CN101560499A - 除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物。本发明涉及具有arogenate脱氢酶活性的新酶，特别是植物的arogenate脱氢酶以及编码所述酶的基因。本发明的arogenate脱氢酶催化酪氨酸生物合成代谢途径的最后一步并因此构成除草剂的潜在靶标。因此本发明也涉及鉴定以所述的酶为靶酶的除草剂的方法，所述的除草剂化合物通过与所述的酶结合而防止酪氨酸的生物合成。本发明还涉及对以参与酪氨酸生物合成途径的酶为靶酶，特别是以参与转化L－酪氨酸为预苯酸的酶，具体是arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂，有耐受性的转基因植物。这些植物成为耐受性是由于在植物组织中表达了预苯酸脱氢酶，此酶对所述的除草剂不敏感并使植物即使在用所述的除草剂处理后仍能合成酪氨酸。
Description
本申请是申请号为01821961.6，名为“除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有arogenate脱氢酶活性的新酶，具体是植物arogenate脱氢酶，还涉及编码这些酶的基因。本发明的arogenate脱氢酶催化酪氨酸生物合成代谢途径的最后一步，由于这一点，构成除草剂的潜在靶标。因此，本发明还涉及鉴定以这些酶为靶酶的除草剂化合物的方法，所述的除草剂化合物通过附着所述的酶而防止酪氨酸的生物合成。本发明也涉及以参与酪氨酸生物合成途径的酶为靶酶，特别是以参与预苯酸转变成L-酪氨酸的酶为靶酶，具体是以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物具有耐受性的转基因植物。这些植物成为耐受性是由于在植物组织中表达了预苯酸脱氢酶，此酶对所述的除草剂不敏感并使植物即使在用所述除草剂化合物处理后仍能合成酪氨酸。
背景技术
芳香族氨基酸的生物合成途径桅了植物、细菌和真菌必需的代谢途径。除了生物合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸外，这个代谢途径在产生许多次级芳香代谢产物的过程中，包括诸如植物-微生物相互作用，结构性生物高聚物如木质素和软木脂生物合成、激素合成、或苯醌合成中都起着非常重要的作用。在具有此代谢途径的所有生物中，已鉴定到两条预苯酸转变成酪氨酸的途径(图1；Stenmark等，1974).在大部分含有叶绿素的细菌，一些微生物和大部分植物中，L-酪氨酸是通过arogenate合成途径合成的(Abou-Zeid等，1995；Byng等，1981；Connely和Conn 1986；Frazel和Jensen 1979；Gaines等，1982；Hall等，1982；Keller等，1985；Mayer等，1985).在此途径中，预苯酸通过一种特殊的转氨酶：预苯酸转氨酶(EC 2.6.1.57)转氨而形成arogenate，然后arogenate通过arogenate脱氢酶(EC 1.3.1.43；图1 ADH)转变成L-酪氨酸。以不同的方式，在生物体中如大肠杆菌或酵母中，预苯酸起初是通过预苯酸脱氢酶(EC 1.3.1.12，EC 1.3.1.13)转变成p-羟苯基-丙酮酸，然后p-羟苯基-丙酮酸再转氨成为L-酪氨酸(Lingens等，1967)。由于其在植物的酪氨酸生物合成途径中的作用，arogenate脱氢酶构成了新除草剂的一个潜在靶标。
参此代谢途径的其它酶也构成除草剂的主要靶标。例如，可提及的有参与预苯酸合成途径上游的5-炳烯醇-草莽酸3-磷酸合成酶(EPSPS)，它是所有除草剂草甘膦的靶酶。还可提及的有参与p-羟苯基丙酮酸转变成尿黑酸的p-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)。HPPD是除草剂新家族的靶酶，它的作用导致叶子漂白(Schulz等，1993；Secor 1994)。这些除草剂具体是异唑(EP 418175，EP 470856，EP 487352，EP 527036，EP 560482，EP 682659，US 5424276)，特别是isoxaflutole，一种选择玉米的除草剂；二酮腈(EP 496630，EP 496631)具体是2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4，2，3-Cl2苯基)丙烷-1，3-二酮；三酮类(EP 625505，EP 625508，EP 5,506,195)，特别是sulcotrione或中三酮，或其它的二氢化吡唑类。
