WO1998035025A1 - Nouvelle carbonyle reductase, gene codant celle-ci et procede d'utilisation - Google Patents

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WO1998035025A1
WO1998035025A1 PCT/JP1997/003051 JP9703051W WO9835025A1 WO 1998035025 A1 WO1998035025 A1 WO 1998035025A1 JP 9703051 W JP9703051 W JP 9703051W WO 9835025 A1 WO9835025 A1 WO 9835025A1
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WO
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enzyme
ethyl
plasmid
transformed cell
general formula
Prior art date
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PCT/JP1997/003051
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French (fr)
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Yoshihiko Yasohara
Noriyuki Kizaki
Junzo Hasegawa
Masaru Wada
Sakayu Shimizu
Michihiko Kataoka
Kazuhiko Yamamoto
Hiroshi Kawabata
Keiko Kita
Original Assignee
Kaneka Corporation
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/002—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by oxidation/reduction reactions

Definitions

  • Novel sulfonyl reductase a gene encoding the same, and methods for using them
  • the present invention relates to an enzyme having carbonyl reducing activity (hereinafter, referred to as CRD enzyme) for asymmetrically reducing a carbonyl compound to produce an optically active alcohol, a DNA encoding the enzyme, a plasmid having the DNA,
  • CRD enzyme carbonyl reducing activity
  • the present invention relates to a transformed cell, and a method for producing an optically active alcohol using the enzyme and / or the transformed cell.
  • the obtained optically active alcohol for example, (S) -4-octa-3-hydroxybutyrate is a compound useful as a raw material for synthesis of pharmaceuticals, agricultural chemicals and the like.
  • CRD enzymes require reduced coenzymes for their reactions.
  • a regeneration system that converts oxidized coenzyme to a reduced form by adding saccharides such as glucose to the reaction system.
  • saccharides such as glucose
  • the present inventors have found a new CRD enzyme derived from the genus Candida, and have found that by using this CRD enzyme, an optically active alcohol can be efficiently produced from a carbonyl compound. It has been found that optically active alcohols can be efficiently produced by using a transformed cell that simultaneously contains a gene for an enzyme capable of regenerating a coenzyme (eg, a glucose dehydrogenase gene). .
  • the present invention described herein provides a novel CRD enzyme, a DNA encoding the enzyme, a plasmid having the DNA, a transformed cell transformed with the plasmid, and the enzyme and / or the transformed cell. This enables the advantage of providing a method for producing an optically active alcohol using the method. Disclosure of the invention
  • the carbonyl reductase of the present invention has the following physicochemical properties (1) to (4):
  • the carbonyl reductase further has the following physicochemical properties (5) to (7):
  • the carbonyl reductase of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or An enzyme having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or an amino acid sequence thereof or a part thereof. It has the activity of producing ethyl (S) -4-chloro-3-hydroxybutyrate upon reduction.
  • the enzyme is from a microorganism of the genus Candida. In a preferred embodiment, the enzyme is from Candida magnoliae. In a more preferred embodiment, the enzyme is derived from Candida magnoliae strain IFO 0705.
  • the DNA of the present invention encodes the enzyme. In one embodiment, the DNA has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • the plasmid of the present invention has the DNA.
  • the plasmid is pNTSl.
  • the transformed cell of the present invention is a transformed cell transformed with the above plasmid.
  • the transformed cells are E. coli.
  • the transformed cell is E. coli HBlOl (pNTSl).
  • the plasmid of the present invention comprises a DNA encoding an enzyme having an activity to asymmetrically reduce 4-chloroacetoacetate to produce (S) -4-chloro-3-ethylhydroxybutyrate; DNA encoding an enzyme capable of regenerating a coenzyme (eg, glucose dehydrogenase).
  • the glucose dehydrogenase is derived from Bacillus megaterium.
  • the plasmid is pNTSlG.
  • the transformed cell of the present invention is a transformed cell transformed with the above plasmid.
  • the transformed cells are E. coli.
  • the transformed cells are E. coli HB101 (pNTSlG).
  • the transformed cell of the present invention has a DNA encoding an enzyme having an activity of asymmetrically reducing 4-ethyl chloroacetoacetate to produce (S) -4-chloro-3-ethyl 3-hydroxybutyrate.
  • Transformed cells transformed with one plasmid and a second plasmid having a DNA encoding an enzyme capable of regenerating a coenzyme upon which the enzyme depends eg, glucose dehydrogenase.
  • the transformed cells are transformed with the plasmid pNTSl and a plasmid having DNA encoding glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium. Cells.
  • the transformed cell is E. coli.
  • the process for producing an optically active 3-hydroxy-butyrate according to the present invention has an activity of asymmetrically reducing 3-oxo-butyrate to produce an optically active 3-hydroxy-butyrate.
  • the method for producing an optically active 3-hydroxy-butyrate according to the present invention has an activity of asymmetrically reducing 3-oxo-butyrate to produce an optically active 3-hydroxy-butyrate.
  • the method for producing an optically active alcohol according to the present invention comprises a DNA encoding an enzyme having an activity to generate an optically active alcohol by asymmetrically reducing a carbonyl compound, and the ability to regenerate a coenzyme on which this enzyme depends
  • the method for producing an optically active alcohol of the present invention comprises a DNA encoding an enzyme having an activity of generating an optically active alcohol by asymmetrically reducing a carbonyl compound.
  • the carbonyl compound has the following general formula:
  • optically active alcohol obtained is a 3-oxo-butyric ester represented by the following general formula:
  • R1 and R2 are each independently halogen, azide, benzylamino or hydrogen, wherein either R1 or R2 is hydrogen, and R3 is substituted or unsubstituted. It is a substituted alkyl group or aryl group.
  • R1 is chlorine
  • R2 is hydrogen
  • R3 is ethyl
  • R1 and R2 are each independently an alkyl group, a hydroxyl group or hydrogen, wherein one of R1 and R2 is hydrogen, and R3 is substituted or unsubstituted. Is an alkyl group or an aryl group.
  • R1 is a hydroxyl group
  • R2 is hydrogen
  • R3 is ethyl.
  • FIG. 1 shows a nucleotide sequence and a deduced amino acid sequence.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method for producing a recombinant plasmid pNTSlG. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the organism used as a source of the CRD enzyme included in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include yeasts of the genus Candida. Particularly preferred yeasts of the genus Candida are Candida magnoliae (Candida). Candida magnoli ae) IFO 0705. Candida magn oliae (Candida magn oliae) IFO 0705 was originally deposited with Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS; Oo sterstraat 1, Postbus 273, L-3740 AG Baarn, Netherlands) under the number CBS166. It is a microorganism, and its isolation and properties are described in “The Yeasts, a Taxonomic Study. 3rd ed.” Pp.731 (1984).
  • the microorganism capable of producing the enzyme of the present invention may be either a wild strain or a mutant strain. Alternatively, a microorganism derived by a genetic technique such as cell fusion or genetic manipulation can also be used. Microorganisms producing the genetically engineered enzyme of the present invention encode the enzyme based on this amino acid sequence, for example, in order to isolate and Z or purify the enzyme to determine a part or all of the amino acid sequence of the enzyme. A step of obtaining a recombinant DNA sequence by introducing the DNA into another microorganism, and a step of culturing the recombinant microorganism to obtain the enzyme of the present invention. .
  • the culture medium for the microorganism is not particularly limited as long as the microorganism can grow.
  • an ordinary liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like can be used.
  • “Culture of microorganism” means microorganism cells or a culture solution containing the cells
  • “treated product” means, for example, those extracted and purified as described below.
  • an enzyme extraction and purification method which can be generally used by those skilled in the art can be used. For example, after centrifuging the cells from the culture solution, the cells are suspended in an appropriate buffer, and the cells are disrupted using a physical method such as glass beads or a biochemical method such as an enzyme.
  • a crude enzyme solution of the enzyme can be obtained by dissolving and further removing the solid matter in the solution by centrifugation.
  • a crude enzyme solution can be obtained from a culture solution by the same purification method as described above.
  • the above crude enzyme solution can be further purified using a technique commonly used by those skilled in the art, for example, ammonium sulfate precipitation, dialysis, and chromatography, alone or in combination.
  • the enzyme of the present invention can be obtained by using various chromatography such as hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography (for example, DEAE Sepharose), and gel filtration, alone or in combination.
  • the CRD enzyme can be isolated from Candida magnoliae IFO 0705 as follows.
  • this yeast is cultured in an appropriate medium, and cells are collected from the culture by centrifugation.
  • the cells are broken by, for example, Dynomill (manufactured by 0110-3 ⁇ 4111) and centrifuged to remove cell residues and obtain a cell-free extract.
  • Dynomill manufactured by 0110-3 ⁇ 4111
  • the enzyme can be purified using techniques such as column chromatography and ultrafiltration alone or in combination.
  • the CRD enzyme activity was determined using lOOmM phosphate buffer (pH 6.
  • the term "stable" means that when treated with PH7.0 at 40 ° C for 30 minutes, 90% or more of the activity before the treatment remains.
  • the molecular weight of the enzyme is measured by gel filtration using a TSK-G3000SW (0.75 ⁇ 60 ⁇ ) (manufactured by Tosoh Corporation) column.
  • a 0.1 M phosphate buffer (PH7.0) containing 0.1 M Na 2 SO 4 and 0.05% Na N 3 is used as an eluent.
  • the molecular weight of the subunit is determined by performing electrophoresis on a 10% SDS-polyacrylamide gel under reducing conditions (reducing agent 2 V / V% 2-mercaptoethanol) and calculating from the relative mobility of the standard protein. You.
  • the CRD enzyme having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention has the following physicochemical properties (1) to (4):
  • the carbonyl reductase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the present invention further has the following physicochemical properties (5) to (7):
  • the enzyme having substantially the same properties as the enzyme of the present invention may be a natural enzyme or a recombinant enzyme.
  • a recombinant enzyme is prepared by substituting, deleting, inserting or adding one or several amino acids in the amino acid sequence of an enzyme derived from Candida's Magnolie IF0705 strain, and It can be obtained by measuring the activity. (Preparation of synthetic oligonucleotide probes)
  • the purified CRD enzyme obtained above is denatured (for example, 8M urea), digested with endopeptidase (for example, lysyl endopeptidase), and the amino acid sequence of the obtained peptide fragment is determined by the Edman method. I do.
  • a DNA probe is synthesized based on this amino acid sequence. The probe can be used after being labeled with, for example, 32p .
  • the chromosomal DNA or cDNA of the microorganism producing the CRD enzyme of the present invention is partially digested with an appropriate restriction enzyme, for example, Sau3AI, and a DNA fragment of an appropriate size (for example, 23 kb to 20 kb) of the digest is obtained.
  • an appropriate restriction enzyme for example, Sau3AI
  • a gene library can be prepared by inserting the resulting recombinant phage vector into a compatible restriction enzyme site of a phage vector, performing in vitro packaging, and then infecting Escherichia coli.
  • the nucleotide sequence analysis of the obtained DNA It can be determined by the dideoxy sequence method or the dideoxy chain method. Sequencing can be performed using, for example, ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer) and ABI 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems).
  • the obtained DNA fragment can be amplified and cloned by PCR or the like.
  • the vector DNA used to introduce the CRD enzyme gene into the host microorganism and express it in the host microorganism into which the CRD enzyme gene is introduced may be any vector DNA as long as the CRD enzyme gene can be expressed in an appropriate host microorganism.
  • Vector DNA can be used. Examples of such a vector DM include a plasmid vector, a phagebeck, and a cosmid vector. Also, a shuttle vector capable of gene exchange with another host strain can be used.
  • vector DNAs may contain operably linked promoters (lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc.), It may have a regulatory element such as an enhancer sequence.
  • promoters lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc.
  • pUCNT W094 / 03613
  • this plasmid PUCNT has an insertion site such as an Ndel or EcoRI site downstream of the lac promoter, it can be suitably used.
  • Examples of enzymes capable of regenerating coenzymes include hydrogenase, formate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and glucose dehydrogenase. Can be used. Preferably, glucose dehydrogenase is used. More preferably, Bacillus megateri Glucose dehydrogenase (hereinafter abbreviated as GDH) derived from Pac (Bacillus megaterium) is used.
  • GDH Bacillus megateri Glucose dehydrogenase
  • Plasmid pGDA2 (J. Biol. Chem., (1989), 264, 6381) contains the GDH gene from Bacillus megaterium. A GDH gene fragment is cut out from this plasmid and inserted into the plasmid containing the CRD enzyme gene upstream or downstream of the CRD enzyme gene, whereby a recombinant plasmid having both the CRD enzyme gene and the GDH gene is prepared. obtain.
  • the obtained recombinant plasmid having the CRD enzyme gene or the recombinant plasmid having both the CRD enzyme gene and the GDH gene can be introduced into host cells by a conventional method.
  • a recombinant plasmid having a CRD enzyme gene and a recombinant plasmid having a GDH gene can be introduced into host cells simultaneously or separately, and a transformant transformed with these two plasmids can also be obtained.
  • host cells bacteria, yeast, filamentous fungi, plant cells, animal cells, and the like can be used. The use of E. coli is particularly preferred.
  • the introduction of the plasmid into the host can be performed by a method known to those skilled in the art, for example, a method including a step of mixing a competent host cell with a recombinant plasmid, conjugation using a helper plasmid.
  • a method that includes the step of transferring by communication is included.
  • the plasmid introduced into the host can replicate autonomously as an episome, or can be fully or partially integrated into a chromosome and replicated together with the chromosome.
  • the GDH activity in the transformed cells was determined by adding 0.1 M of substrate glucose, 2 mM of coenzyme NADP and enzyme to 1 M Tris-HCl buffer (PH8.0), and measuring the increase in absorbance at a wavelength of 340 nm at 25. obtain. (Acquisition of optically active alcohol)
  • Optically active 4-halo-3-hydroxybutyrate which is a kind of optically active alcohol, is obtained, for example, as follows.
  • R1 is halogen
  • R2 is hydrogen
  • R3 represents a substituted or unsubstituted alkyl or aryl group.
  • R3 is an alkyl group
  • R3 is, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, and an isopropyl group.
  • R3 is an aryl group
  • R3 is, for example, a phenyl group or a tolyl group.
  • R3 is a substituted aryl group
  • R3 is, for example, a fluorophenyl group, a cyclophenyl group or the like.
  • R1 is chlorine or bromine
  • R3 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • the substrate is methyl 4-chloroacetoacetate, ethyl 4-chloroacetoacetate, methyl 4-bromoacetoacetate, or ethyl 4-bromoacetoacetate.
  • 4-ethyl acetoacetate, 4-hydroxyacetoethyl acetate, 2-chloro-3-ethyl oxobutyrate, 2-methyl-3-oxobutyrate, ethyl 4-azidoacetoacetate, etc. Can be used.
