JP5726165B2 - アオウキクサ由来の新規リポキシゲナーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、アオウキクサ由来の新規の高活性型９位生成物特異性リポキシゲナーゼ遺伝子、当該リポキシゲナーゼ遺伝子を用いた高活性型９位生成物特異性リポキシゲナーゼの製造方法、並びに当該リポキシゲナーゼ遺伝子の発現産物に関する。
リポキシゲナーゼは、リノール酸、リノレン酸(炭素数１８)やアラキドン酸(炭素数２０)などの１,４-ペンタジエン構造を持つ不飽和脂肪酸に分子状酸素を直接導入し、ヒドロペルオキシル基(-ＯＯＨ)を生成する活性を有する酵素であり、植物をはじめ、動物や、カビ、酵母などの真核微生物等に存在することが知られている(内山充ら、過酸化脂質と生体、23-26, 1985, 学会出版センター)。動物においては、アラキドン酸からプロスタグランジンが生成する過程でこの酵素が関与していることから、最も研究が進んでいる(山本尚三、蛋白質核酸酵素、44, 1132-1138,1999)。植物のリポキシゲナーゼについては、α-リノレン酸、リノール酸等の炭素数１８の不飽和脂肪酸を基質として、９位と１３位の２つの部位に特異性を示す酵素に分類されることが知られている(例えば、内山充ら、過酸化脂質と生体、23-26, 1985, 学会出版センター、Grechkin ら、Eur.J.Biochem., 199, 451-457, 1991）。９位及び１３位特異的リポキシゲナーゼは、ポテト、ダイズ、トマト、エンドウ豆、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、キュウリ等に存在することが知られており、幾つかのｃＤＮＡも単離されている。しかしながら、主に研究がなされているのは、植物ホルモンとして注目されているジャスモン酸の代謝経路に関係する１３位生成物特異性リポキシゲナーゼであり、９位生成物特異性リポキシゲナーゼについての研究は比較的少ない。試薬としても、ダイズ由来の１３位生成物特異性リポキシゲナーゼがシグマ社から市販されている(シグマ社、製品番号L7395)が、９位生成物特異性リポキシゲナーゼは市販されていない。
本発明者らは、本出願前に、花芽形成促進作用、植物賦活作用、及びそれらを包含する植物成長調整作用を有する以下の構造：
を有するα-ケトール不飽和脂肪酸(以下、ＫＯＤＡと呼ぶ)を見出しており、ＫＯＤＡは、９位生成物特異性リポキシゲナーゼ及びアレンオキシドシンターゼによってα-リノレン酸から誘導されることが知られていた(特開平９-２９５９０８号公報、特開平１１-２９４１０号公報、特開２００１-１３１００６号公報及び特開２００９-１７８２９号公報）。
ＫＯＤＡはさまざまな植物種において存在することが知られていたが、ストレスを受けたアオウキクサ(Lemna paucicostata)が他の植物より極めて高いレベル(数百倍)のＫＯＤＡを放出することが知られていた(特開平１１-２９４１０号公報）。したがって、アオウキクサにおいては、他の植物より高い活性を持つ９位生成物特異性リポキシゲナーゼが存在することが推測されていた。しかしながら、アオウキクサからは９位生成物特異性リポキシゲナーゼのｃＤＮＡは単離されておらず、配列も未知であった。
ＫＯＤＡを、α-リノレン酸やリノール酸等を出発材料として酵素合成によって製造する際には、９位生成物特異性リポキシゲナーゼが必須である。しかしながら、９位生成物特異性リポキシゲナーゼは商業的に入手できず、現在知られている９位生成物特異性リポキシゲナーゼのｃＤＮＡを大腸菌で発現した場合、多くが不溶性となり、活性を示すタンパク質を多量に得ることが困難であった。さらに、植物から９位生成物特異性リポキシゲナーゼを抽出するにも材料の入手や処理に大変手間がかかること、またこれまでに知られている９位生成物特異性リポキシゲナーゼでは活性が低いことから、高活性型の９位生成物特異性リポキシゲナーゼ大量調製の技術の確立が望まれていた。
内山充ら、過酸化脂質と生体、23-26, 1985, 学会出版センター
山本尚三、蛋白質核酸酵素、44, 1132-1138,1999
Grechkin ら、Eur.J.Biochem., 199, 451-457, 1991
本発明が解決すべき課題は、発現に有用な高活性型の９位生成物特異性リポキシゲナーゼの遺伝子を同定し、ｃＤＮＡを単離すること、並びに当該リポキシゲナーゼ遺伝子の発現産物を提供すること、ひいては当該リポキシゲナーゼを用いて高い収量でＫＯＤＡを製造する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題の解決を目的として鋭意検討を行い、アオウキクサから新規リポキシゲナーゼｃＤＮＡを単離するにあたり、より活性の高いリポキシゲナーゼｃＤＮＡを得るため、アオウキクサ株をＫＯＤＡ生産能についてスクリーニングを行った。具体的には、６２種類のアオウキクサ株のスクリーニングを行ったところ、驚くべきことにアオウキクサＳＨ株が、他のアオウキクサ株の平均の１０倍以上のＫＯＤＡ生産能を有することを発見した。
