KR20000070896A

KR20000070896A - 신규한 카르보닐 환원효소 및 이것을 코딩하는 유전자 및 이러

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Publication number: KR20000070896A
Application number: KR1019997007161A
Authority: KR
Inventors: 야소하라요시히코; 키이자키노리유키; 하세가와준조; 와다마사루; 시미즈사카유; 카타오카미치히코; 야마모토카주히코; 카와바타히로시; 키타게이코
Original assignee: 후루타 타케시; 카네카 코포레이션
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2000-11-25
Also published as: CZ298236B6; DE69731317T2; US6448052B2; JP4012257B2; KR100506134B1; EP0967271B1; US20020006651A1; WO1998035025A1; ES2235246T3; IL131241A0; CA2280502A1; US6218156B1; EP0967271A1; IL131241A; DE69731317D1; EP0967271A4; CZ276199A3; SI20120A; ATE280218T1; SK105699A3

Abstract

카르보닐 화합물을 비대칭적으로 환원하여 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 카르보닐 환원 활성을 갖는 효소, 상기 효소를 암호화하는 DNA, 상기 DNA를 가지는 플라스미드, 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체, 및 상기 효소 및/또는 형질전환된 세포를 이용하여 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

신규한 카르보닐 환원효소 및 이것을 코딩하는 유전자 및 이러한 환원효소 및 유전자 이용방법{NOVEL CARBONYL REDUCTASE, GENE THAT ENCODES THE SAME, AND METHOD OF UTILIZING THESE}

다수의 CRD 효소가 공지되어있다.(Yuki Gosei Kagaku, 49, 52(1991) 및 Eur.J.Biochem., 184,1(1998) 참조). (S)-4-할로-3-히드록시 부티릭 에스테르를 제조하는 4-할로 아세토아세틱 에스테르상에 활성이며 미생물에서 유도되며 연구되어진 특성들을 가지고 있는 CRD 효소들은 Geotrichum candidum에서 유도되어지는 효소(Enzyme Microb. Technol. (1992), Vol. 14, 731)및 Candida parapsilosis에서 유도되어지는 효소(Enzyme Microb. Technol.(1993). Vol. 15, 950)뿐이다. 그러나, 상기 두 형태의 효소의 유전자 코딩에 대해 알려진 자료는 없다. 상기와 같은 효소를 이용한 4-할로 아세토에세틱 에스테르의 환원은 저농도 기질에서만 발생된다. 그러므로 촉매로써 상기 효소를 사용하여 (S)-4-할로-3-히드록시 부티릭 에스테르를 합성하는 것은 비실용적이다.

상기 두 형태의 효소를 사용한 반응외에도, 미생물체를 이용한 다수의 반응 및, 그러한 반응의 생성물들이 4-할로-아세토아세틱 에스테르의 비대칭적 환원을 현실화하는 것으로 알려져 있다.(일본 특허 제1723728호, 일본공개공보 제6-209782호 및 제6-38776호 등 ) 그러나, 상기 반응들은 고 농도 기질에서 수행되지 않으므로 실용적인 생성 방법이 확립되었다라고 단언할 수 없다. 예를 들면, 이상(two- phase) 시스템을 이용하여 유기 용매와 반응시키는 반응방법을 참조할 수 있다(일본 특허 제2566962호). 촉매로써 루테늄-광학 활성 인화수소를 사용한 방법이 보고되어있다.(일본 공개공보 제1-211551호). 그러나 상기 방법은 고압 반응 용기를 필요한다거나 고가의 촉매가 필요하다라는 등의 풀어야할 많을 문제점들을 포함하고 있다.

상기와 같은 조건하에, 4-할로 아세토아세틱 에스테르와 같은 카르보닐 화합물을 비대칭적으로 환원시켜 (S)-4-할로-3-히드록시 부티릭 에스테르와 같은 광학적으로 활성인 알코올의 제조에 사용되기 위해 실용적인 효소의 발달이 요구되어 왔다.

CRD 효소는 반응을 위해서 환원형 조효소(coenzyme)를 필요로 한다. 일반적으로 CRD 효소를 가진 미생물체 및 이에 유사한 것을 사용하여 카르보닐 화합물이 환원되어지면, 산화된 조효소를 환원된 형태로 변환시키는 일군의 재생성-시스템 효소들을 활성화시키기 위하여 반응 시스템에 글루코스와 같은 당류가 첨가되어진다. 이를 통해 조효소를 재생성하여 환원에 사용한다. 상기 일군의 재생산-시스템 효소들은 기질 및 환원된 생성물에 의해서 방해되어지거나 손상될 수 있다. 상술한 이유가 기질 또는 생성물의 농도가 낮을 때에만 환원이 진행되는 가에 대한 주요 이유중의 하나로 고려되어 왔다. 환원시 이용되는 고가의 조효소의 양은 반응시 CRD 효소가 의존하는 조효소를 재생산하는 능력을 가진 효소를 CRD 효소와 조합함으로써 상당히 감소될 수 있다.(예를 들면, 일본 특허번호 제2566960호 및 Enzyme Microb. Trchnol(1993), Vol. 15, 950에 나타내 있다.) 그러나 상기 경우는, 반응 시스템에 재생산 효소가 첨가되기 전에 CRD 효소의 제조와는 별도로 조효소를 재생산하는 효소 공급원을 제조하는 것이 요구되어진다.

본 발명의 발명자들은 신규한 Candida-genus 유래 CRD 효소를 발견하였으며 상기 CRD 효소를 이용함으로써 카르보닐 화합물에서 광학 활성 알코올이 유효하게 생산될 수 있다라는 것을 발견하였다.

또한 발명자는 광학 활성 알코올이 조효소를 재생성하는 능력을 가진 효소의 유전자(예. 글루코스 탈수소효소 유전자)를 동시에 포함하는 형질전환된 세포를 사용함으로써 효과적으로 생산된다는 것도 발견하였다.

그러므로, 이하 명세서에 설명되어질 본 발명은 신규한 CRD 효소, 이 효소를 암호화하는 DNA, 상기 DNA를 갖는 플라스미드, 이러한 플라스미드로 형질전환된 세포인 형질변환체 및 상기 효소 및/또는 형질전환된 세포를 이용하여 광학 활성 알코올을 제조하는 방법을 유익하게 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 카르보닐 환원 효소(carbonyl reductase)는 (1)에서 (4)까지의 물리적 및 화학적 특성을 갖는다:

(1) 작용(action):

에틸 (S)-4-클로로-3-하이드로부탄산염(ethyl (S) - 4 - chloro - 3 - hydroxybutyrate)를 생산하기 위하여 조효소(coenzyme)로써 NADPH를 사용하는 에틸 4-클로로아세토아세테이트(ethyl 4-chloroacetoacetate)에서의 작용;

(2) 기질 특이성(substrate specificity):

에틸 4-클로로아세트아세테이트에 강한 활성을 나타내는 반면, 에틸 아세토아세테이트에는 실질적으로 활성을 나타내지 않음;

(3) 최적 pH(optimal pH): 5.5 내지 6.5; 및

(4) 작용 최적 온도(action optimal temperature) : 50℃ 내지 55℃.

일 실시예에서, 카르보닐 환원 효소는 (5)에서 (7)까지의 부가적인 물리적 및 화학적 특성을 갖는다:

(5) 열 안정성(heat stability): pH 7.0에서 30분동안 처리되었을 때 약 40℃까지는 안정을 유지함;

(6) 억제제(inhibitor): 수은 이온 및 퀘르세틴(quercetin)에 의해 반응이 억제됨; 및

(7) 분자량: 겔 여과법 분석(gel filtration analysis)에 의해 약 76,000이고, SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동 분석(polyacrylamide electrophoresis analysis)에 의해 약 32,000임.

본 발명에 따른 카르보닐 환원 효소는 서열 목록의 서열번호 1의 아미노산 서열 또는, 서열 목록의 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산을 갖는 아미노산 서열 또는 그 일부를 가지며, 에틸 (S)-4-클로로-하이드록시부탄산염을 생산하기 위하여 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 비대칭으로 환원하는 활성을 갖는다.

일 실시예에서, 효소는 Candida 속(genus Candida)에 속하는 미생물(microbe)로부터 얻을 수 있다. 바람직한 실시예에서, 효소는 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)로부터 얻어진다. 더 바람직한 실시예에서, 효소는 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae) IFO 0705로부터 얻어진다.

본 발명에 따른 DNA는 상기 효소를 암호화한다. 일 실시예에서, DNA는 서열목록의 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가진다.

본 발명에 따른 플라스미드(plasmid)는 상기 DNA 서열을 가진다. 일 실시예에서, 플라스미드는 pNTS1이다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포는 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체이다. 일 실시예에서, 형질전환된 세포는 E. coli이다. 바람직한 실시예에서, 형질전환된 세포는 E. coli HB 101(pNTS1)이다.

본 발명에 따른 플라스미드는, 에틸 (S)-4-클로로-히드록시부탄산염을 생산하기 위하여 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 비대칭적으로 환원시키는 활성을 갖는 효소를 암호화하는 DNA 및, 상기 효소가 의존하는 조효소(예를 들어, 글루코스탈수소효소(glucose dehydrogenase))를 재생시키는 능력을 가지는 효소를 암호화하는 DNA를 가진다.

일 실시예에서, 글루코스 탈수소효소는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유도된다. 바람직한 실시예에서, 플라스미드는 pNTSlG 이다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포(transformed cell)는 상기 플라스미드(plasmid)에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체(transformant)이다.

일 실시예에서, 형질전환된 세포는 E. coli 이다. 바람직한 실시예에서, 형질전환된 세포는 E. coli HB101(pNTS1)이다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포는 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염을 생산하기 위하여 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 비대칭적으로 환원하는 활성을 갖는 효소를 암호화하는 DNA를 가지는 제 1 플라스미드 및, 상기 효소가 의존하는 조효소를 재생성하는 능력을 갖는 효소(예. 글루코스 탈수소효소)를 암호화하는 DNA를 가지는 제 2 플라스미드에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체이다.

일 실시예에서, 형질전환된 세포는 플라스미드 pNTS1 및, 바실러스 메가테리움(Bascillus megaterium)으로부터 유도된 글루코스 탈수소효소(glucose dehydrogenase)를 암호화하는 DNA를 가지는 플라스미드에 의해 형질전환되는 세포인 형질전환체이다. 바람직한 실시예에서, 형질전환된 세포는 E. coli 이다.

