SK105699A3 - Novel carbonyl reductase, gene that encodes the same, and method of utilizing these - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka enzýmu s aktivitou redukcie karbonylu, ktorá redukuje karbonylové zlúčeniny asymetricky za vzniku opticky aktívneho alkoholu (ďalej bude tento enzým označovaný ako CRD enzým), DNA kódujúcej tento enzým, plazmidu nesúceho túto DNA, transformantu, ktorým je bunka transformovaná takýmto plazmidom, a spôsobu na získavanie opticky aktívneho alkoholu použitím uvedeného enzýmu a/alebo transformovanej bunky. Výsledný opticky aktívny alkohol, napríklad ester kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej, je užitočnou zlúčeninou na syntézu liečiv, chemikálií pre poľnohospodárstvo a podobne.

Doterajší stav techniky

Je známych niekoľko CRD enzýmov (viď Yuki Gosei Kagaku, 49, 52 (1991) a Eur. J. Biochem., 184, 1 (1981)). Spomedzi týchto CRD enzýmov tie, ktoré pôsobia na ester kyseliny 4-halogénacetoctovej za vzniku esteru kyseliny (S)-4-halogén-3hydroxybutánovej, ktoré sú získané z mikroorganizmov, a ktoré majú udávané charakteristiky, sú len dva: enzým získaný z Geotríchum candidum (Enzýme Microb. Technol. (1992), Vol. 14, 731) a enzým získaný z Candida parapsilosis (Enzýme Microb. Technol. (1993), Vol. 15, 950). Avšak doposiaľ neboli publikované žiadne informácie o génoch kódujúcich tieto dva typy enzýmov. Redukcia esteru kyseliny 4halogénacetoctovej použitím týchto enzýmov prebieha len pri nízkych koncentráciách substrátu. Je preto nepraktické syntetizovať ester kyseliny (S)-4-halogén-3hydroxybutánovej použitím týchto enzýmov ako katalyzátorov.

Okrem uvedenej reakcie používajúcej tieto dva typy enzýmov je známe, že niekoľko reakcií využívajúcich mikrobiálne bunky a produkty takých reakcií dokážu uskutočniť asymetrickú redukciu esteru kyseliny 4-halogénacetoctovej (japonský patent č. 1723728, japonská patentová publikácia vyložená na verejné nahliadnutie č. 6 - 209782 a č. 6 - 38776 a podobne). Avšak tieto reakcie neprebiehajú pri vysokých koncentráciách substrátu a teda nemožno tvrdiť, že sa našla praktická výrobná metóda. Ako príklad môže slúžiť spôsob reakcie používajúci dvojfázový systém s organickým rozpúšťadlom (Japonský patent číslo 2566962). Rovnako bol opísaný spôsob používajúci opticky aktívny fosfínový komplex s ruténiom (japonská patentová publikácia vyložená na verejné nahliadnutie č. 1 - 211551). Tento spôsob však má mnoho problémov, ktoré nie sú doriešené, napríklad požiadavka na vysokotlakovú reakčnú nádobu a potreba drahého katalyzátora.

Za týchto okolností bolo žiaduce vyvinúť praktický enzýmový spôsob, ktorý by uskutočňoval asymetrickú redukciu karbonylových zlúčenín, ako je ester kyseliny 4halogénacetoctovej, na produkciu opticky aktívnych alkoholov, napríklad esteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej.

Enzýmy CRD typu vyžadujú pre reakciu redukčný typ koenzýmu. Ak má byť karbonylová zlúčenina redukovaná pomocou buniek mikroorganizmov, ktoré majú CRD enzým, je nutné do reakčného systému pridať cukor, napríklad glukózu, aby sa aktivovali enzýmy regeneračného systému na premenu oxidovaného koenzýmu na redukovaný typ a tento regenerovaný koenzým sa potom využije v redukcii. Skupina týchto enzýmov regeneračného systému je náchylná na zablokovanie alebo poškodenie buď substrátmi alebo redukovanými produktmi. Tento fakt sa považoval za jednu z hlavných príčin toho, prečo reakcia prebieha len vtedy, ak je koncentrácia substrátov alebo produktov nízka. Je známe, že množstvo drahého koenzýmu používaného na redukciu možno značne znížiť kombináciou enzýmu majúceho schopnosť regenerácie koenzýmu, od ktorého CRD enzým závisí, s CRD enzýmom počas reakcie (napr. japonský patent č. 2566960 a Enzýme Microb. Technol. (1993), zv. 15, 950). V tomto prípade je však nutné pripraviť zdroj enzýmu na regeneráciu oddelene od produkcie CRD enzýmu skôr, ako sa regeneračný enzým pridá do reakčnej zmesi.

, ’ t

Predkladatelia tohto vynálezu objavili nový typ CRD enzýmu v rode Candida a zistili, že opticky aktívny alkohol možno účinne produkovať z karbonylových zlúčenín použitím tohto CRD enzýmu.

Tiež zistili, že opticky aktívny alkohol možno účinne produkovať použitím transformovaných buniek nesúcich gén so schopnosťou súčasne regenerovať koenzým (napríklad glukózodehydrogenázový gén).

Predložený vynález opísaný v prihláške môže výhodne poskytnúť nový CRD enzým, DNA kódujúcu tento enzým, plazmid nesúci túto DNA, transformant, teda bunku transformovanú týmto plazmidom, a spôsob produkcie opticky aktívnych alkoholov pomocou uvedeného enzýmu a/alebo transformovaných buniek.

Podstata vynálezu

Karbonylová reduktáza uvádzaná v predloženom vynáleze má nasledujúce fýzikálne a chemické vlastnosti od 1) do 4):

1) účinok:

pôsobí na etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej pri využití NADPH ako koenzýmu za vzniku etylesteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej;

2) substrátová špecifickosť:

vykazuje silnú aktivitu na etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej, zatiaľ čo na etylester kyseliny acetoctovej nevykazuje prakticky vôbec žiadnu aktivitu;

3) optimálne pH: 5,5 až 6,5;

4) optimálna teplota reakcie: 50 °C až 55 °C;

V jednom riešení má karbonylová reduktáza ďalšie fyzikálne a chemické vlastnosti od 5) do 7):

5) tepelná stabilita: je stabilná až do 40 °C, ak je uchovávaná pri pH 7,0 počas 30 min;

I t

6) inhibítor: je inhibovaná iónmi ortuti a kvercetínom; a

7) molekulová hmotnosť: cca 76 000 určené gélovou filtráciou a cca 32 000 pomocou SDS polyakrylamidovej elektroforézy.

Karbonylová reduktáza uvádzaná v predloženom vynáleze má sekvenciu aminokyselín SEQ ID č. 1 zoznamu sekvencii alebo aminokyselinovú sekvenciu s jednou alebo niekoľkými vynechanými sekvenciami, substituovanými alebo pridanými v aminokyselinovej sekvencii SEQ ID č. 1 súpisu sekvencii, alebo časť aminokyselinových sekvencií SEQ ID č. 1 súpisu sekvencií a má aktivitu redukcie etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej asymetricky za vzniku etylesteru kyseliny (S)4-chlór-3-hydroxybutánovej.

V jednom uskutočnení je uvedený enzým získavaný z mikroorganizmu patriaceho do rodu Candida. Výhodne sa tento enzým získava z Candida magnoliae. Vo výhodnejšom uskutočnení sa enzým získava z druhu Candida magnoliae IFO 0705.

DNA podľa predloženého vynálezu kóduje uvedený enzým. V jednom uskutočnení má uvedená DNA sekvenciu nukleotidov zodpovedajúcu SEQ ID č. 2 zoznamu sekvencií.

Plazmid podľa predloženého vynálezu má vyššie uvedenú DNA sekvenciu. V jednom uskutočnení je týmto plazmidom pNTS1.

Transformované bunky podľa tohto vynálezu sú bunky, ktoré boli transformované vyššie uvedeným plazmidom. Takou transformovanou bunkou môže byť E. coli. Vo výhodnom uskutočnení sú transformované bunky bunkami E. coli HB101(pNTS1).

Plazmid podľa tohto vynálezu má DNA kódujúcu enzým majúci schopnosť asymetricky redukovať etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej za vzniku etylesteru kyseliny (S)-4-chlórhydroxybutánovej a DNA kódujúcu enzým so schopnosťou regenerácie koenzýmu, od ktorého enzým závisí (napríklad glukózodehydrogenáza).

V jenom uskutočnení je glukózodehydrogenáza získavaná z Bacillus megaterium. Je výhodné, ak je nesená plazmidom pNTS1.

Transformované bunky podľa tohto vynálezu sú transformanty, kde bunky boli transformované uvedeným plazmidom.

V jednom uskutočnení sú transformované bunky E. coli. Vo výhodnom uskutočnení sú transformované bunky E. coli HB101(pNTS1).

Transformované bunky podľa predkladaného vynálezu sú bunky transformované tak, že prvý plazmid obsahuje DNA kódujúcu enzým s aktivitou asymetrickej redukcie etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej za vzniku etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej a druhý plazmid obsahuje DNA kódujúcu enzým s aktivitou regenerácie koenzýmu, od ktorého enzým závisí (napríklad glukózodehydrogenáza).

V jednom uskutočnení sú transformované bunky také transformanty, ktorých bunky nesú plazmid pNTS1 a plazmid, ktorý obsahuje DNA kódujúcu glukózodehydrogenázu, získaný z Bacillus megaterium. Vo výhodnom uskutočnení je transformovanou bunkou E. coli.

Spôsob výroby na produkciu opticky aktívneho esteru kyseliny 3hydroxybutánovej podľa predkladaného vynálezu zahŕňa nasledujúce kroky: reakcia enzýmu, ktorý má aktivitu asymetrickej redukcie esteru kyseliny 3-hydroxybutánovej, s esterom kyseliny 3-hydroxybutánovej za vzniku opticky aktívneho esteru kyseliny 3hydroxybutánovej, alebo kultúry mikroorganizmu majúceho schopnosť produkcie tohto enzýmu, alebo izolovaného produktu tejto kultúry; a získanie vytvoreného produktu, ktorým je opticky aktívny ester kyseliny 3-hydroxybutánovej.

Spôsob výroby na produkciu opticky aktívneho esteru kyseliny 3hydroxybutánovej podľa predloženého vynálezu pozostáva z týchto krokov: reakcia transformantov, ktorými sú bunky transformované plazmidom nesúcim DNA kódujúcu enzým s aktivitou asymetrickej redukcie esteru kyseliny 3-hydroxybutánovej s esterom kyseliny 3-hydroxybutánovej za vzniku opticky aktívneho esteru kyseliny 3hydroxybutánovej; a získanie vzniknutého produktu, ktorým je opticky aktívny ester kyseliny 3-hydroxybutánovej.

Spôsob výroby na produkciu opticky aktívneho alkoholu podľa predloženého

I vynálezu pozostáva z týchto krokov: transformanty, ktorými sú bunky transformované plazmidom nesúcim DNA, ktorá kóduje enzým s aktivitou asymetrickej redukcie karbonylových zlúčenín, a ďalej DNA kódujúcu enzým so schopnosťou regenerácie koenzýmu, od ktorého enzým závisí, reagujú s karbonylovými zlúčeninami za vzniku opticky aktívneho alkoholu; ďalej získanie vzniknutého produktu, ktorým je opticky aktívny alkohol.

Spôsob výroby na získanie opticky aktívneho alkoholu podľa predloženého vynálezu pozostáva z nasledujúcich krokov; s karbonylovou zlúčeninou reaguje transformant, ktorým je bunka, ktorá obsahuje prvý plazmid nesúci DNA kódujúcu enzým s aktivitou asymetrickej redukcie karbonylových zlúčenín za vzniku opticky aktívneho alkoholu, a druhý plazmid, ktorý obsahuje DNA kódujúcu enzým, ktorý má schopnosť regenerovať koenzým, od ktorého enzým závisí; ďalej získanie vzniknutého produktu, ktorým je opticky aktívny alkohol.