  • This 4-haloacetoacetate can be prepared, for example, by the method described in JP-A-61-146191.
  • 4-haloacetoacetic acid ester is obtained by reacting halogen with diketene as a starting material to form 4-halo-acetoacetic halide. It is prepared by a method of reacting alcohol with acetic acid, or a method of directly halogenating the 4-position of acetoacetate using acetoacetate as a starting material.
  • the reaction can be carried out by adding a substrate 4-haloacetoacetate, a coenzyme NADPH, a culture of the transformed microorganism or a processed product thereof to an appropriate solvent, and stirring the mixture under pH adjustment.
  • the reaction is performed at a temperature of 10 ° (: up to 70 ° C, pH 4 to 10.
  • the substrate concentration is 0.1% to 90% (w / v), but the substrate can be added continuously.
  • the reaction can be performed in a batch or continuous mode.
  • the processed product of the microorganism means, for example, a crude extract, a cultured cell, a lyophilized organism, an acetone-dried organism, or a ground product of those cells. Further, they can be used by immobilizing the enzyme itself or the cells as they are by known means. The immobilization can be performed by a method well known to those skilled in the art (for example, a crosslinking method, a physical adsorption method, an entrapment method, and the like).
  • the reaction can greatly reduce the amount of expensive coenzyme used by using a commonly used NADPH regeneration system in combination.
  • a typical NADPH regeneration system includes, for example, a method using GDH and glucose.
  • the reaction conditions vary depending on the enzyme used, the microorganism or its processed product, the substrate concentration, etc., but the substrate concentration is about 0.1 to 90% by weight, the reaction temperature is 10 to 50 ° C, the pH is 5 to 8, the reaction time is 1 to 36 hours. is there.
  • the same method can be performed using a culture of a transformed microorganism into which the gene of the CRD enzyme gene and an enzyme (for example, GDH) having the ability to regenerate a coenzyme on which this enzyme depends (e.g. By performing the reaction, it is not necessary to separately prepare an enzyme source necessary for regeneration of the coenzyme, so that (S) -4-halo-3-hydroxybutyrate can be produced at lower cost.
  • an enzyme for example, GDH
  • the 4-hydroxy-3-hydroxybutyrate produced by the reaction can be purified by a conventional method.
  • 4-octa-3-hydroxybutyrate is subjected to centrifugation, filtration, etc., as necessary, to remove suspended cells and the like. Extracted with an organic solvent such as ethyl and toluene, dehydrated with a dehydrating agent such as sodium sulfate, The organic solvent can be removed under reduced pressure, and purified by distillation under reduced pressure, chromatography or the like (eg, silica gel column chromatography).
  • 4-Halo-3-hydroxybutyrate can be quantified by gas chromatography.
  • the quantitative determination of 4-ethyl-3-ethyl hydroxybutyrate can be performed by using a glass column (ID3imnXlin) filled with PEG-20M Chromosorb WAW DMCS 103 ⁇ 480 / 100mesh (manufactured by GE Science Co., Ltd.) at 150 chromatography. And detection by FID.
  • optical purity of (S) -4-halo-3-hydroxybutyrate can be measured by HPLC using an optical separation column CHI RALCEL 0B (manufactured by Daicel Chemical Industries, Ltd.).
  • CRD enzyme can be mass-produced. Furthermore, the use of this enzyme provides an excellent method for producing optically active alcohols including (S) -4-halo-3-hydroxybutyrate.
  • a CRD having an activity of asymmetrically reducing 4-haloacetoacetate to form (S) -4-halo-3-hydroxybutyrate from Candida magnoliae IFO 0 705 according to the following method.
  • Enzyme was purified singly by electrophoresis, A 8000 ml liquid medium having the following composition was prepared, and 400 ml was dispensed into a 2000 ml volumetric flask, and sterilized with steam at 120 ° C for 20 minutes.
  • Medium composition :
  • Ammonium sulfate was added to the cell-free extract so as to be 40% saturated, dissolved, and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The supernatant was washed with 0. 10 mM phosphate buffer containing ImM DTT. The solution (pH 7.0) was dialyzed. This was applied to a DEAE sephacel (Pharmacia Biotech) column (500 ml) pre-equilibrated with the same buffer, and the column was washed with the same buffer. The active fraction was recovered from the eluate that had passed through, and NaCl was added to this to a final concentration of 4M.
  • This active fraction was applied to a Phenyl sepha rose CL-4B (Pharmacia Biotech) column (200 ml) equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 4 M NaCl and 0.1 M ImDTT. The enzyme was adsorbed. After washing the column with the same buffer, a linear gradient of NaCl (4M to 0M) and ethylene glycol (0% to 50% (w / v)) using 10 mM phosphate buffer (PH7.0) Eluted the active fraction. The active fraction eluted first was collected and dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) overnight.
  • This dialysate is applied to a Mono Q HR 5/5 (Pharmacia Biotech FPLC system) column (1 ml) pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1 lmMDTT, and washed with the same buffer. Was done.
  • the active fraction in the washing solution was collected, concentrated by ultrafiltration to 200, and then superdex was pre-equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2% sodium chloride and 0. ImM DTT. It was applied to a 200 HR10 / 30 (Pharmacia Biotech) column (24 ml) and eluted with the same buffer. The active fractions were collected to obtain a purified enzyme preparation.
  • Example 1 The enzymatic properties of the enzyme obtained in Example 1 were examined.
  • the enzyme activity was measured in 3.0 ml of 200 mM phosphate buffer (PH7.0) containing 0.2 mM of substrate 4-ethyl chloroacetoacetate, 0.32 mM of coenzyme NADPH, and 0.1 ml of enzyme solution. This reaction solution was reacted at 30 ° C. for 1 minute, and the decrease in absorbance at a wavelength of 340 nm was measured.
  • PH7.0 phosphate buffer
  • Optimum temperature of action 20 ° C to 6 (T for 1 minute, using 4-ethyl acetylacetoacetate as a substrate, the activity of the enzyme of the present invention was measured to determine the optimum temperature. As a result, the optimum temperature was 50 to 55.
  • Purified enzyme of the present invention 5 uni- and 4-bromoacetoacetate 25 mg, ADP 0.16 mg, glucose 28 mg, glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 1001 ⁇ phosphate buffer containing 6 1111 ⁇ (PH 6.5 ) 2.5 ml was stirred at 30 ° C for 24 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was extracted with ethyl acetate, and after the solvent was removed, the extract was analyzed.As a result, it was found that ethyl (S) -4-bromo-3-hydroxybutyrate was formed in a yield of 43%. Was.
  • phosphate buffer (PH6.5) containing 5 units of purified enzyme of the present invention 25 mg of methyl 4-chloroacetoacetate, 0.16 mg of NADP, 28 mg of glucose, and 61111 "glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Pharmaceutical) 2.5 ml of butyl acetate was added to 2.5 ml, and the mixture was stirred for 24 hours at 30 ° C. After the reaction was completed, the reaction solution was extracted with ethyl acetate, the solvent was removed, and the extract was analyzed. (S) -Methyl 4-hydroxy-3-hydroxybutyrate was produced at a rate of 58% The quantitative determination of methyl 4-cyclo-3-hydroxybutyrate was as described in Example 2.
  • Example 6 Production of (S) -4-ethyl-3-ethyl hydroxybutyrate using the enzyme of the present invention; continuous addition of substrate
  • Purified enzyme of the present invention 100 units, NADP 1.56 mg, glucose 4.5 g, glucose dehydrogenase (manufactured by Amano Pharmaceutical) 250 units, lOOmM phosphate buffer ( ⁇ 6.5) containing 50 units of NaCl 0.24 g 3.8 ml of 4-chloroacetoacetate in 50 ml g was continuously added at a rate of 0.23 g per hour, and the mixture was stirred at 30 to 20 hours while adjusting the pH with sodium hydroxide.
  • Chromosomal DNA was extracted from cultured cells of Candida magnoliae IFO 0705 according to the method described in Hereford (Cel 1, 18, 1261 (1979)).
  • the obtained chromosomal DNA was partially digested with Sau3AI, and a DN'A fragment having a size of 23 kb to 20 kb of the digest was inserted into the BamHI site of an EMBL3 phage vector (Stratagene).
  • the obtained recombinant phage vector was subjected to in vitro packaging using Gigapack II Gold (manufactured by Stratagene), and then infected with Escherichia coli NM415 to prepare a chromosomal DNA library consisting of about 20,000 chromosomal DNAs. (Preparation of synthetic oligonucleotide probe)
  • the purified CRD enzyme obtained as in Example 1 was denatured in the presence of 8 M urea, and then digested with lysyl endopeptidase from Achromobacter (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The amino acid sequence was determined by the Edman method. Based on this amino acid sequence, a DNA probe having the following sequence was synthesized. Probe 1: 5'-GCNCAYAC AARAAYGA-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • Probe 2 5'-AAYGTNGARTAYCC GC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Probe 3 5'-CTRGTYCTRCTRCTRTT-3 '(SEQ ID NO: 5) Probes 1, 2 and 3 were labeled at 32 P using Megalabel (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and used in the following experiments.
  • the prepared chromosomal DNA library was screened for phage plaques containing the CRD enzyme gene by the plaque 'hybridization method (Science, 196, 180 (1977)) using a labeled synthetic DNA probe. went. As a result, one positive plaque was obtained. Next, the recombinant phage DNA obtained from this positive plaque was double-digested with EcoRI and indl I ⁇ , and the obtained DNA was analyzed by Southern method U. Mol. Biol., 98, 53 (1975)). . As a result, a digested fragment of about 1.3 kb generated by double digestion with EcoRI and Hindi II hybridized with the above synthetic DNA probe.
  • plasmid pUC-HE in which this approximately 1.3 kb DNA fragment was inserted into the EcoRI-HindiII site of plasmid pUC19 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was constructed and selected as a chromosomal DNA clone containing the CRD enzyme gene.
  • This plasmid was named pUC-HE.
  • the entire nucleotide sequence of a DNA fragment of about 1.3 kb, which is expected to contain the CRD enzyme gene was determined.
  • the nucleotide sequence is shown in FIG.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in the lower part of the nucleotide sequence in FIG.
  • the partial amino acid sequence of the purified CRD enzyme is present in the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence. Except for the deletion of the N-terminal methionine, complete matching was found at that portion (underlined portion of the amino acid sequence in FIG. 1). It is considered that the methionine at the X-terminal is removed by modification after protein synthesis.
  • a recombinant plasmid used for transformation was prepared.
  • a double-stranded DNA in which an Ndel site was added to the start codon of the structural gene of the CRD enzyme and an EcoRI site was added immediately after the stop codon was obtained by the following method.
  • an N-terminal DNA primer with an Ndel site added to the start codon of the structural gene of the CRD enzyme, and an EcoRI site immediately after the stop codon of the structural gene of the CRD enzyme The obtained C-terminal DNA primer and were synthesized. The base sequences of these two primers are shown below.
  • Plasmid pGDA2 (J. Biol. Chem., (1989), 264, 6381) was double-digested with EcoRl and PstI to isolate a DNA fragment of about 0.9 kb containing the Bacillus megaterium-derived GDH gene. This DNA fragment was inserted into the EcoRI-Ps11 site of plasmid pSL301 (manufactured by Invitrogen) to construct a recombinant plasmid pSLG. Furthermore, pSLG was double-digested with EcoRI and Xhol, and a DNA fragment of about 0.9 kb containing the GDH gene derived from Bacillus megaterium was isolated.
  • E. coli HB101 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid pNTSl obtained in Example 8 and the recombinant plasmid PNTS1G obtained in Example 9, and recombinant E. coli HBlOl (pNTSl) and B101 ( pNTSlG) was obtained.
  • the transformants thus obtained, E. coli HBlOl (pNTSl) and D (B101 (pNTSlG) were obtained under the accession numbers FERM BP-5834 and FERM BP-5835, respectively, on February 24, 1997. It is said that it has been deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry, at 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan.
  • GDH derived from Bacillus megaterium obtained by double digestion of plasmid pGDA2 (J. Biol. Cem., (1989), 264, 6381) with EcoRI and Pstl.
  • a DNA fragment of about 0.9 kb containing the gene was inserted into the EcoRI-Pstl site of plasmid pSTV28 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) to construct a recombinant plasmid pSTVG.
  • This pSTVG was used to transform Escherichia coli HB101 (pNTSl), which had been previously made competent by the calcium chloride method, to obtain Escherichia coli ⁇ 10151 (pSTVG).
  • the recombinant Escherichia coli HB101 (pTS1) obtained in Example 10 was cultured in 2XYT medium containing 50 g / m1 of ampicillin, collected, suspended in lOOmM phosphate buffer (pH 6.5), A cell-free extract was obtained by sonication.
  • the CRD enzyme activity of this cell-free extract was measured as follows. CRD enzyme activity was measured by adding the substrate 4-chloroacetoacetate (lmM), coenzyme NADPHO. ImM and enzyme to lOOmM phosphate buffer (pH 6.5) and reducing the absorbance at 340 nm at 30 ° C. It was performed by measuring.
  • the enzymatic activity of oxidizing 1 ⁇ mol of MDPH to NADP per minute was defined as 1 unit.
  • the CRD enzyme activity in the cell-free extract thus measured was expressed as a specific activity and compared with a transformant containing only vector plasmid.
  • the CRD enzyme activity in the cell-free extract of Candida magnoliae IFO 0705 prepared in the same manner as in Example 1 was also compared.
  • Table 3 shows the results.
  • Escherichia coli HB101 (pNTSl) showed a marked increase in CRD enzyme activity compared to E. coli HB101 (pUCNT), which is a transformant containing only the vector plasmid, compared to Candida magnoliae IFO 0705. Approximately 8.5 times the activity was obtained.
  • the N-terminal amino acid sequence of the cell-free extract obtained in the same manner as in the above expression experiment and the CRD enzyme purified from the cell-free extract of Candida magnoliae IFO 0705 were analyzed by the Edman method. Up to 30 residues were determined for each. As a result of comparison between the two, the N-terminal sequences of both proteins were completely identical in this range.
  • Example 12 Simultaneous expression of CRD enzyme and GDH in recombinant E. coli
  • the recombinant E. coli HBlOl (pN'TSlG) and E. coli HB101 (pN'TSl, pSTV) obtained in Example 10 were used.
  • the GDH activity of the cell-free extract obtained by treating G) in the same manner as in Example 11 was measured as follows. GDH activity was measured by adding 2 mM of coenzyme NADP and enzyme to 1 M Tris-HCl buffer (PH8.0) and measuring the increase in absorbance at a wavelength of 340 nm at 25 ° C. Under these reaction conditions, the enzyme activity for reducing 1 mol of NADP to MDPH per minute was defined as limit. Also, the CRD enzyme activity was measured in the same manner as in Example 10. The CRD enzyme and GDH enzyme activities in the cell-free extract measured in this way are expressed as specific activities, and E.