本発明者らは、アオウキクサＳＨ株と、代表株としてアオウキクサ４４１株からリポキシゲナーゼｃＤＮＡを単離し、大腸菌を宿主として発現を行い、その生成物特異性を検討した。その結果、９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性を有することを確認し、当該活性が従来使用されていたイネの９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性よりも高い活性を有することを明らかにした。
そこで、本発明者らは、本願においてアオウキクサに由来する新規９位生成物特異性リポキシゲナーゼ遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質を提供する。具体的に、本発明は、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５からなる群から選ばれる塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子、及び当該ＤＮＡと実質的に同一なＤＮＡからなる遺伝子、並びにこれらの遺伝子によりコードされるタンパク質を提供する。さらに、本発明者らは、上記ＤＮＡとベクター断片とを結合させてなる発現ベクターを提供する。さらに、本発明は、当該発現ベクターが形質転換された微生物、動物細胞又は昆虫細胞などの形質転換体にも関する。本発明に係る９位生成物特異性リポキシゲナーゼは、上記形質転換体を培養し、抽出、精製することにより得られる。
本発明に係る９位生成物特異性リポキシゲナーゼは、従来の９位生成物特異性リポキシゲナーゼに比較して活性が高く、また大腸菌で発現した場合も高い活性を維持する。したがって、当該９位生成物特異性リポキシゲナーゼを用いることにより、α-リノレン酸やリノール酸等を出発材料として酵素合成によってＫＯＤＡを始めα-ケトール不飽和脂肪酸を効率よく製造することができる。
以下、本発明の実施の形態について説明する。本発明は、アオウキクサに由来する新規９位生成物特異性リポキシゲナーゼ遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質に関する。具体的に、本発明は、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５からなる群から選ばれる塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子、及び当該ＤＮＡと実質的に同一なＤＮＡからなる遺伝子、並びにこれらの遺伝子にコードされるタンパク質に関する。当該塩基配列が、配列番号１又は配列番号３で表される配列あることが好ましい。さらに好ましくは、当該塩基配列は配列番号１で表される配列である。ここで、「実質的に同一なＤＮＡ」とは、参照元のＤＮＡと塩基配列において少なくとも７０％の同一性を有するＤＮＡをいう。同一性は、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％、又は少なくとも９９.９％である。さらに、「実質的に同一なＤＮＡ」は、参照元のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡのこともいう。これらの「実質的に同一なＤＮＡ」は、転写、翻訳された場合には、参照元のＤＮＡがコードするタンパク質と同じ酵素活性、すなわち９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明は、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに当該アミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡにも関する。ここで、「実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質」については、以下に詳述する。さらに、本発明は、上記ＤＮＡの断片であって、リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片にも関する。
ハイブリダイゼーションは周知の方法又はそれに準じる方法、例えばJ.Sambrookら、Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法に従って行うことができ、そして高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばＮａＣｌ濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃である条件をいう。