V jednom uskutočnení je karbonylovou zlúčeninou ester kyseliny 3hydroxybutánovej, ktorý možno vyjadriť všeobecným vzorcom:

a výsledný opticky aktívny alkohol je opticky aktívny ester kyseliny 3hydroxybutánovej, ktorý možno vyjadriť všeobecným vzorcom:

Vo výhodnom uskutočnení vo vyššie uvedených všeobecných vzorcoch sú R¹ a R² navzájom nezávisle halogén, azid, benzylamino alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² má byť vodík, a R³ je substituovaná alebo nesubstituované alkylová alebo arylová skupina.

* I

Ešte výhodnejšie je, ak vo vyššie uvedených všeobecných vzorcoch R¹ je chlór, R² je vodík a R³ je etyl.

Vo výhodnom uskutočnení vo vyššie uvedených všeobecných vzorcoch sú R¹ a R² navzájom nezávisle alkyl, hydroxyl alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² má byť vodík, a R³ je substituovaná alebo nesubstituované alkylová alebo arylová skupina.

Ešte výhodnejšie je, ak vo vyššie uvedených všeobecných vzorcoch je R¹ hydroxylová skupina, R² je vodík a R³ je etyl.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je znázornené poradie báz a tomu zodpovedajúce aminokyselinové sekvencie.

Na obr. 2 je znázornený spôsob využitý pri konštrukcii rekombinantného plazmidu pNTSIG.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Ďalej bude predložený vynález opísaný podrobnejšie.

Purifikácia CRD enzýmu

Organizmus používaný ako zdroj CRD enzýmu v predloženom vynáleze nie je celkom presne vymedzený, ale môže ním byť napríklad kvasinka rodu Candida. Je obzvlášť výhodné, ak je to kvasinka Candida magnoliae IFO 0705, ktorá je uložená v zbierke mikroorganizmov „Centraalbureau voor Schimmelcultures“ (CBS; Oosterstraat, 1 Postbus 273, NL-3740 AG Baarn, Holandsko) pod číslom CBS166 a ktorej izolácia a charakteristika sú opísané v knihe „The Yeasts, a Taxonomic Study, 3^rd ed. (1984) s. 731). Mikrób schopný produkcie enzýmu podľa predloženého vynálezu môže byť buď divoký alebo mutantný kmeň. Alternatívne možno použiť mikrób získaný genetickými technikami, akými sú fúzia buniek alebo genetické manipulácie. Napríklad mikrób získaný genetickou manipuláciou, ktorý produkuje enzým podľa predloženého vynálezu, možno získať spôsobom zahŕňajúcim tieto kroky: izolácia a/alebo purifikácia tohto enzýmu a určenie časti alebo celej sekvencie aminokyselín; získanie DNA sekvencie alebo úseku DNA kódujúceho enzým na základe skôr uvedenej sekvencie aminokyselín; vnesenie tejto DNA do iného mikroorganizmu s cieľom získať rekombinantný mikroorganizmus; a kultivácia rekombinantného mikroorganizmu s cieľom získať enzým podľa predloženého vynálezu.

Médium na kultiváciu mikroorganizmu na získanie enzýmu podľa predloženého vynálezu (alebo mikroorganizmu použitého na prípravu esteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej podľa predloženého vynálezu) nie je obzvlášť vymedzené, pokiaľ na ňom môže mikroorganizmus rásť. Možno napríklad použiť zvyčajné tekuté výživné médiá, obsahujúce zdroj uhlíka, zdroj dusíka, anorganické soli, organické živiny a podobne.

Pojem „mikrobiálna kultúra“ tu označuje mikrobiálne bunky alebo tekutú kultúru obsahujúcu mikrobiálne bunky a „jej spracovaný produkt znamená produkt získaný extrakciou a purifikáciou, ako je opísané nižšie.

Na extrakciu a purifikáciu enzýmu po výslednej kultivácii možno použiť spôsoby extrakcie a purifikácie enzýmu, ktoré využívajú na tieto účely odborníci v danej oblasti techniky. Napríklad z kultúry sa centrifúgou separujú mikrobiálne bunky, ktoré sa suspendujú do vhodného tlmivého roztoku. Bunky v tejto suspenzii sa rozrušia alebo rozpustia použitím fyzikálnych techník, napríklad pomocou sklenených guľôčok, alebo biochemickými technikami, napríklad pomocou vhodného enzýmu. Pevné častice sa potom z roztoku odstránia centrifúgou a tak sa získa surový enzýmový roztok. Podobne možno surový enzýmový roztok získať z kultúry purifikačnými spôsobmi, ktoré sú podobné vyššie popísanému postupu.

Uvedený surový enzýmový roztok možno ďalej čistiť pomocou spôsobov používaných odborníkmi v danej oblasti techniky, ako je zrážanie síranom amónnym, dialýza a chromatografia, a to samotnými alebo v ich kombinácii. Pokiaľ ide o chromatografiu, rôzne typy chromatografií ako je hydrofóbna chromatografia, iónovýmenná chromatografia (napr. DEAE Sepharose), gélová filtrácia, možno použiť buď samotné alebo v kombinácii na získanie enzýmu podľa predloženého vynálezu.

i · I , ' _f

Napríklad CRD enzým možno izolovať z Candida magnoliae IFO 0705 nasledujúcim spôsobom.

Najskôr sa vyššie uvedená kvasinka kultivuje vo vhodnom médiu a mikrobiálne bunky sa oddelia od výslednej kultúry centrifúgou. Mikrobiálne bunky sa rozrušia napríklad dezintegrátorom Dyno (výrobca Dyno-Mill) a ďalším centrifúgovaním sa odstránia zvyšky buniek a získa sa bezbunkový extrakt. Tento bezbunkový extrakt sa potom ďalej spracúva postupmi ako je vysoľovanie (napr.

zrážanie síranom amónnym a fosforečnanom sodným), zrážanie rozpúšťadlami (frakčné zrážanie bielkovín použitím acetónu, etanolu alebo podobnými látkami), dialýzou, gélovou filtráciou, iónovýmennou chromatografiou a stĺpcovou chromatografiou, čo môže byť chromatografia na reverznej fáze a ultrafiltrácia samotná alebo v kombinácii s ďalšími postupmi, aby sa enzým purifikoval. CRD enzýmovú aktivitu možno určiť meraním zníženia absorpcie pri 340 nm a 30 °C pre 100 mM fosfátový tlmivý roztok (pH 6,5) s 1 mM etylesteru kyseliny 4chlóracetoctovej ako substrátom, 0,1 mM NADPH ako koenzýmom po pridaní sledovaného enzýmu, alebo v 200 mM fosfátovom tlmivom roztoku (pH 7,0) s 0,2 mM etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej ako substrátom a 0,32 mM NADPH ako pridaným koenzýmom. Za týchto reakčných podmienok je oxidácia 1 pmol NADPH na NADP počas 1 minúty definovaná ako 1 jednotka enzýmovej aktivity.

Výraz, že enzým je „stály“ v tu používanom význame znamená, že enzým má pri pH 7,0, teplote 40 °C, po uplynutí 30 minút aktivitu 90 % alebo viac v porovnaní s aktivitou na začiatku testu.

Molekulová hmotnosť enzýmu bola určená gélovou filtráciou použitím kolóny TSK-G3000SW (0 0,75 x 60 cm; výrobca Tosoh Corporation). Ako eluent bol použitý 0,1 M fosfátový tlmivý roztok (pH 7,0) obsahujúci 0,1 M Na2SO₄ a 0,05 % NaN₃. Molekulová hmotnosť podjednotky enzýmu bola určená elektroforézou v 10 % SDS polyakrylamidovom géle za redukujúcich podmienok (redukovadlo: 2 % objemové 2merkaptoetanolu) a výpočtom z relatívnej pohyblivosti štandardných proteínov.

Napríklad CRD enzým, ktorý má poradie aminokyselín SEQ ID č. 1 podľa predloženého vynálezu, má fyzikálne a chemické vlastnosti od 1) do 4):

1) účinok pôsobí na etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej pri použití NADPH ako koenzýmu za vzniku etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej;

2) substrátová špecifickosť:

vykazuje silnú aktivitu na etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej, zatiaľ čo prakticky vôbec nevykazuje aktivitu na etylester kyseliny acetoctovej;

3) optimálne pH: 5,5 až 6,5; a

4) optimálna teplota pre aktivitu: 50 °C až 55 ^eC.

Táto látka, totiž karbonyl reduktáza majúca poradie aminokyselín SEQ ID č. 1 podľa predloženého vynálezu, má ďalšie fyzikálne a chemické vlastnosti od 5) do 7):

5) tepelná stabilita: enzým je stály až do teploty 40 °C, pri pH 7,0 počas 30 min;

6) inhibítor: enzým je inhibovaný iónmi ortuti a kvercetínom; a

7) molekulová hmotnosť: cca 76 000 určené gélovou filtráciou a cca 32 000 stanovené SDS polyakrylamidovou elektroforézou.

Enzým majúci v podstate identické vlastnosti s enzýmom podľa predloženého vynálezu môže byť buď prirodzený alebo rekombinantný enzým. Rekombinantný enzým možno napríklad získať nasledujúcim postupom: jednu alebo niekoľko aminokyselín v aminokyselinovom poradí enzýmu získaného z Candida magnoliae IFO 0705 možno nahradiť, vypustiť, vložiť alebo pridať a tak vytvoriť rekombinantný enzým, ktorého aktivita je merateľná.

Príprava syntetickej oligonukleotidovej sondy

Purifikovaný CRD enzým získaný vyššie uvedeným postupom sa denaturuje (napríklad 8 M močovinou) a potom natrávený endopeptidázou (napríklad lyzyl endopeptidázou). Poradie aminokyselín vo vzniknutých fragmentoch peptidov sa určí Edmanovým spôsobom. DNA sonda sa syntetizuje na základe určeného poradia aminokyselín. Taká sonda môže byť označená napríklad pomocou ³²P.

Príprava génovej knižnice

Chromozomálna DNA mikroorganizmu produkujúceho CRD enzým podľa predloženého vynálezu alebo jeho cDNA sa čiastočne natrávi vhodným reštrikčným enzýmom, napríklad Sau3AI. Fragment DNA majúci vhodnú veľkosť (napríklad 23 kb až 20 kb) po pôsobení reštrikčného enzýmu sa vloží do kompatibilného reštrikčného enzýmového miesta na fágovom vektore. Výsledný rekombinantný fágový vektor je uložený in vitro a potom je možné ním infikovať E. coli a vytvoriť tak génovú knižnicu.

Klonovanie génu CRD enzýmu z génovej knižnice

Takto vzniknutú génovú knižnicu možno skrínovať na gén pre CRD enzým pomocou metódy plakovej hybridizácie použitím sondy syntetickej DNA označenej pomocou ³²P (Science, 196,180 (1997)). Analýzu poradia báz výslednej DNA možno uskutočniť metódou dideoxy sekvenovania, metódou terminácie dideoxy reťazca alebo podobne. Určenie sekvencie možno uskutočniť pomocou súpravy ABI PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (výrobca Perkin Elmer) a ABI 373A DNA Sequencer (výrobca Applied Biosystems).

Výsledný fragment DNA možno amplifikovať metódou PCR alebo podobne a klonovať.