본 발명에 따른 광학 활성 3-히드록시 부티르 에스테르(3-hydroxy butyric ester)의 생산방법은: 3-옥소(oxo)-부티르 에스테르를 비대칭적으로 환원하여 광학 활성 3-히드록시-부티르 에스테르를 생산하는 활성을 가지는 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 능력이 있는 미생물 배앙체(microbe culture), 또는 상기 배양체의 처리된 생산물과 3-옥소-부티르 에스테르를 반응시키는 단계; 및 생산된 광학 활성 3-히드록시-부티르 에스테르를 채취(harvest)하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 광학 활성 3-히드록시 부티르 에스테르의 생산 방법은: 3-옥소(oxo)-부티르 에스테르를 비대칭적으로 환원하여 광학 활성 3-히드록시-부티르 에스테르를 생산하는 활성을 갖는 효소를 암호화하는 DNA를 가지고 있는 플라스미드에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체를, 3-옥소-부티르 에스테르와 반응시키는 단계; 및 생산된 광학 활성 3-히드록시-부티르 에스테르를 채취하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 광학 활성 알코올 생산 방법은: 카르보닐 화합물(carbonyl compound)을 비대칭적으로 환원하여 광학 활성 알코올을 생산하는 활성을 갖는 효소를 암호화하는 DNA 및 상기 효소가 의존하는 조효소를 재생성하는 능력을 갖는 효소를 암호화하는 DNA를 가지는 플라스미드에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체를 카르보닐 화합물에 반응시키는 단계; 및 생산된 광학 활성 알코올을 채취하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 광학 활성 알코올 생산 방법은: 카르보닐 화합물을 비대칭적으로 환원하여 광학 활성 알코올을 생산하는 활성을 갖는 효소를 암호화하는 DNA를 가지는 제 1 플라스미드 및, 상기 효소가 의존하는 조효소를 재생하는 능력을 가지는 효소를 암호화하는 DNA를 가지는 제 2 플라스미드에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체를, 카르보닐 화합물과 반응시키는 단계; 및 생산된 광학 활성 알코올을 채취하는 단계를 포함한다.

일 실시예에서, 카르보닐 화합물은 다음과 같은 일반식으로 나타내어지는 3-옥소-부티르 에스테르이다:

그리고, 결과적인 광학 활성 알코올은 다음과 같은 일반식으로 나타내어지는 광학 활성 3-히드록시-부티르 에스테르이다.

바람직한 실시예에서, 상기 일반식에서 R₁및 R₂는 독립적으로 할로겐(halogen), 아지드(azide), 벤질아미노(benzylamino) 또는 수소(hydrogen)이고, R₁및 R₂둘 중의 하나는 수소이며, R₃는 치환 또는 비치환된 알킬(alkyl)기 또는 아릴(aryl)기이다.

더 바람직한 실시예에서, 상기 일반식에서, R₁은 염소(chlorine)이고, R₂는 수소이며, R₃는 에틸이다.

바람직한 실시예에서, 상기 일반식에서, R₁및 R₂는 독립적으로 알킬기, 히드록시기, 또는 수소이고, R₁및 R₂둘 중의 하나는 수소이며, R₃는 치환 또는 비 치환된 알킬기 또는 아릴기이다.

더 바람직한 실시예에서, 상기 일반식에서 R₁은 히드록시기이고, R₂는 수소이며, R₃는 에틸이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 염기 서열(base sequence) 및 추정된 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.

도 2는 재조합 플라스미드 pNTS1의 제작 방법을 도시하는 도면이다.

발명을 수행하는 최적 모드

하기에, 본 발명은 더욱 자세하게 기술된다.

(CRD 효소의 정제(purification))

본 발명에 따라 CRD 효소의 공급원으로서 사용되는 유기체(organism)는 구체적으로 한정되어 있지는 않으나, 예를 들어 Candida 종의 효모가 될 수 있다. 특히 바람직한 예는 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae) IFO 0705인데, 이것은 번호 CBS166 하에 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS: Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, 네덜란드) 에 기탁된 미생물이며, 상기 미생물의 분리 및 특성은 "효모, 분류학, 제 3판 (1984) PP.731" 에 기술되어 있다. 본 발명에 따라 효소를 생산할 수 있는 미생물은, 야생주(wild strain) 또는 돌연변이주(mutant strain)일 수 있다. 대안적으로, 세포 융합(cell fusion) 또는 유전적 조작(genetic manipulation) 과 같은 유전적 기술에 의해 유도된 미생물 역시 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 효소를 생산하는 유전적 조작에 의해 유도된 미생물은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다: 효소의 일부 또는 전체 아미노산 서열을 결정하기 위하여 상기와 같은 효소를 분리 및/또는 정제하는 단계와; 상기 얻어진 아미노산 서열에 근거하여 효소를 암호화하는 DNA의 DNA 서열을 얻는 단계와; 재조합(recombinant) 미생물을 얻기 위하여 DNA를 다른 미생물안에 도입(introduce)하는 단계; 및 본 발명에 따른 효소를 얻기 위하여 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계.

본 발명에 따른 효소를 얻기 위한 미생물을 배양하는 배지(또는, 본 발명에 따른 (S)-4-할로-3-히드록시부티르 에스테르의 생산 방법에 사용된 미생물)는, 그것이 미생물을 자랄 수 있게 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기염(inorganic salt), 유기 양분(organic nutrient) 및 그 유사물을 포함하고 있는 보통의 액체 자양분 배지(normal liquid nutritious medium)가 사용될 수 있다.

여기에서 사용된 "미생물 배양체"는 미생물체, 또는 상기 미생물체를 포함하는 액체 배양물을 의미하며, "그의 처리된 생산물(its processed product)"은, 예를 들어, 하기 기술된 것과 같은 추출(extraction) 및 정제에 의해 얻어지는 생산물을 의미한다.

당업자에 의해 일반적으로 사용되어지는 효소 추출 및 정제 방법이 결과적인 배양물로부터 효소를 추출하고 정제하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 배양물은 미생물체를 분리해 내기 위해 원심 분리되고, 결과적인 미생물체는 적절한 버퍼에서 부유된다(suspend). 상기 현탁액속의 미생물체는 유리 비드의 사용과 같은 물리적 기술 또는, 효소의 사용과 같은 생화학적 기술의 사용에 의해 파괴 또는 용해된다. 그리고 나서, 용액(solution) 내의 고형체(solid)는 원심 분리에 의해서 제거되어, 조 효소용액(crude enzyme solution)을 얻는다. 또한, 이러한 조 효소용액은 상기 기술된 것과 유사한 정제 방법에 의하여 배양물로부터 얻어질 수 있다.

상기 조 효소용액은 암모늄 황산염 침전(ammonium sulfate precipitation), 투석(dialysis) 및 크로마토그래피(chromatography)와 같은, 당업자에 의해 일상적으로 사용되는 방법을 단독 또는 공동으로 사용함으로써 더욱 정제될 수 있다. 크로마토그래피에 있어서, 소수성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래라피 (예를 들어, DEAE 세파로스), 겔 여과법과 같은 다양한 형태의 크로마토그래피가 하나 또는 조합된 형태로 사용되어 본 발명에 따른 효소를 얻을 수 있다.

예를 들어 CRD 효소는 다음과 같은 방식으로 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae) IFO 0705로부터 분리될 수 있다.

우선, 상기 효모는 적절한 배지에서 배양되고, 미생물체(microbe bodies)는 생성된 배양물로부터 원심분리에 의해 모아진다. 미생물체는 예를 들어 Dyno mill(Dyno-Mill사에 의해 제조된)에 의해 파괴되고, 세포 부스러기를 제거하여 세포가 없는 추출물을 얻기 위해 원심분리된다. 세포가 없는 추출물은 염석(salting-out)(예를 들어, 암모늄 황산염 (ammonium sulfate) 침전(precipitation) 및 나트륨 인산염 (sodium phosphate) 침전), 용제 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전법), 투석(dialysis), 겔 여과법(gel filtration), 이온 교환 (ion exchange), 역상 크로마토그래피 (reverse phase chromatography)와 같은 컬럼 크로마토그래피, 및 한외여과법등의 방법 중 하나 또는 조합의 형태로 처리되어 효소를 정제시킨다. CRD 효소 활성은 기질로서 1mM 에틸 4-클로로아세토아세테이트와, 조효소로서 0.1mM NADPH와, 첨가된 효소를 갖는 100mM 인산염 버퍼(pH 6.5) 또는 기질로서 0.2mM 에틸 4-클로로아세토아세테이트와 첨가된 조효소로서 0.32mM NADPH를 갖는 200mM 인산염 버퍼 (pH 7.0)에 대해 30℃, 340nm에서 흡광도의 감소를 측정함으로써 결정된다. 이러한 반응 조건에서, 1분에 NADP로의 1μmol NADPH의 산화는 한 단위의 효소의 활성으로서 정의된다.

본 명세서에서 사용된 효소가 "안정적인(stable)"이란 표현은 40℃, pH 7.0에서 30분 동안 처리된 후 효소가 처리 전의 활성보다 90% 이상의 활성을 유지한다는 것을 의미한다.

효소의 분자량은 컬럼 TSK-G3000SW(ø0.75 × 60cm; Tosoh Corporation사에 의해 제조된)을 이용하는 겔 여과법에 의해 측정된다. 용리액(eluent)으로서, 0.1M Na₂SO₄및 0.05% NaN₃를 함유하는 0.1M 인산염 버퍼 (pH 7.0)가 사용된다. 서브유니트의 분사량은 환원 조건 (환원제: 2 V/V% 2-mercaptoethanol)에서 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동을 수행하고 표준 단백질의 상대적인 이동도로부터 계산함으로써 결정된다.

예를 들어, 본 발명에 따라 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CRD 효소는 다음과 같이 (1) 내지 (4)의 물리적, 화학적 특성을 갖는다.

(1) 작용:

에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염을 생성하기 위해 조효소로서 NADPH를 이용하여 에틸 4-클로로아세토아세테이트에 작용;

(2) 기질 특이성:

에틸 아세토아세테이트에 대한 활성을 거의 나타내지 않으면서 에틸 4-클로로아세토아세테이트에 강한 활성을 나타내는 것;

(3) 최적의 pH: 5.5 내지 6.5;

(4) 최적의 작용 온도: 50℃ 내지 55℃.

일실시예에서, 본 발명에 따라 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 카르보닐 환원효소는 다음과 같이 (5) 내지 (7)의 추가적인 물리적, 화학적 특성을 갖는다.

(5) 열안정성: pH 7.0에서 30분동안 처리될 때 약 40℃까지 안정함:

(6) 억제제: 수은 이온 및 퀘르세틴에 의해 억제됨;

(7) 분자량: 겔 여과 분석에서 약 76,000, 그리고 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 분석에서 약 32,000임.

본 발명에 따른 효소와 실질적으로 동일한 특성을 갖는 효소는 천연 효소 또는 재조합 효소가 될 수 있다. 예를 들어, 재조합 효소는 다음과 같은 방식으로 얻어질 수 있다. 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae) IFO 0705로부터 유래된 효소의 아미노산 서열에서 하나의 아미노산 또는 수개의 아미노산이 치환되거나, 삭제되거나, 삽입되거나 첨가되어 재조합 효소를 생성하게 되고 그에 대한 효소 활성이 측정된다.