本発明はさらに、配列番号２、配列番号４及び配列番号６からなる群から選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、並びに当該アミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。当該アミノ酸配列が、配列番号２又は４で表される配列であることが好ましい。最も好ましくは、当該アミノ酸配列は、配列番号２で表される配列である。ここで、「実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、参照元のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ参照元のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性、すなわち９位生成物特異的リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をいう。さらに、「実質的に同一なアミノ酸配列からなるタンパク質とは、参照元のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列からなり、かつ９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をいう。同一性は、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％、又は少なくとも９９.９％である。さらに、本発明は、配列番号１、配列番号３、及び配列番号５からなる群から選ばれる塩基配列のＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと実質的に同一なＤＮＡによりコードされ、かつ９位生成物特異的リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質にも関する。さらに、本発明は上記タンパク質の断片であって、リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質断片にも関する。
本明細書において配列番号１は、アオウキクサＳＨ株由来の９位生成物特異性リポキシゲナーゼの塩基配列を表し、配列番号２は当該リポキシゲナーゼのアミノ酸配列を表す。一方、配列番号３は、アオウキクサ４１１株由来の９位生成物特異性リポキシゲナーゼ１の塩基配列を表し、配列番号４は当該リポキシゲナーゼのアミノ酸配列を表し、配列番号５は、アオウキクサ４１１株由来の９位生成物特異性リポキシゲナーゼ２の塩基配列を表し、配列番号６は当該リポキシゲナーゼのアミノ酸配列を表す。これらの具体的な配列を図２Ａ〜４Ｃに示す。
９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性とは、α-リノレン酸、リノール酸等の炭素数１８の不飽和脂肪酸を基質として、その９位の炭素に特異的に分子状の酸素をヒドロキシペルオキシド基として導入する酵素活性を意味する。
本発明でいう９位生成物特異性リポキシゲナーゼ又は９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性を有するタンパク質とは、例えば後述の活性測定法により有意な９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性を有することの認められたものをいう。例えば、配列番号２又は配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する９位生成物特異性リポキシゲナーゼの活性と比較し、例えば少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の活性を有するもの、更には１００％以上の活性を有するものを包含する。
本発明の遺伝子(ｃＤＮＡ)は、例えば以下の手順で得ることができる。植物由来のリポキシゲナーゼに共通したアミノ酸配列からプライマーを設計し、ＲＴ-ＰＣＲ等を行って、ｃＤＮＡ断片を得る。この断片を必要に応じて32Ｐまたはジゴキシゲニン等でラベルし、これを用いて５'-ＲＡＣＥまたは３'-ＲＡＣＥ、あるいは作製したｃＤＮＡライブラリーを用いて常法によりスクリーニングを行い、リポキシゲナーゼ遺伝子(ｃＤＮＡ)全長を得ることができる。塩基配列の決定は、サンガー法やマキサム-ギルバート法等の一般的方法によって行うことができる。
別法としては、アオウキクサ由来９位生成物特異性リポキシゲナーゼを、硫安分画や各種クロマトグラフィー等の手段を用いて精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜等に電気的に転写し、クマシーブリリアントブルー等の色素で検出されるバンドを切り出した後、プロテインシークエンサーにより、Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、この配列を元にプライマーを設計して、上述の方法に準じてＰＣＲを行うことによりリポキシゲナーゼ遺伝子(ｃＤＮＡ)全長を得ることができる。
単離した遺伝子(ｃＤＮＡ)は例えばプラスミド、ウィルス等に周知の方法により挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の培養細胞に導入して発現させることにより、当該タンパク質を大量調製することが可能である。さらに、タンパク質発現系として、例えば小麦胚芽抽出物を用いる無細胞タンパク質発現系が使用されることもある。