Konštrukcia rekombinantného plazmidu obsahujúceho gén CRD enzýmu

Gén CRD enzýmu sa zavedie do hostiteľského mikroorganizmu a exprimuje sa v ňom pomocou DNA vektora. Ako taký DNA vektor možno použiť akýkoľvek DNA vektor, ktorý môže zabezpečiť expresiu génu CRD enzýmu vo vhodnom hostiteľskom mikroorganizme. Príkladmi týchto DNA vektorov sú plazmidové vektory, fágové vektory a kozmidy. Možno použiť prenášačový vektor, ktorý umožňuje výmenu génu medzi rôznymi hostiteľskými kmeňmi. Taký DNA vektor obsahuje riadiace úseky ako je promótor (napríklad lacUV5 promótor, trp promótor, trc promótor, tac promótor, Ipp promótor, tufB promótor, recA promótor a promótor pL) a prvok enhancera operatívne k nim pripojený. Možno napríklad použiť predovšetkým pUCNT (WO94/03613) a podobne. Plazmid pUCNT je výhodný preto, že jeho inzerčné miesta Ndel a EcoR 1 ležia za lac promótorom (downstream).

Konštrukcia rekombinantného plazmidu nesúceho gén CRD ako aj gén enzýmu majúceho schopnosť regenerácie koenzýmu, od ktorého CRD enzým závisí

Ako enzýmy so schopnosťou regenerácie koenzýmu možno použiť enzýmy hydrogenáza, formiátdehydrogenáza, alkoholdehydrogenáza, aldehyddehydrogenáza, glukózo-6-fosfát-dehydrogenáza, glukózodehydrogenáza atď. S výhodou sa používa glukózodehydrogenáza. Presnejšie, ide o glukózodehydrogenázu z kmeňa Bacillus megateríum (ďalej skracovanú ako GDH).

Plazmid pGDA2 (J. Biol. Chem. (1988), 264, 6381) obsahuje GDH gén získaný z Bacillus megateríum. Fragment nesúci GDH gén sa dá vyňať z tohto plazmidu a vložiť do plazmidu obsahujúceho gén enzýmu CRD a to buď pred neho alebo za neho (upstream alebo downstream) a tak vytvoriť rekombinantný plazmid nesúci gén CRD enzýmu aj gén pre GDH.

Transformácia

Výsledný rekombinantný plazmid nesúci gén CRD enzýmu alebo rekombinantný plazmid majúci gén CRD enzýmu aj gén GDH možno konvenčnými spôsobmi vniesť do hostiteľskej bunky. Alternatívne možno rekombinantný plazmid nesúci gén CRD enzýmu a rekombinantný plazmid nesúci gén GDH súčasne alebo postupne zaviesť do hostiteľskej bunky tak, aby sa získal kmeň transformovaný týmito dvoma plazmidmi.

Ako hostiteľskú bunku možno použiť baktériu, kvasinku, vláknitú hubu, rastlinnú bunku, živočíšnu bunku a pod. Obzvlášť výhodné je, ak sa použije E. coli.

Plazmid je možné preniesť do hostiteľskej bunky niektorým spôsobom známym v danej oblasti techniky, akým je spôsob zahŕňajúci zmiešanie hostiteľskej bunky v kompetentnom stave s rekombinantným plazmidom a ďalej spôsob zahŕňajúci transfekciu plazmidu použitím plazmidu typu „helpeŕ* pomocou konjugačnej transmisie.

Plazmid vnesený do hostiteľskej bunky sa tu môže autonómne replikovať ako epizóm. Alternatívne možno celý plazmid alebo jeho časť zabudovať do chromozómu a replikovať spolu s chromozómom.

Aktivitu GDH transformovaných buniek možno určiť meraním zvýšenia absorpcie pri 340 nm pri 25 °C v 1 M tris-HCI tlmivom roztoku (pH 8,0) v reakcii, kde substrátom je 0,1 M glukóza, 2 mM NADP je koenzým, po pridaní enzýmu.

Získanie opticky aktívneho alkoholu

Opticky aktívny ester kyseliny 4-halogén-3-hydroxybutánovej, ktorý je reprezentantom opticky aktívnych alkoholov, možno získať nasledujúcim spôsobom napríklad takto.

Ako substrát sa použije ester kyseliny 4-halogénacetoctovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

kde R¹ je halogén, R² je vodík a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl. V prípade, ak je R³ alkyl, ide napríklad o skupiny ako metyl, etyl, propyl, butyl, izopropyl a podobne. Keď je R³ aryl, môže to byť napríklad fenyl, tolyl a podobne. Keď je R³ substituovaný aryl, môže to byť napríklad fluórfenyl, chlórfenyl a podobne.

Je výhodné, ak je R¹ chróm alebo bróm, a R³ je Ci-C4-alkyl. Ešte výhodnejšie je, ak je substrátom metylester kyseliny 4-chlóracetoctovej, etylester kyseliny 4chlóracetoctovej, metylester kyseliny 4-brómacetoctovej alebo etylester kyseliny 4brómacetoctovej. Substrátmi môžu byť aj etylester kyseliny 4-jódacetoctovej, etylester kyseliny 4-hydroxyacetoctovej, etylester kyseliny 2-chlór-3-oxobutánovej, etylester kyseliny 2-metyl-3-oxobutánovej, etylester kyseliny 4-azidoacetoctovej a podobné zlúčeniny.

Vyššie uvedený ester kyseliny 4-halogénacetoctovej možno pripraviť spôsobom uverejneným napríklad v japonskej patentovej publikácii vyloženej na verejné nahliadnutie číslo 61-146191. Tieto estery kyseliny 4-halogénacetoctovej možno napríklad pripraviť spôsobom používajúcim ako východiskovú látku diketén, ktorý reaguje s halogénom za vzniku halogenidu kyseliny halogénacetoctovej, ktorý potom reaguje s alkoholom. Alternatívne možno ester kyseliny 4-halogénacetoctovej pripraviť spôsobom, pri ktorom sa ako východisková látka použije ester kyseliny acetoctovej a jeho štvrtá poloha sa priamo halogenuje.

Ester kyseliny 4-halogénacetaoctovej ako substrát sa pridá do vhodného rozpúšťadla spolu s NADPH ako koenzýmom a kultúrou transformovaného mikroorganizmu alebo z nej získaným produktom a zmes sa mieša, pričom sa vhodne upravuje pH. Táto reakcia prebieha pri pH od 4 do 10 pri teplote od 10 do 70 °C. Aj keď používané koncentrácie substrátu sú v rozsahu od 0,1 do 90% (hmotnosť/objem), substrát možno pridávať aj kontinuálne. Reakcia môže prebiehať dávkovým aj kontinuálnym spôsobom.

Produktom získaným z mikroorganizmu alebo iných buniek, ako je uvedené vyššie, môže byť surový extrakt, nakultivované mikrobiálne bunky, lyofilizované organizmy, acetónom vysušené organizmy, homogenát mikróbov a podobne. Tento vytvorený produkt možno použiť v stave imobilizovanom ako enzým alebo ako bunky mikroorganizmov známymi prostriedkami. Na imobilizáciu možno použiť spôsoby známe odborníkom v tejto oblasti techniky (napríklad metóda zosietenia, fyzikálne absorpčné spôsoby alebo zachycovacie spôsoby).

V reakcii potom možno množstvo drahého koenzýmu značne znížiť využitím všeobecného regeneračného systému NADPH. Možno napríklad použiť spôsob využívajúci GDH a glukózu, čo je typický regeneračný systém NADPH. Reakčné podmienky, aj keď závisia od typu enzýmu, mikroorganizmu alebo jeho produktu, sú nasledujúce: koncentrácia substrátu je v rozsahu od 0,1 do 90% hmotnostných, reakčná teplota je od 10 do 50 °C, pH je od 5 do 8 a reakčný čas je 1 až 36 hodín.

Vyššie uvedenú reakciu možno uskutočniť pomocou kultúry transformovaného mikroorganizmu alebo vytvoreného produktu získaného vnesením génu pre CRD enzým aj génu enzýmu (napr. GDH) majúceho schopnosť regenerovať koenzým, od ktorého CRD enzým závisí, do hostiteľského organizmu. V tomto prípade potom už ďalšia príprava zdroja enzýmu požadovaného pre regeneráciu koenzýmu nie je nutná a ester kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej možno pripraviť s nižšími nákladmi.

Tento ester kyseliny 4-halogén-3-hydroxybutánovej vzniknutý v reakcii možno purifikovať štandardnými spôsobmi. Napríklad ester kyseliny 4-halogén-3hydroxybutánovej sa podrobí centrifugácii, filtrácii a ďalším postupom, ktoré sú zvyčajné pre odstránenie mikróbov z reakčnej zmesi. Výsledný produkt sa potom extrahuje organickým rozpúšťadlom ako napríklad etylacetátom a toluénom a vysuší látkami ako síran sodný. Organické rozpúšťadlo sa odstráni za zníženého tlaku. Výsledný produkt sa potom podrobí vákuovému sušeniu, chromatografii (napríklad stĺpcovej chromatografii na silikagéle) a podobným purifikačným postupom.

Kvantitatívne stanovenie esteru kyseliny 4-halogén-3-hydroxybutánovej možno uskutočňovať plynovou chromatografiou. Napríklad kvantitatívne stanovenie etylesteru kyseliny 4-chlór-3-hydroxybutánovej možno uskutočniť na chromatografe so sklenenou kolónou (vnútorný priemer 3 mm x 1 m) naplnenou stacionárnou fázou PEG-20M Chromosorb WAWDMCS 10% 80/100 mesh (výrobca GL Science Co. Ltd.) pri 150 °C s detekciou plameňovým ionizačným detektorom.

Optickú čistotu etylesteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej možno určiť pomocou HPLC s optickou izolačnou kolónou CHILCEL OB (výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.).

Teda ako je opísané vyššie, predložený vynález umožňuje masovú produkciu CRD enzýmu. Ďalej použitím tohto enzýmu je k dispozícii účinný spôsob získania opticky aktívneho alkoholu, napríklad esteru kyseliny (S)-4-halogén-3hydroxybutánovej.

Ďalej bude predložený vynález opísaný podrobne na príkladoch uskutočnenia, ktoré sú len ilustračné a nie je nimi obmedzený rozsah ochrany.

Podrobnosti metódy, ktorá sa použila na génové manipulácie súvisiace s technikou na získanie rekombinantnej DNA použitou v príkladoch, sú opísané v nasledujúcich publikáciách.

(I) Molecular Cloning 2^nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) (II) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience)

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Purifikácia CRD enzýmu

CRD enzým získaný z Candida magnoliae IFO 0705, ktorý má schopnosť asymetricky redukovať ester kyseliny 4-halogénacetoctovej za vzniku esteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej, bol purifikovaný nasledujúcim spôsobom tak, že sa pohyboval ako jediný pás v elektroforéze.

Bolo pripravených 8 000 ml tekutého média nasledujúceho zloženia, toto médium bolo rozdelené po 400 ml dávkach do Sakaguchiho baniek s objemom 2 000 ml a sterilizované parou pri 120 °C počas 20 minút.