以植物必需的代谢途径中的酶为靶酶的除草剂的一个优点，是它们对远亲缘性植物具有广谱活性。然而，当这些除草剂应用于农作物以除去不需要的植物或“杂草”时，它们的主要缺点是也作用于种植物。。这个缺点可以通过种植对所述除草剂有耐受性的植物而得到克服。这些植物通常通过遗传工程获得，即在它们的基因组中引入编码对所述除草剂有抗性的一种酶的基因，以此方式这些植物在其组织中过量表达所述的酶。迄今为止，有三种主要运用遗传工程技术的策略得到应用以使植物对除草剂产生抗性。第一种包括通过用编码一解毒酶的基因转化植物使之能解毒除草剂。此酶把除草剂或其活性代谢产物转变成没有毒性的降解物，例如，对bromoxynil或是对basta有耐受性的酶(EP 242236，EP 337899)。第二种策略包括用编码经某种方式突变而对除草剂或其活性代谢物不大敏感的靶酶的基因转化植物，例如，对草甘膦有耐受性的酶(EP 293356，Padgette S.R.等，J.Biol.Chem.，266，33，1991).第三种策略包括过量表达敏感的靶酶以至于在植物体中产生大量的靶酶，如果可能的话产生远大于进入植物中的除草剂的量。采用此策略曾成功的得到了对HPPD抑制剂有耐受性的植物(WO 96/38567)，使得即使其抑制物存在时也可能维持足量水平的功能性酶。
存在着分类学不同分级的两种L-酪氨酸生物合成途径，尤其是植物中还没有发现将预苯酸直接转变成p-羟苯基丙酮酸的途径，这些事实使得可能设想第四种使植物耐受除草剂的策略。具体说，在使用以植物中的arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物时，有目的地用细菌或酵母预苯酸脱氢酶的编码基因转化植物，将能使所述植物合成L-酪氨酸而产生耐受性，因此即使所述除草剂化合物能抑制arogenate脱氢酶，所述植物仍对除草剂化合物有耐受性。因此这种新策略包括通过走到用arogenate胱氢酶的酪氨酸生物合成天然代谢途径的一个旁路，在植物中有目的制造对除草剂的抗性，方法是人为地在这些植物中植入踟氨酸生物合成中利用预苯酸脱氢酶一种新的代谢途径。拥有此旁路的植物宜为农业植物，特别是杂草，将对所述除草剂化合物敏感。
发明内容
本发明因此涉及编码具有arogenat脱氢酶活性的酶的新分离的多聚核苷酸。按照本发明，术语“多聚核苷酸”意指天然或人造的核苷酸序列，可以是DNA或RNA类型，更好的是DNA类型，特别是双链DNA。“有arogenate脱氢酶活性的酶”这种表达方式意指此酶能将arogenate转变成L-酪氨酸。Arogenate脱氢酶的活性可以通过检测arogenate底物量的减少，或是通过检测酶反应产物即L-酪氨酸或辅因子NADPH的积累等方法进行测量。具体讲，可用实施例4所描述的方法检测arogenate脱氢酶活性。
按照本发明的一个具体实施方案，编码arogenate脱氢酶的多聚核苷酸包括编码选自序列身份号SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的多肽序列的多聚核苷酸。本领域技术人员熟知此定义包括编码相同的氨基酸序列的所有多聚核苷酸尽管有由于遗传密码子的简并性可导致核苷酸序列不同，这些氨基酸序列由序列号SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13为代表。
本发明还包括编码arogenate脱氢酶选择性与上述多聚核苷酸之杂交的，或组成探针的这些多聚核苷酸的分离的多聚核苷酸。按照本发明，“能选择性杂交的多聚核苷酸”含义是指该多聚核苷酸以本领域溶胀的方法(Sambrook等，1989，分子克隆：实验操作手册，Nolan C.编，纽约：冷泉港实验室出版社)，与上述多聚核苷酸杂交或与其衍生的探针杂交，产生的信号水平比背景噪音要强得多。背景噪音的产生可能与其它存在的多聚核苷酸，例如cDNA文库中存在的其它cDNA杂交有关。由于能选择性杂交的多聚核苷酸与本发明上述序列号SEQ ID NO所定义的多聚核苷酸：或探针之间的相互作用而产生的信号水平通常要比与产生背景噪音的其它DNA序列相互作用产生的强10倍，更好是100倍。此种相互作用的水平可以通过，例如，用诸如32P等放射性元素标记的上述多聚核苷酸或探针进行测量。选择性杂交通常可用非常严格的培养条件(例如大约50℃-60℃ 0.03M NaCl和0.03M柠檬酸钠)获得。
本发明还包括编码arogenate脱氢酶的分离的多聚核苷酸和上述多聚核苷酸的同源物。按照本发明，术语“同源物”含义是与上述核苷酸序列相比有一处或多处序列修饰的和编码具有arogenate脱氢酶活性的酶的多聚核苷酸。这些修饰可以是天然的或通过溶胀的突变技术导致加入，去除或置换本发明序列中的一个或多个核苷酸人为获得的。这些修饰决定了与上述序列的同源性程度。有利的是，与上述序列相比同源性程度将至少为70％，优选至少80％，更优选至少90％。检测和鉴定核苷酸序列之间同源性的方法是本领域技术人员所熟知。例如，可以采用PILEUP或BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10；也可以见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。
本发明还涉及上述多聚核苷酸的片段关。术语“片段”具体表示至少20个核苷酸，至少50个核苷酸，优选至少100个核苷酸片段。
按照本发明一项具体实施方案，本发明的多聚核苷酸由序列身份号SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12所代表。