ベクターとしては、大腸菌(Escherichia coli)由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)由来のプラスミド、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、酵母由来プラスミド、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等の動物ウィルスの他、ｐＡ１-１１、ｐＸＴ１、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。本発明においては市販のベクター、ｐＥＴ２３ｄ(Novagen)を用いることができる。
本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターは、本発明に係る遺伝子を適当なベクターのプロモーターの下流に、適当な制限部位を介して周知の方法で連結することにより製造できる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に制限されない。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター、β-アクチンプロモーター等が挙げられる。宿主が大腸菌等のエシェリヒア属の細菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等、宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎプロモーター、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主が昆虫の場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。所望により、発現ベクターには更にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点、等を含んでよい。
宿主細胞には、組換タンパク質を産生するための宿主として従来から利用されている原核又は真核細胞のいずれでもよく、例えば限定することなく、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞であり、そして好ましくは細菌又は真菌などの微生物である。「真菌」なる語は糸状菌及び酵母を包含することを意図する。適当な細菌の例は、エシェリヒア(Escherichia)属、例えば大腸菌、バチルス属、例えばバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、例えばストレプトマイセス・リビダンス(S. lividans)等のグラム陽性菌、シュードモナス(Pseudomonas)属、例えばシュードモナス・セパシア(P. cepacia)等のグラム陰性菌が挙げられる。また、この細胞は真菌、即ち酵母又は糸状菌の細胞であってもよい。酵母は例えばサッカロマイセス(Saccharomyces)属の細胞、例えばＳ.セレビジエ(S. cerevisiae)であってよい。糸状菌宿主生物は例えばアスペルギルス(Aspergillus)種の株、例えばＡ.ニガー(A. niger)であってよい。昆虫細胞としては、例えばＳｆ細胞、ＭＧ１細胞、ＢｍＮ細胞等が挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ-７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ等が挙げられる。本発明においては大腸菌細胞を利用するのが特に好ましい。
宿主細胞の形質転換は周知の方法、例えば塩化カルシウム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、プロトプラストポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法等が利用でき、利用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。
得られる組換宿主細胞を適当な培養培地で培養し、培養液から、慣用の手順、例えば限定することなく、遠心又はろ過により培養液から細胞を分離させ、必要に応じて細胞を破壊し、硫酸アンモニウムの如き塩により上清液又は濾液のタンパク質性成分を沈殿させ、次いで様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を行うことにより目的のタンパク質を回収することができる。
所望により、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの上流に分泌のための微生物用又は動物用の適当なシグナル配列を接続すれば、当該タンパク質を培地中に分泌発現させることもできる。このような分泌型に改変したＤＮＡは、培地中に分泌した当該タンパク質の精製を容易にする点で有用である。かかるシグナル配列の例としては、大腸菌の場合ｐｅｌＢシグナル(S.P.Lei ら、J. Bacteriology, 169:4379-4383, 1987)、酵母の場合α因子シグナル(A.J. Brake, Yeast Genetic Engineering, p269 Butterworth, 1989)、動物細胞の場合イムノグロブリンのシグナルＳＧ-１(H.Maedaら、Hum. Antibod. Hybridomas, 2:124-134, 1991)、C25のシグナル(ＷＯ９４／２０６３２)等が挙げられる。