Zloženie média:

glukóza 5,00 % polypeptón 0,50 %

KH₂PO₄

K2HPO4

0,20 % 0,10 %

MgSO₄.7 H₂O 0,01 % voda z vodovodu pH 6,5

Vyššie uvedené médium bolo zaočkované kultúrou Candida magnoliae IFO 0705, ktorá bola predkultivovaná v tomto médiu, po 5 ml/banku počas 3 dní na trepačke pri 30 °C. Bunky mikroorganizmu sa oddelili od výslednej kultúry centrifúgou a dvakrát sa premyli roztokom soli, takže sa získalo 230 g vlhkej hmoty biomasy. Z tejto vlhkej biomasy bolo 180 g rozmiešaných v 360 ml 50 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 7,0) a bunky sa potom rozrušili dezintegrátorom Dyno (výrobca Dyno-Mill). Suspenzia dezintegrovaných mikroorganizmov bola centrifugovaná, aby sa odstránili zvyšky bunkových štruktúr, a získalo sa 760 ml bezbunkového extraktu. Do neho bol pridaný síran amónny až do 40 % nasýtenia. Výsledný precipitát bol odstránený centrifúgou a supernatant bol dialyzovaný proti 10 mM fosfátovému tlmivému roztoku (pH 7,0) obsahujúcemu 0,1 mM DTT. Výsledný produkt bol nanesený na kolónu (500 ml) DEAE Sephacelu (výrobca Pharmacia

Biotech), ktorá obsahovala rovnaký tlmivý roztok a ktorá bola týmto tlmivým roztokom aj premytá. Frakcie s enzýmovou aktivitou sa oddelili a do nariedeného roztoku, ktorý prešiel kolónou, sa pridal NaCI až do konečnej koncentrácie 4 M. Aktívne frakcie sa naniesli na kolónu (200 ml) plnenú Phenyl Sepharose CL-4B (výrobca Pharmacia Biotech), ekvilibrovanú 10 mM fosfátovým tlmivým roztokom obsahujúcim 4 M NaCI a 0,1 mM DTT, na ktorú sa enzým absorboval. Potom bola kolóna premytá rovnakým tlmivým roztokom, aktívne frakcie boli eluované 10 mM fosfátovým tlmivým roztokom (pH 7,0) s lineárnym gradientom NaCI (od 4 M do 0 M) a etylénglykolu (od 0 % do 50 % hmotnosť/objem). Eluované aktívne frakcie boli spojené a dialyzované cez noc v 10 mM fosfátovom tlmivom roztoku (pH 7,0).

Výsledný dialyzát bol nanesený na kolónu (1 ml) Mono Q HR 5/5 (FPLC systém vyrobený Pharmacia Biotech), ktorá bola ekvilibrovaná 10 mM fosfátovým tlmivým roztokom (pH 7,0) obsahujúcim 0,1 mM DTT a premytá tým istým tlmivým roztokom. Aktívne frakcie vpremývacom roztoku sa spojili a nakoncentrovali ultrafiltráciou na 200 μΙ. Tento koncentrát sa potom naniesol na kolónu (24 ml) obsahujúcu Superdex 200 HR 10/30 (výrobca Pharmacia Biotech), ktorá bola ekvilibrovaná 10 mM fosfátovým tlmivým roztokom (pH 7,0) obsahujúcim 0,2 NaCI a 0,1 mM DTT a boli eluované tým istým tlmivým roztokom. Aktívne frakcie sa spojili, čím sa získal purifikovaný enzým.

Príklad 2

Meranie vlastností enzýmu

Skúmali sa enzýmové charakteristiky enzýmu získaného postupom uvedeným v príklade 1.

Enzýmová aktivita bola určená v 3 ml reakčného roztoku, ktorý obsahoval 0,2 mM etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej ako substrát, 0,32 mM NADPH ako koenzým a 0,1 ml roztoku enzýmu v 200 mM fosfátovom tlmivom roztoku (pH 7,0) pri 1 minútovej reakcii pri 30 °C a meraní zníženia hodnôt absorpcie pri 340 nm.

1) Účinok: Enzým pôsobí na etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej za prítomnosti NADPH ako koenzýmu za vzniku etylesteru kyseliny (S)-4-halogén-3hydroxybutánovej, ktorý má optickú čistotu minimálne 99 %.

2) Substrátová špecifickosť: Enzým podľa predloženého vynálezu reaguje s rôznymi karbonylovými zlúčeninami, ako ukazuje nižšie uvedená tabuľka 1. Podmienky reakcie týchto substrátov boli rovnaké ako pri etylestere kyseliny 4chlóracetoctovej. Výsledná substrátová špecifickosť, ktorú enzým vykazoval, je uvedená v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Substrát 0,2 mM	Relatívna aktivita (%)
etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej	100
etylester kyseliny acetoctovej	0
p-nitrobenzaldehyd	0
o-nitrobenzaldehyd	0
m-nitrobenzaldehyd	0
p-chlórbenzaldehyd	0
o-chlórbenzaldehyd	0
m-chlórbenzaldehyd	0
nikotínaldehyd	0
izonikotínaldehyd	0
benzaldehyd	0
glyoxál	0
metylglyoxál	0
diacetyl	19
chlóracetaldehyd	0
gáforchinón	0
etylester kyseliny 2-chlóracetoctovej	95
metylester kyseliny 4-chlóracetoctovej	11
metylester kyseliny 2-chlóracetoctovej	11
oktylester kyseliny 4-chlóracetoctovej	36

3) Optimálne pH: Enzýmová aktivita bola meraná v rozsahu pH od 5,0 do 8,5 vo fosfátovom tlmivom roztoku alebo tlmivom roztoku na báze tris-HCI. Výsledkom bolo zistenie, že optimálne pH pre účinok enzýmu na etylester kyseliny (S)-4-chlór-3hydroxybutánovej leží medzi hodnotami 5,5 až 6,5.

4) Optimálna teplota: Aktivita enzýmu podľa predloženého vynálezu bola meraná s použitím etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej ako substrátu počas 1 minúty v teplotnom rozsahu od 20 °C do 60 °C. Výsledkom bolo zistenie, že optimálna teplota je v rozsahu od 50 °C do 55 °C.

5) Tepelná stabilita: Enzým podľa predloženého vynálezu bol inkubovaný pri pH 7,0 pri 40 °C počas 30 minút, výsledná aktivita bola meraná s etylesterom kyseliny 4-chlóracetoctovej ako substrátom. Za týchto podmienok bola zachovaná 90 % aktivita, ktorú mal enzým pred experimentom.

6) Inhibítor: Do vyššie uvedeného reakčného roztoku sa pridali rôzne ióny kovov a inhibítory v príslušných koncentráciách uvedených v tabuľke 2. Pri týchto koncentráciách sa merala aktivita, pričom produktom bol etylester kyseliny (S)-4chlór-3-hydroxybutánovej vytvorený z etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej ako substrátu. Výsledkom bolo zistenie, že enzým podľa predloženého vynálezu bol inhibovaný kvercetínom a iónmi ortuti, ako vyplýva z tabuľky 2.

Tabuľka 2

Zlúčenina	koncentrácia inhibítorov (mM)	relatívna aktivita (%)
bez prídavku kvercetín	0,01	100 84
difenyl hydantoín	0,1 1	0 84
dikumarol	0,1	97
2,4-dinitrofenol	0.1	86
DTNB	0,05	100
kyselina jódoctová	1	100
NEM	1	105
PMSF	1	93
p-CMB	1	88
EDTA	1	95
fenylhydrazín	1	97
SnCI2	1	77
PbCI2	1	86
CdCI2	1	91
CuSO4	1	85
CoCI2	1	89
MgCI2	1	83
ZnSO4	1	97
HgCI2	0,1	49

7) Molekulová hmotnosť: Molekulová hmotnosť enzýmu bola meraná použitím TSK-G 3 000 SW kolóny v 0,1 M fosfátovom tlmivom roztoku (pH 7,0) obsahujúcom 0,1 M Na₂SO₄ a 0,05 % NaN3 ako eluent, a bola stanovená na cca 76 000.

Molekulová hmotnosť podjednotky enzýmu bola určená z výsledkov elektroforézy s 10% SDS-polyakrylamidovým gélom v prítomnosti 2% objemových 2merkaptoetanolu a bola vypočítaná z relatívnej pohyblivosti štandardných proteínov. Ako výsledok bola stanovená molekulová hmotnosť podjednotky enzýmu cca 32 000.

8) Odolnosť voči organickým rozpúšťadlám: Do fosfátového tlmivého roztoku (pH 7,0) bolo pridané ekvivalentné množstvo etylacetátu alebo butylacetátu, kde bol prítomný enzým podľa predloženého vynálezu a zmes sa trepala pri 28 °C počas 30 minút a potom centrifugovala. Zvyšková aktivita enzýmu vo vodnej fáze bola meraná použitím etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej ako substrátu. Výsledkom je zachovanie 72 % aktivity po pridaní etylacetátu a zachovanie 85 % aktivity po pridaní butylacetátu.

Príklad 3

Produkcia etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej použitím enzýmu podľa predloženého vynálezu

Zmes 25 ml 100 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,5), 50 jednotiek enzýmu podľa predloženého vynálezu, 250 mg etylesteru kyseliny 4chlóracetoctovej, 1,56 mg NADP, 280 mg glukózy a 60 jednotiek glukózodehydrogenázy (výrobca Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) sa miešala 24 hodín pri 30 °C. Po skončení reakcie sa reakčný roztok extrahoval etylacetátom a extrakt sa po odstránení rozpúšťadla analyzoval. Získal sa etylester kyseliny (S)-4chlór-3-hydroxybutánovej s optickou čistotou minimálne 99 % enantiomérneho nadbytku vo výťažku 98 %.

Optická čistota etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánôvej bola overená na HPLC s optickou izolačnou kolónou CHIRACEL OB (výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.). Táto chromatografia sa uskutočnila s použitím zmesi hexán/izopropanol v pomere 9 :1 ako mobilnej fázy pri prietoku 0,8 ml/min. Detekcia sa uskutočňovala meraním absorpcie pri 215 nm.

Kvantitatívne stanovenie etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej sa uskutočnilo plynovou chromatografiou pri 150’C s použitím sklenenej kolóny (vnútorný priemer 3 mm x 1 m) plnenej PEG-20M Chromosorbom WAW DMCS

10% 80/100 mesh (výrobca GL Science Co., Ltd.) s plameňovo ionizačným detektorom.

Príklad 4

Produkcia etylesteru kyseliny (S)-4-bróm-3-hydroxybutánovej použitím enzýmu podľa predloženého vynálezu

Zmes 2,5 ml 100 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,5), 5 jednotiek purifikovaného enzýmu podľa predloženého vynálezu, 25 mg etylesteru kyseliny 4brómacetoctovej, 0,16 mg NADP, 28 mg glukózy a 6 jednotiek glukózodehydrogenázy (výrobca Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) sa miešala 24 hodín pri 30 °C. Po skončení reakcie sa reakčný roztok extrahoval etylacetátom a extrakt sa po odstránení rozpúšťadla analyzoval. Zistilo sa, že etylester kyseliny (S)-4-bróm-3hydroxybutánovej bol produkovaný rovnakým spôsobom ako etylester kyseliny (S)-4chlór-3-hydroxybutánovej v príklade 2.

Príklad 5

Produkcia metylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej použitím enzýmu podľa predloženého vynálezu

Do 2,5 ml butylacetátu sa pridalo 2,5 ml 100 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,5) obsahujúceho 5 jednotiek enzýmu podľa predloženého vynálezu, 25 mg metylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej, 0,16 mg NADP, 28 mg glukózy a 6 jednotiek glukózodehydrogenázy (výrobca Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) a zmes sa miešala 24 hodín pri 30 °C. Po skončení reakcie sa reakčný roztok extrahoval etylacetátom a extrakt sa po odstránení rozpúšťadla analyzoval. Zistilo sa, že¹

I metylester kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej bol produkovaný rovnakým spôsobom ako etylester kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej v príklade 2.

Príklad 6

Produkcia etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej použitím enzýmu podľa predloženého vynálezu; kontinuálne pridávanie substrátu

3,8 g etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej sa kontinuálne pridávalo do 50 ml 100 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,5) obsahujúceho 100 jednotiek purifikovaného enzýmu podľa predloženého vynálezu, 1,56 mg NADP, 4,5 g glukózy, 250 jednotiek glukózodehydrogenázy (výrobca Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) a 0,24 g NaCI rýchlosťou 0,23 g za hodinu a zmes sa miešala 20 hodín pri 30 °C, pričom sa upravovalo pH pomocou hydroxidu sodného. Po skončení reakcie sa reakčný roztok extrahoval etylacetátom a extrakt sa po odstránení rozpúšťadla analyzoval. Získal sa etylester kyseliny (S)-4-chIór-3-hydroxybutánovej s optickou čistotou 100 % enantiomérneho nadbytku vo výťažku 91 %. Kvantitatívna analýza a meranie optickej čistoty etylesteru kyseliny 4-chlór-3-hydroxybutánovej sa uskutočnila rovnakým spôsobom ako v príklade 2.