  • coli 13 ⁇ 4101 (0 ⁇ 51), HBlOKpN TS1, pSTVG) and the vector-only transformant HB101 (pUCNT)
  • Table 4 shows the results of the comparison.
  • Escherichia coli HB101 (PNTS1G) and HB101 (pNTSl, pSTVG) showed a clear increase in CRD enzyme and GDH activity compared to Escherichia coli HBlOl (pUCNT), which is a transformant containing only vector plasmid.
  • Table 4 shows the results of the comparison.
  • Escherichia coli HB101 (PNTS1G) and HB101 (pNTSl, pSTVG) showed a clear increase in CRD enzyme and GDH activity compared to Escherichia coli HBlOl (pUCNT), which is a transformant containing only vector plasmid.
  • Table 4 shows the results of the comparison.
  • the recombinant Escherichia coli HBlOl (pNTSl) obtained in Example 10 was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and cultured with shaking at 37 ° C for 13 hours.
  • Ethyl 4-chloroacetoacetate was added at 250 mg every 15 minutes.
  • Quantification of 4-chloro-3-ethyl hydroxybutyrate was performed by gas chromatography. Chromatography was performed at 150 ° C using a glass column (ID3mmXlin) packed with PEG-20M Chromosorb WAW DMCS 10% 80 / 100mesh (manufactured by GE Science Co., Ltd.), and detection was performed by FID.
  • coli HB101 [pNTSlG] was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask, and cultured with shaking at 37 for 13 hours.
  • 5.5 g of glucose and 3.2 mg of NADP are added to 50 ml of the obtained culture solution, and the pH is adjusted to 6.5 with a 5 M aqueous solution of sodium hydroxide.
  • a total of 5 g of ethyl 4-chloroacetoacetate was added and reacted for 5 hours.
  • the reaction mixture was extracted with ethyl acetate, and the solvent was extracted with J ⁇ solvent.
  • the extract was analyzed.
  • ethyl ethyl (S) -4-chloro-3-hydroxybutyrate with 100 ee was produced in a yield of 92%.
  • Example 15 Synthesis of (S) -4-ethyl-3-ethyl hydroxyethylate from 4-chloroacetoacetate by recombinant Escherichia coli co-expressing CRD enzyme and GDH
  • Set obtained in Example 10 The transformed E. coli HBlOl (pN'TSlG) was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and cultured with shaking at 37 for 13 hours.
  • Example 16 Synthesis of (S) -4-ethyl-3-ethyl hydroxyethylate from 4-chloroacetoacetate by recombinant Escherichia coli co-expressing CRD enzyme and GDH
  • the set obtained in Example 10 Recombinant E. coli HBlOl (pNTSlG) was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask, and cultured with shaking at 37: for 13 hours.
  • Example 17 Synthesis of (S) -4-ethyl-3-bromo-3-hydroxybutyrate from ethyl 4-bromoacetoacetate by recombinant Escherichia coli co-expressing CRD enzyme and GDH
  • Set obtained in Example 10 The transformed Escherichia coli 13 ⁇ 4101 ( ⁇ 5) was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500-ral flask, and cultured with shaking at 37 ° C for 13 hours.
  • optical purity of this (S) -4-bromo-3-hydroxybutyrate ethyl ester was analyzed as follows and found to be 10 ( ⁇ ee. In the analysis, the sample was carbaminated with phenyl isocyanate in the presence of pyridine. The optical purity was measured by the HP LC method.
  • Example 18 Synthesis of (S) -4-ethyl-3-ethyl-3-hydroxybutyrate from 4-ethyl acetoacetate by recombinant E. coli co-expressing CRD enzyme and GDH
  • Recombinant E. coli obtained in Example 10 HBlOl (pNTSlG) was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and cultured with shaking at 37 ° C for 13 hours.
  • Example 19 Synthesis of methyl (S) -4-chloro-3-hydroxybutyrate from methyl 4-chloroacetoacetate by recombinant Escherichia coli co-expressing CRD enzyme and GDH
  • the group obtained in Example 10 The transformed E. coli ⁇ 101 51 was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and cultured with shaking at 37 ° C for 13 hours.
  • Example 20 Synthesis of (S) -4-azido-3-hydroxybutyrate from 4-ethyl azidoacetoacetate by recombinant E. coli in which CRD enzyme and GDH were co-expressed
  • the set obtained in Example 10 The transformed E. coli ⁇ 101 5) was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and shake-cultured at 37 T: for 13 hours.
  • To 50 ml of the resulting culture add 3.lg of glucose and 3.2 mg of NADP, add 2 g of ethyl 4-azidoacetoacetate, and adjust the pH to 6.5 with a 5 M aqueous sodium hydroxide solution at 30 ° C.
  • Example 21 Synthesis of (S) -3,4-dihydroxybutyrate ethyl from 4-hydroxyacetoacetate by recombinant Escherichia coli co-expressing CRD enzyme and GDH
  • Recombinant Escherichia coli obtained in Example 10 HB101 (pNTSlG) was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and cultured with shaking at 37 ° C for 13 hours. 7.4 g of glucose and 3.2 mg of MDP are added to 50 ml of the obtained culture solution, 4 g of 4-hydroxyacetoacetate is added, and the pH is adjusted to 6.5 with a 5 M aqueous sodium hydroxide solution.
  • the recombinant Escherichia coli HBlOl (pNTSlG) obtained in Example 10 was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and cultured with shaking at 37 ° C for 13 hours.
  • To 50 ml of the obtained culture 7.5 g of glucose and 3.2 mg of NADP are added, and 4 g of ethyl 2-methyl-3-oxoacetate is added, and the pH is adjusted to 6.5 with a 5 M aqueous sodium hydroxide solution. The reaction was carried out for 18 hours with stirring.
  • the reaction solution was extracted with ethyl acetate, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the concentrate was purified by silica gel column chromatography to obtain 3.5 g of ethyl 3-hydroxy-2-methylbutyrate. .
  • the optical purity of this 3-hydroxy-2-methylbutyrate was 91.6% ee when analyzed as follows. The analysis was conducted by reacting the sample with sodium cyanide in dimethyl sulfoxide at room temperature to obtain 4-cyano-3-hydroxybutyrate, which was converted into benzoate with benzoyl chloride in the presence of pyridine. Purity was measured by HPLC.
  • Example 23 Synthesis of ethyl 2-chloro-3-hydroxybutyrate by reduction of ethyl 2-chloro-3-oxoacetate by recombinant Escherichia coli co-expressing CRD enzyme and GDH
  • the recombinant Escherichia coli HBlOl (pNTSlG) obtained in Example 10 was inoculated into 100 ml of sterilized 2XYT medium in a 500 ml volumetric flask and cultured with shaking at 37 ° C for 13 hours.
  • pNTSlG recombinant Escherichia coli HBlOl
  • To 50 ml of the obtained culture 6.5 g of glucose and 3.2 mg of NADP were added, 4 g of 2-ethyl-3-ethyl oxoacetate was added, and the pH was adjusted to 6.5 with a 5 M aqueous sodium hydroxide solution. The reaction was carried out for 18 hours while stirring at 30 ° C.
  • Sequence type nucleic acid
  • GGCTACATCA ACACGGAGAT CTCGGACTTC GTGCCCCAGG AGACGCAGAA CAAGTGGTGG 720
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書
新規力ルボニル還元酵素、 およびこれをコードする逍伝子、 ならびにこれらの利 用方法 技術分野
本願発明は、 カルボニル化合物を不斉的に還元して光学活性アルコールを生成 するカルボニル還元活性を有する酵素 （以下、 CRD酵素という） 、 この酵素を コードする DNA、 この DNAを有するプラスミド、 このプラスミドで形質転換 された形質転換細胞、 ならびにこの酵素および またはこの形質転換細胞を用い る光学活性アルコールの製造方法に関する。 得られる光学活性アルコール、 例 えば、 （S)- 4-八口- 3-ヒドロキシ酪酸エステルは、 医薬 ·農薬等の合成原料とし て有用な化合物である。
背景技術
CRD酵素は多数知られている （有機合成化学 49， 52，（1991)、 Eur. J.Biochem.
184， 1，（1981)) 。 このうち、 4-ハロアセト酢酸エステルに作用し（S)- 4-ハロ- 3 - ヒドロキシ酪酸エステルを生成する微生物由来の酵素であり、 かつその性質まで 報告されているものとしては、 Geotrichum candidum (ゲォトリカム ·キャンデ ィダム） 由来の酵素（Enzyme Microb. Technol. , (1992), vol.14, 731)、 および Can dida parapsilosis (キャンディダ 'パラプシロシス） 由来の酵素（Enzyme Micro b. Technol., (1993), vol.15, 950) のみが挙げられる。 これら 2種類の酵素をコ ードする遺伝子に関する情報は報告されていない。 これらの酵素を用いた 4-ハロ ァセト酢酸エステルの還元反応は低濃度でしか進行しないので、 これらの酵素を 触媒とした（S)-4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸エステルの合成は実用的ではない。
4-ハロアセト酢酸エステルの不斉還元反応としては、 上記 2種類の酵素を用い る反応の他に、 微生物菌体およびその処理物を利用する反応が多数知られている (特許公報第 Π23728号、 特開平 6- 209782号、 同 6- 38776号など） 。 しかし、 これ らの反応においても高い基質濃度での反応は行われていないので、 実用的な製造 方法が確立されているとは言いがたい。 例えば、 有機溶媒との 2相系で反応を行 う方法を参照のこと （特許公報第 2566962号） 。 ルテニウム-光学活性ホスフィン 錯体を触媒として用いる例も報告されている （特開平卜 211551) が、 これは、 高 圧反応容器を必要とすること、 高価な触媒を用いるなどの多くの課題を有してい る。
このように、 4-ハロアセト酢酸エステルなどのカルボニル化合物を不斉的に還 元して（S)- 4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸エステルなどの光学活性アルコールを製造 するために実用的な酵素の開発が望まれていた。