本发明还涉及至少包括上述一条多聚核苷酸的诸多聚核苷酸。
所有的上述多聚核苷酸编码arogenate脱氢酶。因此，本发明扩充至所有编码arogenate脱氢酶的所有多聚核苷酸。
按照本发明的一具体实施方案，arogenate脱氢酶是一种酶，其多肽序列选自序列身份号SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13的序列，或这些序列的片段。术语“片段”含义指必需有生物活性的片段，如arogenate脱氢酶中的具有与完整arogenate脱氢酶相同活性的片段。
按照本发明的一具体实施方案，上述的多聚核苷酸和arogenate脱氢酶来源于植物。更具体说，它们来源于拟南芥属植物，优选A.thaliana属，或者来源于Picea，属，优选Picea glauca属植物。
按照本发明的另一特定实施方案，上述的多聚核苷酸和arogenate脱氢酶来源于细菌。更具体说，它们来源于Synechocystis属细菌。
本发明还涉及含有功能上相互连接的在宿主中有功能的一个启动子，一个编码本发明所定义的arogenate脱氢酶的多聚核苷酸以及一个在同一宿主中有功能的终止子元件的嵌合基因。首先，此嵌合基因可以包含的各种不同的元件是调控转录、翻译和蛋白质成熟的元件，如启动子，编码一信号肽或转运肽的序列，或组成多聚腺苷酸信号的终止子元件；其次，可包含编码一蛋白质的多聚核苷酸。“功能上相互连接”，含义是所述嵌合基因中的元件相互连接的方式使这些元素中一个的作用是受到另一个的影响。例如，当启动子与一编码序列功能上相连时它就能影响所述编码序列的表达，本发明嵌合基因的构建以及其各种元件的装配可以采用本领域技术人员所熟知的技术，特别是Sambrook等，(1989，分子克隆：实验操作手册，Nolan C.编，纽约：冷泉港出版社)所描述的技术进行。选择组成该嵌合基因的调控元件必须是能在宿主中发挥功能的，本领域技术人员有能力选择那些在某给定宿主生物中发挥功能的调控元件。术语“能发挥功能的”含义是能在某给定的宿主中发挥作用。
本发明嵌合基因的启动子包括组成型或可诱导型启动子。本发明的组成型启动子是能诱导编码序列在宿主的所有组织中表达的并在所述宿主生物的整个生命周期中表达的启动子。这些启动子中的一些可以是组织特异性的，如持续地表达该编码序列，但仅是在宿主生物的特定组织中。组成型启动子可来源于任何类型的生物。在可用于本发明的嵌合基因的组成型启动子中，例如，可提及的有细菌启动子，如羧乙基精氨酸合成酶基因的启动子或胭脂碱合成酶基因的启动子，或可提及的有病毒启动子，如花椰菜镶嵌病毒的控制19S RNA或35S RNA转录的基因的启动子(Odell等，1985，Nature，313，810-812)，或是木薯叶脉镶嵌病毒的启动子(专利申请WO 97/48819有所描述)。在来源于植物的启动子中，可提及的有核酮糖二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的小亚基基因的启动子，专利申请EP 0507698中所描述的组蛋白基因的启动子，或稻米肌动蛋白基因的启动子(US 5,641,876)。
按照本发明的另一特定实施方案，此嵌合基因包括一个可诱导型启动子。可诱导型启动子，是只有当其自身被一种诱导剂诱导时，才能起作用，即才能诱导某编码序列表达的启动子。这种诱导剂通常是一种在所述生物受到某种外部刺激后可以在宿主生物体内合成的物质，这种外部刺激可能是，例如病原因子。这种诱导剂也可以是一种对于宿主而言是外部的，但能穿透进入宿主生物体内的物质。有利地是，本发明所用的启动子在病原因子攻击宿主生物后成为可诱导的启动子。这些已知的启动子是专利申请FR 9903700所描述的植物O-甲基转移酶II类(COMTII)基因的启动子，拟南芥PR-1启动子(Lebel等，1998，Plant J.16(2)：223-233)，烟草倍半萜烯合成酶基因的EAS4启动子(Yin等，1997，Plant Physiol.115(2)：437-451)，或是编码3-羟基-3甲基-戊二酸辅酶A还原酶基因的启动子(Nelson等，1994，Plant Mol.Biol.25(3)：401-412)。
可用于本发明嵌合基因的终止子元件中，可提涉及的如编码根瘤出杆菌胭脂碱合成酶的基因的nos终止子元件(Beven等，1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)，或者专利申请EP 0633317中所描述的组蛋白基因的终止子元件。
对于此嵌合基因另外包含一信号肽或一转运肽看来也是重要的，这使得能控制和导向arogenate脱氢酶的产物运送到宿主生物的某一部分，如细胞质或细胞膜，细质质的某特定腔室和植物中的某特定类型的细胞腔室，如叶绿体，或细胞外基质中。
转运肽可以是单体或是双体。双聚体转运肽可任选地用一间隔序列分开，例如，它们以转录方向包括编码位于质体中一种酶的植物基因的转运肽，编码位于质体中一种酶的植物基因的成熟N-端部分的序列，以及编码位于质体中一种酶的植物基因的第二转运肽的序列。例如，这些双体转运肽在专利申请EP 0508909中有所描述。