(합성 올리고뉴클레오티드 프로브의 표본)

상기와 같은 방식으로 얻어진 정제된 CRD 효소는 변성되고(예를 들어, 8M 요소(urea)로), 엔도펩티다제(예를 들어, 리실 엔도펩티다제(lysyl endopeptidase))로 소화된다(digested). 그 결과 생성된 펩타이드 절편의 아미노산 서열은 에드만(Edman) 방법에 의해 결정된다. DNA 프로브는 결정된 아미노산 서열을 근거로 합성된다. 그러한 프로브는 예를들어³²P로 표시된다.

(유전자 라이브러리의 생성)

본 발명에 따른 CRD 효소를 생성하는 미생물의 염색체 DNA 또는 그의 cDNA는 적절한 제한 효소 예를 들어 Sau3AI으로 부분적으로 소화된다. 소화된 생산물의 적절한 크기 (예를 들어, 23kb 내지 20kb)를 갖는 DNA 절편은 박테리오파지 벡터의 적합한 제한 효소 부위로 삽입된다. 그 결과 생성된 재조합 박테리오파지 벡터는 시험관내로 패키지되고 난 후 그들에 의해 E. coli가 감염되도록 하여 유전자 라이브러리를 생성한다.

(유전자 라이브러리로부터의 CRD 효소 유전자의 클로닝)

그리하여 생성된 유전자 라이브러리는³²P로 표시된 합성 DNA 프로브를 이용하는 플라크 혼성화 방법 (plapue hybridization method)에 의해 CRD 효소 유전자에 대해 스크린 될 수 있다 (Science, 196, 180(1977) 참조). 결과적으로 생성된 DNA의 염기 서열 분석은 다이디옥시(dideoxy) 시퀀싱 방법, 다이디옥시 사슬(dideoxy chain)종결 방법 등에 의해 결정될 수 있다. 그러한 서열 결정은 ABI PRISM Dye 종결체 주기 시퀀싱 준비 반응 키트 (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) (Perkin Elmer사에 의해 제조된) 및 ABI 373A DNA 시퀀서(Sequencer)(Applied Biosystems사에 의해 제조된)를 사용하여 수행될 수 있다.

그 결과 생성된 DNA 절편은 PCR 방법 등에 의해 증폭될 수 있고, 클로닝될 수 있다.

(CRD 효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 구조)

CRD 효소 유전자가 숙주 미생물안에 도입되어 벡터 DNA를 이용하여 그 안에서 발현된다. 상기 벡터 DNA로서, 적절한 숙주 미생물 내에서 CRD 효소 유전자를 발현시킬 수 있는 한 어떠한 벡터 DNA라도 사용될 수 있다. 그러한 벡터 DNA의 예로는 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 코스미드(Cosmid) 벡터가 있다. 다른 숙주 변종사이에 유전자 교환을 허용하는 셔틀 벡터 (shuttle vector)가 사용될 수도 있다. 그러한 벡터 DNA는 프로모터(promoter) (예를 들어, 라크UV5 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 1pp프로모터, tufB프로모터, recA프로모터, 그리고 pL프로모터)와 같은 조절 요소 및 이들에 사용할 수 있도록 연결된 인헨서 요소(enhancer element)를 가질 수 있다.

예를 들어, pUCNT(W094/03613)등이 바람직하게 사용될 수 있다. 플라스미드 pUCNT는 라크 프로모터의 하부에 NdeI 및 EcoRI와 같은 삽입 부위를 가지므로 바람직 하다.

(CRD 효소 유전자 및 CRD 효소가 의존하는 조효소를 재생성시키는 능력을 갖는 효소의 유전자 모두를 포함하는 재조합 플라스미드의 구조)

조효소를 재생성시키는 능력을 갖는 효소로서, 수소효소, 포름산염(formate)탈수소효소, 알코올 탈수소효소, 알데히드 탈수소효소, 글루코스-6-인산염 탈수소효소, 글루코스 탈수소효소 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 글루코스 탈수소 효소가 사용된다. 특히, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 유래된 글루코스 탈수소효소(이하, GDH로 축약됨)가 사용된다.

플라스미드 pGDA2 (J.Biol. Chem. (1989), 264, 6381)는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 유래된 GDH 유전자를 포함한다. GDH 유전자 절편이 이러한 플라스미드로부터 잘라내지고 CRD 효소 유전자의 상부 또는 하부에서 CRD 효소 유전자를 포함하는 플라스미드에 삽입되어, CRD 효소 유전자 및 GDH 유전자 둘다를 갖는 재조합 플라스미드를 생성하게 된다.

(형질전환)

CRD 효소 유전자를 갖는 결과적으로 생성된 재조합 플라스미드와, CRD 효소유전자 및 GDH 유전자 둘다를 갖는 재조합 플라스미드가 종래의 방법에 의해 숙주세포에 유도될 수 있다. 또한, CRD 효소 유전자를 갖는 재조합 플라스미드와 GDH 유전자를 갖는 재조합 플라스미드가 동시에 또는 다른 시간에 숙주 세포에 도입되어 이들 두 플라스미드로 형질전환된 형질전환체 변종을 얻을 수 있다.

숙주 세포, 박테리아, 효모, 자균(thread fungus), 식물 세포, 동물 세포 등이 이용될 수 있다. 바람직하게는, E. coli가 특히 선호된다.

종래 기술에서 알려진 방법, 예를 들어 수용능력있는(competent) 상태의 숙주 세포와 재조합 플라스미드를 혼합하는 공정을 포함하는 방법 및 접합전달(conjugational transmission)에 의해 헬파(helper) 플라스미드를 이용하여 플라스미드를 형질감염시키는 공정을 포함하는 방법을 이용하여 숙주 내에 플라스미드를 도입할 수 있다.

숙주 내로 도입된 플라스미드는 에피솜(episome)으로서 자율 복제가 가능하다. 또는, 플라스미드 전체나 일부가 염색체에 통합되어 염색체와 함께 복제되기도 한다.

기질로 0.1M의 글루코스를 갖는 1M 트리스 염산 버퍼(pH 8.0)에서, 25℃에서의 340nm 흡광도 증가를 측정함으로써 형질전환 세포의 GDH 활성을 측정할 수 있다.

(광학 활성 알코올의 취득)

광학 활성 4-할로-3-하이드록시 부티릴 에스테르는 광학 활성 알코올의 한 종류로서, 예를 들어 다음과 같은 방식으로 얻어진다.

다음과 같이 표현되는 4-할로 아세토아세틱 에스테르가 기질로 이용될 수 있다(여기에서 R₁은 할로겐, R₂는 수소, 그리고 R₃는 치환 또는 비치환된 알킬기 또는 아릴기이다).

R₃가 알킬기일 때, R₃는 예를 들어 메틸기, 에틸기. 프로필기, 부틸기, 이소프로필기 등이 된다. R₃가 아릴기일 때, R₃는 예를 들어 페닐기, 토릴(tolyl) 그룹등이 된다. R₃가 치환된 아릴기일 때, R₃는 예를 들어 플루오로페닐기, 클로로페닐기 등이 된다.

바람직하게, R₁은 염소 또는 불소이고, R₃는 1 내지 4개의 탄소를 갖는 알킬기이다. 보다 바람직하게, 기질은 메틸 4-클로로아세토아세테이트(methyl 4- chloroacetoacetate), 에틸 4-클로로아세토아세테이트, 메틸 4-브로모아세토아세테이트(methyl 4-bromoacetoacetate), 또는 에틸 4-브로모아세토아세테이트이다. 다른 한편으로, 에틸 4-요오드아세토아세테이트(ethyl 4-iodoacetoacetate), 에틸 4- 히드록시아세토아세테이트(ethyl 4-hydroxyacetoacetate), 에틸 2-클로로-3-옥소부탄산염(ethyl 2-chloro-3-oxobutyrate), 에틸 2-메틸-3-옥소부탄산염, 에틸 4-아지드아세토아세테이트(ethyl 4-azideacetoacetate) 등이 기질로 사용될 수 있다.

상기 4-할로 아세토아세틱 에스테르는 예를 들어 일본 공개공보 제 61- 146191호에 개시된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 디케텐(diketene)이 시작물질로 이용되어 할로겐과 반응하여, 이후에 알코올과 반응하게 되는 4-할로 아세토아세테이트 할로겐화물(halide)을 얻는 방법을 이용함으로써, 4-할로 아세토아세틱 에스테르를 제조할 수 있다. 다른 한편으로, 아세토아세틱 에스테르가 시작물질로 이용되고 그 4차 위치가 직접 할로겐화되는 방법을 이용하여 4-할로 아세토아세틱 에스테르를 제조할 수 있다.

조효소(coenzyme)인 NADPH 및 형질전환 미생물(trnsformant microbe) 배양물(culture) 또는 그 처리 생성물의 배양물(culture)과 같은 것과 함께 상기 4-할로 아세토아세틱 에스테르를 기질로서 적정 용매에 첨가하여 pH를 조절한 상태에서 휘젓는다. 이 반응은 pH 4 내지 10, 온도 10℃ 내지 70℃에서 수행된다. 제조된 기질의 농도가 0.1% 내지 90% (w/v)에 있다하더라도, 기질을 계속해서 첨가할 수도 있다. 반응은 일괄적인 방식 또는 지속적인 방식으로 수행된다.

상기와 같은 미생물을 처리한 생성물은 조 추출물(crude extract), 배양된 미생물체, 동결건조된 유기체(lyophilized organism), 아세톤으로 건조한 유기체, 상기 미생물체의 동종체(homogenates) 등을 가리킨다. 상기 처리된 생성물은 종래기술을 이용하여, 있는 그대로, 즉 효소 또는 미생물체 상태로 고정시켜 사용할 수 있다. 본 기술 분야의 지식을 갖는 자가 알고 있는 방법(예를 들어, 교차결합(corsslinking) 방법, 물리적 흡착 방법, 그리고 트랩(entrapping) 방법)으로써 상기 고정 작업을 수행할 수 있다.

반응에서, 일반적인 NADPH 재생 시스템을 조합하여 이용하면 반응에 이용되는 값비싼 조효소의 양을 크게 줄일 수 있다. 예를 들어, 통상적인 NADPH 재생 시스템인 GDH와 글루코스를 이용하는 방법을 채택할 수 있을 것이다. 효소, 미생물 또는 그 처리 생성물, 기질의 농도, 그리고 이용되는 기타 물질에 따라 달라지기는 하지만 반응 조건은 다음과 같다: 기질 농도는 대략 0.1% 내지 90 wt%이고, 반응온도는 10℃ 내지 50℃, pH는 5 내지 8, 그리고 반응 시간은 1 내지 36시간이다.

CRD 효소유전자 및 상기 효소가 의존하는 조효소를 재생하는 능력을 가진 효소(예를 들어, GDH)의 유전자를 동일 숙주 미생물내에 도입한 형질전환 미생물의 배양물 또는 이의 처리물 등을 이용하여 상기 반응을 수행하게 되면, 별도로 조효소의 재생에 필요한 효소원을 제조할 필요가 없기 때문에 상기 반응은 형질전환된 미생물의 배양물 또는 그 처리 생성물을 이용하여 수행할 수 있는데, (S)-4-할로-3-히드록시-부티릭 에스테르를 저비용으로 생산할 수 있다.