Príklad 7

Klonovanie génu pre CRD enzým

Vytvorenie knižnice chromozomálnej DNA

Chromozomálna DNA bola extrahovaná z nakultivovaných buniek Candida magnoliae IFO 0705 podľa spôsobu popísaného Herefordom (Celí, 18,1261 (1979)). Získaná chromozomálna DNA bola čiastočne naštiepená pomocou Sau3A1 a fragmenty DNA s veľkosťou 23 až 20 kb produktu sa vložili do miesta BamH1 fágového vektora EMBL3 (dodávateľ Stratagene).· Výsledný rekombinantný fágový vektor bol vložený in vitro pomocou Gigapack II Goid (dodávateľ Strategene) a potom sa ním infikovala E. coli NM415, a tak vznikla knižnica chromozomálnej DNA zložená z cca 20 000 úsekov DNA.

Príprava syntetickej oligonukleotidovej sondy

Purifikovaný CRD enzým získaný podľa postupu opísaného v príklade 1 bol denaturovaný v prítomnosti 8 M močoviny a potom natrávený lyzylendopeptidázou z Achromobacter (výrobca Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Poradie aminokyselín vzniknutých peptidov bolo stanovené Edmanovou metódou.

Na základe výsledného poradia aminokyselín boli syntetizované DNA sondy s nasledujúcim zložením.

Sonda 1: 5'-GCNCAYACNAARAAYGA-3' (SEQ ID č. 3)

Sonda 2: 5'-AAYGTNGARTAYCCNGC-3' (SEQ ID č. 4)

Sonda 3: 5'-CTRGTYCTRCTRCTRTT-3' (SEQ ID č. 5)

Sondy 1, 2 a 3 boli označené izotopom ³²P použitím súpravy Megalabel (výrobca Takara Shuzo Co., Ltd.) a označené sondy boli použité v nasledujúcich experimentoch.

Klonovanie génu enzýmu CRD z knižnice chromozomálnej DNA

Knižnica chromozomálnej DNA vytvorená vyššie opísaným spôsobom sa skrínovala na plaky fágov obsahujúce gén pre CRD enzým metódou plakovej hybridizácie (Science, 196,180 (1977)) použitím syntetických DNA sond označených pomocou ³²P. Ako výsledok sa získal jeden pozitívny plak. Potom sa rekombinantná fágová DNA získaná z pozitívneho plaku natrávila dvoma enzýmami EcoR1 a Hindlll a výsledná DNA sa potom analyzovala pomocou metódy Southern blotting (J. Mol. Biol., 98, 53 (1975)). Zistilo sa, že štiepny fragment s veľkosťou asi 1,3 kb vytvorený účinkom EcoR1 a Hindlll sa hybridizoval vyššie uvedenými syntetickými DNA sondami. Na základe tejto skutočnosti sa fragment DNA s veľkosťou asi 1,3 kb vložil do miesta EcoR1 a Hindlll plazmidu pUC19 (dodávateľ Takara Shuzo Co., Ltd.) a tak bol vytvorený rekombinantný plazmid pUC-HE a bolo určené, že obsahuje časť chromozomálnej DNA nesúcej gén pre CRD enzým. Tento plazmid bol pomenovaný ako pUC-HE.

Určenie poradia báz

Použil sa celý rad rekombinantných enzýmov, ktoré pôsobili na vyššie uvedený rekombinantný plazmid pUC-HE, a získané fragmenty sa analyzovali, aby sa vytvorila mapa štiepenia reštrikčného enzýmu. Potom sa rôzne fragmenty DNA získané počas analýzy inzertovali do multi-klonových miest plazmidu pUC19 s cieľom získať rekombinantné plazmidy. Použitím týchto rekombinantných plazmidov sa analyzovalo poradie báz daného vloženého fragmentu použitím systému ABI PRISM Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (výrobca Perkin Elmer) a ABI 373A DNA Sequencer (výrobca Applied Biosystems). Ako výsledok týchto postupov bola získaná celá sekvencia báz fragmentu DNA s veľkosťou cca 1,3 kb, kde sa očakávalo, že je prítomný gén pre CRD enzým. Obrázok 1 ukazuje takto získané poradie báz. Poradie aminokyselín určené z poradia báz častí štrukturálneho génu je tiež zobrazené pod zodpovedajúcimi sekvenciami báz na obrázku 1. Poradie aminokyselín bolo porovnané s čiastočným poradím získaným z fragmentov peptidov purifikovaného enzýmu CRD po účinku lyzylendopeptidázy. Zistilo sa, že čiastočná aminokyselinová sekvencia z purifikovaného CRD enzýmu existovala aj v poradí aminokyselín určenom na základe sekvencie báz a je s ňou úplne zhodná (tieto časti sú podčiarknuté úseky poradia aminokyselín na obr. 1) s výnimkou neprítomnosti metionínu na N-konci. Predpokladá sa, že metionín na N-konci sa odstraňuje modifikáciami po ukončení proteosyntézy.

Príklad 8

Konštrukcia rekombinantného plazmidu obsahujúceho gén enzýmu CRD

Aby mohol byť CRD enzým tvorený v E. coli, pripravil sa rekombinantný plazmid na použitie pri transformácii. Najskôr sa nasledujúcim spôsobom získala dvojvláknová DNA s Nde1 miestom pridaným do iniciačného kodónu štruktúrneho génu pre CRD enzým a tiež EcoRI miestom pridaným bezprostredne po jeho terminačnom kodóne. Syntetizovali sa N-koncový DNA primér s Nde1 miestom pridaným do časti iniciačného kodónu štruktúrneho génu CRD enzýmu a C-koncový DNA primér s EcoRI miestom pridaným bezprostredne za terminačný kodón štruktúrneho génu CRD enzýmu. Poradie báz týchto dvoch primérov je nasledujúce. N-koncový DNA primér

5'-TAGTCGTTAACCATATGGCTAAGAAGAACTTCTCCAAC-3' (SEQ ID č. 6)

C-koncový DNA primér

5'-TCTGAGTTAACGAATTCTTAGGGAAGCGTGTAGCCACCGT-3' (SEQ ID č. 7)

Použitím týchto dvoch vyššie uvedených syntetických DNA primérov sa syntetizovala dvojvláknová DNA použitím plazmidu pUC-HE získaného v príklade 7 ako templátu. Výsledný fragment DNA bol natrávený Nde1 a EcoR1 a vložený do Nde1 a EcoR1 miest za lac promótor (downstream) plazmidu pUCNT (WO94/03613), a tak bol vytvorený rekombinantný plazmid pNTS1.

Príklad 9

Príprava rekombinantného plazmidu obsahujúceho gén CRD enzýmu aj gén pre GDH

Plazmid pGDA2 (J. Biol. Chem. (1989), 264, 6381) sa vystavil pôsobeniu dvoch enzýmov, EcoR1 a Pst1, s cieľom izolovať fragment DNA s veľkosťou cca 0,9 kb, nesúci gén GDH pochádzajúci z Bacillus megaterium. Tento fragment DNA sa vložil do EcoR1-Pst1 miesta plazmidu pSL301 (výrobca Invitrogen) s cieľom konštrukcie rekombinantného plazmidu pSLG. Rekombinantný plazmid pSLG bol potom podrobený digescii dvoch enzýmov, EcoR1 a Xho1, aby sa izoloval fragment DNA s veľkosťou cca 0,9 kb nesúci gén GDH pochádzajúci z Bacillus megaterium. Tento DNA fragment bol vložený do miesta EcoR1-Sal1 (umiestneného za miestom (downstream) CRD génu) plazmidu pNTS1 skonštruovaného v príklade 8, čím sa získal rekombinantý plazmid pNTSIG. Spôsob konštrukcie a štruktúra pNTSIG sú ukázané na obr. 2.

Príklad 10

Konštrukcia rekombinantných E. coli

E. coli HB101 (výrobca Takara Shuzo Co., Ltd.) sa transformovali pombcou rekombinantného plazmidu pNTS1 získaného v príklade 8 a ďalej použitím rekombinantného plazmidu pNTSIG získaného v príklade 9, čím sa získali rekombinantné E. coli HB101(pNTS1) a HB101 (pNTSIG). Takto získané transformanty E. coli HB101(pNTS1) a HB101)pNTS1G) boli uložené na Ministerstve zahraničného obchodu a priemyslu, Agentúre priemyselnej vedy a technológie a Národnom ústave pre biologické vedy a humánne technológie pod zbierkovými číslami FERM BP-5834 a FERM BP-5835 dňa 24. februára 1997.

Ďalej, ako je uvedené v príklade 9, bol plazmid pGDA1 (J. Biol. Chem. (1989), 264, 6381) podrobený digescii dvoch enzýmov EcoR1 a Pst1, aby bolo možné izolovať fragment DNA s veľkosťou cca 0,9 kb nesúci gén pre GDH z Bacillus megaterium. Tento fragment DNA bol vložený do EcoR1-Pst1 miesta plazmidu pSTV28 (výrobca Takara Shuzo Co., Ltd.) a tak sa vytvoril rekombinantný plazmid pSTVG. Kmeň E. coli HB101(pNTSS1), v ktorom bola navodená kompetencia spôsobom s CaCb, sa transformoval pomocou pSTVG, a tak sa získal kmeň E. coli HB101(pNTS1, pSTVG).

Príklad 11

Expresia enzýmu CRD v rekombinantnomných E. coli

Určenie aktivity enzýmu CRD v rekombinantných E. coli

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1) získaný podľa príkladu 10 bol kultivovaný v 2 x YT médiu obsahujúcom 50 pg/ml ampicilínu, zahustený a resuspendovaný v 100 mM fosfátovom tlmivom roztoku (pH 6,5) a rozrušený pôsobením ultrazvuku tak, aby sa získal bezbunkový lyzát. Aktivita CRD enzýmu

I v bezbunkovom extrakte sa zmerala nasledujúcim spôsobom. 1 mM etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej, 0,1 mM NADPH ako koenzýmu a skúmaný enzým sa pridali do 100 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,5) a meralo sa zníženie absorpcie pri 340 nm pri teplote 30 °C. Za týchto reakčných podmienok bola oxidácia 1 pmol NADPH na NADP počas 1 minúty definovaná ako jedna jednotka enzýmovej aktivity. Takto nameraná aktivita CRD enzýmu v bezbunkovom lyzáte sa vyjadrila ako špecifická aktivita a porovnala sa s aktivitou transformantov len pomocou vektorového plazmidu. Na porovnanie sa získala aj aktivita CRD enzýmu . v bezbunkovom extrakte z Candida magnoliae IFO 0705 pripravenom v zásade rovnako ako v príklade 1. Výsledky sú zhrnuté v nižšie uvedenej tabuľke 3. Kmeň E. coli HB101(pNTS1) vykazoval určité zvýšenie aktivity CRD enzýmu v porovnaní s kmeňom E. coli BH101(pUCNT), ktorý bol transformovaný len vektorovým plazmidom, a vykazoval 8,5 x vyššiu aktivitu v porovnaní s Candida magnoliae IFO 0705.

Tabuľka 3

Označenie kmeňa	Špecifická aktivita CRD (U/mg)
HB101(pUCNT)	<0,01
HB101(pNTS1)	16,0
Candida magnoliae IFO 0705	1,89

Porovnanie sekvencií na N-konci

Poradie aminokyselín na N-konci všetkých CRD enzýmov purifikovaných z bezbunkových extraktov získaných vyššie uvedenými postupmi a z bezbunkového lyzátu Candida magnoliae IFO 0705 bolo určené pre vyše 30 zvyškov Edmanovou metódou. Výsledné poradie aminokyselín na N-konci bolo porovnané a bolo zistené, že je vo všetkých prípadoch rovnaké.