本发明所用信号肽可提及的包括，当需将本发明的嵌合基因导入植物细胞或植物中时，具体是Cornelissen等所描述的烟草PR-1α基因的信号肽(1987，Nucleic Acid Res.15，6799-6811)，或当需将本发明的嵌合基因导入酵母中时，为Mat α1因子前体的信号肽(Brake等，1985，In：Gething M.-J.(编)；蛋白运输和分泌，第103-108页，冷泉港出版社，纽约)。
本发明还涉及含有本发明嵌合基因的载体。本发明的载体可用于转化宿主生物以及在该宿主生物中表达arogenate脱氢酶。此载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。总体上，此载体的主要特点应是能在宿主生物细胞中持续存活并能自身复制，特别是由于存在复制起点而能表达arogenate脱氢酶。这种载体的选择和将其插入本发明嵌合基因中的技术在Sambrook等所编写的书中(1989，分子克隆：实验操作手册，Nolan C.编，纽约，冷泉港出版社)有广泛的描述，且是本领域技术人员所具有的一般知识的一部分。有利的是，本发明所使用的载体除了含有本发明嵌合基因之外，还包括编码选择性标记物的基因。此选择性标记物使得可能选出受到有效转化的宿主生物，如那些掺入了所述载体的生物。按照本发明的一具体实施方案，受转化的宿主生物是微生物，具体是酵母、细菌、真菌或病毒。根据另一项具体实施方案，此宿主生物是植物或植物细胞。在编码可以使用的选择性标记物的基因中，可提及的有抗生素抗性基因，如潮霉素磷酸转移酶(Gritz等，1983，Gene 25：179-188)，但有对除草剂抗性基因，如对bialaphos耐受的bar基因(White等，NAR 18：1062，1990)，对草甘膦耐受的EPSPS基因(US5,188,642)或还有对异口恶唑耐受的HPPD基因(WO 96/38567)。还可提及的有编码容易鉴定的酶如GUS酶的基因，或编码色素的基因，或编码在转化细胞中调控色素产量的酶的基因。这些选择性标记物基因具体是在专利申请WO 91/02071，WO 95/06128，WO 96/38567和WO 97/04103中有所描述。
本发明还涉及上述含有载体的已转化过的宿主生物。术语“宿主生物”含义是可引入本发明嵌合基因产生arogenate脱氢酶的任何低等或高等单细胞或多细胞生物。它们具体是细菌如大肠杆菌；酵母菌特别是酵母菌属，克鲁维酵母属或毕赤属酵母菌；真菌特别是贡霉菌杆状病毒、或优选植物细胞和植物。
按照本发明，术语“植物细胞”含义是任何从植物中获得的和能形成非分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎组织的细胞，植物的一部分，植物或种子。
按照本发明，术语“植物”的特定含义是任何有能力进行光合作用的已分化的多细胞生物，特别是单子叶植物或双子叶植物。
术语“已转化的宿主生物”含义是其基因组中掺入了本发明嵌合基因并随后在其组织中或其培养基中产生arogenate脱氢酶的宿主生物。本领域技术人员能按照本发明采用许多已知的转化方法中的一种来获得此种宿主生物。
这些方法中的一种包括使待转化的细胞与本发明的载体和聚乙二醇接触(Chang and Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115)；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517).电穿孔是另外一种方法，它包括将待转化的细胞或组织和本发明的载体置于电场中(Andreason and Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigekawa and Dower，1989，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62).另一种方法包括通过显微注射方法把该载体直接注射入宿主细胞或组织中(Gordon and Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136).有利的是，可以使用“生物弹击(biolistic)”方法。包括用其上吸附有本发明载体的粒子轰击细胞或组织(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(24)，9692-9697；Klein等，1992，Biotechnology 10(3)，286-291；美国专利号4,945,050)。优选的是，植物转化将采用农杆菌属的细菌来进行，更为适宜的是，可以通过用tumefaciens农杆菌(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)：315-330)或rhizogenes农杆菌(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16：357-384；Tepfer and Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)感染所述植物的细胞或组织.优选的是，用农杆菌tumefaciens进行植物细胞的转化可以参照Ishida等描述的方案(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)。