CRD酵素は、 その反応に還元型補酵素を必要とする。 従来、 CRD酵素を有 する微生物菌体等を用いてカルボニル化合物の還元反応を行う際には、 反応系に グルコース等の糖類を添加して、 酸化された補酵素を還元型に変換する再生系の 酵素群を機能させることにより、 補酵素を再生し、 これを還元反応に利用してい た。 しかし、 これらの再生系の酵素群は、 基質や還元反応生成物による阻害ゃダ メージを受ける場合が多い。 このことが、 基質または生成物が低濃度の場合にし か該還元反応が進行しない主な原因の 1つであると考えられてきた。 CRD酵素 を用いてカルボニル化合物を不斉的に還元する際に、 CRD酵素が依存する補酵 素を再生する能力を有する酵素と C R D酵素とを組み合わせて反応を行うことに より、 高価な補酵素の使用量を大幅に減らし得ることが知られている （特許公報 第 2566960号、 Enzyme Microb. Technol. , (1993), voし 15， 950など) 。 しかし、 そ の場合、 補酵素の再生を担う酵素源を CRD酵素とは別に調製した後、 反応系内 に添加する必要があった。
本願発明者らは、 新たなキャンディダ （Candida) 属由来の CRD酵素を見い 出し、 この CRD酵素を使用することにより、 カルボニル化合物から効率良く光 学活性アルコールを製造し得ることを見いだした。 補酵素を再生する能力を有する酵素の遺伝子 （例えば、 グルコース脱水素酵素遺 伝子） を同時に含有する形質転換細胞を使用することにより、 光学活性アルコ一 ルを効率よく製造し得ることを見出した。
従って、 本明細書に記載の本願発明は、 新規な CRD酵素、 この酵素をコード する DNA、 この DNAを有するプラスミド、 このプラスミドで形質転換された 形質転換細胞、 ならびにこの酵素および またはこの形質転換細胞を用いる光学 活性アルコールの製造方法を提供する利点を可能にする。 発明の開示
本願発明のカルボニル還元酵素は、 以下の （1) から （4) の理化学的性質を 有する：
( 1 ) 作用：
NADPHを補酵素として、 4-クロロアセト酢酸ェチルに作用し、 （S)- 4-クロロ- 3 - ヒドロキシ酪酸ェチルを生成する、
(2) 基質特異性：
4-クロロアセト酢酸ェチルに対して強い活性を示し、 ァセト酢酸ェチルには実 質的に活性を示さない、
(3) 至適 pH： pH5.5〜6.5、 および
(4) 作用至適温度： 50° (：〜 55 ：。
1つの実施態様において、 前記カルボニル還元酵素は、 さらに、 以下の （5) から （7) の理化学的性質を有する：
(5) 熱安定性： PH7.0で 30分間処理したときに約 40°Cまで安定である、
(6) 阻害剤：水銀イオン、 クェルセチンにより阻害される、 および
(7) 分子量：ゲル濾過分析において約 76, 000、 SDSポリアクリルアミド電気泳 動分析において約 32， 000。
本願発明のカルボニル還元酵素は、 配列表の配列番号 1のアミノ酸配列または 配列表の配列番号 1のアミノ酸配列において 1または数個のアミノ酸が欠失、 置 換、 または付加されたアミノ酸配列あるいはその一部を有する酵素であって、 4- クロロアセト酢酸ェチルを不斉的に還元して（S)-4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェ チルを生成する活性を有する。
1つの実施態様においては、 前記酵素はキャンディダ （Candida) 属の微生物 に由来する。 好適な実施態様においては、 前記酵素はキャンディダ ·マグノリエ (Candida magnoliae) に由来する。 さらに好適な実施態様においては、 前記酵 素はキャンディダ ·マグノリエ （Candida magnoliae) IFO 0705株に由来する。 本願発明の DN Aは、 前記酵素をコードする。 1つの実施態様においては、 前 記 DNAは、 配列表の配列番号 2のヌクレオチド配列を有する。
本願発明のプラスミドは、 前記 DNAを有する。 1つの実施態様においては、 前記プラスミドは pNTSlである。
本願発明の形質転換細胞は、 前記プラスミドにより形質転換された形質転換細 胞である。 1つの実施態様においては、 前記形質転換細胞は大腸菌である。 好適 な実施態様においては、 前記形質転換細胞は、 E.coli HBlOl(pNTSl)である。 本願発明のプラスミドは、 4-クロロアセト酢酸ェチルを不斉的に還元して（S) - 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルを生成する活性を有する酵素をコードする D NAおよびこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素 （例えば、 グ ルコース脱水素酵素） をコードする DNAを有する。
1つの実施態様においては、 前記グルコース脱水素酵素は、 バシラス 'メガテ リウム （Bacillus megaterium) に由来する。 好適な実施態様においては、 前記 プラスミドは pNTSlGである。
本願発明の形質転換細胞は、 前記プラスミドにより形質転換された形質転換細 胞である。
1つの実施態様においては、 前記形質転換細胞は大腸菌である。 好適な実施態 様においては、 前記形質転換細胞は E.coli HB101 (pNTSlG)である。 本願発明の形質転換細胞は、 4-クロロアセト酢酸ェチルを不斉的に還元して (S) - 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルを生成する活性を有する酵素をコードす る D N Aを有する第一のプラスミドおよびこの酵素が依存する補酵素を再生する 能力を有する酵素 （例えば、 グルコース脱水素酵素） をコードする D N Aを有す る第二のプラスミドにより形質転換された形質転換細胞である。
1つの実施態様においては、 前記形質転換細胞は、 プラスミド pNTSlと、 バシ ラス ·メガテリゥム （Bac i l l us megater ium) に由来するグルコース脱水素酵素 をコードする D N Aを有するプラスミドとにより形質転換された形質転換細胞で ある。 好適な実施態様においては、 前記形質転換細胞は大腸菌である。
本願発明の光学活性 3-ヒドロキシ -酪酸エステル類の製造方法は、 3-ォキソ-酪 酸エステル類を不斉的に還元して、 光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類を生 成する活性を有する酵素あるいは該酵素の産生能を有する微生物の培養物あるい はその処理物と、 3-ォキソ -酪酸エステル類とを反応させる工程、 および生成し た光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類を採取する工程を包含する。
本願発明の光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類の製造方法は、 3-ォキソ-酪 酸エステル類を不斉的に還元して、 光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類を生 成する活性を有する酵素をコードする D N Aを有するプラスミドで形質転換され た形質転換細胞と、 3-ォキソ -酪酸エステル類とを反応させる工程、 および生成 した光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類を採取する工程を包含する。
本願発明の光学活性アルコールの製造方法は、 カルボニル化合物を不斉的に還 元して光学活性アルコールを生成する活性を有する酵素をコードする D N Aおよ びこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードする D N Aを 有するプラスミドで形質転換された形質転換細胞と、 カルボニル化合物とを反応 させる工程、 ならびに生成した光学活性アルコールを採取する工程を包含する。 本願発明の光学活性アルコールの製造方法は、 カルボニル化合物を不斉的に還 元して光学活性アルコールを生成する活性を有する酵素をコードする D N Aを有 する第一のプラスミドおよびこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する 酵素をコードする D N Aを有する第二のプラスミドで形質転換された形質転換細 胞と、 カルボニル化合物とを反応させる工程、 ならびに生成した光学活性アルコ ールを採取する工程を包含する。
1つの実施態様において、 前記カルボニル化合物は以下の一般式：
Figure imgf000008_0001
で表される 3-ォキソ -酪酸エステル類であり、 得られる光学活性アルコールは以 下の一般式：
Figure imgf000008_0002
で表される光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類である。
好適な実施態様において、 前記一般式において、 R1および R2はそれぞれ独立し て、 ハロゲン、 アジド、 ベンジルァミノまたは水素であり、 ここで R1または R2の いずれか一方が水素であり、 そして R3は置換または非置換のアルキル基またはァ リール基である。
より好適な実施態様において、 前記一般式において、 R1は塩素であり、 R2は水 素であり、 そして R3はェチルである。
好適な実施態様において、 前記一般式において、 R1および R2がそれぞれ独立し て、 アルキル基、 水酸基または水素であり、 ここで R1または R2のいずれか一方が 水素であり、 そして R3が置換または非置換のアルキル基またはァリール基である。 より好適な実施態様において、 前記一般式において、 R1は水酸基であり、 R2は 水素であり、 そして R3はェチルである。 図面の簡単な説明
図 1は、 塩基配列および推定アミノ酸配列を示す図である。
図 2は、 組換えプラスミド pNTSlGの作製方法を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 更に詳細に本願発明を説明する。
(CRD酵素の精製）
本願発明に含まれる C RD酵素の起源として用いられる生物は特に限定されな いが、 例えばキャンディダ （Candida) 属酵母が挙げられ、 特に好ましいキャン デイダ （Candida) 属酵母としてはキャンディダ ·マグノリエ （Candida magnoli ae) IFO 0705を挙げることができる。 キャンディダ ·マグノリエ （Candida magn oliae) IFO 0705は、 もとは、 Centraalbureau voor Schimmelcul tures (CBS; Oo sterstraat 1, Postbus 273, L-3740 AG Baarn, Netherlands) に CBS166の番号 の下で寄託されていた微生物であり、 その単離および性質は、 「The Yeasts, a Taxonomic Study. 3rd ed.」 pp.731 (1984)に記載されている。 本願発明の酵素 を生産し得る微生物は、 野生株または変異株のいずれでもあり得る。 あるいは、 細胞融合または遺伝子操作等の遺伝学的手法により誘導される微生物も用いられ 得る。 遺伝子操作された本願酵素を生産する微生物は、 例えば、 これらの酵素を 単離および Zまたは精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定するェ 程、 このアミノ酸配列に基づいて酵素をコードする DNA配列を得る工程、 この DNA を他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、 およびこの組換え微生物を培 養して、 本願発明の酵素を得る工程を包含する方法により得られ得る。
本願発明の酵素を得るための （または本願発明の（S)-4-ハ口- 3-ヒドロキシ酪 酸エステルの製造方法に用いられる） 微生物のための培養培地は、 その微生物が 増殖し得るものである限り特に制限されない。 例えば、 炭素源， 窒素源， 無機塩 類， 有機栄養素等を含有する通常の液体栄養培地が使用され得る。
「微生物の培養物」 とは、 微生物の菌体、 あるいは菌体を含む培養液を意味し、 「その処理物」 は、 例えば下記のように抽出および精製されたものを意味する。 得られた培養物からの酵素の抽出および精製のためには、 当業者に通常用いら れ得る酵素の抽出精製法が用いられ得る。 例えば、 培養液から菌体を遠心分離し た後、 菌体を適当な緩衝液中に懸濁し、 該菌体をグラスビーズ等の物理的手法、 酵素等の生化学的手法等を用いて破碎または溶解し、 さらに遠心分離により該溶 液中の固形物を除去することにより、 酵素の粗酵素液を得ることができる。 ある いは、 培養液から、 上記と同様の精製法で、 粗酵素液を得ることができる。
上記粗酵素液を当業者が通常用いる手法、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿、 透 析、 クロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて用いてさらに精製し得る。 クロマトグラフィーは、 疎水クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィ ― (例えば、 DEAEセファロ一ス） 、 ゲル濾過等の各種クロマトグラフィーを単独 で、 または組み合わせて用いることにより、 本願発明の酵素を得ることができる。 例えば、 C R D酵素はキャンディダ ·マグノリエ （Cand i da magno l i ae) IFO 0 705から以下のように単離され得る。
まず、 この酵母を適切な培地で培養し、 培養液から遠心分離により菌体を集め る。 菌体を例えば、 ダイノミル （0 110-¾11 1 1社製） などで破枠し、 遠心分離にて 菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。 この無細胞抽出液に、 例えば、 塩析 （硫 酸アンモニゥム沈殿、 リン酸ナトリウム沈澱など） 、 溶媒沈殿 （アセトンまたは エタノールなどによる蛋白質分画沈殿法） 、 透析、 ゲル濾過、 イオン交換、 逆相 等のカラムクロマトグラフィー、 限外濾過等の手法を単独で、 または組み合わせ て用いて、 酵素が精製され得る。 C R D酵素活性は、 l OOmMリン酸緩衝液 （pH6.
5) に、 基質 4-クロロアセト酢酸ェチル lmM、 補酵素 NADPHO. lmMおよび酵素を添加 して、 または、 200mMリン酸緩衝液 （pH7.0) に、 基質 4-クロロアセト酢酸ェチル 0.2mM、 補酵素 NADPH 0.32mMを添加して、 30°Cで波長 340nmの吸光度の減少を測 定することにより行い得る。 この反応条件に於いて、 1分間に 1 imolの NADPHを NADPに酸化する酵素活性を 1 uni tと定義する。
本願発明において、 酵素が 「安定である」 とは、 PH7.0で、 40°C、 30分間処理 したときに、 処理前の 90%またはそれ以上の活性が残存していることをいう。 酵素の分子量の測定は、 TSK- G3000SW ( 0.75Χ60οπι) (東ソ一株式会社製） カラムを用いたゲル濾過により行う。 溶離液としては、 0.1M Na2S04、 0.05% Na N3を含む 0.1Mリン酸緩衝液 （PH7.0) を用いる。 サブユニットの分子量は、 還元 条件下 （還元剤 2V/V% 2-メルカプトエタノール） で、 10%SDS-ポリアクリルァ ミドゲルでの電気泳動を行い、 そして標準タンパク質の相対移動度から算出する ことにより決定される。
例えば、 本願発明の配列番号 1に示すアミノ酸配列を有する CRD酵素は、 以 下の （1) から （4) の理化学的性質を有する：
(1) 作用：
NADPHを補酵素として、 4-クロロアセト酢酸ェチルに作用し、 （S)- 4-クロロ- 3- ヒドロキシ酪酸ェチルを生成する、
( 2 ) 基質特異性：
4-クロロアセト酢酸ェチルに対して強い活性を示し、 ァセト酢酸ェチルには実 質的に活性を示さない、
(3) 至適 pH： pH5.5〜6.5、
(4) 作用至適温度： 50°C〜55°C。
1つの実施態様においては、 、 本願発明の配列番号 1に示すアミノ酸配列を有 するカルボニル還元酵素はさらに、 以下の （5) から （7) の理化学的性質を有 する：
(5) 熱安定性： PH7.0で 30分間処理したときに約 40°Cまで安定である、 (6) 阻害剤：水銀イオン、 クェルセチンにより阻害される、
(7) 分子量：ゲル濾過分析において約 76， 000、 SDSポリアクリルアミド電気泳 動分析において約 32， 000。
本願発明の酵素とほぼ同一の性質を有する酵素は、 天然酵素であってもよく、 または組換え酵素であってもよい。 例えば、 組換え酵素は、 キャンディダ 'マグ ノリエ IF0 0705株に由来する酵素のアミノ酸配列中の 1つまたは数個のァミノ 酸を置換、 欠失、 挿入または付加させることにより作製し、 そしてその酵素活性 を測定することより、 得られ得る。 (合成ォリゴヌクレオチドプロ一ブの作製）
上記で得られた精製 CRD酵素を変性 （例えば、 8M尿素） した後、 エンドぺプ チダーゼ （例えば、 リシルエンドべプチダ一ゼ） で消化し、 得られたペプチド断 片のアミノ酸配列をェドマン法により決定する。 このアミノ酸配列に基づいて、 DNAプローブを合成する。 プローブは、 例えば、 32pで標識して用いられ得る。
(遺伝子ライブラリーの作製）
本願発明の CRD酵素を産生する微生物の染色体 DNAまたは c DNAを、 適 切な制限酵素、 例えば、 Sau3AIで部分消化し、 この消化物のうち適切な大きさ (例えば、 23kbから 20kb) の DNA断片を、 例えば、 ファージベクターの適合性の 制限酵素部位に挿入し、 得られる組換えファージベクターを、 インビトロパッケ 一ジングした後、 大腸菌に感染させ、 遺伝子ライブラリーが作製され得る。
(遺伝子ライブラリーからの CRD酵素遺伝子のクローニング）
作製した遺伝子ライブラリーを、 32p標識した合成 DNAプローブを用いて、 プ ラーク ·ハイブリダィゼ一シヨン法 （Science, 196, 180 (1977)) により、 CR D酵素遺伝子についてスクリーニングし得る。 得られた DNAの塩基配列分析は、 ジデォキシ ·シークェンス法、 またはジデォキシ ·チエイン ·タ一ミネイシヨン 法などにより決定することができる。 配列決定は、 例えば、 ABI PRISM Dye Term inator Cycle Sequencing Ready React ion Kit (Perkin Elmer社製) および ABI 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems社製) を用いて行われ得る。