リポキシゲナーゼ活性の測定は、通常用いられる方法で行うことができる。例えば、本発明の９位リポキシゲナーゼをα-リノレン酸やリノール酸等の基質に作用させ、酵素反応生成物であるヒドロペルオキシド体の生成に由来する２３４ｎｍの吸光度の増加、分子状酸素の消費に由来する反応液中の溶存酸素の減少、ヒドロペルオキシド体を直接ＨＰＬＣで検出する方法などを用いることができる。さらに、リポキシゲナーゼの９位生成物特異性については、文献に記載されているように(Yamamoto ら、Lipids, 15, 1-5, 1980)、例えばシリカゲルカラムを用いた順相ＨＰＬＣ等で検出することができる。
本発明にかかるタンパク質は、例えば種々のリノール酸、リノレン酸誘導体等の合成に利用するための試薬として有用であり得る。具体的に、本タンパク質は、植物成長調整剤として有用なα-ケトール不飽和脂肪酸、好ましくはＫＯＤＡを、リノール酸やリノレン酸から酵素的に合成する場合に使用する酵素として有用である。また、本発明の遺伝子を植物体に導入することで、植物体内に存在するリノール酸やリノレン酸の９位生成物特異性リポキシゲナーゼによる代謝をコントロールすることも可能になると考えられる。
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例等により、本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
実施例１：ＫＯＤＡ高生産アオウキクサ株のスクリーニング
様々な場所から採取された６２種類のアオウキクサを準備し、１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地中において、２４〜２５℃の昼光色蛍光ライトからの連続的な光照射の下で継代培養した。１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地は、次の成分を含む：
スクロース １０ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4 ２００ｍｇ／ｌ
ＮＨ4ＮＯ3 １００ｍｇ／ｌ
ＥＤＴＡ遊離酸 ２５０ｍｇ／ｌ
Ｃａ(ＮＯ3)・４Ｈ2Ｏ １７６ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２５０ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １２.４ｍｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ８.９２ｍｇ／ｌ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ３２.８ｍｇ／ｌ
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ １２.６ｍｇ／ｌ
Ｈ3ＢＯ3 ７.１ｍｇ／ｌ
Ｃｏ(ＮＯ3)・６Ｈ2Ｏ ０.１ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ １.９７ｍｇ／ｌ
を含み、ＫＯＨ（５０％）を用いてｐＨ６．２〜６．５に調整した。
様々な場所から採取された６２種類のアオウキクサを準備し、１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地中において、２４〜２５℃の昼光色蛍光ライトからの連続的な光照射の下で継代培養した。１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地は、次の成分を含む：
スクロース １０ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4 ２００ｍｇ／ｌ
ＮＨ4ＮＯ3 １００ｍｇ／ｌ
ＥＤＴＡ遊離酸 ２５０ｍｇ／ｌ
Ｃａ(ＮＯ3)・４Ｈ2Ｏ １７６ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２５０ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １２.４ｍｇ／ｌ
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ８.９２ｍｇ／ｌ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ３２.８ｍｇ／ｌ
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ １２.６ｍｇ／ｌ
Ｈ3ＢＯ3 ７.１ｍｇ／ｌ
Ｃｏ(ＮＯ3)・６Ｈ2Ｏ ０.１ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ １.９７ｍｇ／ｌ