本领域的那些技术人员将能选择恰当的作为待转化宿主生物性能的方法。
本发明因此也涉及制备arogenate脱氢酶的方法，包括在合适的培养基中，培养已转化的含有编码以上定义的arogenate脱氢酶基因的宿主生物，通过离心或过滤回收培养基中产生的arogenate脱氢酶，然后使它至少通过一个层析柱以纯化回收获得的酶的步骤。这些抽提和纯化步骤可以得到所有的或部分的arogenate脱氢酶。优选转化的生物是微生物，特别是细菌、酵母、真菌或病毒。
本发明还包括鉴定以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物的方法，其特征如下：
(a)至少准备有两个样品，每一个在溶液中含有等量的arogenate脱氢酶；
(b)其中的一个样品用化合物进行处理；
(c)测定所述的每一个样品中的arogenate脱氢酶活性；
(d)当步骤(c)处理过的样品检测的酶活性明显地比未处理过的样品低时，可认定(b)步骤中所用的化合物是一种除草剂化合物。
(e)在(d)步骤中所鉴定化合物的除草活性可以用所述化合物处理植物加以验证。
按照本方法，arogenate脱氢酶活性可以通过任何能够检测arogenate底物量的减少或能够检测该酶反应产物，即L-酪氨酸或辅因子NADPH积累的方法予以测量。具体讲，arogenate脱氢酶活性的测量可以用实施例4中所描述的方法。此外，本方法步骤(e)中验证的除草剂活性可能是致死性活性，导致处理过的植物死亡，或是严重减缓处理过的植物的生长率。
按照本发明，术语“化合物”含义是任何的化合物或化合物的混合物，包括多肽和蛋白质。按照本发明，术语“化合物的混合物”应理解为至少两种不同的化合物，例如，一种分子的立体异构体或二面异构体，从生物物质(植物、植物组织、细菌培养物、酵母培养物或真菌培养物液、昆虫、动物组织等)的抽提物中得到的天然来源的混合物，或未纯化的或完全的或部分纯化的反应混合物，或组合化学技术得到的产物的混合物。
按照本发明方法的一特定实施方案，所用的arogenate脱氢酶来自植物，优选来自拟南芥。
按照本发明方法的另一特定实施方案，所用的arogenate脱氢酶来自细菌，优选Synechocystis属细菌。
更为适宜的是，本发明方法中所用的arogenate脱氢酶是本发明的酶，具体是SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所代表的那些酶。
本发明还扩展至用上面所提到的方法鉴定的除草剂化合物，特别是以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物，如那些能抑制此酶活性的除草剂。优选除草剂化合物不是通用的酶抑制剂。还优选本发明的除草剂化合物不是已知的有除草活性的化合物。
本发明也涉及含有作为活性物质的本发明除草剂化合物最低有效量的农用化学组合物。
按照本发明，术语“农用除草化学组合物”含义是能够预防性或治疗性应用于正在生长的或必定会生长的种植物区域的组合物，以防止不需要的植物或“种子”在所述种植物区域发育生长，无论它们处于何种发育状态。本发明除草剂化合物的有效量，相应于能够破坏或抑制不需要植物的生长的化合物量。
本发明的农用除草化学组合物包括本发明的除草剂化合物或其农业上可接受的一种盐或此化合物的一种金属或非金属复合物，与农业上可接受的固体或液体运载体或在农业上也可接受的表面活性剂组合而成。特别是，可使用通常的惰性运载体和通常的表面活性剂。这些组合物不仅覆盖了那些用合适的装置，如喷洒或撒粉装置易于施用于待处理的植物或种子的组合物，而且覆盖了可通过商业途径获得的浓缩的组合物，这些组合物在用于农作物之前必须先进行稀释。
本发明的除草剂组合物也包括许多其它成分，如保护性胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、穿透剂、稳定剂或鳌合剂。更为普通的是，这些活性物质可用常用的配制技术与任何固体或液体添加剂相混合。
按照本发明，术语“运载体”表示一种与活性物质相混合后有利施用于植物的天然或合成的、有机或无机物质。此种运载体因此通常是惰性的且必须是农业上可接受的。此种运载体可以是固体(如粘土、天然或合成的硅酸盐、硅土、树脂、蜡、固体肥料)或液体(如水、酒精、特别是丁醇)。
表面活性剂可以是一种乳化剂、分散剂或离子型或非离子型的润湿剂，或这些表面活性剂的混合物。例如，可提及的有聚丙烯酸盐、木质素磺酸盐、苯酚磺酸盐或萘磺酸盐、环氧乙烷与脂肪酒精或与脂肪酸或与脂肪胺的多聚冷凝物，苯酚的替代物(特别是烷基酚或芳香酚)，琥珀磺酸盐酯，牛磺酸衍生物(特别是烷基牛磺酸)，己聚氧乙烯化的乙醇磷脂或苯酚磷脂，脂肪酸酯以及多羟基酯，和上述含有硫酸盐、磺酸盐和磷酸盐功能的化合物的衍生物。当活性物质和/或惰性运载体为非水溶性时和当应用的载体试剂是水时，通常必须有至少一种表面活性剂。