得られた DN A断片は、 PCR法などで増幅されて、 クローニングされ得る。
(CRD酵素遺伝子を含む組換えプラスミドの作製）
CRD酵素遺伝子を宿主微生物内に導入し、 それをその導入された宿主微生物 内で発現させるために用いられるベクター DNAとしては、 適切な宿主微生物内で この CRD酵素遺伝子を発現させ得る限り、 任意のベクター DNAが用いられ得る。 このようなベクタ一 DMとしては、 例えば、 プラスミドベクタ一、 ファ一ジべク 夕一、 コスミドベクターなどが挙げられる。 また、 他の宿主株との間で遺伝子交 換が可能なシャトルベクタ一も使用され得る。 さらに、 このようなベクター DNA は、 作動可能に連結されたプロモーター （lacUV5プロモーター、 trpプロモータ 一、 trcプロモーター、 tacプロモ一夕一、 lppプロモーター、 tufBプロモータ一、 recAプロモータ一、 pLプロモータ一等） 、 ェンハンサー配列等の制御因子を有し 得る。 例えば、 pUCNT (W094/03613) 等が好適に用いられ得る。 このプラスミド PUCNTは、 lacプロモーターの下流に、 Ndel、 EcoRI部位等の挿入部位を有してい るので、 好適に用いられ得る。
(CRD酵素遺伝子およびこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵 素の遺伝子の両者を同時に含む組換えプラスミドの作製）
補酵素を再生する能力を有する酵素としては、 例えば、 ヒドロゲナ一ゼ、 ギ酸 脱水素酵素、 アルコール脱水素酵素、 アルデヒド脱水素酵素、 グルコース- 6 -リ ン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを用いることが出来る。 好適に は、 グルコース脱水素酵素が用いられる。 さらに好適には、 バシラス ·メガテリ ゥム （Bacillus megaterium) 由来のグルコース脱水素酵素 （以下、 GDHと略 す） が用いられる。
プラスミド pGDA2(J. Biol. Chem.，（1989)， 264， 6381)は、 Bacillus megaterium 由来の GDH遺伝子を含んでいる。 このプラスミドから GDH遺伝子断片を切り 出し、 CRD酵素遺伝子を含むプラスミドの CRD酵素遺伝子の上流または下流 に挿入することにより、 C R D酵素遺伝子と G D H遺伝子の両者の遺伝子を有す る組換えプラスミドが作製され得る。
(形質転換）
得られた CRD酵素遺伝子を有する組換えプラスミド、 あるいは CRD酵素遺 伝子と GDH遺伝子の両者の遺伝子を有する組換えプラスミドは、 常法により宿 主細胞に導入され得る。 また、 CRD酵素遺伝子を有する組換えプラスミドと G DH遺伝子を有する組換えプラスミドは、 同時にあるいは別々に宿主細胞に導入 され得、 これら 2つのプラスミドにより形質転換された形質転換株も得られ得る。 宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 糸状菌、 植物細胞、 動物細胞などが使用され 得る。 大腸菌の使用が特に好ましい。
宿主へのプラスミドの導入は、 当業者に周知の方法、 例えば、 コンビテント (competent) 状態にされた宿主細胞と組換えプラスミドとを混合する工程を包 含する方法、 ヘルパー ·プラスミドを用いて接合伝達により移入する工程を包含 する方法などが挙げられる。
宿主に導入されたされたプラスミドは、 ェピゾームとして自律的に複製し得る か、 あるいはその全部または一部が染色体に組み込まれて染色体とともに複製し 得る。
形質転換細胞中の GDH活性は、 1Mトリス塩酸緩衝液 （PH8.0) に、 基質ダル コース 0.1M、 補酵素 NADP2mM及び酵素を添加し、 25 で波長 340nmの吸光度の増加 を測定することにより行い得る。 (光学活性アルコールの取得）
光学活性アルコールの一種である光学活性 4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸エステル は、 例えば以下のようにして取得される。
基質としては、 以下の一般式：
Figure imgf000015_0001
(式中、 R1はハロゲンであり、 R2は水素であり、 そして R3は置換または非置換の アルキル基またはァリール基を表す） で表される 4-ハロアセト酢酸エステルが用 いられ得る。 R3がアルキル基である場合、 R3は例えば、 メチル基、 ェチル基、 プ 口ピル基、 ブチル基、 およびイソプロピル基などである。 R3がァリール基である 場合、 R3は例えば、 フエニル基またはトリル基等である。 これらの R3が置換され たァリール基である場合、 R3は例えば、 フルオロフェニル基、 クロ口フエニル基 などである。
好適には R1が塩素または臭素であり、 R3が炭素数 1〜 4のアルキル基である。 より好適には、 前記基質が、 4—クロロアセト酢酸メチル、 4一クロロアセト酢 酸ェチル、 4一プロモアセト酢酸メチル、 または 4一プロモアセト酢酸ェチルで ある。 また、 前記基質として、 4-ョ一ドアセト酢酸ェチル、 4-ヒドロキシァセト 酢酸ェチル、 2-クロ口- 3-ォキソ酪酸ェチル、 2-メチル -3-ォキソ酪酸ェチル、 4- アジドアセト酢酸ェチルなども用いることができる。
この 4-ハロアセト酢酸エステルは、 例えば、 特開昭 61- 146191に記載の方法に より調製され得る。 例えば 4-ハロアセト酢酸エステルは、 ジケテンを出発原料と して、 これにハロゲンを反応させ、 4-ハロ-ァセト酢酸ハライドとした後、 これ にアルコールを作用させる方法、 あるいは、 ァセト酢酸エステルを出発原料とし て、 ァセト酢酸エステルの 4位を直接ハロゲン化する方法などにより調製される。 反応は、 適当な溶媒中に基質 4-ハロアセト酢酸エステル、 補酵素 NADPH、 およ び該形質転換微生物の培養物またはその処理物等を添加し、 PH調整下撹拌するこ とにより行い得る。 反応は温度 10° (：〜 70°C、 pH4〜10で行う。 また、 基質の仕込 み濃度は 0. 1 %〜90 % (w/v)であるが、 基質を連続的に添加し得る。 反応はバッチ 方式または連続方式で行い得る。
ここで、 微生物の処理物等とは、 例えば、 粗抽出液、 培養菌体、 凍結乾燥生物 体、 アセトン乾燥生物体、 またはそれらの菌体の磨砕物等を意味する。 更にそれ らは、 酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。 固 定化は、 当業者に周知の方法 （例えば、 架橋法、 物理的吸着法、 包括法など） で 行い得る。
反応は、 一般的に用いられる NADPH再生系を組み合わせて用いることにより、 高価な補酵素の使用量を大幅に減少させ得る。 代表的な NADPH再生系としては、 例えば、 G D Hおよびグルコースを用いる方法が挙げられる。 反応条件は用いる 酵素、 微生物またはその処理物、 基質濃度などによって異なるが、 基質濃度約 0. 1〜90重量％、 反応温度 10〜50°C、 pH5~8、 反応時間、 1〜36時間である。
C R D酵素遺伝子およびこの酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵 素 （例えば、 G D H) の遺伝子を同一宿主微生物内に導入した形質転換微生物の 培養物またはその処理物等を用いて同様の反応を行えば、 別途に補酵素の再生に 必要な酵素源を調製する必要がないため、 より低コス卜で（S) - 4-ハロ- 3-ヒドロ キシ酪酸エステルが製造され得る。
反応で生じた 4-ハ口- 3-ヒドロキシ酪酸エステルは、 常法により精製され得る。 例えば、 4 -八口- 3-ヒドロキシ酪酸エステルは、 微生物を用いた場合などには必 要に応じ遠心分離、 濾過などの処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、 次いで酢 酸ェチル、 トルエン等の有機溶媒で抽出し、 硫酸ナトリウム等の脱水剤で脱水し、 有機溶媒を減圧下で除去し、 そして減圧蒸留またはクロマトグラフィー等 （例え ば、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー） の処理を行うことにより、 精製され 得る。
4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸エステルはガスクロマトグラフィーで定量され得る。 例えば、 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの定量は、 PEG- 20M Chromosorb WAW DMCS 10¾ 80/100mesh (ジ一エルサイエンス株式会社製） を充填したガラスカラ ム （ID3imnXlin) を用い、 150 でクロマトグラフィーを行い、 FIDにより検出する ことにより行い得る。
(S) -4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの光学純度の測定は、 光学分離カラム CHI RALCEL 0B (ダイセル化学工業株式会社製） を用いた HPLCにより行い得る。
以上のように、 本願発明に従って、 CRD酵素の大量生産が可能である。 さら に、 この酵素を利用することにより、 （S)- 4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸エステルを はじめとする光学活性アルコールの優れた製造法が提供される。
以下、 実施例により本願発明を詳細に説明する。 しかし、 本願発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。
以下の実施例において用いた組換え DNA技術に関する詳細な操作方法などは、 次のテキストに記載されている。
(I)Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))
(IDCurrent Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wi ley-Interscience )
(実施例 1 ： CRD酵素の精製）
以下の方法に従って、 キャンディダ.マグノリエ （Candida magnoliae) IFO 0 705より 4-ハロアセト酢酸エステルを不斉的に還元して（S)-4-ハロ- 3-ヒドロキシ 酪酸エステルを生成する活性を有する CRD酵素を電気泳動的に単一に精製した, 下記の組成からなる液体培地 8000mlを調製し、 2000ml容坂ロフラスコに 400ml ずつ分注して、 120度で 20分間蒸気殺菌をおこなった。 培地組成：
グルコース 5 %
ポリペプトン 0.5 %
KH2P04 0.2 %
K2HP04 0.1 %
MgS04 · 7H20 0.02%
水道水
pH 6.5 これらの培地に、予め同培地中で前培養しておいたキャンディダ ·マグノリエ (Candida magnoliae) IFO0705の培養液を 5mlずつ接種し、 30°Cで 3日間振とう培養 した。 この培養液から遠心分離により菌体を集め、 生理食塩水にて 2回洗浄を行 つた。 このようにして， 該菌株の湿菌体 230gを得た。 この湿菌体 180gを 360mlの 5 OmMリン酸緩衝液 （pH7.0) に懸濁し、 次いで菌体をダイノミル （Dyno- Mill社 製） で破碎した。 この菌体破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、 無細胞抽出 液 760mlを得た。 この無細胞抽出液に 40%飽和となるように硫酸アンモニゥムを 添加し、 これを溶解させ、 次いで生じた沈殿を遠心分離により除去した後、 上清 を 0. ImMの DTTを含む 10mMリン酸緩衝液 （pH7.0) に対して透析した。 これを同 一緩衝液で予め平衡化した DEAE sephacel (Pharmacia Biotech製）カラム (500m 1) に供し、同一緩衝液でカラムを洗浄した。 素通りしてきた溶出液から活性画分 を回収し、 これに終濃度 4Mとなるように NaClを添加した。 この活性画分を 4Mの N aClと 0. ImMの DTTを含む 10mMリン酸緩衝液 （pH7.0) で平衡化した Phenyl sepha rose CL-4B (Pharmacia Biotech製）カラム （200ml) に供して、 酵素を吸着させた。 同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 10mMリン酸緩衝液 （PH7.0) を用い、 NaCl (4Mから 0Mまで） およびエチレングリコール （0%から 50%(w/v)まで） のリニア グラジェントにより、 活性画分を溶出させた。 活性画分のうち最初に溶出されて くるものを集め、 これを lOmMリン酸緩衝液 （pH7.0) に対して 1夜透析を行った。 この透析液を 0. lmMDTTを含む 10mMリン酸緩衝液 （pH7.0) で予め平衡化した M ono Q HR 5/5 (Pharmacia Biotech製 FPLCシステム）カラム （1ml) に供し、 同一緩 衝液で洗浄を行った。 洗浄液中の活性画分を集め、 これを限外ろ過にて 200 に 濃縮し、 次いで 0.2Μ塩化ナトリウム， 0. ImM DTTを含む 10mMリン酸緩衝液 （pH7. 0) にて予め平衡化した Superdex 200 HR10/30(Pharmacia Biotech製）カラム (24 ml) に供し、 同緩衝液で溶出した。 活性画分を集め精製酵素標品を得た。
(実施例 2 ：酵素の性質の測定）
実施例 1において得られた酵素の酵素学的性質について検討した。
酵素活性の測定は、 基本的には、 200mMリン酸緩衝液 （PH7.0) 中に、 基質 4 -ク ロロァセト酢酸ェチル 0.2mM、 補酵素 NADPH 0.32mM、 および酵素溶液 0. lmlを含む 3.0mlの反応液を、 30°C、 1分間反応させ、 波長 340nmの吸光度の減少を測定する ことにより行った。
(1) 作用： NADPHを補酵素として、 4-クロロアセト酢酸ェチルに作用し、 光学 純度 99 % e. e.以上の（S) -4-ヒドロキシ酪酸ェチルを生成した。
(2) 基質特異性：表 1に示す各種カルボニル化合物を基質として、 4-クロロア セ卜酢酸ェチルと同様の条件で反応を行った結果、 本願発明の酵素は表 1に示す 様な基質特異性を示した。 基質 0. 2 mM 相対活性 （％)
4-クロロアセト酢酸ェチル 1 0 0 ァセ卜酢酸ェチル 0 p -二トロべンズアル子'ヒド 0
0-二トロべンズアルギヒド 0 m -二トロべンズアルデヒド 0 p -クロロベンズァリレデヒド 0
0 -クロ口べンズァリレデ ド 0 m -クロロべンズアルデヒド 0 ニコチンアルデヒド 0 ィソニコチンアルデヒド' 0 ベンズアルデヒド 0 グリオキサール 0 メ千ルゲリオキ卄一ル 0 ジァセチル 1 9 クロロアセトアルデヒド 0 カンファーキノン 0
2-ク口口ァセト酢酸ェチル 9 5
4 -クロロアセト酢酸メチル 1 1
2 -クロロァセ卜醉酸メチル 1 1
4 -クロロアセト酢酸ォクチル 3 6 (3) 至適 pH：緩衝液としてリン酸緩衝液またはトリスー塩酸緩衝液を用いて pH 5.0〜8.5の範囲で、 上記方法で酵素活性を測定した。 その結果、 （S)- 4-クロ口- 3 -ヒドロキシ酪酸ェチルに作用する至適 pHは 5.5〜6.5であった。
(4) 作用至適温度： 20°C〜6(T の温度で 1分間の、 4-クロロアセト酢酸ェチル を基質とした場合の本願発明の酵素の活性を測定して、 至適温度を求めた。 その 結果、 至適温度は 50で〜55 であった。
(5) 熱安定性：本酵素を PH7.0において 40°Cで 30分間処理した後、 4-クロロア セト酢酸ェチルを基質として活性を測定した結果、 処理前の 90%の活性が残存し ていた。
(6) 阻害剤：上記反応溶液に、 表 2に示す濃度の各種金属イオンまたは阻害剤 を添加して、 4-クロロアセト酢酸ェチルを基質として（S)- 4-クロ口- 3-ヒドロキ シ酪酸ェチル活性を測定した。 表 2に示す様に、 本願発明の酵素はクェルセチン、 水銀イオンによって阻害を受けた。
表 2
化合物 添加濃度 （mM) 相対活性 （％) 無添加 100 クェルセチン (quercet in) 0. 01 84
0. 1 0 ジフエニルヒダン卜イン 1 84 シクマロ一ル (dico腿 rol) 0. 1 97
2， 4-ジニトロフエノール 0. 1 86
DTNB 0. 05 1 00 ョード酢酸 1 100
NEM 1 105
PMS F 1 93
P-CMB 1 88
EDTA 1 95 フエニルヒドラジン 1 97
S n C 12 1 77
P b C 12 1 86
Figure imgf000022_0001
C u S04 1 85
C o C 12 1 89
MgC 12 1 83
Z n S〇4 1 97
HgC 12 0. 1 49 (7) 分子量
酵素の分子量の測定は TSK- G3000SWカラムを用い、 溶離液として 0.1M Na2S04、 0.05% NaN3を含む 0.1Mリン酸緩衝液 （pH7.0) を用いた場合、 約 76， 000であつ た。 酵素のサブユニットの分子量は、 2V/V%の 2-メルカプトエタノール存在下、 10%SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、 そして標準タンパクの相対移動 度から算出することにより決定した。 その結果、 本酵素のサブユニットの分子量 は約 32， 000であった。
(8) 有機溶媒耐性：本願発明の酵素が溶解している PH7.0のリン酸緩衝液に等 量の酢酸ェチルまたは酢酸ブチルを添加し、 28°Cで 30分間振とうした後遠心分離 を行い、 水相中の酵素の残存活性を、 4-クロロアセト酢酸ェチルを基質として測 定した。 その結果、 酢酸ェチルを添加した場合では 72%、 酢酸ブチルを添加した 場合では 85%の活性が残存していた。