반응으로 만들어진 4-할로-3-히드록시 부티릭 에스테르는 종래 방법으로 정제가 가능하다. 예를 들어, 4-할로-3-히드록시 부티릭 에스테르에 원심분리, 여과 및 미생물이 사용되는 경우 필요한 기타 처리를 수행하여 미생물체와 같은 부유 물질을 제거한다. 그 결과의 생성물은 에틸 아세테이트 및 톨루엔과 같은 유기 용매로 추출하여 황산 나트룸(sodium sulfate)과 같은 탈수제(dehydrant)로 탈수시킨다. 유기 용매는 감압 상태에서 제거된다. 그 결과의 생성물에 다시 감압 증발, 크로마토그래피(예를 들어, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피)와 같은 처리를 수행하여 정제시킨다.

4-할로-3-히드록시 부티릭 에스테르는 가스 크로마토그래피(gas chromatohraphy)를 이용하여 정량될 수 있다. 예를 들어, 에틸 4-클로로-3-히드록시부탄산염은, PEG-20M 크로모소브(Chromosorb) WAWDMCS 10% 80/100 메쉬(mesh) (GL Science Co., Ltd에서 제조됨)으로 채워진 유리 칼럼(ID 3mm×1m)을 150℃에서 이용하는 크로마토그래피로 정량될 수 있으며 FID를 이용하여 검출될 수 있다.

에틸 (S)-4-할로-3-히드록시부탄산염은 광학 분리 컬럼 CHIRALCEL OB(Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에서 생산)을 이용하는 HPLC에 의해 그 광학적 순도가 측정될 수 있다.

그러므로, 위에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 CRD 효소의 대량 생산을 가능하게 한다. 또한, 상기 효소를 이용함으로써 (S)-4-할로-히드록시 부티릭 에스테르와 같은 광학 활성 알코올의 효율적 생산 방법을 제공한다.

지금부터, 본 발명을 실례를 들어 보다 자세히 설명할 것이다. 그러나, 다음의 실시예는 예시적인 것이지 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예에서 채택되는 재조합 DNA 기술에 관한 상세한 조작 방법은 다음의 문헌에서 설명되고 있다.

(I) Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)

(II) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)

[실시예 1]

CRD효소의 정제

칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)IFO 0705 에서부터 비대칭적으로 4-할로-아세토아세틱 에스테르를 환원시켜 (S)-4-할로-히드록시 부티릭 에스테르를 만드는 능력을 갖는 CRD 효소는 전기영동적으로(electrophoretically) 단일 밴드로서 이동되도록 다음과 같은 방식으로 정제되었다.

다음에 보여진 조성(composition)으로 된 액체 배지 800ml가 제조되었으며, 그중 400ml씩 2000ml의 사카구씨 플라스크(Sakaguchi flask)에 투여하여 120℃에서 20분간 증기로 살균하였다.

배지의 조성:

글루코스(glucose) 5%

폴리펩톤(polypepton) 0.5%

KH₂PO₄0.2%

K₂HPO₄0.1%

MgSO₄??7H₂O 0.02%

담수(tap water)

pH 6.5

선 배양(pre-culture)된 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)IFO 0705의 배양물이 5ml/플라스크로 상기 배지에 심어졌고, 30℃에서 3일 동안 격렬히 흔들면서(agitation) 배양되었다. 미생물체는 원심 분리에 의해 상기 과정에 의해 생성된 배양물로부터 수집(collect)되었고, 이후 식염수로 두 차례 세척되었다. 이에 의하여 습윤 미생물체(wet microbe body) 230g를 얻었다. 습윤 미생물체 중에 180g은 50mM의 인산염 버퍼(pH 7.0) 360ml에서 부유하고, 그런 다음 미생물체는 Dyno mill(Dyno-mill에 의해 제조된)에 의해 파괴되었다. 파괴된 미생물체는 세포 파편(cell debris)을 제거하기 위하여 원심 분리되었고, 이후 무세포 추출물(cell-free extract) 760ml을 얻는다. 암모늄 황산염이 상기 무세포 추출물에 첨가 및 용해되어, 40% 포화액을 얻었다. 생성된 침전물은 원심 분리에 의하여 제거되고, 상청액(supernatant)은 0.1mM DTT를 함유하는 10mM 인산염 버퍼(pH 7.0)로 투석되었다. 결과로 생성된 생산물은, 동일 버퍼로 평형이 유지된 DEAE 세파셀(Sephacel)(파르마시아 바이오텍에 의해 제조된) 컬럼(column)(500ml)으로 공급된다. 활성 절편(active fraction)은 상기 컬럼을 통과한 용출용액으로부터 수집되며, NaCl이 상기 수집된 활성 절편에 첨가되어 4M의 최종 농도(concentration)를 얻었다. 활성절편은 4M NaCl 및 0.1 mM DTT를 포함하는 10mM 인산염 버퍼(pH 7.0)에 의해 평형이 유지된 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) CL-4B(Pharmacia Biotech에 의해 제조된) 컬럼(200ml)으로 공급되어, 효소를 흡수하였다. 컬럼이 동일 버퍼에 의해 세척된 후, 활성 단편은 NaCl 선형 경사(linear gradient)(4M에서 0M까지) 및 에틸렌글리콜(0%에서 50%(w/v)까지)이 있는 10mM 인산염 버퍼를 사용하여 용출되었다. 초기 용출된 상기 활성 단편들은 10mM 인산염 버퍼(pH 7.0)에 의해 밤새 수집 및 투석되었다.

결과적인 투석물(dialysate)은, 0.1mM DDT를 포함하는 10mM 인산염 버퍼(pH 7.0)에 의해 평행이 유지된 Mono Q HR 5/5(파르마시아 바이오텍에 의해 제조된 FPLC 시스템) 컬럼(1ml)으로 공급되었으며, 동일 버퍼에 의해 세척되었다. 세척 용액의 활성 절편들은 한외여과에 의하여 200μl로 수집 및 농축되었다. 농축물은 그후, 0.2 M 염화나트륨 및 0.1mM DTT를 포함하는 10mM 인산염 버퍼(pH 7.0)에 의해 평형이 유지된 Superdex 200 HR 10/30 컬럼(24ml)으로 공급되었고, 동일 버퍼에 의하여 용출되었다. 활성 절편들은 정제 효소 표본(purified enzyme specimen)을 얻기 위하여 수집되었다.

[실시예 2]

효소 특성 측정

실시예 1에서 얻어진 효소의 효소적 특성이 검사되었다.

효소 활성은, 기본적으로 기질로써 0.2mM 에틸 4-클로로아세토아세테이트를, 조효소로써 0.32mM NADPH를 포함하는 3 ml 반응 용액 및, 200mM 인산염 버퍼(pH 7.0)의 0.1 ml 효소 용액을 30℃에서 1분간 반응시켜, 340 nm에서의 흡광도의 감소를 측정함에 의하여 결정된다.

(]) 작용 : 조효소로서의 NADPH와 함께 에틸 4-클로로아세토아세테이트에서 작용하여, 99% e.e. 또는 그 이상의 광학 순도를 가지는 에틸 (S)-4-히드록시부탄산염을 생산하는 효소.

(2) 기질 특이성 : 본 발명에 따른 효소는, 에틸 4-클로로아세토아세테이트에 대하여 사용되었던 것과 동일한 상황하에서 기질로써 하기 표 1에 나타난 다양한 카르보닐 화합물을 사용하여 반응될 수 있다. 그 결과, 상기 효소는 표 1에 도시된 것과 같이 기질 특이성을 나타내었다.

(3) 최적 pH : 효소 활성은 인산염 버퍼 또는 삼-염산(tris-hydrochloric acid) 버퍼를 사용하여 pH 5.0에서 8.5의 범위에서 측정되었다. 그 결과, 에틸(S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염에서의 효소 작용에 대한 최적 pH는 5.5 에서 6.5 이었다.

(4) 작용 최적 온도 : 본 발명에 따른 효소의 활성은, 최적 온도를 얻기 위하여 20℃에서 60℃의 온도 범위 내에서 1분간, 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 기질로 사용하여 측정되었다. 그 결과, 최적 온도는 50℃에서 55℃이었다.

(5) 열 안정성: 효소가 본 발명에 따라 30분간 40℃에서 pH 7.0로 처리된 후, 효소의 활성은 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 기질로 사용하여 측정되었다. 그 결과, 처리 이전 활성의 90% 에 해당하는 활성이 남아 있었다.

(6) 억제제: 하기 표 2에 나타낸 개별 농축물을 가지는 다양한 금속 이온 및 억제제가 상기 반응 용액에 첨가되었고, 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 기질로 사용하여 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 활성이 측정되었다. 그 결과, 본 발명에 따른 요소는 표 2에 나타난 것처럼 퀘르세틴 및 수은 이온에 의해 억제되었다.

(7)분자량

상기 요소의 분자량은 전개액으로서 0.1M Na₂SO₄및 0.05% NaN₃를 포함하는 0.1M 인산염 버퍼(pH 7.0) 및 TSK-G3000SW 컬럼을 사용하여 측정되었고 약 76,000으로 밝혀졌다. 상기 효소의 서브유니트의 분자량은 2v/v% 2-메르캅토에탄올의 존재하에서 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 의하여 그것을 전기영동하고 표준 단백질의 상대적인 유동성으로부터 계산하여 결정되었다. 그 결과 상기 효소의 서브유니트의 분자량은 약 32,000으로 나타났다.

(8) 유기 용매 내성: 에틸 아세테이트 또는 부틸 아세테이트의 동등한 양이 본 발명에 따른 효소가 그 안에 용해되어 포함된 인산염 버퍼(pH 7.0)에 첨가되었고, 28℃에서 30분 동안 흔들어진 후 원심분리되었다. 상기 수용액상에서 효소의 잔여 활성이 기질로서 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 사용하여 측정되었다. 그 결과, 에틸 아세테이트 첨가시 72% 활성이, 그리고 부틸 아세테이트를 첨가했을 경우 85% 활성이 남아있었다.

[실시예 3]

본 발명에 따른 효소를 사용한 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시 부탄산염의 생산

본 발명에 따른 정제된 효소 50단위를 포함하는 100mM 인산염 버퍼(pH 6.5) 25㎖, 250mg의 에틸 4-클로로아세토아세테이트, 1.56mg의 NADP, 280mg의 글루코스 및 60단위의 글루코스 탈수소효소(Amino Pharmaceutical Co., Ltd.에 의하여 제조됨)가 30℃에서 24시간 동안 교반되었다. 반응 후에, 상기 반응 용액은 에틸 아세테이트로 추출되었고, 용매 제거 후에 추출물이 분석되었다. 결과적으로 99% e.e. 또는 그 이상의 광학 활성을 갖는 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염이 98%의 수득율로 생성되어졌음이 밝혀졌다.