本发明还涉及把参与预苯酸转变成L-酪氨酸的一个代谢步骤的酶作为靶酶的，除草剂化合物有耐受性的转基因植物，其特征在于，它们包含了编码预苯酸脱氢酶的基因并在它们的组织中表达所述的酶。预苯酸脱氢酶是一种催化把预苯酸变为p-羟基苯丙酮酸反应的酶。具有预苯酸脱氢酶活性的酶可以用任何能够测量预苯酸底物量减少，或测量该酶反应产物即p-羟苯基丙酮酸或辅因子NADH或NADPH之一积累的方法加以鉴定。具体说，预苯酸脱氢酶活性的测量可以采用实施例4中所描述的方法。
按照本发明的一具体实施方案，本发明的转基因植物对以arogenate脱氢酶，优选本发明所述的arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物有耐受性。
按照本发明另一具体实施方案，本发明的转基因植物对以预苯酸氨基转移酶为靶酶的除草剂化合物有耐受性。
按照本发明的一特定实施方案，在本发明耐受性植物中所表达的编码预苯酸脱氢酶的基因是一种酵母基因。优选它是编码如Mannhaupt等(1989，Gene85，303-311)所述的编码酿酒酵母预苯酸脱氢酶的基因(accession No.NC001134)为序列身份号SEQ ID NO：14所代表。
按照本发明的另一具体实施方案，在本发明耐受性植物中所表达的编码预苯酸脱氢酶基因是一种细菌基因。优选从杆菌属细菌得到的基因，特别是序列号SEQID NO：16所代表的芽胞杆菌(accession No.M80245)的基因。优选从大肠杆菌属细菌得到的基因，特别是Hudson等(1984，J.Mol.Biol.180(4)，1023-1051)所述的由序列号SEQ ID NO：18代表的大肠杆菌中得到的基因。优选从Erwinia属细胞中，特别是由序列号SEQ ID NO：20代表的E.herbicola菌种(accession No.43343)中得到的基因。
按照本发明的一项具体实施方案，在本发明耐受性植物中所表达的编码预苯酸脱氢酶的基因是一种真菌基因。
本发明的转基因植物是通过用编码预苯酸脱氢酶的基因作遗传转化而获得的。优选此基因是一个嵌合基因，包含功能上相互连接的至少一个在宿主体内有功能的启动子，一个编码预苯酸脱氢酶的多聚核苷酸和在同一宿主生物中有功能的终止子元件。此基因通常被导入一个用上述转化方法把所述基因导入所述植物中的载体。
本发明也涉及产生对以参与预苯酸转变为L-酪氨酸的代谢途径某一步骤的酶为靶酶的除草剂有耐受性的植物的方法，其特征是用编码预苯酸脱氢酶的基因以可以在组织中表达的方式转化所述的植物中。
按照本发明的一具体实施方案，现今的方法可用于能耐受以本发明所述的arogenate脱氢酶为靶酶的除草化合物的植物产品中。
按照本发明的另一具体实施方案，现今的方法可用于能耐受以预苯酸氨基转移酶为靶酶的除草化合物的植物产品中。
因此现今的方法也包括能够得到能耐受以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂的植物的方法，其特征是将编码预苯酸脱氢酶的基因用一种能让此基因在植物组织中表达的方法转化所述的植物。
本发明的转基因植物，除编码预苯酸脱氢酶的基因之外，还可至少包含另一个含有编码感兴趣蛋白的多聚核苷酸的基因.在这些编码感兴趣蛋白质的多聚核苷酸中，可提到的有编码对除草剂有抗性的酶的多聚核苷酸，例如编码对bialaphos有耐受性的bar酶的多聚核苷酸(White等，NAR 18：1062，1990)，编码对草甘膦有耐受性的EPSPS酶的多聚核苷酸(US 5,188,642；WO 97/04103)，或编码对异口恶唑有耐受性的HPPD酶的多聚核苷酸(WO 96/38567)。还可提到的有编码杀虫毒素的多聚核苷酸，例如，编码Bacillus thuringiensis细胞毒素的多聚核苷酸(例如，见国际专利申请WO 98/40490)。其它对疾病有抗性的多聚核苷酸也可包含在这些植物中，例如编码专利申请EP 0531498或美国专利5,66,778中所描述的oxaylate氧化酶，或编码另一种抗细菌或抗真菌多肽的多聚核苷酸，如专利申请WO 97/30082、WO 99/24594、WO 99/02717、WO 99/53053和WO 99/91089中所描述的那些多聚核苷酸。还提到的有编码植物的农艺学特征的多聚核苷酸，特别是编码美国专利5,552,306和5,614,313，和专利申请WO 98/46763和WO98/46764所描述的δ-6去饱和酶的多聚核苷酸，或编码专利申请WO 00/01833和PCT/FR 99/03179中所描述的丝氨酸乙酰转移酶的多聚核苷酸。
以下的实施例可能举例说明了本发明，然而，并没有限制它的范围。
附图说明
图1是两条预苯酸转变成酪氨酸的途径。
图2(a)显示了用分光光度计鉴测所生成的NADH或NADPH的量来测定arogenate脱氢酶活性。
图2(b)显示了TyrA-Atc、TyrA-AT1、TyrA-AT2对Arogenate和NADP形成NADPH的催化比活。
图3显示了三种重组酶的Km NADP、Km arogenate、Ki酪氨酸和天然分子量。
