM 트리스/염산 완충용액(pH 7.5)을 이용하여 ADH만을 용출시켰다. 상기 용출된 ADH를 12.5% SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 정제된 ADH의 분자량은 38,000Da이었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 생산방법에 따른 재조합 GST-ADH 단백질은 열, pH, 화학적 변성제 등 각종 조건에서 안정성이 우수하기 때문에, 음주운전의 규제, 의료분야, 공업 및 식품제조 공정 등에서 요구되는 알코올 측정을 위한 바이오센서 제조, 각종 알코올류의 생공업적 생산 및 이를 필요로 하는 단백질 공학 연구분야 등에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 GST-ADH 단백질은 GST의 특성을 이용한 단 1회의 정제를 통하여 고수율로 수득할 수 있는 장점이 있다.

Claims

a) 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 바실러스 스테아로써모필러스의 ADH(alcohol dehydrogenase) 유전자를 증폭시키는 단계;

b) 상기 증폭된 ADH 유전자를 pGEX-KG 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

c) 상기 재조합 발현벡터로 대장균 BL-21을 형질전환시키는 단계; 및

d) 상기 형질전환된 대장균 BL-21을 배양하여 융합단백질 GST-ADH를 발현시킨 후, 글루타치온 친화 크로마토그래피(glutathione affinity chromatography)를 수행하여 상기 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 재조합 GST-ADH 단백질을 생산하는 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1항의 방법에 의해 얻어지고, 하기 (a) 내지 (c)의 특징을 갖는 재조합 GST-ADH 단백질.

(a) 최적온도 65℃ 내지 75℃;

(b) 최적 pH 8.0 내지 9.5;

(c) 분자량 61 kDa