에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 광학 순도는 광학 분리 컬럼, CHIRALCEL OB(Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조됨)를 사용한 HPLC에 의해 측정되었다. 상기 크로마토그래피는 이동상으로 9/1의 헥산/이소프로파놀의 혼합용매를 사용하여 이동상의 흐름속도 0.8㎖/분에서 수행되었다. 검색은 215nm의 흡광도를 측정함에 의하여 실시되었다.

에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 정량이 PEG-20M Chromosorb WAW DMCS 10% 80/100 메쉬(GL Science Co. Ltd.에 의하여 제조됨)로 채워진 유리컬럼(ID 3 mm×1m)을 사용한 기체 크로마토그래피에 의하여 150℃에서 수행되고 FID에 의하여 검출되었다.

[실시예 4]

본 발명에 따른 효소를 사용하는 에틸 (S)-4-브로모-3-히드록시부탄산염의 생산

본 발명에 따른 정제된 효소의 5단위를 함유하는 100mM 인산염 버퍼(pH 6.5) 2.5㎖, 25mg의 에틸 4-브로모아세토아세테이트, 0.16㎎의 NADP, 28mg의 글루코스 및 6단위의 글루코스 탈수소효소(Amino Pharmaceutical Co., Ltd.에 의하여 제조됨)가 30℃에서 24시간 동안 교반되었다. 반응 후에, 상기 반응 용액은 에틸 아세테이트로 수출되었고, 용매 제거 후에 추출물이 분석되었다. 결과적으로 에틸 (S)-4-브로모-3-히드록시부탄산염이 43%의 수득율로 생성되었음이 밝혀졌다. 에틸 (S)-4-브로모-3-히드록시부탄산염의 정량이 실시예 2에서 에틸 4-클로로-3-히드록시부탄산염에 대한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다.

[실시예 5]

본 발명에 따른 효소를 사용한 메틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 생산

부틸 아세테이트 2.5㎖가 본 발명에 따른 정제된 효소의 5단위를 포함하는 100mM의 인산염 버퍼(pH 6.5) 2.5㎖, 25㎎의 메틸 4-클로로아세토아세테이트, 0.16 mg의 NADP, 28mg의 글루코스 및 6단위의 글루코스 탈수소효소(Amino Pharmaceutical Co., Ltd.에 의하여 제조됨)에 첨가되었고, 30℃에서 24시간 동안 교반되었다. 반응 후에, 상기 반응 용액은 에틸 아세테이트로 추출되었고, 용매 제거 후에 추출물이 분석되었다. 결과적으로 메틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염이 58%의 수득율로 생성되었음이 밝혀졌다. 4-클로로-3-히드록시 메틸 부탄산염의 정량이 실시예 2에서 에틸 4-클로로-3-히드록시부탄산염에 대한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다.

[실시예 6]

본 발명에 따른 효소를 사용한 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 생산; 기질의 연속 첨가

에틸 4-클로로아세토아세테이트 3.8g이 본 발명에 따른 정제된 효소의 100단위를 포함하는 100mM 인산염 버퍼(pH 6.5) 50㎖, 1.56mg의 NADP, 4.5g의 글루코스, 250단위의 글루코스 탈수소효소(Amino Pharmaceutical Co., Ltd.에 의하여 제조됨) 및 0.24g의 NaCl에 시간당 0.23g의 속도로 첨가되었고, 30℃에서 20시간 동안 교반되었다. 반응 후에, 상기 반응 용액은 에틸 아세테이트로 추출되었고, 용매 제거 후에 추출물이 분석되었다. 결과적으로 100% e.e.를 갖는 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염이 91%의 수득율로 생성되었음이 밝혀졌다. 상기 에틸(S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 정량은 실시예 2에서 에틸 4-클로로-3-히드록시부탄산염에 대한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다.

[실시예 7]

CRD 효소 유전자의 클로닝

(염색체 DNA 라이브러리(cromosomal DNA library)의 제작)

염색체 DNA는 Hereford(Cell, 18, 1261(1979))에 의하여 설명된 방법에 따라 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)IFO 0705의 배양된 미생물체로부터 추출되었다. 결과적인 염색체 DNA는 Sau3AI에 의하여 부분적으로 소화되었고, 결과적인 소화물의 크기 23kb 내지 20kb를 갖는 DNA 절편이 EMBL3 박테리오파지 벡터(phage vector)(Stratagene에 의하여 제조됨)의 BamHI 부위로 삽입되었다. 상기 결과적인 재조합 박테리오파지 벡터는 Gigapack II Gold(Stratagene에 의하여 제조됨)를 사용하여 시험관내에서 패키지되어졌고(packaged), 그후 E. coli NM415가 상기 벡터로 감염되는 것을 허용하여 약 20,000 DNA들로 구성된 염색체 DNA 라이브러리를 만들어냈다.

(합성 올리고뉴클레오티드 프로브의 제조)

실시예 1에서 설명된 것처럼 정제된 CRD 효소는 8 M 우레아의 존재하에 변성되었고 그후 아크로모박터(Achrobobacter)로부터 유도된 리실엔도펩티다아제(lysyl endopeptidase)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 의하여 소화되었다. 결과적인 펩티드 절편의 아미노산 서열은 에드만(Edman) 방법에 의하여 결정되었다.

결과적인 아미노산 서열을 기초로, 다음 서열을 갖는 DNA 프로브가 합성되었다.

프로브 1:5'-GCNCAYACNAARAAYGA-3' (서열번호 3)

프로브 2:5'-AAYGTNGARTAYCCNGC-3' (서열번호 4)

프로브 3:5'-CTRGTYCTRCTRCTRTT-3' (서열번호 5)

상기 프로브 1,2 및 3은 메가라벨(Megalabel : Takara Shuzo Co. Ltd.에서 제조됨)을 사용하여³²P가 표지되었고, 상기 표지된 프로브는 다음의 실험에서 사용되었다.

(염색체 DNA 라이브러리로부터 CRD 효소 유전자의 클로닝)

상기 설명된 것처럼 만들어진 염색체 DNA 라이브러리는 상기³²P 표지된 합성DNA 프로브를 사용하는 플라크 혼성화 방법(Science, 196,180(1977))에 의하여 CRD 효소를 포함하는 박테리아파지의 플라크에 대해 스크린되었다. 결과적으로, 하나의 양성 플라크가 얻어졌다. 그때, 상기 양성 플라크로부터 얻어진 재조합 박테리아파지 DNA가 EcoRI 및 HindIII에 의하여 이중 소화되었고, 상기 결과적인 DNA는 써던블로팅(J. Mol. Biol., 98, 53(1975))에 의하여 분석되었다. 결과적으로, EcoRI 및 HindIII에 의한 이중 소화에 의하여 발생된 약 1.3kb의 소화된 절편은 상기 합성된 DNA 프로브에 의하여 혼성화되어짐이 밝혀졌다. 상기 사실을 기초로 하여, 약 1.3kb의 DNA 절편은 재조합 플라스미드 pUC-HE를 구성하도록 플라스미드 pUC19(Takara Shuzo Co., Ltd.에 의하여 제조됨)의 EcoRI-HindIII 부위로 삽입되고, 상기 CRD 효소 유전자를 포함하는 염색체 DNA 클론으로써 선택되었다. 이 플라스미드는 pUC-HE로 명명되었다.

(염기서열의 결정)

다양한 제한 효소는 상기 재조합 플라스미드 pUC-HE와 반응하고, 반응동안 생성된 소화된 단편들이 제한효소 절단지도를 만들기 위하여 분석되었다. 그때, 상기 분석 동안 다양한 DNA 절편은 플라스미드 pUC19의 다중-클로닝 부위로 삽입되어 재조합 플라스미드들을 얻었다. 상기 재조합 플라스미드들을 사용하면 삽입된 각각의 절편들의 염기 서열이 ABI 프리즘 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 레디 반응기 키트(ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit : Perkin Elmer에 의하여 제조됨) 및 ABI 373A DNA 시퀀서(Applied Biosystems에 의하여 제조됨)를 사용하여 분석되었다. 결과적으로 CRD 효소 유전자를 포함한다고 예측되는 약 1.3kb의 상기 DNA 절편의 완전한 염기 서열이 결정되었다. 도 1은 여기서 결정된 염기서열을 보인다. 또한, 상기 염기서열의 구조 유전자 부위에 대한 염기서열로부터 추정된 아미노산 서열이 도 1의 대응하는 염기서열 아래에 제시되어 있다. 상기 아미노산 서열은 정제된 CRD 효소의 리실 엔도펩티다아제 소화된 펩티드 절편의 부분적인 아미노산 서열과 비교되었다. 결과적으로, 정제된 CRD 효소의 부분적인 아미노산 서열이 염기 서열로부터 추정된 아미노산 서열에 존재하고, N 말단에서 메티오닌의 결핍을 제외하고 완전하게 그것들과(도 1의 아미노산 서열에서 밑줄쳐진 부분으로 나타내짐) 동등하다. 상기 N 말단에서의 메티오닌은 단백질 합성 후에 변형에 의하여 제거되는 것으로 생각된다.

[실시예 8]

CRD 효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 제조

E. coli에서 CRD 효소를 발현하도록 형질전환을 위해 사용된 재조합 플라스미드가 구성되었다. 우선, CRD 효소의 구조 유전자의 개시 코돈 부위에 첨가된 NdeI 부위 및 종결 코돈 후에 즉시 첨가된 EcoRI 부위를 갖는 이중-나선 DNA가 다음의 방법으로 취득되었다. 상기 CRD 효소의 구조 유전자의 개시 코돈 부위에 첨가된 NdeI 부위를 갖는 N-말단 DNA 프라이머 및 상기 CRD 효소의 구조 유전자의 종결 코돈 후에 즉시 첨가된 EcoRI부위를 갖는 C-말단 DNA 프라이머가 합성되었다. 상기 두가지 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다:

N-말단 DNA 프라이머

5'-TAGTCGTTAACCATATGGCTAAGAACTTCTCCAAC-3'

(서열 번호 6)

C-말단 DNA 프라이머

5'-TCTGAGTTAACGAATTCTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGT-3'

(서열 번호 7)

상기 두가지 합성된 DNA 프라이머를 사용하면, 주형(template)으로서 실시예 7에서 얻어진 플라스미드 pUC-HE를 사용하여 이중-나선 DNA가 합성되었다. 상기 생성된 DNA 절편은 NdeI 및 EcoRI에 의하여 소화되었고 플라스미드 pUCNT(W094/03613의 라크 프로모터(lac promoter)의 하류부분의 NdeI 및 EcoRI 부위로 삽입되어 재조합 플라스미드 pNTS1이 얻어졌다.