(実施例 3 ：本願発明の酵素を用いた（S)- 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの 製造）
精製した本願発明の酵素 50unit、 4-クロロアセト酢酸ェチル 250mg、 NADP 1.56 mg、 グルコース 280mg、 グルコース脱水素酵素 （天野製薬製） 60uni tを含む 100mM リン酸緩衝液 （PH6.5) 25mlを、 30°Cで 24時間撹拌した。 反応終了後、 反応液を 酢酸ェチルで抽出し、 脱溶剤した後の抽出物の分析を行ったところ、 収率 98%で 光学純度 99%e. e.以上の（S)- 4-クロロ- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルが生成していた。
(S)-4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの光学純度の測定は、 上記記載のよう に光学分離カラム CHIRALCEL 0B (ダイセル化学工業製） を用いた HPLCにより行つ た。 移動相としてへキサン イソプロパノール =9Z1の混合溶媒を用い、 移動 相の流速は 0.8ml/分でクロマトグラフィーを行った。 検出は、 215nmの吸光度を 測定することにより行った。
(S)- 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの定量はガスクロマトグラフィーによ り行った。 PEG- 20M Chromosorb AW DMCS 10% 80/100mesh (ジーエルサイェン ス株式会社製） を充填したガラスカラム （ID 3 mmx l m) を用い、 150ででクロ マトグラフィーを行い、 検出は FIDにより行った。 (実施例 4 ：本願発明の酵素を用いた（S) -4-ブロモ -3-ヒドロキシ酪酸ェチルの 製造）
精製した本願発明の酵素 5 uniし 4 -プロモアセト酢酸ェチル 25mg、 ADP 0. 16m g、 グルコース 28mg、 グルコース脱水素酵素 （天野製薬製） 6 1111 ^を含む1001^リ ン酸緩衝液 （PH6. 5) 2. 5mlを、 30°Cで 24時間撹拌した。 反応終了後、 反応液を酢 酸ェチルで抽出し、 脱溶剤した後、 抽出物の分析を行ったところ、 収率 43%で (S) - 4-ブロモ -3-ヒドロキシ酪酸ェチルが生成していた。 4-ブロモ -3-ヒドロキシ 酪酸ェチルの定量は実施例 2の 4-クロロ- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの場合と同様 に行った。 (実施例 5 ：本願発明の酵素を用いた（S) - 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸メチルの 製造）
精製した本願発明の酵素 5 uni t、 4-クロロアセト酢酸メチル 25mg、 NADP 0. 16m g、 グルコース 28mg、 グルコース脱水素酵素 （天野製薬製） 6 1111 "を含む100 リ ン酸緩衝液 （PH6. 5) 2. 5mlに酢酸ブチル 2. 5mlを添加し、 30°Cで 24時間撹拌した。 反応終了後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 脱溶剤した後抽出物の分析を行った ところ、 収率 58%で（S) - 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸メチルが生成していた。 4 - クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸メチルの定量は実施例 2の 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸 ェチルの場合と同様に行った。 (実施例 6 ：本願発明の酵素を用いた（S) - 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの 製造；基質の連続添加） 精製した本願発明の酵素 100unit、 NADP 1.56mg, グルコース 4.5g、 グルコース 脱水素酵素 （天野製薬製） 250unit、 NaCl 0.24gを含む lOOmMリン酸緩衝液 （ρΗ6· 5) 50mlに 4-クロロァセト酢酸ェチル 3.8gを 1時間に 0.23gの速度で連続的に添加 し、 水酸化ナトリウムを用いて pHを調整しながら 30 で 20時間撹拌した。 反応終 了後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、 脱溶剤した後抽出物の分折を行ったところ、 収率 91%で 100%e.e.の（S)-4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルが生成していた。 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの定量および光学純度の測定は実施例 2と同 様に行った。 (実施例 7 ： CRD酵素遺伝子のクローニング）
(染色体 DMライブラリ一の作製）
キャンディダ*マグノリエ （Candida magnoliae) IFO 0705の培養菌体から、 H ereford (Cel 1, 18, 1261 (1979)) に記載の方法に従って染色体 DNAを抽出した。 得られた染色体 DNAを Sau3AIで部分消化し、 この消化物のうち 23kbから 20kbの大 きさの DN'A断片を EMBL3ファージベクター （Stratagene社製） の BamHI部位に挿入 した。 得られた組換えファージベクターを、 Gigapack II Gold (Stratagene社 製） を用いてインビトロパッケージングした後、 これを大腸菌 NM415に感染させ て、 約 2万個からなる染色体 DNAライブラリーを作製した。 (合成オリゴヌクレオチドプローブの作製）
実施例 1のようにして得られた精製 C R D酵素を 8M尿素存在下で変性させた後、 ァクロモバクタ一由来のリシルエンドべプチダーゼ （和光純薬工業株式会社製） で消化し、 得られたペプチド断片のアミノ酸配列をエドマン法により決定した。 このアミノ酸配列をもとに、 以下の配列を有する DNAプローブを合成した。 プローブ 1 ： 5'-GCNCAYAC AARAAYGA-3' (配列番号： 3)
プローブ 2 : 5'-AAYGTNGARTAYCC GC-3' (配列番号： 4)
プローブ 3 : 5' -CTRGTYCTRCTRCTRTT-3' (配列番号： 5) プローブ 1、 2および 3を、 Megalabel (宝酒造株式会社製） を用いて32 Pで標 識して、 以下の実験に用いた。
(染色体 Di\TAライブラリーからの C R D酵素遺伝子のクローニング）
作製した染色体 DNAライブラリーを、 ，標識した合成 DNAプローブを用いて、 プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法 （Science, 196, 180 (1977)) により、 C RD酵素遺伝子を含むファージのプラークについてスクリーニングを行った。 そ の結果、 1個のポジティブプラークが得られた。 次に、 このポジティブプラーク から得た組換えファージ DNAを EcoRIおよび i ndl I〗で二重消化し、 得られた DNAを サザン法 U. Mol. Biol., 98， 53 (1975)) により解析した。 その結果、 EcoRI および Hindi IIによる二重消化で生じる約 1.3kbの消化断片が上記の合成 DNAプロ ーブとハイブリダィズした。 そこで、 この約 1.3kbの DNA断片をプラスミド pUC19 (宝酒造株式会社製） の EcoRI— Hindi II部位に挿入した組換えプラスミド pUC - HE を構築し、 CRD酵素遺伝子を含む染色体 DNAクローンとして選択した。 このプ ラスミドを pUC- HEと命名した。
(塩基配列の決定）
この組換えプラスミド pUC- HEに種々の制限酵素を作用させ、 その際に生じる消 化断片の解析を行い、 制限酵素切断地図を作成した。 次に、 この解析の際に得ら れた各種 DNA断片を pUC19のマルチクローニングサイトに揷入した組換えプラスミ ドを構築した。 これらの組換えプラスミドを用いて、 各々の挿入断片についての 塩基配歹1 J分析を、 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready React ion Kit (Perkin Elmer社製） および ABI 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems 社製） を用いて行った。 その結果、 CRD酵素遺伝子が含まれると予想される約 1.3kbの DNA断片の全塩基配列を決定した。 その塩基配列を図 1に示す。 また、 こ の塩基配列中の構造遺伝子部分については、 その塩基配列から推定されるァミノ 酸配列を図 1中で塩基配列の下段に示す。 このアミノ酸配列を、 精製 CRD酵素 のリジルェンドぺプチダ一ゼ消化べプチド断片の部分アミノ酸配列と比較した結 果、 精製 CRD酵素の部分アミノ酸配列は、 塩基配列から推定されるアミノ酸配 列中に存在し、 N末端のメチォニンが欠失していることを除くとその部分で完全 に一致することが見出された （図 1中のアミノ酸配列の下線部分） 。 X末端のメ チォニンはタンパク合成後の修飾により除去されるものと考えられる。
(実施例 8 ： CRD酵素遺伝子を含む組換えプラスミドの作製）
大腸菌において CRD酵素を発現させるために、 形質転換に用いる組換えブラ スミドを作製した。 まず、 CRD酵素の構造遺伝子の開始コドン部分に Ndel部位 を付加し、 かつ終止コドンの直後に EcoRI部位を付加した二本鎖 DNAを以下の方法 により取得した。 実施例 7で決定された塩基配列に基づき、 CRD酵素の構造遺 伝子の開始コドン部分に Ndel部位を付加した N末端 DNAプライマーと、 CRD酵素 の構造遺伝子の終始コドンの直後に EcoRI部位を付加した C末端 DNAプライマ一と を合成した。 これら 2つのプライマーの塩基配列を以下に示す。
N末端側の DNAプライマー
5'-TAGTCGTTAACCATATGGCTAAGAACTTCTCCAAC-3' (配列番号： 6)
C末端側の DNAプライマー
5' -TCTGAGTTAACGAATTCTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGT-3' (配列番号： 7 ) これら 2つの合成 DNAプライマーを用い、 実施例 7で得たプラスミド pUC- HEを錶 型として PCRにより二本鎖 DNAを合成した。 得られた DNA断片を Nde Iおよび Ec oRIで 消化し、 プラスミド pUCNT (W094/03613) の lacプロモーターの下流の Ndel、 EcoR I部位に挿入することにより、 組換えプラスミド pN'TSlを得た。
(実施例 9 ： CRD酵素遺伝子および GDH遺伝子の両者を同時に含む組換えプ ラスミドの作製）
プラスミド pGDA2(J. Biol. Chem. , (1989)， 264， 6381)を EcoRlおよび Pst Iで二重 消化し、 Bacillus megaterium由来の GDH遺伝子を含む約 0.9kbの DNA断片を単 離した。 この DNA断片をプラスミド pSL301 (Invitrogen社製） の EcoRI— Ps 11部位 に挿入した組換えプラスミド pSLGを構築した。 さらに、 pSLGを EcoRIおよび Xhol で二重消化し、 Bacillus megaterium由来の GDH遺伝子を含む約 0.9kbの DNA断 片を単離した。 この DNA断片を実施例 8において構築した pNTSlの EcoRI— Sail部 位 （CRD遺伝子の下流に存在する） に挿入した組換えプラスミド pNTSlGを得た。 pNTSlGの作製法および構造を図 2に示す。
(実施例 10 ：組換え大腸菌の作製）
実施例 8で得た組換えプラスミド pNTSlおよび実施例 9で得た組換えプラスミ ド PNTS1Gを用いて大腸菌 HB101 (宝酒造株式会社製） を形質転換し、 各々から組 換え大腸菌 HBlOl(pNTSl)および B101(pNTSlG)を得た。 こうして得られた形質転 換体である大腸菌 HBlOl(pNTSl)およ D¾B101(pNTSlG)は、 それぞれ、 受託番号 FER M BP- 5834および FERM BP- 5835として、 平成 9年 （1997年） 2月 24日付けで、 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305) 通商産業省工業技術 院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
また、 実施例 9と同様にプラスミド pGDA2(J. Biol. C em. , (1989) , 264, 6381) を EcoRIおよび Pstlで二重消化して得られる、 Bacillus megaterium由来の GDH 遺伝子を含む約 0.9kbの DNA断片を、 プラスミド pSTV28 (宝酒造株式会社製） の Ec oRI— Pstl部位に揷入して、 組換えプラスミド pSTVGを構築した。 この pSTVGで、 予め塩化カルシウム法でコンビテント化しておいた大腸菌 HB101 (pNTSl)を形質転 換し、 大腸菌^101 51， pSTVG)を得た。
(実施例 1 1 ：組換え大腸菌における CRD酵素の発現）
(組換え大腸菌の C R D酵素活性の測定）
実施例 10で得た組換え大腸菌 HB 101 (p TS 1 )を 50 g/m 1のアンピシリンを含む 2XYT培地で培養し、 集菌後、 lOOmMリン酸緩衝液 （pH6.5) に懸濁し、 超音波破 碎により無細胞抽出液を得た。 この無細胞抽出液の CRD酵素活性を以下のよう に測定した。 CRD酵素活性の測定は、 lOOmMリン酸緩衝液 （pH6.5) に、 基質 4- クロロアセト酢酸ェチル lmM、 補酵素 NADPHO. ImMおよび酵素を添加し、 30°Cで波 長 340nmの吸光度の減少を測定することにより行った。 この反応条件において、 1 分間に 1 μ mo 1の MDPHを NADPに酸化する酵素活性を 1 un i tと定義した。 この様に測 定した無細胞抽出液中の CRD酵素活性を比活性として表し、 ベクタ一プラスミ ドのみの形質転換体と比較した。 また、 実施例 1と同様の方法で調製したキャン ディダ'マグノリエ （Candida magnoliae) IFO 0705の無細胞抽出液中の C RD 酵素活性についても同様に比較した。 それらの結果を表 3に示す。 大腸菌 HB101 (pNTSl)では、 ベクタ一プラスミドのみの形質転換体である大腸菌 HB101 (pUCNT) と比較して明らかな CRD酵素活性の増加が見られ、 キャンディダ*マグノリエ (Candida magnoliae) IFO 0705と比較して約 8.5倍の活性が得られた。 表 3
Figure imgf000030_0001
(N末端配列の比較）
上記の発現実験と同様にして得られた無細胞抽出液、 およびキャンディダ*マ グノリエ （Candida magnol iae) IFO 0705の無細胞抽出液から精製した C RD酵 素の N末端アミノ酸配列をエドマン法によりそれぞれ 30残基まで決定した。 両者 を比較した結果、 両夕ンパクの N末端配列はこの範囲で完全に一致した。
(実施例 12 ：組換え大腸菌における CRD酵素および GDHの同時発現） 実施例 10で得た組換え大腸菌 HBlOl(pN'TSlG)および大腸菌 HB101(pN'TSl, pSTV
G)を、 実施例 1 1と同様に処理して得られる無細胞抽出液の GDH活性を、 以下 のように測定した。 GDH活性の測定は 1Mトリス塩酸緩衝液 （PH8.0) に、 基質 グルコース ば、 補酵素 NADP2mM及び酵素を添加し、 25°Cで波長 340nmの吸光度の 増加を測定することにより行った。 この反応条件において、 1分間に 1 molの NAD Pを MDPHに還元する酵素活性を limitと定義した。 また、 CRD酵素活性につい ても実施例 10と同様に測定した。 このように測定した無細胞抽出液中の CRD 酵素および GDH酵素活性を比活性として表し、 大腸菌1¾101(0^51)、 HBlOKpN TS1, pSTVG)およびべクタ一のみの形質転換体 HB101 (pUCNT)と比較した結果を表 4に示す。 大腸菌 HB101 (PNTS1G)および HB101 (pNTSl, pSTVG)では、 ベクターブラ スミドのみの形質転換体である大腸菌 HBlOl(pUCNT)と比較して、 明らかな CRD 酵素および GDH活性の増加が見られた。 表 4
Figure imgf000031_0001
(実施例 13 ： CRD酵素遺伝子を導入した組換え大腸菌による 4-ハロアセト酢 酸エステルからの（S) -4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸エステルの合成）
実施例 10で得た組換え大腸菌 HBlOl(pNTSl)を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37°Cで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに GDH (天野製薬株式会社製） 1250U、 グルコース 5.5g、 NADP1.6mgを添 加し、 5Mの水酸化ナトリウム水溶液で pH6.5に調製しつつ 30°Cで撹拌しながら、 4 -クロロアセト酢酸ェチルを 15分間毎に 250mgずつ添加した。 このようにして、 合 計 5gの 4-クロロアセト酢酸ェチルを添加し、 5時間反応を行った。 反応終了後、反 応液を酢酸ェチルで抽出し >脱溶剤した後抽出物の分析を行つたところ、収率 90% で 100 e.e.の （S) -4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルが生成していた。