を含み、ＫＯＨ（５０％）を用いてｐＨ６．２〜６．５に調整した。
増殖したアオウキクサをろ紙上に広げ、２時間放置した後、水中に１時間浸漬した。その水を高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ；カラム:TYPE UG120 5μm SIZE 4.6mm I.D×250mm；ガードフィルター:INERTSTL 4.6mm×50mm；溶離液:50%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸；条件:吸光度の波長210λ(nm)、流速1.mL/min、カラム温度40℃)でＫＯＤＡの濃度を分析した。全てのアオウキクサ株のＫＯＤＡ生産量の平均は４.９７μＭであった。その中で、アオウキクサＳＨ株は６０.２μＭのＫＯＤＡを生産しており、全株の平均ＫＯＤＡ生産量の約１２倍も多く、極めて高い生産量を与えた(図１)。
実施例２：アオウキクサ株由来リポキシゲナーゼのクローニングとその活性測定
アオウキクサＳＨ株及びアオウキクサ４４１株からRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて全ＲＮＡを抽出後、アオウキクサのそれぞれの株の全ＲＮＡ１.８μｇを鋳型としてLongRange 2Step RT-PCR Kit(QIAGEN)によりｃＤＮＡを合成した。
その後、ｃＤＮＡを鋳型とし、下記縮重プライマー(ＬｐＤＰｆ、ＬｐＤＰｒ)を用いて縮重ＰＣＲ(ＰＣＲ条件：初期変性９４℃３分；９４℃０.５分、４７℃０.５分,７２℃１.３分のサイクルを３９回)を行い、目的とする９-リポキシゲナーゼの部分配列を得た。
ＬｐＤＰｆ: 5'-GCITGGMGIACIGAYGARGARTTY-3' (配列番号７)
ＬｐＤＰｒ: 5'-GCRTAIGGRTAYTGICCRAARTT-3' (配列番号８)
ここで、Ｉはイノシンを表す。
この縮重プライマーは、アオウキクサ・リポキシゲナーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）クローニングのためのプライマー設計には既にクローニングされている植物由来のリポキシゲナーゼ（ダイズ、ポテト、トマト、大麦、イネ）のアミノ酸配列について、相同性の高い領域から設計されたものである。
アオウキクサＳＨ株及びアオウキクサ４４１株からRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて全ＲＮＡを抽出後、アオウキクサのそれぞれの株の全ＲＮＡ１.８μｇを鋳型としてLongRange 2Step RT-PCR Kit(QIAGEN)によりｃＤＮＡを合成した。
その後、ｃＤＮＡを鋳型とし、下記縮重プライマー(ＬｐＤＰｆ、ＬｐＤＰｒ)を用いて縮重ＰＣＲ(ＰＣＲ条件：初期変性９４℃３分；９４℃０.５分、４７℃０.５分,７２℃１.３分のサイクルを３９回)を行い、目的とする９-リポキシゲナーゼの部分配列を得た。
ＬｐＤＰｆ: 5'-GCITGGMGIACIGAYGARGARTTY-3' (配列番号７)
ＬｐＤＰｒ: 5'-GCRTAIGGRTAYTGICCRAARTT-3' (配列番号８)
ここで、Ｉはイノシンを表す。
この縮重プライマーは、アオウキクサ・リポキシゲナーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）クローニングのためのプライマー設計には既にクローニングされている植物由来のリポキシゲナーゼ（ダイズ、ポテト、トマト、大麦、イネ）のアミノ酸配列について、相同性の高い領域から設計されたものである。
ＳＨ株からは１配列、４４１株から２配列のリポキシゲナーゼｃＤＮＡ中央部に相当する約１.０ｋｂの産物を得て、塩基配列の決定を行った。得られた配列情報を元にＢＬＡＳＴ検索を行った結果、これら３配列は複数の既知植物由来のＬＯＸに対して高い相同性を示した(Corylus avellana(セイヨウハシバミ)75%、Actinidia deliciosa(キウイフルーツ)74%、Solanum tuberosum(ジャガイモ)75%、Oryza sativa(イネ)76%、Nicotiana tabacum(タバコ)74%、Cucumis sativus(キュウリ)75%、Arabidopsis thaliana(シロイヌナズナ)73%など)。
この配列情報をもとに、以下の３'ＲＡＣＥ及び５'ＲＡＣＥ法(Rapid Amplification of cDNA end)用のプライマーを設計した。
３’−ＲＡＣＥ用プライマー
SH-3'-TP: 5'-AGCTCTTCATCTTGGACC-3' (配列番号９)
441-1-3'-TP: 5'-AAGCTTCTTCATCCCCACTTCC-3' (配列番号１０)
441-2-3'-TP: 5'-AAGCTCCTTCATCCCCACTTCC-3' (配列番号１１)
５’−ＲＡＣＥ用プライマー
SH-5'-TP: 5'-TTTCATCCTTCTTGTCGC-3' (配列番号１２)
441-1-5'-TP: 5'-GCTTGTATATTGGGTGCAC-3' (配列番号１３)