[실시예 9]

CRD 효소 유전자 및 GDH 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 생산

플라스미드 pGDA2 (J. Biol. Chem. (1989), 264,6381)는 EcoRI 및 PstI로 이중 소화되어 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유도된 GDH 유전자를 포함하는 약 0.9kb의 DNA 절편이 분리되었다. 상기 DNA 절편은 재조합 플라스미드 pSLG를 구성하도록 플라스미드 pSL301(인비트로겐(Invitrogen)에 의하여 제조됨)의 EcoRI-PstI 부위에 삽입되었다. 상기 재조합 플라스미드 pSLG는 EcoRI 및 Xhol에 의하여 이중으로 소화되어 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유도된 GDH 유전자를 포함하는 약 0.9kb의 DNA 절편이 분리되었다. 상기 DNA 절편은 실시예 8에서 제조된 상기 pNTS1의 EcoRI-SalI 부위(CRD 유전자의 하류부분에 위치함)에 삽입되어서 재조합 플라스미드 pNTS1G를 얻었다. 상기 pNTS1G의 제조방법 및 구조는 도 2에 도시되었다.

[실시예 10]

재조합 E. coli 의 제조

E. coli HB101(Takara Shuzo Co., Ltd에 의해 제조됨)는 실시예 8에서 얻어진 재조합 플라스미드 pNTS1 및 실시예 9에서 얻어진 재조합 플라스미드 pNTS1G를 사용하여 형질전환되어 각각 재조합 E. coli HB101(pNTS1) 및 HB101(pNTS1G)을 얻었다. 상기 얻어진 형질전환체 E. coli HB101(pNTS1) 및 HB101(pNTS1G)은 국제 무역 및 산업부(Ministry of International Trade and Industry), 산업상 과학 및 기술국(Agency of Industrial Science and Technology), 생명공학 국립학회(National Institute of Bioscience and Human Technology) 및 인간과학기술(Human Technology)에 각 기탁번호 FERM BP-5834 및 FERM BP-5835로 1997년 2월 24일에 기탁되었다.

또한, 실시예 9에서처럼, 플라스미드 pGDA2(J.Biol.Chem.(1989), 264, 6381)는 EcoRI 및 PstI에 의해 이중으로 소화되어 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유도된 GDH 유전자를 포함하는 약 0.9kb의 DNA 절편이 분리되었다. 상기 DNA 절편은 플라스미드 pSTV28(Takara Shuzo Co., Ltd.에 의하여 제조됨)의 EcoRI-PstI 부위로 삽입되어 재조합 플라스미드 pSTVG를 제조하였다. 염화칼슘 방법에 의하여 사전에 적정화된 E. coli HB101(pNTS1)는 상기 pSTVG로 형질전환되어 E. coli HB101(pNTS1, pSTVG)가 얻어졌다.

[실시예 11]

재조합 E. coli에서 CRD 효소의 발현

(재조합 E. coli에서 CRD 효소 활성의 결정)

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1)은 암피실린 50㎍/㎖을 함유하는 2×YT 배지에서 배양되고, 수집되고, 100mM 인산염 버퍼(pH 6.5)에서 부유되었으며, 초음파 치료법(Ultrasonic treatment)을 통해 무세포 추출물을 얻었다. 상기 무세포 추출물의 CRD 효소 활성은 다음 방법으로 측정되었다. 즉, 기질로써의 1mM 에틸 4-클로로아세토아세테이트, 조효소로써의 0.1mM NADPH 및 상기 효소가 반응을 위해 100mM 인산염 버퍼(pH 6.5)에 첨가되었고, 340nm에서 흡광도의 감소가 30℃에서 측정되었다. 이러한 반응 조건에서, 1분내에 NADPH 1μmol의 NADP로의 산화가 효소 활성 1단위(unit)로 정의되었다. 무세포 추출물에서 상기 측정된 CRD 효소 활성은 비활성으로 나타났고, 벡터 플라스미드만을 사용한 형질전환체의 효소 활성과 비교되었다. 또한, 실시예 1에서 설명된 것과 실질적으로 동일한 방법으로 제조된 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)IFO 0705의 무세포 추출물에서의 상기 CRD 효소 활성이 비교되기 위해 얻어졌다. 상기 결과는 하기 표 3에 보여진다. 상기 E. coli HB101(pNTS1)는 벡터 플라스미드만을 사용하여 형질전환된 E. coli HB101(pUCNT)와 비교하여 CRD 효소 활성의 명확한 증가를 나타냈고, 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)IFO 0705의 효소 활성의 약 8.5배 활성을 나타냈다.

(N-말단 서열의 비교)

상기 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)IFO 0705의 무세포 추출물 및 상기 설명된 발현 실험에서와 실제적으로 같은 방법으로 얻어진 무세포 추출물로부터 정제된 각 CRD 효소의 N 말단에서 아미노산 서열이 에드만(Edman) 방법에 의하여 30 잔기 이상에서 결정되었다. 상기 결과적인 N-말단 아미노산 서열이 비교되었고 상기 범위에서 서로 완전하게 동등한 것이 발견되었다.

[실시예 12]

재조합 E. coli에서 CRD 효소 및 GDH의 동시 발현

실시예 11에서 설명된 방법으로 실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G) 및 E. coli HB101(pNTS1, pSTVG)를 처리하여 얻어진 무세포 추출물의 GDH 활성이 다음과 같이 측정되었다. 즉, 기질로서 0.1M 글루코스, 조효소로서 2mM NADP 및 상기 효소가 반응을 위하여 1M 트리스 염산 버퍼(tris hydrochloric acid buffer)(pH 8.0)에 첨가되었고, 340nm에서 흡광도의 증가가 25℃에서 측정되었다. 상기 반응 조건에서, 1분내에 1μmol NADP의 NADPH로의 환원은 효소 활성의 1단위(unit)로서 정의되었다. 또한, 상기 CRD효소 활성은 실시예 10에서와 같이 측정되었다. 상기 무세포 추출물에서 측정된 CRD 효소 활성 및 GDH 효소 활성은 비활성으로 나타내졌고, 벡터만을 사용한 재조합 E. coli HB101(pNTS1), HB101(pNTS1, pSTVG) 및 형질전환체 HB101(pUCNT)의 활성과 비교되었다. 상기 결과는 하기 표 4에 제시된다. 벡터 플라스미드만을 사용하여 형질전환된 E. coli(pUCNT)와 비교하여 상기 E. coli HB101(pNTS1G) 및 HB101(pNTS1, pSTVG)는 CRD 효소 활성 및 GDH 활성의 명확한 증가를 나타냈다.

[실시예 13]

CRD 효소 유전자가 도입된 재조합 E. coli를 사용하여 4-할로 아세토아세틱에스테르(4-halo-acetoacetic ester)로부터 (S)-4-할로-3-히드록시 부티르 에스테르((S)-halo-3-hydroxy butyric ester)의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. GDH(Amano Pharmaceutical Co. Ltd.에서 제조됨) 1250U, 5.5g의 글루코스 및 1.6mg의 NADP가 50㎖의 상기 합성 배지에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌다. 섞는 동안, 에틸 4-클로로아세토아세테이트가 매 15분마다 250mg씩 배양물에 첨가되었다. 이러한 방법으로, 5g의 4-클로로아세토아세테이트 전체가 첨가되었고, 상기 반응은 5시간 동안 수행되었다. 상기 반응 후에, 상기 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매 제거 후에 추출물이 분석되었다. 결과적으로 100% e.e.의 광학 순도를 갖는 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염이 90%의 수득율로 생성되었음이 밝혀졌다.

에틸 4-클로로-3-히드록시부탄산염의 정량이 PEG-20M Chromosorb WAW DMCS 10% 80/100 메쉬(GL Science Co., Ltd.에 의하여 제조됨)로 채워진 유리 컬럼(ID 3 mm×1m)을 사용한 기체 크로마토그래피에 의하여 150℃에서 수행되고 FID에 의하여 검출되었다.

에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 광학 순도는 광학 분리 컬럼, CHIRALCEL OB (Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조됨)를 사용한 HPLC에 의하여 측정되었다. 상기 크로마토그래피는 이동상의 흐름 속도 0.8㎖/분에서 이동상으로서 헥산/이소프로파놀 9/1의 혼합 용매를 사용하여 수행되었다. 상기 검출은 215 nm의 흡광도를 측정함에 의하여 실행되었다.

[실시예 14]

동시에 발현된 CRD 효소 및 GDH를 갖는 재조합 E. coli를 사용하여 4-할로-아세토아세틱 에스테르로부터 (S)-4-할로-3-히드록시 부티르 에스테르의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 5.5g의 글루코스 및 3.2mg의 NADP가 50㎖의 상기 합성 배지에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌다. 섞는 동안, 에틸 4-클로로아세토아세테이트가 매15분마다 250mg씩 배양물에 첨가되었다. 이러한 방법으로, 5g의 에틸 4-클로로아세토아세테이트 전체가 첨가되었고, 상기 반응은 5시간 동안 수행되었다. 상기 반응 후에, 상기 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매 제거 후에 추출물이 분석되었다. 결과적으로 100% e.e.의 광학 순도를 갖는 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄삼염이 92%의 수득율로 생성되었음이 밝혀졌다.

에틸 4-클로로-3-히드록시부탄산염의 정량 및 광학 순도의 측정은 실시예 13에서 사용된 것과 실질적으로 동일한 방법으로 수행되었다.

[실시예 15]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 4-클로로-아세토아세테이트로부터 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 19.2g의 글루코스 및 2.5mg의 NADP가 40㎖의 상기 생성된 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌다. 섞는 동안, 16.1g의 에틸 4-클로로아세토아세테이트 전체가 한시간 당 약 2g의 속도로 배양물에 연속적으로 첨가되었다. 상기 반응이 24시간 동안 수행되었다. 상기 반응 후에, 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 강압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되어 15.6g의 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염을 얻었다. 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 광학 순도는 HPLC 방법에 의하여 분석되었고, 100% e.e.임이 밝혀졌다. 1H NMR (CDC13)δ(ppm): 1.33 (3H,t). 2.65 (2H,d), 3.31 (1H,d), 3.60 (2H,d), 4.2 (3H,m); 컬럼: Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조된 Chiralcel OB(0.46×25cm); 컬럼온도: 0℃; 용출액(eluent): 9/1의 n-헥산/2-프로판올; 유속:0.8ml/분; 검출: 215nm; 용출시간: (S)에 대하여 19.2 분, (R)에 대하여 17.0분.

[실시예 16]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 4-클로로 아세토아세테이트로부터 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 9.6g의 글루코스가 40㎖의 상기 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌다. 섞는 동안, 8.1g의 에틸 4-클로로아세토아세테이트가 시간당 약 2g의 속도로 상기 배양물에 연속적으로 첨가되었다. 상기 반응은 24시간 동안 행해졌다. 상기 반응 후에, 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매 제거 후에 농축물이 분석되었다. 결과적으로 100% e.e.의 광학 순도를 갖는 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염이 96%의 수득율로 생성되었음이 밝혀졌다.