4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの定量はガスクロマトグラフィーにより行 つた。 PEG- 20M Chromosorb WAW DMCS 10% 80/100mesh (ジ一エルサイエンス株式 会社製） を充填したガラスカラム （ID3mmXlin) を用い、 150°Cでクロマトグラフ ィーを行い， 検出は FIDにより行った。
(S)-4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの光学純度の測定は光学分離カラム CHI RALCEL 0B (ダイセル化学工業株式会社製） を用いた HPLCにより行った。 移動相 としてへキサン/イソプロパノール =9/1の混合溶媒を用い， 移動相の流速は 0.8ml /分でクロマトグラフィーを行った。 検出は、 215nmの吸光度を測定することによ り行った。 (実施例 14 ： CRD酵素及び GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4 -八 ロアセ卜酢酸エステルからの（S)- 4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸エステルの合成） 実施例 10で得た組換え大腸菌 HB101[pNTSlG]を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37でで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlにグルコース 5.5g、 NADP3.2mgを添加し、 5Mの水酸化ナトリウム水溶液で p H6.5に調製しつつ 30°Cで撹拌しながら 4-クロロアセ卜酢酸ェチルを 15分間毎に 25 Omgずつ添加した。 このようにして、 合計 5gの 4-クロロアセト酢酸ェチルを添加 し、 5時間反応を行った。 反応終了後、反応液を酢酸ェチルで抽出し J兑溶剤した 後抽出物の分析を行ったところ，収率 92%で 100 e.e.の（S)- 4-クロロ- 3-ヒドロキ シ酪酸ェチルが生成していた。
4 -クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの定量およびその光学純度の測定は、 実施 例 1 3と同様に行った。 (実施例 1 5 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4 - クロロアセト酢酸ェチルからの（S)- 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの合成） 実施例 10で得た組換え大腸菌 HBlOl(pN'TSlG)を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37 で 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 40mlに、 グルコース 19.2g、 NADP2.5mgを添加し、 5Mの水酸化ナトリウム水溶液 で PH6.5に調整しつつ 30°Cで撹拌しながら、 4-クロロアセト酢酸ェチルを毎時約 2 gの速度で合計 16. lgを連続して添加した。 反応は合計 24時間行った。 反応 後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、減圧下で溶媒を留去し、 濃縮物をシリカゲル カラムクロマトグラフィーにより精製して、 15.6gの （S) -4-クロ口- 3-ヒドロ キシ酪酸ェチルを得た。 この （S) -4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの光学純 度を HPLC法により分析したところ、 100%e.e.であった。 1H- NMR(CDC13) δ (pp m) ： 1.33(3H， 0、 2.65(2H,d)、 3.31(lH,d)、 3.60(2H,d)、 4.2 (3H， m) ；カラム： ダイセル化学工業社製、 Chiralcel OB (0.46 X 25cm) ；カラム温度： 0°C ；溶離 液： n—へキサン/ /2—プロパノール =9 1 ；流速： 0.8ml/分；検出： 215η m ;溶出時間： （S) 体— 19.2分、 （R) 体一 17.0分。 (実施例 16 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4- クロロアセト酢酸ェチルからの（S)- 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの合成） 実施例 1 0で得た組換え大腸菌 HBlOl(pNTSlG)を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37 :で 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 40mlに、 グルコース 9.6g、 5Mの水酸化ナトリウム水溶液で pH6.5に調整しつつ 3 0°Cで撹拌しながら、 4-クロロアセト酢酸ェチルを毎時約 2 gの速度で合計 8. lg を連続して添加した。 反応は合計 24時間行った。 反応後 >反応液を酢酸ェチル で抽出し、脱溶媒した後、 濃縮物を分析したところ、 収率 96%で、 lOO .e.の
(S) -4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルが生成していた。 (実施例 1 7 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4- ブロモアセト酢酸ェチルからの（S)- 4-ブロモ -3-ヒドロキシ酪酸ェチルの合成） 実施例 1 0で得た組換ぇ大腸菌1¾101( ^5 ）を、 500ral容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37°Cで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに、 グルコース 1.3g、 NADP3.2mgを添加し、 4-ブロモアセト酢酸ェチル 1 gを添加して、 5Mの水酸化ナトリウム水溶液で PH6.5に調整しつつ 30°Cで撹拌し ながら 18時間反応した。 反応後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、減圧下で溶媒 を留去し、 濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、 900m gの （S) -4-ブロモ -3-ヒドロキシ酪酸ェチルを得た。 この （S) - 4-ブロモ- 3- ヒドロキシ酪酸ェチルの光学純度を以下のように分析したところ、 10(^e. e.であ つた。 分析は、 試料をピリジン存在下で、 イソシアン酸フエニルによりカーバメ ートとし、 このものの光学純度を HP LC法により測定することにより行った。 1H-NMR(CDC13) δ (ppm) ： 1.38(3H, t), 2.75(2H,m)、 3.28(lH,br)、 3.51(2H，m)、 4. 18(3H，q)、 4.25(1H, m) ；カラム： ダイセル化学工業社製、 Chiralcel 0J (0.46X2 5cm) ；カラム温度： 25°C；溶離液： n—へキサン/ /2—プロパノール = 9/ 1 ；流速： 0.8ml/分；検出： 254nm；溶出時間： （S) 体— 24.2分、 （R) 体— 2 7.8分。
(実施例 18 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4- ョードアセト酢酸ェチルからの（S)- 4-ョード- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの合成） 実施例 10で得た組換え大腸菌 HBlOl(pNTSlG)を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37°Cで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに、 グルコース 0.5g、 NADP3.2mgを添加し、 4-ョードアセト酢酸ェチル 0.5 gを添加して、 5Mの水酸化ナトリゥム水溶液で pH6.5に調整しつつ 30°Cで撹拌し ながら 72時間反応した。 反応後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、減圧下で溶媒 を留去し、 濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、 900m gの (S) -4-ョ一ド- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルを得た。 この （S) - 4-ョード -3- ヒドロキシ酪酸ェチルの光学純度を以下のように分析したところ、 91.6%e.e.で あった。 分析は、 試料をジメチルスルホキシド中でシアン化ナトリウムと加熱す ることにより 4-シァノ -3-ヒドロキシ酪酸ェチルとし、 これをピリジン存在下で、 塩化ベンゾィルにより安息香酸エステルとし、 このものの光学純度を HP L C法 により測定することにより行った。 NMR(CDC13) <5 (ppm) ： 1.28(3H， t)、 2.65(2H, d)、 3.31(3H，m)、 4.00(lH,m), 4.20 (2H, q) ；カラム：ダイセル化学工業社製、 Ch iralpak AS (0.46 X 25cm) ；カラム温度： 25°C；溶離液： n—へキサン/エタノ ール =95 5 ；流速： 1ml/分；検出： 254nm；溶出時間： （S) 体一 19.6分、 (R) 体一 21.3分。 (実施例 1 9 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4- クロロアセト酢酸メチルからの（S) -4-クロロ- 3-ヒドロキシ酪酸メチルの合成） 実施例 1 0で得た組換ぇ大腸菌^101 51 を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37°Cで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに、 グルコース 7.2g、 NADP3.2mgを添加し、 4-クロロアセト酢酸メチル 4 gを添加して、 5Mの水酸化ナトリゥム水溶液で pH6.5に調整しつつ 30°Cで撹拌し ながら 24時間反応した。 反応後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、減圧下で溶媒 を留去し、 濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、 3.85 gの （S) -4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸メチルを得た。 この （S) - 4-クロロ- 3 - ヒドロキシ酪酸メチルの光学純度を以下のように分析したところ、 100%e.e.であ つた。 分析は、 試料をピリジン存在下で、 イソシアン酸フエニルにより力一バメ ートとし、 このものの光学純度を H PLC法により測定することにより行った。 1H-NMR(CDC13) δ (ppm) ： 2.65(2H,m), 3.20(lH,br) 3.63(2H, m), 3.73(3H，s)、 4. 28 (1H, m) ；カラム：ダイセル化学工業社製、 Chiralcel 0J (0.46 X 25cm) ；カラム 温度： 2 5°C；溶離液： n—へキサン 2—プロパノール - 8Z2 ；流速： 1ml /分；検出： 254ηπι；溶出時間： （S) 体一 19.2分、 （R) 体一 22.6分。
(実施例 2 0 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4 - アジドアセト酢酸ェチルからの（S) -4-アジド -3-ヒドロキシ酪酸ェチルの合成） 実施例1 0で得た組換ぇ大腸菌^101 5 ）を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37T:で 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに、 グルコース 3. lg、 NADP3.2mgを添加し、 4-アジドアセト酢酸ェチル 2 gを添加して、 5Mの水酸化ナトリゥム水溶液で pH6.5に調整しつつ 30°Cで撹拌し ながら 7 2時間反応した。 反応後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し，減圧下で溶媒 を留去し、 濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、 1.6g の （S) -4-アジド -3-ヒドロキシ酪酸ェチルを得た。 この （S) -4-アジド- 3 -ヒ ドロキシ酪酸ェチルの光学純度を H PLC法により分析したところ、 90.0%e.e. であった。 1H-NMR(CDC13) δ (ppm) ： 1.25(3H, t) , 2.55(2H, d)> 3.30- 3.35 (3H， m)、 4.20C3H, m) ；カラム：ダイセル化学工業社製、 Chiralcel 0B (0.46 X 25cm) ；カラ ム温度： 25で；溶離液： n—へキサン/ ^2—プロパノール =9 1 ；流速： 1 ml/分；検出： 254nm；溶出時間： （S) 体— 16.2分、 （R) 体— 19.6分。
(実施例 21 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 4- ヒドロキシァセト酢酸ェチルからの（S)- 3， 4-ジヒドロキシ酪酸ェチルの合成） 実施例 10で得た組換え大腸菌 HB101 (pNTSlG)を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37°Cで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに、 グルコース 7.4g、 MDP3.2mgを添加し、 4-ヒドロキシァセト酢酸ェチ ル 4 gを添加して、 5Mの水酸化ナトリゥム水溶液で pH6.5に調整しつつ 30°Cで撹 拌しながら 18時間反応した。 反応後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、減圧下で 溶媒を留去し、 濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、 3.2gの （S) -3， 4-ジヒドロキシ酪酸ェチルを得た。 この （S) -3， 4-ジヒドロキ シ酪酸ェチルの光学純度を以下のように分析したところ、 100¾e.e.であった。 分 析は、 試料をエタノール中でシアン化ナトリゥムと室温で反応させることにより 4 -シァノ -3-ヒドロキシ酪酸ェチルとし、 これをピリジン存在下で、 塩化べンゾ ィルにより安息香酸エステルとし、 このものの光学純度を H P L C法により測定 することにより行った。 1H- MR(CDC13) δ (ppm) ： 1.30(3H, t), 2.55(2H, m) 3.18 (lH.br), 3.55(lH,d)、 3.68(lH，d)、 4.15(lH，s)、 4.20(2H， q) ；カラム：ダイセ ル化学工業社製、 Chiralpak AS (0.46 X 25cm) ；カラム温度： 25°C ;溶離液： n —へキサン エ夕ノール =95 5 ；流速： 1ml/分；検出： 254MI；溶出時間： (S) 体一 19.6分、 （R) 体一 21.3分。 (実施例 22 ： CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 2 - メチル -3-ォキソ酢酸ェチルの還元による 3-ヒドロキシ- 2-メチル酪酸ェチルの合 成）
実施例 1 0で得た組換え大腸菌 HBlOl(pNTSlG)を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37°Cで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに、 グルコース 7.5g、 NADP3.2mgを添加し、 2-メチル -3-ォキソ酢酸ェチル 4 gを添加して、 5Mの水酸化ナトリゥム水溶液で pH6.5に調整しつつ 30 で撹拌 しながら 1 8時間反応した。 反応後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、減圧下で溶 媒を留去し、 濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、 3. 5gの 3-ヒドロキシ- 2-メチル酪酸ェチルを得た。 この 3-ヒドロキシ- 2-メチル酪酸 ェチルの光学純度を以下のように分析したところ、 91.6%e.e.であった。 分析は、 試料をジメチルスルホキシド中でシアン化ナトリゥムと室温で反応させることに より 4-シァノ -3-ヒドロキシ酪酸ェチルとし、 これをピリジン存在下で、 塩化べ ンゾィルにより安息香酸エステルとし、 このものの光学純度を H PLC法により 測定することにより行った。 1H- MRCCDC13) δ (ppm) ： 1.17(3H, t), 1.22(2H， t)、 1·28(3Η ）、 2.46(lH，m)、 2.82(lH,br)、 3.90(lH，m)、 4.18(2H, q)0
(実施例 23 : CRD酵素および GDHを同時発現させた組換え大腸菌による 2-ク ロロ- 3-ォキソ酢酸ェチルの還元による 2-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルの合 成）