图4显示了TyA-Synechocystis arogenate脱氢酶的Vmax、KmNADP和Kmarogenate。
实施例1：编码拟南芥arogenate脱氢酶基因的鉴定
现今在公共数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中可得到所有的预苯酸脱氢酶和arogenate脱氢酶序列的比较，显示了四个短的同源序列部分。所比较的酶是酵母预苯酸脱氢酶(登录号：Z36065)，枯草芽胞杆菌预苯酸脱氢酶(登录号：M80245)和Synechocystis预苯酸脱氢酶(登录号：D90910)。这些同源部分使得能够鉴定拟南芥基因(登录号：AF096371)起初表明是编码“与特殊的D-异构体2-羟基酸脱氢酶相似”的酶。此基因包括由一个94bp内含子隔开的两个外显子。第一个外显子包括1.08kb长的含有位于第一个ATG密码子下游的推定的叶绿体转运肽序列的开放阅读框。第二个外显子可能有一个长892bp的开放阅读框。从两个外显子推断的蛋白质之间大约有60％的非常强的同源性。如果不考虑位于第一个外显子中的推定的叶绿体转运肽，则同源性可达到70％.此外，这两个预计蛋白质序列中的每一个都有以预苯酸/arogenate脱氢酶为特征的四个同源部分。此基因命名为TyrA(SEQ ID NO：1)。
实施例2：TyrA的转录特性
TyrA基因的转录物大小可用Northern杂交和PCR技术测定。将拟南芥新叶中抽提出来的纯化mRNA与32P放射标记的探针(相应于TyrA两个外显子DNA片段)杂交。此项分析可能鉴定到一1.8-1.9kb的转录物，与预计的含有该两个外显子的mRNA的大小非常接近。此外，尽管没有用PCR扩增完整的cDNA，但获得一1.5kb的PCR片段。此片段包含始于513bp位的5’寡聚核苷酸(P8＝5’-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3’)和始于2053bp位的与3’UTR互补的3’寡聚核苷酸(p7＝5’-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3’)。此片段包括一部分第一编码序列(TyrA-AT1)和完整的第二编码序列(TyrA-AT2)。此cDNA的序列分析证实了内含子的剪接。Northern杂交和PCR的分析结果强烈提示存在一个含有两个编码区域TyrA-AT1(SEQ ID NO：4)和TyrA-AT2(SEQ ID NO：6)的mRNA转录物。
实施例3：含有拟南芥arogenate脱氢酶不同编码序列的构建物的制备
用在第一个ATG密码子处引入NdeI限制性切割位点(下划线所示)的寡聚核苷酸P1(5’-TCTCCATATGATCTTTCAATCTCATTCTCATC-3’)和与第一个外显子3’端互补并与内含子5’端互补且引入一终止子(下划线所示)的寡聚核苷酸P2(5’-CTAACTAACTAACTACATACCTCATCATATCC-3’)，对拟南芥基因组DNA进行PCR扩增，得到第一外显子TyrA-AT1。三个缺少编码转运肽序列的构建物也可用127位第二个ATG密码子处(M43)引入了Nde I限制性切割位点的寡聚核苷酸P3(5’-CCTCTCTTTCCATATGCTCCCTTCTC-3’)，在距第一个ATG密码子(V58M)起的第174位引入起始密码子ATG NdeI限制性切割位点(下划线所示)的寡聚核苷酸P4(5’-CCGCCAGCCACCTCCATATGACCGACACCATCC-3’)，和在距第一个ATG密码子(L75M)起的第222位引入起始密码子ATG和Nde I限制性切割位点(下划线所示)的寡聚核苷酸P5(5’-CGCCACCCCTCATATGCGTATCGCC-3’)产生。将所有对应于第一外显子的OCR片段，它们可能或不能编码转运肽，都克隆入质粒pPCR-Script(Strategene)中。然后无论有没有转运肽序列，将含有此编码序列的Nde I-BamH I DNA片段克隆入质粒pET21a(+)(Novagen)中，导致产生有或没有转运肽序列的质粒pET21-TyrA-AT1(pET21-TyrA-AT1-M1，pET21-TyrA-AT1-M43，pET21-TyrA-AT1-M58和pET21-TyrA-AT1-M75)。
用另两个寡聚核苷酸扩增第二编码序列(TyrA-AT2)。寡聚核苷酸P6(5’-GATGCATCTTTGCATATGATGAGGTCAGAAGATG-3’)在第二个开放阅读框的ATG密码子处(距第一个ATG密码子起的第1081位)引入一个Nde I限制酶切位点(下划线所示)，和寡聚核苷酸P7(5’-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTG AGAG-3’)与3’-UTR的起始处互补，引入BamHI的限制酶切位点(下划线所示)。与第二编码序列相对应的PCR片段用Nde I-BamH I酶消化，然后克隆入质粒pET21a(+)，产生质粒pET21-TyrA-AT2。