[실시예 17]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 4-브로모아세토아세테이트로부터 에틸 (S)-4-브로모-3-히드록시부탄산염의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 1.3g의 글루코스 및 3.2mg의 NADP 그후에 1g의 에틸 4-브로모아세토아세테이트가 50㎖의 상기 생성된 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌고 18시간 동안 반응되었다. 상기 반응 후에 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 감압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 크로마토그래피에 의하여 정제되어 900mg의 에틸 (S)-4-브로모-3-히드록시부탄산염을 얻었다. 에틸 (S)-4-브로모-3-히드록시부탄산염의 광학 순도가 다음과 같이 분석되었고, 100% e.e.임이 밝혀졌다. 즉, 샘플은 피리딘의 존재 하에서 페닐이소시아네이트(phenyl isocyanate)를 사용하여 카바메이트(cabamate)로 전환되었고, 상기 카바메이트의 광학 순도는 HPLC 방법에 의하여 측정되었다. 1H NMR(CDC13)δ(ppm): 1.38 (3H,t). 2.75 (2H,m), 3.28 (1H,br), 3.51 (2H,m), 4.18(3H,q), 4.25(1H,m); 컬럼; Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조된 Chiralcel 0J(0.46×25cm); 컬럼온도: 25℃; 용출액: 9/1의 n-헥산/2-프로판올; 유속: 0.8ml/분; 검출: 254nm; 용출시간: (S)에 대하여 24.2 분, (R)에 대하여 27.8분.

[실시예 18]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 4-요오드아세토아세테이트로부터 에틸 (S)-4-요오드-3-히드록시부탄산염의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 0.5g의 글루코스 및 3.2mg의 NADP 그후에 0.5g의 에틸 4-요오드 아세토아세테이트가 50㎖의 상기 생성된 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌고 72시간 동안 반응되었다. 상기 반응 후에 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 감압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되어 900mg의 에틸 (S)-4-요오드-3-히드록시부탄산염을 얻었다. 에틸 (S)-4-요오드-3-히드록시부탄산염의 광학 순도가 다음과 같이 분석된 후에 91.6% e.e.임이 밝혀졌다. 즉, 샘플은 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide)에서 소디움 시아나이드(sodium cyanide)와 함께 열처리되어 에틸 4-시아노-3-히드록시부탄산염을 얻었고 피리딘 존재하에서 벤조익 클로라이드(benzoic chloride)를 사용하여 벤조익 에스테르(benzoic ester)로 변화되었다. 상기 벤조익 에스테르의 광학 순도는 HPLC 방법에 의하여 측정되었다. NMR (CDC13)δ(ppm): 1.28 (3H,t). 2.65 (2H,d), 3.31 (3H,m), 4.00 (1H,m), 4.20 (2H,q); 컬럼: Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조된 Chiralpak AS(0.46×25cm); 컬럼 온도: 25℃; 용출액: 95/5의 n-헥산/에탄올; 유속: 1ml/분; 검출: 254nm; 용출시간: (S)에 대하여 19.6분 , (R)에 대하여 21.3분.

[실시예 19]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 메틸 4-클로로아세토아세테이트로부터 메틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 7.2g의 글루코스 및 3.2mg의 NADP 그후에 4g의 메틸 4-클로로아세토아세테이트가 50㎖의 상기 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌고 24시간 동안 반응되었다. 상기 반응 후에 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 감압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되어 3.85g의 메틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염을 얻었다. 메틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염의 광학 순도가 다음과 같이 분석된 후에 100% e.e.임이 밝혀졌다. 즉, 샘플은 피리딘의 존재 하에서 페닐 이소시아네이트를 사용하여 카바메이트(cabamate)로 전환되었고, 상기 카바메이트의 광학 순도는 HPLC 방법에 의하여 측정되었다. 1H NMR (CDC13)δ(ppm): 2.65 (2H,m). 3.20 (1H,br), 3.63 (2H,m), 3.73 (3H,s), 4.28 (1H,m); 컬럼: Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조된 Chiralcel 0J(0.46×25cm); 컬럼 온도: 25℃; 용출액: 8/2의 n-헥산/2-프로판올; 유속: 1ml/분; 검출: 254nm; 용출시간: (S)에 대하여 19.2 분, (R)에 대하여 22.6분.

[실시예 20]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 4-아지드아세토아세테이트로부터 에틸 (S)-4-아지드-3-히드록시부탄산염의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 3.1g의 글루코스 및 3.2g의 NADP, 그후에 2g의 에틸 4-아지드아세토아세테이트가 50㎖의 상기 생성된 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌고 72시간 동안 반응되었다. 상기 반응 후에 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 감압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되어 1.6g의 에틸 (S)-4-아지드-3-히드록시부탄산염을 얻었다. 에틸 (S)-4-아지드-3-히드록시부탄산염의 광학 순도가 HPLC 방법에 의해 분석된 후에 90% e.e.임이 밝혀졌다. 1H NMR (CDC13)δ(ppm): 1.25 (3H,t). 2.55 (2H,d), 3.30-3.35 (3H,m), 4.20 (3H,m); 컬럼: Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조된 Chiralcel OB(0.46×25cm); 컬럼 온도: 25℃; 용출액: 9/1의 n-헥산/2-프로판올: 유속:1ml/분; 검출: 254nm; 용출시간: (S)에 대하여 16.2 분, (R)에 대하여 19.6분.

[실시예 21]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 4-히드록시아세토아세테이트로부터 에틸 (S)-3,4-디히드록시부탄산염의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 7.4g의 글루코스 및 3.2mg의 NADP 그후에 4g의 에틸 4-히드록시아세토아세테이트가 50㎖의 상기 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌고 18시간동안 반응되었다. 상기 반응 후에 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 감압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되어 3.2g의 에틸 (S)-3,4-디히드록시부탄산염을 얻었다. 상기 에틸 (S)-3,4-디히드록시부탄산염의 광학 순도가 분석된 후에 100% e.e.임이 밝혀졌다. 상기 분석은 다음의 방법으로 행해졌다. 샘플은 실온에서 에탄올에서 소디움시아나이드와 반응하여 4-시아노-3-히드록시 에틸 부탄산염을 얻었고, 피리딘의 존재 하에서 벤조일 클로라이드를 사용하여 벤조익 에스테르로 전환되었다. 상기 벤조익 에스테르의 광학 순도는 HPLC 방법에 의하여 측정되었다. 1H NMR(CDC13)δ(ppm): 1.30 (3H,t). 2.55 (2H,m), 3.18 (1H,br), 3.55 (1H,d), 3.68 (1H,d), 4.15 (1H,s), 4.20(2H,q) ; 컬럼: Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.에 의하여 제조된 Chiralpak AS(0.46×25cm); 컬럼 온도: 25℃; 용출액: 95/5의 n-헥산/에탄올; 유속: 1ml/분; 검출: 254nm; 용출시간: (S)에 대하여 19.6 분, (R)에 대하여 21.3분

[실시예 22]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 2-메틸-3-옥소아세테이트(ethyl 2-methyl-3-oxoacetate)의 환원에 의한 에틸 3-히드록시-2-메틸부탄산염(ethyl 3-hydroxy-2-methylbutyrate의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 7.5g의 글루코스 및 3.2mg의 NADP, 그후에 4g의 에틸 2-메틸-3-옥소아세테이트가 50㎖의 상기 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌고 18시간 동안 반응되었다. 상기 반응 후에 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 감압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되어 3.5g의 에틸 3-히드록시-2-메틸부탄산염을 얻었다. 상기 에틸 3-히드록시-2-메틸부탄산염의 광학 순도는 다음과 같이 측정되었고 91.6% e.e.임이 밝혀졌다. 분석은 다음과 같이 수행되었다. 샘플은 실온에서 디메틸 설폭시드에서 소디움 시아나이드와 실온에서 반응하여 에틸 4-시아노-3-히드록시 부탄산염을 얻었고, 피리딘의 존재 하에서 벤조일 클로라이드를 사용하여 벤조익 에스테르로 전환되었다. 상기 벤조익 에스테르의 광학 순도는 HPLC 방법에 의하여 측정되었다.1HNMR (CDC13)δ(ppm): 1.17 (3H,t). 1.22 (2H,t), 1.28 (3H,t), 2.46 (1H,m), 2.82(1H,br), 3.90 (1H,m), 4.18 (2H,q).

[실시예 23]

동시에 CRD 효소 및 GDH를 발현하는 재조합 E. coli를 사용하여 에틸 2-클로로-3-옥소아세테이트(ethyl 2-chloro-3-oxoacetate)의 환원에 의한 에틸 2-클로로-3-히드록시부탄산염(ethyl 2-chloro-3-hydroxybutyrate의 합성

실시예 10에서 얻어진 재조합 E. coli HB101(pNTS1G)이 500㎖ 사카구찌 플라스크(Sakaguchi flask)에서 살균된 100㎖의 2×YT 배지에 심어졌고, 37℃에서 13시간동안 격렬히 흔들면서 배양되었다. 6.5g의 글루코스 및 3.2mg의 NADP, 그후에 4g의 에틸 2-클로로-3-옥소아세테이트가 50㎖의 상기 생성된 배양물에 첨가되었다. 상기 배양물은 pH 6.5에서 5M 수산화나트륨 용액과 적용되면서 30℃에서 섞여졌고 18시간 동안 반응되었다. 상기 반응 후에 반응 용액은 에틸 아세테이트를 사용한 추출이 행해졌고 용매가 감압하에 제거되었고, 상기 농축물은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제되어 3.8g의 에틸 2-클로로-3-히드록시부탄산염을 얻었다. 1H-NMR (CDC13)δ(ppm): 1.35 (6H,m). 2.55 (1H,br), 4.15 (1H,d), 4.25 (1H,m), 4.30(2H,q).

본 발명은 카르보닐 화합물을 비대칭적으로 환원하여 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 카르보닐 환원 활성을 가지는 효소(이하, 상기 효소는 CRD 효소로 칭함), 상기 효소를 암호화하는 DNA, 상기 DNA를 함유하는 플라스미드, 상기 플라스미드로 변환되는 세포인 형질전환체, 및 효소 및/또는 형질전환된 세포를 사용하여 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법에 관한 것이다. (S)-4-할로-3-히드록시 부티릭 에스테르((S)-4-halo-3-hydroxy butyric ester)와 같은 제조되는 광학적으로 활성인 알코올은 약품 또는 농업용 화학품 또는 그 유사물의 합성에 천연물질로 유용한 화합물이다.

신규한 CRD 효소를 사용함에 의하여, 약제 등을 위한 합성 중간체로써 유용한 (S)-4-할로-3-히드록시부티르 에스테르와 같은 광학 활성 알코올이 효율적으로 생성될 수 있다.

상기 CRD 효소 유전자를 클로닝하고 상기 유전자의 염기 서열을 분석함에 의하여 상기 CRD 효소를 고도로 생성할 수 있는 형질전환체가 얻어질 수 있다. 또한 동시에 상기 CRD 효소 및 GDH를 고도로 생성하는 형질전환체가 얻어질 수 있다.