Príklad 12

Súčasná expresia enzýmov CRD a GDH v rekombinantných E. coli

Aktivita GDH v bezbunkovom lyzáte získanom z rekombinantných E. coli HB101(pNTS1G) a E. coli HB101(pNTS1, pSTVG) získaných, ako je uvedené v príklade 10, spôsobom opísaným v príklade 11, sa zmerala nasledujúcim spôsobom. 0,1 M glukózy ako substrát, 2 mM NADP ako koenzým a enzým sa pridali do 1 M tris-HCI tlmivého roztoku (pH 8,0) na reakciu a meralo sa zvýšenie absorpcie pri 340 nm pri 25 °C. Za týchto reakčných podmienok sa definovala redukcia 1 μιτιοΙ NADP na NADHP za 1 minútu ako jedna jednotka enzýmovej aktivity. Merala sa aj aktivita CRD enzýmu, a to spôsobom uvedeným v príklade 10. Takto nameraná aktivita CRD enzýmu a aktivita GDH enzýmu v bezbunkovom lýzáte boli vyjadrené ako špecifické aktivity a porovnané s aktivitami E. coli BH101(pNTS1), HB101(pNTS1, pSTVG) a transformantu HB101(pUCNT), ktorý obsahoval samotný vektor. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 4. E. coli HB101(pNTS1) a HB101(pNTS1, pSTVG) vykazovali jasné zvýšenie aktivity CRD enzýmu a aktivity GDH v porovnaní s E. coli HB101(pUCNT), ktorý bol transformovaný len vektorovým plazmidom.

Tabuľka 4

Názov kmeňa	Špecifická aktivita CRD (U/mg)	Špecifická aktivita GDH (U/mg)
HB101(pUCNT)	<0,01	<0,01
HB101(pNTS1)	16,0	<0,01
HB101(pNTS1G)	8,03	62,6
HB101(pNTS1, pSTVG)	13,5	1.6

Príklad 13

Syntéza esteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej z esteru kyseliny 4halogénacetoctovej použitím rekombinantého E. coli s vloženým génom CRD enzýmu

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1) získaný postupom uvedeným v príklade 10 bol naočkovaný do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho bankách s obsahom 500 ml a kultivovaný na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Enzým GDH (výrobca Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) v množstve 1 250 jednotiek, ďalej 5,5 g glukózy a 1,6 mg NADP bolo pridaných do 50 ml výslednej kultúry. Táto kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M roztoku hydroxidu sodného. Počas miešania sa pridával etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej v 250 mg dávkach každých 15 minút. Týmto spôsobom bolo celkom pridaných 5 g etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej a reakcia prebiehala 5 hodín. Potom sa reakčná zmes podrobila extrakcii etylacetátom a extrakt sa po odstránení rozpúšťadla analyzoval. Zistilo sa, že vzniknutý etylester kyseliny (S)-4-chlór-3hydroxybutánovej mal optickú čistotu 100 % enantiomérneho nadbytku a získal sa vo výťažku 90%. .

Kvantitatívne stanovenie etylesteru kyseliny 4-chlór-3-hydroxybutánovej sa uskutočnilo plynovou chromatografiou použitím sklenenej kolóny (vnútorný priemer 3 mm x 1 m) plnenej PEG-20 M Chromosorbom WAW DMCS 10% 80/100 mesh (výrobca GL Science Co., Ltd.) pri 150 °C s plameňovo ionizačným detektorom.

Optická čistota etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej sa merala pomocou HPLC s optickou izolačnou kolónou CHIRACEL OB (výrobca Daicel

Chemical Industries, Co., Ltd.). Pri chromatografii sa použila zmes hexán/izopropanol v pomere 9 : 1 ako mobilná fáza pri prietokovej rýchlosti 0,8 ml/min. Detekcia sa uskutočnila meraním absorpcie pri 215 nm.

Príklad 14

Syntéza esteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej z esteru kyseliny 4halogénacetoctovej pomocou rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný podľa príkladu 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 5,5 g glukózy a 3,2 mg NADP. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M roztoku NaOH. Počas miešania sa pridával etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej v 250 mg dávkach každých 15 minút. Takto sa pridalo celkovo 5 g etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej a reakcia prebiehala 5 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom a extrakt sa po odstránení rozpúšťadla podrobil analýze. Zistilo sa, že etylester kyseliny (S)-4-chlór3-hydroxybutánovej s optickou čistotou 100 % enantiomérneho nadbytku sa získal vo výťažku 92 %.

Kvantitatívne stanovenie a meranie optickej čistoty etylesteru kyseliny 4-chlór3-hydroxybutánovej sa uskutočnilo v zásade rovnakým spôsobom ako v príklade 13.

Príklad 15

Syntéza etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej z etylesteru kyseliny 4chlóracetoctovej použitím rekombinantných E. coli exprimujúcich súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 40 ml výslednej kultúry sa pridalo 19,2 g glukózy, 2,5 mg NADP. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH. Počas miešania sa pridával etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej v celkovom množstve 16,1 g kontinuálnym spôsobom rýchlosťou asi 2 g/hod. Reakcia prebiehala 24 hodín. Po skončení reakcie sa výsledná kvapalina extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo pod vákuom a koncentrát sa purifikoval chromatografiou na kolóne so silikagélom, čím sa získalo 15,6 g etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej. Optická čistota tohto etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej sa analyzovala pomocou HPLC a bola 100 % enantiomérneho nadbytku. ¹H NMR (CDCI₃) δ (ppm): 1,33 (3H, t), 2,65 (2H, d), 3,31 (1 H, d), 3,60 (2H, d), 4,2 (3H, m); kolóna: Chiracel OB (0,46 x 25 cm) výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; teplota kolóny: 0 °C; eluent: nhexán/2-propanol v pomere 9:1; prietoková rýchlosť: 0,8 ml/min.; detekcia: 215 nm; čas eluovania: 19,2 min pre (S), 17,0 min pre (R).

Príklad 16

Syntéza etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej z etylesteru kyseliny 4chlóracetoctovej použitím rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 40 ml výslednej kultúry sa pridalo 9,6 g glukózy. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na

6,5 pomocou 5 M NaOH. Počas miešania sa pridával etylester kyseliny 4chlóracetoctovej v celkovom množstve 8,1 g kontinuálnym spôsobom rýchlosťou asi 2 g/hod. Reakcia prebiehala 24 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo a koncentrát sa analyzoval. Získal sa etylester kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej s optickou čistotou 100 % enantiomérneho nadbytku vo výťažku 96 %.

Príklad 17

Syntéza etylesteru kyseliny (S)-4-bróm-3-hydroxybutánovej z etylesteru kyseliny 4brómacetoctovej použitím rekombinantného E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 1,3 g glukózy, 3,2 mg NADP a potom 1 g etylesteru kyseliny 4brómacetoctovej. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH, pričom reakcia sa nechala prebiehať 18 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a koncentrát sa vyčistil chromatografiou na silikagéle, čím sa získalo 900 mg etylesteru kyseliny (S)-4-bróm-3-hydroxybutánovej. Optická čistota tohto etylesteru kyseliny (S)-4-bróm-3-hydroxybutánovej sa analyzovala nižšie popísaným spôsobom a zistilo sa, že bola 100% enantiomérneho nadbytku. Vzorka sa previedla na karbamát pomocou fenylizokyanátu za prítomnosti pyridínu a optická čistota karbamátu sa merala pomocou HPLC. ¹H NMR (CDCI₃) δ (ppm): 1,38 (3H, t), 2,75 (2H, m), 3,28 (1H, br), 3,51 (2H, m), 4,18 (3H, q), 4,25 (1H, m); kolóna: Chiracel OJ (0,46 x 25 cm) výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; teplota kolóny: 25 °C; eluent: n-hexán/2-propanol v pomere 9:1; prietoková rýchlosť: 0,8 ml/min.: detekcia: 254 nm; čas eluovania: 24,2 min pre (S), 27,8 min pre (R).

Príklad 18

Syntéza etylesteru kyseliny (S)-4-jód-3-hydroxybutánovej z etylesteru kyseliny 4jódacetoctovej použitím rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 ’C počas 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 0,5 g glukózy, 3,2 mg NADP a potom 0,5 g etylesteru kyseliny 4jódacetoctovej. Kultúra sa miešala pri 30 ’C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH, pričom sa reakcia nechala prebiehať 72 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a koncentrát sa vyčistil chromatografiou na kolóne so silikagélom, čím sa získalo 900 mg etylesteru kyseliny (S)-4-jód-3-hydroxybutánovej. Optická čistota tohto etylesteru kyseliny (S)-4-jód-3-hydroxybutánovej sa analyzovala nižšie uvedeným spôsobom a zistilo sa, že je 91,6% enantiomérneho nadbytku. Takže vzorka sa zahrievala spolu s kyanidom sodným v dimetylsulfoxide, aby sa získal etylester kyseliny 4-kyano-3-hydroxybutánovej, ktorý sa potom previedol na ester kyseliny benzoovej použitím benzoyl chloridu za prítomnosti pyridínu. Optická čistota esteru kyseliny benzoovej sa potom merala pomocou HPLC. ¹H NMR (CDCI₃) δ (ppm): 1,28 (3H, t), 2,65 (2H, d), 3,31 (3H, m), 4,00 (1H, m), 4,20 (2H, q); kolóna: Chiralpak AS (0,46 x 25 cm), výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; teplota kolóny: 25 °C; eluent: n-hexán/etanol v pomere 95 : 5; prietoková rýchlosť: 1 ml/min.; detekcia: 254 nm; čas eluovania: 19,6 min pre (S), 21,3 min pre (R).

Príklad 19

Syntéza metylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej z metylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej použitím rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 7,2 g glukózy, 3,2 mg NADP a potom 4 g metylesteru kyseliny 4chlóracetoctovej. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH, pričom reakcia sa nechala prebiehať 24 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a koncentrát sa vyčistil chromatografiou na kolóne so silikagélom, čím sa získalo 3,85 g metylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej. Optická čistota tohto metylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej sa analyzovala nižšie

I uvedeným spôsobom a zistilo sa, že je 100 % enantiomérneho nadbytku. Vzorka sa previedla na karbamát pomocou fenylizokyanátu za prítomnosti pyridínu a optická čistota produktu sa zmerala pomocou HPLC. ¹H NMR (CDCI3) δ (ppm): 2,65 (2H, m), 3,20 (1H, br), 3,63 (2H, m), 3,73 (3H, s), 4,28 (1H, m); kolóna: Chiracel OJ (0,46 x 25 cm), výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; teplota kolóny: 25 °C; eluent: nhexán/2-propanol v pomere 8 : 2; prietoková rýchlosť: 1 ml/min.; detekcia: 254 nm; čas eluovania: 19,2 min pre (S), 22,6 min pre (R).

Príklad 20

Syntéza etylesteru kyseliny (S)-4-azido-3-hydroxybutánovej z etylesteru kyseliny 4azidoacetoctovej použitím rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 3,2 g glukózy, 3,2 mg NADP a potom 2 g etylesteru kyseliny 4azidoacetoctovej. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH, pričom reakcia sa nechala prebiehať 72 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a koncentrát sa vyčistil stĺpcovou chromatografiou na silikagéle, čím sa získalo

1,6 g etylesteru kyseliny (S)-4-azido-3-hydroxybutánovej. Optická čistota tohto etylesteru kyseliny (S)-4-azido-3-hydroxybutánovej sa analyzovala pomocou HPLC a zistilo sa, že je 90 % enantiomérneho nadbytku. ¹H NMR (CDCI₃) δ (ppm): 1,25 (3H, t), 2,55 (2H, d), 3,30-3,35 (3H, m), 4,20 (3H, m); kolóna: Chiracel OB (0,46 x 25 cm), výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; teplota kolóny: 25 °C; eluent: nhexán/2-propanol v pomere 9:1; prietoková rýchlosť: 1 ml/min.; detekcia: 254 nm; čas eluovania: 16,2 min pre (S), 19,6 min pre (R).