441-2-5'-TP: 5'- AAGCAGTAACACGGTTCTGGAGG -3' (配列番号１４)
３’−ＲＡＣＥ用プライマー
SH-3'-TP: 5'-AGCTCTTCATCTTGGACC-3' (配列番号９)
441-1-3'-TP: 5'-AAGCTTCTTCATCCCCACTTCC-3' (配列番号１０)
441-2-3'-TP: 5'-AAGCTCCTTCATCCCCACTTCC-3' (配列番号１１)
５’−ＲＡＣＥ用プライマー
SH-5'-TP: 5'-TTTCATCCTTCTTGTCGC-3' (配列番号１２)
441-1-5'-TP: 5'-GCTTGTATATTGGGTGCAC-3' (配列番号１３)
441-2-5'-TP: 5'- AAGCAGTAACACGGTTCTGGAGG -3' (配列番号１４)
３’−ＲＡＣＥ
上記実験で得られたＳＨ株、４４１株の全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit（Seegene）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型溶液として、キット内アダプタープライマー（３’−ＲＡＣＥプライマー）とＳＨ−３’−ＴＰ、４４１−１−３’−ＴＰ又は４４１−２−３’−ＴＰとそれぞれＰＣＲを行った。
上記実験で得られたＳＨ株、４４１株の全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit（Seegene）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型溶液として、キット内アダプタープライマー（３’−ＲＡＣＥプライマー）とＳＨ−３’−ＴＰ、４４１−１−３’−ＴＰ又は４４１−２−３’−ＴＰとそれぞれＰＣＲを行った。
５’−ＲＡＣＥ
上記実験で得られたＳＨ株、４４１株の全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit（Seegene）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型溶液として、キット内アダプタープライマー（５’−ＲＡＣＥプライマー）とＳＨ−５’−ＴＰ、４４１−１−５’−ＴＰ又は４４１−２−５’−ＴＰとそれぞれＰＣＲを行った。
上記実験で得られたＳＨ株、４４１株の全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、CapFishingTM target full-length cDNA cloning Kit（Seegene）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型溶液として、キット内アダプタープライマー（５’−ＲＡＣＥプライマー）とＳＨ−５’−ＴＰ、４４１−１−５’−ＴＰ又は４４１−２−５’−ＴＰとそれぞれＰＣＲを行った。
それぞれの産物の塩基配列を決定し、適当な制限酵素部位を用いて１本につなぎ、ｃＤＮＡ全長を取得して、ｐＴＡＣ−２ベクター（BioDynamics）にサブクローニングした。
アオウキクサＳＨ株から得られたリポキシゲナーゼを、ＳＨＬｐＬＯＸ、アオウキクサ４４１株から得られたリポキシゲナーゼを、４４１ＬｐＬＯＸ１及び４４１ＬｐＬＯＸ２と名付けた。
アオウキクサＳＨ株から得られたリポキシゲナーゼを、ＳＨＬｐＬＯＸ、アオウキクサ４４１株から得られたリポキシゲナーゼを、４４１ＬｐＬＯＸ１及び４４１ＬｐＬＯＸ２と名付けた。
アオウキクサ４４１株及びＳＨ株由来の３種類の新規ＬＯＸｃＤＮＡについて、５’側にＮｃｏＩ、３’側にＮｔｏＩ切断部位を付したプライマーを用いて、開始コドン〜終止コドンからなる翻訳領域全長を含むＤＮＡ断片をＰＣＲにより取得し、市販の発現ベクターｐＥＴ２３ｄ(Novagen)のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入して、アオウキクサ・リポキシゲナーゼ発現用プラスミドｐＥＴ２３ｄ／ＳＨＬｐＬＯＸ、ｐＥＴ２３ｄ／４４１ＬｐＬＯＸ１およびｐＥＴ２３ｄ／４４１ＬｐＬＯＸ２を得た。これらプラスミドを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Novagen）に形質転換した。そして、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振盪培養を行った。この培養液を、同濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地１０ｍｌに対して１００μｌ添加し、３７℃で５時間振盪培養した。この培養液から遠心分離にて菌体を回収し、０．１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（和光純薬）、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＴＢ培地に移し、１５℃で４０時間培養し、リポキシゲナーゼの発現誘導を行った。培養終了後、遠心分離により集菌(湿重量０.４ｇ)し、１０ｍｌのBugBusterTM(Novagen)にて菌体を溶解した。その後遠心分離(９,０００ｒｐｍ、５分、４℃)を行って上清(１０ｍｌ)を回収し、酵素液とした。