상기 형질전환체를 사용하여 4-할로-아세토아세틱 에스테르와 같은 카르보닐 화합물로부터 (S)-4-할로-3-히드록시부틸릭 에스테르와 같은 광학 활성 알코올의 합성을 보다 효율적으로 수행할 수 있다.

서열 목록

서열 번호 1

서열 길이: 283

서열 유형: 아미노산

분자 유형: 펩티드

토폴로지: 선형

서열 기재:

서열 번호 2

서열 길이: 852

서열 유형: 핵산

쇄의 수: 2본쇄

토폴로지: 선형

서열 유형: 게놈 DNA

서열 기재:

서열 번호 3

서열 길이: 17

서열유형: 핵산

쇄의 수: 단일

토폴로지: 선형

서열 유형: 합성 DNA

서열 기재:

GCNCAYACNA ARAAYGA

서열번호 4

서열 길이: 17

서열 유형: 핵산

쇄의 수: 단일

토폴로지: 선형

서열 유형: 합성 DNA

서열 기재:

AAYGTNGART AYCCNGC

서열번호 5

서열 길이: 17

서열 유형: 핵산

쇄의 수: 단일

토폴로지: 선형

서열 유형: 합성 DNA

서열기재:

CTRGTYCTRC TRCTRTT

서열번호 6

서열 길이: 35

서열 유형: 핵산

쇄의 수: 단일

토폴로지: 선형

서열 유형: 합성 DNA

서열기재:

TAGTCGTTAA CCATATGGCT AAGAACTTCT CCAAC

서열번호 7

서열 길이: 40

서열 유형: 핵산

쇄의 수: 단일

토폴로지: 선형

서열 유형: 합성 DNA

서열 기재:

TCTGAGTTAA CGAATTCTTA GGGAAGCGTG TAGCCACCGT

Claims

이하 (1) 내지 (4)의 물리적 및 화학적 성질을 가지는 카르보닐 환원효소:

(1) 작용 :

NADPH를 조효소로 하고, 에틸 4-클로로아세토아세테이트에 작용하여, 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염을 생성함;

(2) 기질특이성 :

에틸 4-클로로아세토아세테이트에 대해 강한 활성을 나타내는 반면, 에틸 아세토아세테이트에는 실질적으로 활성을 나타내지 않음;

(3) 적정 pH: 5.5 내지 6.5; 및

(4) 작용 적정온도: 50℃ 내지 55℃
제 1 항에 있어서, 이하의 (5) 내지 (7)의 물리적 및 화학적 성질을 더욱 포함함을 특징으로 하는 카르보닐 환원효소 :

(5) 열안정성 : pH 7.0에서 30분간 처리했을 때 약 40℃까지 안정함;

(6) 억제제 : 수은 이온 및 퀘르세틴(quercetin)에 의해 억제됨; 및

(7) 분자량 : 겔 여과분석에 있어서 약 76,000이며, SDS 폴리아크릴아미드 전기영동 분석에 있어서 약 32,000임.
서열목록의 서열번호 1의 아미노산서열 또는 서열목록의 서열번호 1의 아미노산서열에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산서열 또는 그 일부를 가지며, 에틸 4-클로로아세토아세테이트를 비대칭적으로 환원하여 에틸 (S)-4-클로로-3-히드록시부탄산염을 생성하는 활성을 가짐을 특징으로 하는 카르복실 환원효소.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 칸디다(Candida) 속에 속하는 미생물로부터 얻어지는 것임을 특징으로 하는 카르보닐 환원효소.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae)로부터 얻어지는 것임을 특징으로 하는 카르보닐 환원효소.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 칸디다 마그노리에(Candida magnoliae) IFO 0705로부터 얻어지는 것임을 특징으로 하는 카르보닐 환원효소.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 효소를 암호화하는 DNA.
제 7 항에 있어서, 상기 DNA는 서열목록의 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 7 항 또는 제 8 항의 DNA를 가지는 플라스미드.
제 9 항에 있어서, 상기 플라스미드는 pNTS1인 것을 특징으로 하는 플라스미드
제 9 항 또는 제 10 항의 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환세포.
제 11 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 E.coli인 것을 특징으로 하는 형질전환세포.
제 11 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 E.coli HB1O1(pNTS1)인 것을 특징으로 하는 형질전환세포.
하기의 일반식:

으로 나타내어지는 (S)-4-할로-3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법에 있어서,

(이때 R₁은 할로겐 원자이며, R₂는 수소이며, R₃는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기임)

상기 방법은 하기의 일반식:

(이때 R₁은 할로겐 원자이며, R₂는 수소이며, R₃는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기임)

으로 나타내어지는 4-할로 아세토아세틱 에스테르와, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 효소 또는 상기 효소를 생산하는 능력을 가지는 미생물의 배양물 또는 그 처리물과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 (S)-4-할로-3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 할로겐 원자는 염소 또는 브롬이며, 상기 R₃는 1 내지 4의 탄소를 가지는 알킬기인 것을 특징으로 하는 (S)-4-할로-3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 기질은 메틸 4-클로로아세토아세테이트, 에틸 4-클로로아세토아세테이트, 메틸 4-브로모아세토아세테이트, 또는 에틸 4-브로모아세토아세테이트인 것을 특징으로 하는 (S)-4-할로-3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 칸디다(Candida) 속에 속하는 미생물인 것울 특징으로 하는 (S)-4-할로-3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 미생물은 칸디다 마그노리에(Candida magnolie)인 것을 특징으로 하는 (S)-4-할로-3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 18 항에 있어서, 상기 미생물은 칸디다 마그노리에(Candida magnolie) IFO 0705인 것을 특징으로 하는 (S)-4-할로-3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 (S)-4-할로-3-히드록시-부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
하기의 일반식:

으로 나타내어지는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법에 있어서,

상기 방법은 하기의 일반식:

으로 나타내어지는 3-옥소-부틸릭 에스테르를 비대칭적으로 환원하여 이하의 일반식:

으로 나타내어지는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 활성을 가지는 효소를 암호화하는 DNA를 갖는 플라스미드에 의해 형질전환된 세포인 형질전환체를, 이하의 일반식:

으로 나타내어지는 3-옥소 부틸릭 에스테르와 반응시키는 단계, 및 생성된 이하의 일반식:

으로 나타내어지는 광학적으로 활성인 3-히드록시-부틸릭 에스테르를 채취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 일반식의 R₁및 R₂는 각각 독립적으로 할로겐, 아지드, 벤질 아미노 또는 수소로서 이때 R₁및 R₂중 어느 일방은 수소이며, R₃는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기이거나, 또는 상기 일반식의 R₁및 R₂는 각각 독립적으로 알킬기, 수산화(hydroxide)기 또는 수소로서 이때 R₁및 R₂중 어느 일방은 수소이며, R₃은 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 일반식의 R₁은 히드록시기이며, R₂는 수소이며, R₃는 에틸기인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법
제 22 항에 있어서, 상기 일반식의 R₁은 염소이며, R₂는 수소이며, R₃는 에틸기인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법
제 21 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르를 제조하는 방법
제 7 항 또는 제 8 항의 DNA 및 글루코스 탈수소효소를 암호화하는 DNA를 가지는 플라스미드.
제 26 항에 있어서, 상기 글루코스 탈수소효소는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 플라스미드.
제 27 항에 있어서, 상기 플라스미드는 pNTS1G인 것을 특징으로 하는 플라스미드.
제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항의 플라스미드에 의해 형질전환된 세포.
제 29 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 E. coli인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
제 30 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포가 E. coli HB101(pNTS1G)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법에 있어서,

카르보닐 화합물을 비대칭적으로 환원하여 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 활성을 갖는 효소를 암호화하는 DNA 및 상기 효소가 의존하는 조효소를 재생성하는 능력을 갖는 효소를 암호화하는 DNA를 가지는 플라스미드로 형질전환된 형질전환세포와 카르보닐 화합물을 반응시키는 단계; 및

생성된 광학적으로 활성인 알코올을 채취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 32 항에 있어서, 상기 조효소를 재생성하는 능력을 갖는 효소는 글루코스 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 32 항에 있어서, 상기 형질전환세포는 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항의 형질전환세포인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카르보닐 화합물은 하기의 일반식:

으로 나타내어지는 3-옥소-부틸릭 에스테르이며, 상기 생성된 광학적으로 활성인 알코올은 이하의 일반식:

으로 나타내어지는 광학적으로 활성인 3-히드록시 부틸릭 에스테르인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 일반식의 R₁및 R₂가 각각 독립적으로 할로겐, 아지드, 벤질 아미노 또는 수소로서 이때 R₁및 R₂중 어느 일방은 수소이며, R₃은 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기이거나, 또는 상기 일반식의 R₁및 R₂는 각각 독립적으로 알킬기, 히드록시기 또는 수소로서 이때 R₁및 R₂중 어느 일방은수소이며, R₃는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 36 항에 있어서, 상기 R₁은 염소이며, R₂는 수소이며, R₃는 에틸기인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 7 항 또는 제8항의 DNA를 가지는 제1 플라스미드 및 글루코스 탈수소효소를 암호화하는 DNA를 가지는 제2 플라스미드에 의해 형질전환된 세포.
제 38 항에 있어서, 상기 제1 플라스미드는 pNTS1이며, 상기 글루코스 탈수소효소는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 E. coli인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법에 있어서,

카르보닐 화합물을 비대칭적으로 환원시켜 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 활성을 갖는 효소를 암호화하는 DNA를 가지는 제1 플라스미드 및 상기 효소가 의존하는 조효소를 재생성하는 능력을 갖는 효소를 암호화하는 DNA를 가지는 제2 플라스미드에 의해 형질전환된 세포를 카르보닐 화합물과 반응시키는 단계; 및 생성된 광학적으로 활성인 알코올을 채취하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 41 항에 있어서, 상기 조효소를 재생성하는 능력을 갖는 효소는 글루코스 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 41 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항의 형질전환된 세포인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카르보닐 화합물은 하기의 일반식:

으로 나타내어지는 3-옥소-부틸릭 에스테르이며, 상기 생성된 광학적으로 활성인 알코올은 하기의 일반식:

으로 나타내어지는 광학적으로 활성인 3-히드록시-부틸릭 에스테르인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 44 항에 있어서, 상기 일반식의 R₁및 R₂는 각각 독립적으로 할로겐, 아지드, 벤질 아미노 또는 수소로서 이때 R₁및 R₂중 어느 일방은 수소이며, R₃는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기이거나, 또는 상기 일반식의 R₁및 R₂는 각각 독립적으로 알킬기, 히드록시기 또는 수소로서 이때 R₁및 R₂중 어느 일방은 수소이며, R₃는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기 또는 아릴기인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.
제 45 항에 있어서, 상기 일반식의 R₁은 염소이며, R₂은 수소이며, R₃은 에틸기인 것을 특징으로 하는 광학적으로 활성인 알코올을 제조하는 방법.