実施例 1 0で得た組換え大腸菌 HBlOl (pNTSlG)を、 500ml容坂ロフラスコ中で滅 菌した 100mlの 2XYT培地に接種し、 37°Cで 13時間振とう培養した。 得られた培養 液 50mlに、 グルコース 6.5g、 NADP3.2mgを添加し、 2-クロ口- 3-ォキソ酢酸ェチル 4 gを添加して、 5Mの水酸化ナトリゥム水溶液で pH6.5に調整しつつ 30°Cで撹拌 しながら 1 8時間反応した。 反応後、 反応液を酢酸ェチルで抽出し、減圧下で溶 媒を留去し、 濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、 3. 8gの 2-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルを得た。 1H-N'MR(CDC13) δ (ppm) ： 1.35(6H, m)、 2.55(lH,br), 4.15(1H, d), 4.25(lH，m)、 4.30(2H，q)。 産業上の利用の可能性
新規な CRD酵素を用いて、 医薬などの合成中間体として有用な（S)-4-ハロ- 3 -ヒドロキシ酪酸エステルなどの光学活性アルコールを効率よく製造することが 可能となった。
この C R D酵素遺伝子のクローニングおよびその塩基配列の解析により、 高い CRD酵素産生能を有する形質転換体を得ることが可能になった。 また、 CRD 酵素および GDHを同時に高生産する能力を有する形質転換体をも得ることが可 能になった。
これらの形質転換体を用いることにより、 4-ハロアセト酢酸エステルなどの力 ルポニル化合物からの（S) -4-ハロ -3-ヒドロキシ酪酸エステルなどの光学活性ァ ルコールの合成を、 さらに効率良く行うことが可能となった。
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Arg Phe Glu Lys Glu Gly Lys Lys Gly Ala Leu Val Phe Thr Ala Ser
165 170 175
Met Ser Gly His lie Val Asn Val Pro Gin Phe Gin Ala Thr Tyr Asn
180 185 190
Ala Ala Lys Ala Gly Val Arg His Phe Ala Lys Ser Leu Ala Val Glu
195 200 205
Phe Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Ser Val Ser Pro Gly Tyr lie Asn
210 215 220
Thr Glu lie Ser Asp Phe Val Pro Gin Glu Thr Gin Asn Lys Trp Trp
225 230 235 240
Ser Leu Val Pro Leu Gly Arg Gly Gly Glu Thr Ala Glu Leu Val Gly
245 250 255
Ala Tyr Leu Phe Leu Ala Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Thr Gly Thr
260 265 270
Asp lie lie Val Asp Gly Gly Tyr Thr Leu Pro
275 280 配列番号 2
配列の長さ ： 852
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノム DNA
配列：
ATGGCTAAGA ACTTCTCCAA CGTCGAGTAC CCCGCCCCGC CTCCGGCCCA CACCAAGAAC 60 GAGTCGCTGC AGGTCCTTGA CCTGTTCAAG CTGAATGGCA AGGTTGCCAG CATCACTGGC 1 20 TCGTCCAGCG GTATTGGCTA CGCTCTGGCT GAGGCCTTCG CGCAGGTCGG CGCTGACGTC 180
GCCATCTGGT ACAACAGCCA CGACGCTACT GGCAAGGCTG AGGCCCTCGC CAAGAAGTAC 240
GGCGTCAAGG TCAAGGCCTA CAAGGCGAAC GTGAGCAGCT CTGACGCCGT GAAGCAGACG 300 ATCGAGCAGC AGATCAAGGA CTTCGGCCAC CTCGACATTG TCGTGGCGAA CGCCGGCATT 360
CCCTGGACGA AGGGTGCCTA CATCGACCAG GACGACGACA AGCACTTCGA CCAGGTCGTT 420
GACGTCGATC TGAAGGGTGT TGGATACGTC GCGAAGCACG CTGGCCGTCA CTTCCGCGAG 480
CGCTTCGAGA AGGAGGGCAA GAAGGGCGCC CTTGTGTTCA CGGCCTCCAT GTCTGGCCAC 540
ATTGTGAACG TGCCCCAGTT CCAGGCCACG TACAACGCGG CCAAGGCTGG CGTGCGCCAC 600 TTCGCGAAGT CGCTGGCCGT CGAGTTCGCG CCGTTCGCGC GCGTGAACTC TGTGTCGCCG 660
GGCTACATCA ACACGGAGAT CTCGGACTTC GTGCCCCAGG AGACGCAGAA CAAGTGGTGG 720
TCGCTCGTGC CCCTTGGCCG CGGCGGAGAG ACGGCCGAGC TCGTTGGCGC CTACCTGTTC 780
CTTGCATCTG ACGCCGGCTC GTACGCCACT GGTACGGACA TCATTGTTGA CGGTGGCTAC 840
ACGCTTCCCT AA 852 配列番号 3
配列の長さ ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列：
GCNCAYACNA ARAAYGA 17 配列番号 4
配列の長さ ： 17 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列：
AAYGTNGART AYCC GC 17
配列番号 5
配列の長さ ： Π
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列：
CTRGTYCTRC TRCTRTT 17 配列番号 6
配列の長さ ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列：
TAGTCGITAA CCATATGGCT AAGAACTTCT CCAAC 35 配列番号 7 配列の長さ ： 40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
配列：
TCTGAGTTAA CGAATTCTTA GGGAAGCGTG TAGCCACCGT 40

Claims

請求の範囲
1. 以下の （1) から （4) の理化学的性質を有するカルボニル還元酵素： ( 1 ) 作用：
NADPHを補酵素として、 4-クロロアセト酢酸ェチルに作用し、 （S)- 4-クロロ- 3 - ヒドロキシ酪酸ェチルを生成する、
( 2 ) 基質特異性：
4 -クロロアセト酢酸ェチルに対して強い活性を示し、 ァセト酢酸ェチルには実 質的に活性を示さない、
(3) 至適 pH： pH5.5〜6.5、 および
(4) 作用至適温度： 50 ：〜 55°C。
2. さらに、 以下の （5) から （7) の理化学的性質を有する請求項 1に記載の カルボニル還元酵素：
(5) 熱安定性： PH7.0で 30分間処理したときに約 40°Cまで安定である、
(6) 阻害剤：水銀イオン、 クェルセチンにより阻害される、 および
(7) 分子量：ゲル濾過分析において約 76， 000、 SDSポリアクリルアミド電気泳 動分析において約 32， 000。
3. 配列表の配列番号 1のアミノ酸配列または配列表の配列番号 1のアミノ酸配 列において 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換、 または付加されたアミノ酸配 列あるいはその一部を有し、 かつ 4-クロロアセト酢酸ェチルを不斉的に還元して (S)- 4-クロ口- 3-ヒドロキシ酪酸ェチルを生成する活性を有する、 カルボニル還 元酵素。
4. 前記酵素が、 キャンディダ （Candida) 属に属する微生物から得られた酵素 である、 請求項 1〜3のいずれかに記載の酵素。
5. 前記酵素が、 キャンディダ ·マグノリエ （Candida magnoliae) から得られ た酵素である、 請求項 1〜3のいずれかに記載の酵素。
6. 前記酵素が、 キャンディダ *マグノリエ IF0 0705から得られた酵素である、 請求項 1〜 3のいずれかに記載の酵素。
7. 請求項 1〜 6のいずれかに記載の酵素をコードする DNA。
8. 前記 DNAが配列表の配列番号 2のヌクレオチド配列を有する、 請求項 7に 記載の DNA。
9. 請求項 7または 8に記載の DNAを有するプラスミド。
1 0. 前記プラスミド力 ¾NTS1である、 請求項 9に記載のプラスミド。
1 1. 請求項 9または 10に記載のプラスミドにより形質転換された形質転換細 胞。
12. 前記形質転換細胞が大腸菌である、 請求項 1 1に記載の形質転換細胞。
13. 前記形質転換細胞が E. col i HBlOl(pNTSl)である、 請求項 1 1に記載の形 質転換細胞。
14. 以下の一般式：
Figure imgf000046_0001
(式中、 R1はハロゲン原子であり、 R2は水素であり、 R3は置換または非置換のァ ルキル基またはァリール基を表す） で表される（S)-4-ハロ- 3-ヒドロキシ酪酸ェ ステルの製造方法であって、 該方法は、 以下の一般式：
Figure imgf000046_0002
(式中、 R1はハロゲン原子であり、 R2は水素であり、 R3は置換または非置換のァ ルキル基またはァリール基を表す） で示される 4-ハロアセト酢酸エステルと請求 項 1〜 3のいずれかに記載の酵素、 あるいは該酵素の産生能を有する微生物の培 養物あるいはその処理物とを反応させる工程を包含する、 方法。
15. 前記ハロゲン原子が塩素または臭素であり、 前記 R3が炭素数 1〜4のアル キル基である、 請求項 14に記載の方法。
16. 前記基質が、 4_クロロアセト酢酸メチル、 4—クロロアセト酢酸ェチル、 4一プロモアセト酢酸メチル、 または 4一プロモアセト酢酸ェチルである、 請求 項 1 5に記載の方法。
1 7. 前記微生物が、 キャンディダ （Candida) 属に属する微生物である、 請求 項 14〜 16のいずれかに記載の方法。
18. 前記微生物が、 キャンディダ ·マグノリエ （Candida magnoliae) である、 請求項 17に記載の方法。
19. 前記微生物が、 キャンディダ ·マグノリエ IF0 0705である、 請求項 18 に記載の方法。
20. 前記微生物が、 請求項 1 1〜13のいずれかに記載の形質転換細胞である. 請求項 14〜 16のいずれかに記載の方法。
21. 以下の一般式：
Figure imgf000047_0001
で表される光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類の製造方法であって、 以下の 一般式：
Figure imgf000047_0002
で表される 3-ォキソ -酪酸エステル類を不斉的に還元して、 以下の一般式
Figure imgf000048_0001
で表される光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類を生成する活性を有する酵素 をコードする D N Aを有するプラスミドで形質転換された形質転換細胞と、 以下 の一般式：
Figure imgf000048_0002
で表される 3-ォキソ -酪酸エステル類とを反応させる工程、 および生成した以下 の一般式：
Figure imgf000048_0003
で表される光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類を採取する工程を包含する、 方法。
2 2 . 前記一般式において、 IUおよび R2がそれぞれ独立して、 ハロゲン、 アジド、 ベンジルァミノまたは水素であり、 ここで R1または R2のいずれか一方が水素であ り、 そして R3が置換または非置換のアルキル基またはァリール基である、 または 前記一般式において、 R1および R2がそれぞれ独立して、 アルキル基、 水酸基また は水素であり、 ここで R1または R2のいずれか一方が水素であり、 そして R3が置換 または非置換のアルキル基またはァリール基である、 請求項 2 1に記載の方法。
23. 前記一般式において、 R1が水酸基であり、 R2が水素であり、 そして R3がェ チルである、 請求項 22に記載の方法。
24. 前記一般式において、 R1が塩素であり、 R2が水素であり、 そして R3がェチ ルである、 請求項 22に記載の方法。
25. 前記形質転換細胞が請求項 1 1〜1 3のいずれかに記載の形質転換細胞で ある、 請求項 2 1〜24のいずれかに記載の方法。
26. 請求項 7または 8に記載の DN Aおよびグルコース脱水素酵素をコードす る DNAを有するプラスミド。
27. 前記グルコース脱水素酵素が、 バシラス ·メガテリゥム （Bacillus megat erium) に由来する、 請求項 26に記載のプラスミド。
28. 前記プラスミドが pNTSlGである、 請求項 27に記載のプラスミド。
29. 請求項 26〜28のいずれかに記載のプラスミドにより形質転換された形 質転換細胞。
30. 前記形質転換細胞が大腸菌である、 請求項 29に記載の形質転換細胞。
3 1. 前記形質転換細胞が E. col i HBlOl(pNTSlG)である、 請求項 30に記載の形 質転換細胞。
3 2 . 光学活性アルコールの製造方法であって、 カルボニル化合物を不斉的に還 元して光学活性アルコールを生成する活性を有する酵素をコードする D N Aおよ び該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵素をコードする D N Aを有 するプラスミドで形質転換された形質転換細胞と、 カルボニル化合物とを反応さ せる工程、 ならびに生成した光学活性アルコールを採取する工程を包含する、 方 法。
3 3 . 前記補酵素を再生する能力を有する酵素がグルコース脱水素酵素である、 請求項 3 2に記載の方法。
3 4 . 前記形質転換細胞が請求項 2 9〜 3 1のいずれかに記載の形質転換細胞で ある、 請求項 3 2に記載の方法。
3 5 . 前記カルボニル化合物が以下の一般式：
Figure imgf000050_0001
で表される 3-ォキソ -酪酸エステル類であり、 得られる光学活性アルコールが以 下の一般式：
Figure imgf000050_0002
で表される光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類である、 請求項 3 2〜3 4の いずれかに記載の方法。
3 6 . 前記一般式において、 R1および R2がそれぞれ独立して、 ハロゲン、 アジド、 ベンジルァミノまたは水素であり、 ここで R1または R2のいずれか一方が水素であ り、 そして R3が置換または非置換のアルキル基またはァリール基である、 または 前記一般式において、 R1および R2がそれぞれ独立して、 アルキル基、 水酸基また は水素であり、 ここで R1または R2のいずれか一方が水素であり、 そして R3が置換 または非置換のアルキル基またはァリール基である、 請求項 3 5に記載の方法。
3 7 . 前記一般式において、 R1が塩素であり、 R2が水素であり、 そして R3がェチ ルである、 請求項 3 6に記載の方法。
3 8 . 請求項 7または 8に記載の D N Aを有する第 1のプラスミドおよびダルコ —ス脱水素酵素をコードする D N Aを有する第 2のプラスミドにより形質転換さ れた形質転換細胞。
3 9 . 前記第 1のプラスミドが pNTSlであり、 グルコース脱水素酵素がバシラ ス ·メガテリゥム （Bac i l lus mega ter i urn) に由来する、 請求項 3 8に記載の形 質転換細胞。
4 0 . 前記形質転換細胞が大腸菌である、 請求項 3 8または 3 9に記載の形質転 換細胞。
4 1 . 光学活性アルコールの製造方法であって、 カルボニル化合物を不斉的に還 元して光学活性アルコールを生成する活性を有する酵素をコードする D N Aを有 する第一のプラスミドおよび該酵素が依存する補酵素を再生する能力を有する酵 素をコードする D N Aを有する第二のプラスミドで形質転換された形質転換細胞 と、 カルボニル化合物とを反応させる工程、 ならびに生成した光学活性アルコ一 ルを採取する工程を包含する、 方法。
4 2 . 前記補酵素を再生する能力を有する酵素がグルコース脱水素酵素である、 請求項 4 1に記載の方法。
4 3 . 前記形質転換細胞が請求項 3 8〜 4 0のいずれかに記載の形質転換細胞で ある、 請求項 4 1に記載の方法。
4 4 . 前記カルボニル化合物が以下の一般式：
Figure imgf000052_0001
で表される 3-ォキソ-酪酸エステル類であり、 得られる光学活性アルコールが以 下の一般式：
R
Figure imgf000052_0002
で表される光学活性 3-ヒドロキシ-酪酸エステル類である、 請求項 4 1〜4 3の いずれかに記載の方法。
4 5 . 前記一般式において、 R1および R2がそれぞれ独立して、 ハロゲン、 アジド, ベンジルァミノまたは水素であり、 ここで R1または R2のいずれか一方が水素であ り、 そして R3が置換または非置換のアルキル基またはァリール基である、 または 前記一般式において、 R1および R2がそれぞれ独立して、 アルキル基、 水酸基また は水素であり、 ここで R1または R2のいずれか一方が水素であり、 そして R3が置換 または非置換のアルキル基またはァリール基である、 請求項 4 4に記載の方法。
4 6 . 前記一般式において、 R1が塩素であり、 R2が水素であり、 そして R3がェチ ルである、 請求項 4 5に記載の方法。
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