９位特異的な対照酵素液として、イネ胚芽由来の９位特異的なリポキシゲナーゼであるｒ９-ＬＯＸ１をｐＥＴ２３ｄのＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入したプラスミドを大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)に形質転換したものをから、上記と同様にリポキシゲナーゼを発現・抽出して得た酵素液を用いた。
ＳＨＬｐＬＯＸ、４４１ＬｐＬＯＸ１、４４１ＬｐＬＯＸ２及びコントロールとして用いたｒ９-ＬＯＸ１の酵素液中のリポキシゲナーゼの活性測定を行った。５ｍＭのα-リノレン酸水溶液(０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ８０を含む)２５μｌ、０.２Ｍのリン酸Ｎａ緩衝液(ｐＨ７.０)１０μｌ、蒸留水５μｌを１.５ｍｌ容量のチューブに入れ、当該チューブに上記酵素液１０μｌを加えて３０分間反応させた。反応終了後、反応液をＨＰＬＣ(逆相系；カラム：カプセルパックＣ-１８ ＵＧ１２０(４.６×２５０ｍｍ、資生堂)、カラム温度：４０℃、移動相：５０％のアセトニトリル(０.０２％ＴＦＡ)、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ)に供し、生成するリノレン酸ヒドロペルオキシドの部位特異性および生成量を検査した。当該ＨＰＬＣの結果を図５Ａ−Ｄに示す。ＨＰＬＣチャートに示されるように、ＳＨＬｐＬＯＸ、４４１ＬｐＬＯＸ１、４４１ＬｐＬＯＸ２のそれぞれについて、リノレン酸-９-ヒドロペルオキシドのピーク(２１.１分)が確認され、９位生成物特異性リポキシゲナーゼ活性を持つことが明らかとなった。
ＨＰＬＣの結果をリノレン酸-９-ヒドロペルオキシド体の生成量について比較した。当該比較の結果を図６に示す。アオウキクサＳＨ株から得られた新規ＬＯＸ(ＳＨＬｐＬＯＸ)及びアオウキクサ４４１株から得られた新規ＬＯＸ(４４１ＬｐＬＯＸ１)が、既知の９位生成物特異性リポキシゲナーゼの中でも活性が強いとされていたｒ９-ＬＯＸ１よりはるかに活性の高い９位生成物特異性リポキシゲナーゼであることが明らかとなった。
これらアオウキクサ由来の新規ＬＯＸの中で、リノレン酸−９−ヒドロペルオキシド体の生成量が最も高かったＳＨＬｐＬＯＸのカイネティクス解析を行った。４０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０の反応液を用い、反応温度は２５℃で行った。基質であるα−リノレン酸は、１０〜１００μＭの基質濃度で試験した。反応液１００μＬをキュベットに加え、ＳｍａｒｔＳｐｅｃ Ｐｌｕｓスペクトロフォトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、２３４ｎｍの吸光度を、１５秒のインターバルで経時的に１０分間スキャニングした。測定したＡ234から反応産物の量を算出した（ｅ＝２５，０００）。カイネティックパラメーターはＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット（［Ｓ］／ｖ ｖｅｒｓｕｓ［Ｓ］プロット）を用いて決定した。この結果、表１に示すように、ＳＨＬｐＬＯＸでは、基質との親和性パラメーターであるＫm値がｒ９−ＬＯＸ１より低く、ＳＨＬｐＬＯＸが基質であるα−リノレン酸との親和性が高いことを示している。また、最大反応速度Ｖmaxはｒ９−ＬＯＸ１とＳＨＬｐＬＯＸは、ほぼ同程度ではあるが、単位時間当たりの反応回数であるｋcat値はＳＨＬｐＬＯＸのほうがｒ９−ＬＯＸ１と比較して高かった。酵素活性の指標となるｋcat／Ｋm値は、ＳＨＬｐＬＯＸがｒ９−ＬＯＸ１の約１．６倍となった。このことから、アオウキクサＳＨ株由来の新規９−ＬＯＸが非常に高活性の９−ＬＯＸであることが明らかとなった。
Claims (5)
- 以下の(ａ)〜(ｂ)：
(ａ) 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；及び
(ｂ) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる群から選ばれるＤＮＡからなる遺伝子。 - 請求項１に記載のＤＮＡとベクター断片とを結合させてなる発現ベクター。
- 請求項２に記載の発現ベクターを、宿主となる微生物、動物細胞又は植物細胞に導入してなる形質転換体。
- 請求項３に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、９位生成物特異性リポキシゲナーゼの製造方法。
- 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質。
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