Príklad 21

Syntéza etylesteru kyseliny (S)-3,4-dihydroxybutánovej z etylesteru kyseliny 4hydroxyacetoctovej použitím rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH , I

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 7,4 g glukózy, 3,2 mg NADP a potom 4 g etylesteru kyseliny 4hydroxyacetoctovej. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH. Reakcia prebiehala 18 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a koncentrát sa vyčistil stĺpcovou chromatografiou na silikagéle, čím sa získalo 3,2 g etylesteru kyseliny (S)-3,4-hydroxybutánovej. Optická čistota tohto etylesteru kyseliny (S)-3,4-hydroxybutánovej sa analyzovala nižšie uvedeným spôsobom a zistilo sa, že je 100% enantiomérneho nadbytku. Analýza prebiehala nasledujúcim spôsobom: vzniknutý produkt reagoval s kyanidom sodným v prostredí etanolu a laboratórnej teplote za vzniku etylesteru kyseliny 4-kyano-3-hydroxybutánovej, ktorý bol ďalej prevedený benzoyl chloridom za prítomnosti pyridínu na príslušný ester kyseliny benzoovej. Optická čistota tohto esteru kyseliny benzoovej sa merala pomocou HPLC. ¹H NMR (CDCI₃) δ (ppm): 1,30 (3H, t), 2,55 (2H, m), 3,18 (1H, br), 3,55 (1H, d), 3,68 (1H, d), 4,15 (1H, s), 4,20 (2H, q); kolóna: Chiralpak AS (0,46 x 25 cm), výrobca Daicel Chemical Industries, Co., Ltd.; teplota kolóny: 25 °C; eluent: nhexán/etanol v pomere 95 : 5; prietoková rýchlosť: 1ml/min.; detekcia: 254 nm; čas eluovania: 19,6 min pre (S), 21,3 min pre (R).

Príklad 22

Syntéza etylesteru kyseliny 3-hydroxy-2-metylbutánovej redukciou etylesteru kyseliny

2- metyl-3-oxobutánovej¹ použitím rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 3,2 g glukózy, 3,2 mg NADP a potom 4 g etylesteru kyseliny 2metyl-3-oxobutánovej. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH. Reakcia prebiehala 18 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a koncentrát sa vyčistil na silikagélovej kolóne, čím sa získalo 3,5 g etylesteru kyseliny

3- hydroxy-2-metylbutánovej. Optická čistota tohto etylesteru kyseliny 3-hydroxy-2metylbutánovej sa analyzovala nasledujúcim spôsobom a zistilo sa, že je 91,6% ¹V origináli je ester kyseliny 2-metyl-3-oxooctovej (2-methyl-3-oxoacetate), ktorý však nemôže existovať, pretože acetát má iba dva uhlíky, preto nemôže mať na treťom oxoskupinu. Z kontextu a produktu reakcie vyplýva, že pôjde o ester kyseliny 2-metyl-3-oxobutánovej. Toto sa vzťahuje na všetky výskyty “3-oxoacetátov v tomto a v nasledujúcom príklade (pozn. prekl.).

enantiomérneho nadbytku. Analýza prebiehala nasledujúcim spôsobom: vzorka reagovala s kyanidom sodným v dimetylsulfoxide pri laboratórnej teplote a vzniknutý etylester kyseliny 4-kyano-3-hydroxybutánovej bol ďalej podrobený reakcii s benzoyl chloridom za prítomnosti pyridínu za vzniku príslušného esteru kyseliny benzoovej. Optická čistota tohto esteru kyseliny benzoovej bola meraná pomocou HPLC. ¹H NMR (CDCI₃) δ (ppm): 1,17 (3H, t), 1,22 (2H, t), 1,28 (3H, t), 2,46 (1 H, m), 2,82 (1H, br), 3,90 (1H, m), 4,18 (2H, q).

Príklad 23

Syntéza etylesteru kyseliny 2-chlór-3-hydroxybutánovej redukciou etylesteru kyseliny 2-chlór-3-oxobutánovej použitím rekombinantného kmeňa E. coli exprimujúceho súčasne enzým CRD a GDH

Rekombinantný kmeň E. coli HB101(pNTS1G) získaný v príklade 10 sa naočkoval do 100 ml 2 x YT média sterilizovaného v Sakaguchiho banke s obsahom 500 ml a kultivoval sa na trepačke pri 37 °C počas 13 hodín. Do 50 ml výslednej kultúry sa pridalo 6,5 g glukózy, 3,2 mg NADP a potom 4 g etylesteru kyseliny 2chlór-3-oxobutánovej. Kultúra sa miešala pri 30 °C a pH sa upravovalo na 6,5 pomocou 5 M NaOH. Reakcia prebiehala 18 hodín. Po skončení reakcie sa reakčná zmes extrahovala etylacetátom, rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a koncentrát sa vyčistil na silikagélovej kolóne, čím sa získalo 3,8 g etylesteru kyseliny 2-chlór-3-hydroxybutánovej. ¹H NMR (CDCI3) δ (ppm): 1,35 (6H, m), 2,55 (1H, br), 4,15 (1H, d), 4,25 (1H, m),4,30(2H, q).

Priemyselná využiteľnosť

J '

Použitím nového CRĎ enzýmu jé možné efektívne vyrábať opticky aktívne alkoholy ako napríklad ester kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej použiteľný ako syntetický medziprodukt na výrobu liekov.

Klonovaním génu pre CRD enzým a určením jeho poradia báz sa získal transformant s vysokou účinnosťou produkcie CRD enzýmu. Získal sa aj transformant s vysokou schopnosťou produkovať súčasne CRD enzým aj GDH.

Použitím vyššie uvedených transformantov je možné efektívnejšie uskutočňovať syntézu opticky aktívnych alkoholov, ako je napríklad ester kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej, z karbonylových zlúčenín, ako je napríklad ester kyseliny 4-halogénacetoctovej.

Zoznam sekvencií

Informácia pre SEQ ID č. 1

Dĺžka sekvencie: 283

Typ sekvencie: aminokyseliny

Typ molekuly: peptid

Topológia: lineárna

Opis sekvencie

Met

Ala

Lys

Asn

Phe

Ser

Asn

Val

Glu

Tyr

Pro Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

i

5

10

15

His

Thr

Lys

Asn

Glu

Ser

Leu

Gin

Val

Leu

Asp Leu

Phe

Lys

Leu

Asn

20

25

30

Gly

Lys

Val

Ala

Ser

íle

Thr

Gly

Ser

Ser

Ser Gly

íle

Gly

Tyr

Ala

35

40

45

Leu

Ala

Glu

Ala

Phe

Ala

Gin

Yal

Gly

Ala

Asp Yal

Ala

íle

Trp

Tyr

50

55

60

Asn

Ser

His

Asp

Ala

Thr

Gly

Lys

Ala

Glu

Ala Leu

Ala

Lys

Lys

Tyr

65

70

75

80

Gly

Val

Lys

Val

Lys

Ala

Tyr

Lys

Ala

Asn

Val Ser

Ser

Ser

Asp

Ala

85

90

95

Val

Lys

Gin

Thr

íle

Glu

Gin

Gin

Íle

Lys

Asp Phe

Gly

His

Leu

Asp

100

105

110

íle

Val

Yal

Ala

Asn

Ala

Gly

íle

Pro

Trp

Thr Lys

Gly

Ala

Tyr

íle

115

120

125

Asp

Gin

Asp

Asp

Asp

Lys

His

Phe

Asp

Gin

Yal Yal

Asp

Val

Asp

Leu

130

135

140

Lys

Gly

Yal

Cly

Tyr

Val

Ala

Lys

His

Ala

Gly Arg

His

Phe

Arg

Glu

145

150

155

160

Arg

Phe

Glu

Lys

Glu

Gly

Lys

Lys

Gly

Ala

Leu Val

Phe

Thr

Ala

Ser

165

170

175

Met

Ser

Gly

His

íle

Val

Asn

Val

Pro

Gin

Phe Gin

Ala

Thr

Tyr

Asn

180

185

190

Ala

Ala

Lys

Ala

Gly

Val

Arg

His

Phe

Ala

Lys Ser

Leu

Ala

Yal

Glu

195 200 205

Phe

Ala

Pro

Phe

Ala

Arg

Val Asn

Ser

Val

Ser

Pro

Gly

Tyr

íle

Asn

210

215

220

Thr

Clu

íle

Ser

Asp

Phe

Val Pro

Gin

Glu

Thr

Gin

Asn

Lys

Trp

Trp

225

230

235

240

Ser

Leu

Val

Pro

Leu

Gly

Arg Gly

Gly

Glu

Thr

Ala

Glu

Leu

Val

Gly

245

250

255

Ala

Tyr

Leu

Phe

Leu

Ala

Ser Asp

Ala

Gly

Ser

Tyr

Ala

Thr

Gly

Thr

260

265

270

Asp

íle

íle

Val

Asp

Gly

Gly Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

Informácia pre SEQ ID č. 2

Dĺžka sekvencie: 852

Typ sekvencie: nukleová kyselina

Počet vláken: dve

Topológia: lineárna

Typ sekvencie: genómová DNA

Opis sekvencie

ATCGCTAAGA ACTTCTCCAA CGTCGAGTAC CCCGCCCCGC CTCCGGCCCA CACCAAGAAC 60 GAGTCGCTGC AGGTCCTTGA CCTGTTCAAG CTGAATGGCA AGGTTGCCAG CATCACTGGC 120 TCGľCCAGCG GTATTGGCTA CGCTCTGGCT GAGGCCTTCG CGCAGGTCGG CGCTGACGTC 180 GCCATCTGGT ACAACAGCCA CGACGCTACT GGCAAGGCTG AGGCCCTCGC CAAGAAGTAC 240 GGCGTCAAGG TCAAGGCCTA CAAGGCGAAC GTGAGCAGCT CTGACGCCGT GAAGCAGACG 300 ATCGAGCAGC AGATCAAGGA CTTCCGCCAC CTCGACATTG TCGTGGCGAA CGCCGGCATT 360 CCCTGGACGA AGGGTGCCTA CATCGACCÄG GACGACGACA AGCACTTCGA CCAGGTCGTT 420 GACGTCGATC TGAAGGGTGT TGGATACGTC GCGAAGCACG CTGGCCGTCA CTTCCGCGAG 480 CGCTTCGAGA AGGAGGGCAA GAAGGGCGCC CTTGTGTTCA CGCCCTCCAT GTCTGGCCAC 540 ATTGTGAACG TGCCCCAGTT CCAGGCCACG TACAACGCGG CCAAGGCTGG CGTGCGCCAC 600 TTCGCGAAGT CGCTGGCCGT CGAGTTCGCG CCGTTCGCGC CCGTGAACTC TGTGTCGCCG 660 GCCTACATCA ACACGGAGAT CTCGGACTTC GTGCCCCAGG AGACGCAGAA CAAGTGGTGG 720 TCGCTCGTGC CCCTTGGCCG CGGCGGAGAG ACGGCCGAGC TCGTTGGCGC CTACCTGTTC 780 CTTGCATCTG ACGCCGGCTC GTACGCCACT GGTACGGACA TCATTGTTGA CCGTGGCTAC 840

ACGCTTCCCTAA 852

Informácia pre SEQ ID č. 3

Dĺžka sekvencie: 17

Typ sekvencie: nukleotidy

Počet vláken: jedno

Topológia: lineárna

Typ sekvencie: syntetická DNA

Opis sekvencie

GCNCAYACNA ARAAYGA

Informácia pre SEQ ID č. 4

Dĺžka sekvencie: 17

Typ sekvencie: nukleová kyselina

Počet vláken: jedno

Topológia: lineárna

Typ sekvencie: syntetická DNA

Opis sekvencie:

AAYGTNGART AYCCNGC

Informácia pre SEQ ID č. 5

Dĺžka sekvencie: 17

Typ sekvencie: nukleová kyselina

Počet vláken: jedno

Topológia: lineárna

Typ sekvencie: syntetická DNA

Opis sekvencie:

CTRGTYCTRC TRCTRTT

Informácia pre SEQ ID č. 6

Dĺžka sekvencie: 35

Typ sekvencie: nukleová kyselina

Počet vláken: jedno

Topológia: lineárna

Typ sekvencie: syntetická DNA

Opis sekvencie:

TAGTCGTTAA CCATATGGCT AAGAACTTCT CCAAC

Informácia pre SEQ ID č. 7

Dĺžka sekvencie: 40

Typ sekvencie: nukleová kyselina

Počet vláken: jedno

Topológia: lineárna

Typ sekvencie: syntetická DNA

Opis sekvencie

Claims (46)

PATENTOVÉ NÁROKY

1) účinok:

pôsobí na etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej pri využití NADPH ako koenzýmu za vzniku etylesteru kyseliny (S)-4-chlór-3-hydroxybutánovej;

1. Karbonylová reduktáza vyznačujúca sa tým, že má nasledujúce fyzikálne a chemické vlastnosti od 1) do 4):

2. Karbonylová reduktáza podľa nároku 1 vyznačujúca sa tým, že má ďalšie fyzikálne a chemické vlastnosti od 5) do 7):

2) substrátová špecifickosť:

vykazuje silnú aktivitu na etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej, zatiaľ čo na etylester kyseliny acetoctovej nevykazuje prakticky vôbec žiadnu aktivitu;

3. Karbonylová reduktáza vyznačujúca sa tým, že má sekvenciu zodpovedajúcu poradiu SEQ ID č. 1 v zozname sekvencií, alebo aminokyselinové poradie s jednou alebo viacerými vynechanými, substituovanými alebo pridanými aminokyselinami v porovnaní so SEQ ID č. 1 zoznamu sekvencií, alebo čiastočnú aminokyselinovú sekvenciu a majúca aktivitu redukcie etylesteru kyseliny 4-chlóracetoctovej asymetricky za vzniku etylesteru kyseliny (S)-4chlór-3-hydroxybutánovej.

3) optimálne pH: 5,5 až 6,5;

4. Karbonylová reduktáza podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 vyznačujúca sa tým, že enzým bol získaný z mikróba patriaceho do rodu Candida.

4) optimálna teplota reakcie: 50 ^eC až 55 °C;

5. Karbonylová reduktáza podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 vyznačujúca sa tým, že enzým bol získaný z Candida magnoliae.

5) tepelná stabilita: je stabilná až do asi 40 °C, ak je uchovávaná pri pH 7,0 počas 30 min;

6. Karbonylová reduktáza podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 vyznačujúca sa tým, že enzým bol získaný z Candida magnoliae IFO 0705.

6) inhibítor: je inhibovaná iónmi ortuti a kvercetínom; a

7. DNA kódujúca enzým podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6.

7) molekulová hmotnosť: určené gélovou filtráciou cca 76 000 a cca 32 000 pomocou SDS polyakrylamidovej elektroforézy.

8. DNA podľa nároku 7 vyznačujúca sa tým, že DNA má sekvenciu uvedenú ako SEQ ID č. 2 v zozname sekvencií.

9. Plazmid nesúci DNA podľa nároku 7 alebo 8.

10. Plazmid podľa nároku 9 vyznačujúci sa tým, že plazmid je pNTS1.

11. Transformant, ktorý je bunkou transformovanou plazmidom podľa nároku 9 alebo 10.

12. Transformovaná bunka podľa nároku 11 vyznačujúca sa tým, že transformovaná bunka je E. coli.

13. Transformovaná bunka podľa nároku 11 vyznačujúca sa tým, že transformovaná bunka je E. coli HB101(pNTS1).

14. Spôsob prípravy esteru kyseliny (S)-4-halogén-3-hydroxybutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

OH

COOR3

R2 kde R¹ označuje atóm halogénu, R² označuje vodík a R³ označuje substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl, pričom tento spôsob pozostáva z nasledujúcich krokov: reakcia esteru kyseliny 4-halogénacetoctovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

Ο

COOR3 a enzýmu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 alebo kultúry mikroorganizmu majúcej schopnosť produkcie tohto enzýmu alebo spracovaného produktu tejto kultúry.

15. Spôsob podľa nároku 14 vyznačujúci sa tým, že atóm halogénu je chlór alebo bróm a R³ je Ci-C₄-alkyl.

16. Spôsob podľa nároku 15 vyznačujúci sa tým, že substrátom je metylester kyseliny 4-chlóracetoctovej, etylester kyseliny 4-chlóracetoctovej, metylester kyseliny 4-brómacetoctovej alebo etylester kyseliny 4-brómacetoctovej.

17. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 16 vyznačujúci sa tým, že mikróbom je mikroorganizmus patriaci do rodu Candida.

18. Spôsob podľa nároku 17 vyznačujúci sa tým, že mikróbom je mikroorganizmus patriaci do rodu Candida magnoliae.

19. Spôsob podľa nároku 18 vyznačujúci sa tým, že mikróbom je mikroorganizmus patriaci do rodu Candida magnoliae IFO 0705.

20. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 16 vyznačujúci sa tým, že mikroorganizmus je transformovanou bunkou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13.

21. Spôsob prípravy opticky aktívneho esteru kyseliny 3-hydroxybutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

OH

COOR3 pričom tento spôsob pozostáva z nasledujúcich krokov: reakcia transformantu, ktorým je bunka transformovaná plazmidom nesúcim DNA kódujúcu enzým, ktorý má schopnosť asymetricky redukovať ester kyseliny 3-oxobutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

COOR3

R2 za vzniku opticky aktívneho esteru kyseliny 3-hydroxybutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

OH

R¹

COOR3

R2 s esterom kyseliny 3-oxobutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

O

Rk Jl O00R3

R2 a oddelenie vzniknutého opticky aktívneho esteru kyseliny 3-hydroxybutánovej všeobecného vzorca:

OH

COOR3

R2

22. Spôsob podľa nároku 21 vyznačujúci sa tým, že vo všeobecných vzorcoch R¹ a R je navzájom nezávisle halogén, azido, benzylamino alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² by mal byť vodík, a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl, alebo vo všeobecných vzorcoch R¹ a R² je navzájom nezávisle alkyl, hydroxyl alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² by mal byť vodík, a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl.

23. Spôsob podľa nároku 22 vyznačujúci sa tým, že vo všeobecnom vzorci R¹ je hydroxylová skupina, R² je vodík a R³ je etyl.

24. Spôsob podľa nároku 22 vyznačujúci sa tým, že vo všeobecnom vzorci R¹ je chlór, R² je vodík a R³ je etyl.

25. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 24 vyznačujúci sa tým, že transformovanou bunkou je transformovaná bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 13.

26. Plazmid nesúci DNA podľa nároku 7 alebo 8 a DNA kódujúcu glukózodehydrogenázu.

27. Plazmid podľa nároku 26 vyznačujúci sa tým, že glukózodehydrogenáza bola odvodená z Bacillus megaterium.

28. Plazmid podľa nároku 27 vyznačujúci sa tým, že plazmid je pNTS1 G.

29. Transformant, ktorým je bunka transformovaná plazmidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 28.

30. Transformovaná bunka podľa nároku 29 vyznačujúca sa tým, že transformovanou bunkou je E. coli.

31. Transformovaná bunka podľa nároku 30 vyznačujúca sa tým, že transformovanou bunkou je E. coli HB101 (pNTSIG).

32. Spôsob prípravy opticky aktívneho alkoholu pozostávajúci z nasledujúcich krokov: reakcia transformantu, ktorým je bunka transformovaná plazmidom majúcim DNA kódujúcu enzým s aktivitou asymetrickej redukcie karbonylovej zlúčeniny za vzniku aktívneho alkoholu a ďalej DNA kódujúcu enzým so schopnosťou regenerovať koenzým, od ktorého aktivita prvého enzýmu závisí, s karbonylovou zlúčeninou; a oddelenie vytvoreného opticky aktívneho alkoholu.

33. Spôsob podľa nároku 32 vyznačujúci sa tým, že enzýmom, ktorý má schopnosť regenerácie koenzýmu, je glukózodehydrogenáza.

34. Spôsob podľa nároku 32 vyznačujúci sa tým, že transformovanou bunkou je transformovaná bunka podľa ktoréhokoľvek z nárokov 29 až 31.

35. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 32 až 34 vyznačujúci sa tým, že karbonylovou zlúčeninou je ester kyseliny 3-oxobutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

Rt

COOR³

R2 a výsledný opticky aktívny alkohol je opticky aktívny ester kyseliny 3hydroxybutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

OH

Rt

COOR3

R2

36. Spôsob podľa nároku 35 vyznačujúci sa tým, že vo všeobecných vzorcoch R¹ a R² je navzájom nezávisle halogén, azido, benzylamino alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² by mal byť vodík, a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl, alebo vo všeobecných vzorcoch R¹ a R² je navzájom nezávisle alkyl, hydroxyl alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² by mal byť vodík, a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl.

37. Spôsob podľa nároku 36 vyznačujúci sa tým, že R¹ je chlór, R² je vodík a R³ je etyl.

38. Transformant, ktorým je bunka transformovaná prvým plazmidom, ktorý má DNA podľa nároku 7 alebo 8, a druhým plazmidom, ktorý má DNA kódujúcu glukózodehydrogenázu.

39. Transformovaná bunka podľa nároku 38 vyznačujúca sa tým, že prvým plazmidom je pNTS1 a glukózodehydrogenáza je odvodená zBacillus megaterium.

40. Transformovaná bunka podľa nároku 38 alebo 39 vyznačujúca sa tým, že transformovanou bunkou je E. coli.

41. Spôsob prípravy opticky aktívneho alkoholu pozostávajúci z nasledujúcich krokov: reakcia transformantu, ktorým je bunka transformovaná prvým plazmidom, ktorý má DNA kódujúcu enzým s aktivitou asymetrickej redukcie karbonylovej zlúčeniny za vzniku opticky aktívneho alkoholu, a druhým plazmidom, ktorý má DNA kódujúcu enzým so schopnosťou regenerovať koenzým, od ktorého aktivita prvého enzýmu závisí, s karbonylovou zlúčeninou; a oddelenie vzniknutého opticky aktívneho alkoholu.

42. Spôsob podľa nároku 41 vyznačujúci sa tým, že enzýmom so schopnosťou regenerácie koenzýmu je glukózodehydrogenáza.

43. Spôsob podľa nároku 41 vyznačujúci sa tým, že transformovanou bunkou je bunka transformovaná podľa ktoréhokoľvek z nárokov 38 až 40.

44. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 41 až 43 vyznačujúci sa tým, že karbonylovou zlúčeninou je ester kyseliny 3-oxobutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

COOR3

R2 a výsledným opticky aktívnym alkoholom je opticky aktívny ester kyseliny 3hydroxybutánovej nasledujúceho všeobecného vzorca:

OH

COOR3

45. Spôsob podľa nároku 44 vyznačujúci sa tým, že vo všeobecných vzorcoch R¹ a R² je navzájom nezávisle halogén, azido, benzylamino alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² by mal byť vodík, a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl, alebo vo všeobecných vzorcoch R¹ a R² je navzájom nezávisle alkyl, hydroxyl alebo vodík, pričom jeden z R¹ a R² by mal byť vodík, a R³ je substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl alebo aryl.

46. Spôsob podľa nároku 45 vyznačujúci sa tým, že vo všeobecnom vzorci R¹ je chlór, R² je vodík a R³ je etyl.