完整的编码序列通过拼接第一个外显子失去的5’端与用起始于距第一个ATG密码子513bp处的寡聚核苷酸P8(5’-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3’)和3’寡聚核苷酸P7PCR扩增拟南芥cDNA获得的部分TyrA-AT cDNA(1.5kb)而得到重组。位于离第一个ATG密码子起的812bp处和部分TyrA-AT cDNA的5’末端处的ECoRV限制酶切位点用于重组的。将部分TyrA-AT cDNA克隆进入粒pPCR-Script中。EcoRV-EcoRV片段从质粒pPCR-Script-TyrA-AT中获得然后其隆入用EcoRV酶消化后的质粒pPCR-Script-TyrA-AT1中。此项操作导致获得质粒pPCR-Script-TyrA-Atc。将含有完整编码序列的Nde1-BamH1片段从质粒pPCR-Script-TyrA-ATc中剪切下来，然后克隆入用Nde1和BamH1酶消化后的质粒pET21a(+)(Novagen)中，得到质粒pET21a(+)-TyrA-ATc。然后对于第一外显子用同样的方法得到4个质粒pET21a(+)-TyrA-ATc；一个质粒含有完整编码序列具有编码推定的转运肽的序列，缺少此转运肽序列的三个质粒已在三个不同的位点经过切割(M43，V58和L75，见上)。
对于上述的所有构建物，对cDNA插入片段测序以保证在PCR扩增反应时没有导入不需要的突变。
实施例4：酶活性的测量
在25℃、以340nm的波长，在总体积为200μl的含有50mM Tris-HCl，pH8.6，300μM arogenate和1mM NAD或NADPH的溶液中用分光光度计鉴测所生成的NADH或NADPH的量来测定arogenate脱氢酶活性。
在25℃，以340nm的波长，在总体积为200μl的含有50mM Tris-HCl，pH8.6，300μM预苯酸和1mM的NAD或NADPH的溶液中用分光光度计鉴测所生成的NADH或NADPH的量来测定预苯酸脱氢酶活性。
实施例5：重组arogenate脱氢酶的产生
用实施例3中所得到的每一种pET21-TyrA-AT质粒转化大肠杆菌AT2471细胞，然后37℃在加有100μg/ml的羧苄青霉素的2升Luria-Bertani培养基中培养。当培养液600nm(A600)波长的吸收值达到等于0.6时，在培养液中加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷以诱导重组蛋白合成。然后将细胞28℃下培养16小时，收集，然后40000g离心20min。沉淀重悬于含有1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，1mM苄脒盐酸和5mM氨基己酸的50mM Tris-HCl缓冲液中，pH 7.5，然后用震动细胞搅碎器(Sonics and Marterials，Danbury，CT，USA)进行超声破碎(每3秒100脉冲功率5)。40000g离心20分钟获得粗提取物，上清夜直接用于酶试验。
含有不同构建物pET21-TyrA-Atc、pET21-TyrA-AT1和pET21-TyrA-AT2的大肠杆菌菌株AT 2471的总蛋白抽提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，存在三种重组蛋白，分子量分别是66-68kDa、35kDa和33-34kDa。这些分子量与推测的各自编码序列十分相符(68786Da为TyrA-ATc，34966 Da为TyrA-AT1，34069 Da对应于TyrA-AT2)。对于含有完整编码序列(TyrA-ATc)和第一编码序列(TyrA-AT1)的转化株，重组蛋白仅在编码蛋白M58-TyrA-ATc和M58-TyrA-AT1的构建物中观察到。这三种重组蛋白主要见蛋白包涵体中。然而，大肠杆菌中可溶性蛋白抽提物中存在的少量重组蛋白使特征鉴定其生化特征成为可能。
实施例6：拟南芥arogenate脱氢酶的鉴定和分析生化特征
重组arogenate脱氢酶的生化特征分析采用转化的大肠杆菌菌株的可溶性蛋白抽提物来进行。按照实施例4中所描述的方法测量了Arogenate脱氢酶活性。这三个重组酶中的每一个均显示了严格依赖NADP的arogenate脱氢酶活性。当存在NAD时检测不到arogenate脱氢酶活性，不论采用何种辅因子(NADP或NAD)或不论测试何种蛋白质(TyrA-ATc，TyrA-AT1或TyrA-AT2)都不能检测到预苯酸脱氢酶的活性。此外，1mM浓度的预苯酸不能抑制这三种重组酶的arogenate脱氢酶活性。这些酶中的每一种都具有Michaelis-Menten类型的行为，它们的arogenate和NADP的Km值大致相同(图2和3)。NADP的Michaelis常数分别是TyrA-ATc40μM，TyrA-AT1 60μM和TyrA-AT2 20μM。Arogenate的Michaelis常数分别是TyrA-ATc 70μM，TyrA-AT1 45μM和TyrA-AT2 45μM。此外，像其它植物的arogenate脱氢酶一样(Byng等，1981，Phytochemistry 6，1289-1292；Connellyand Conn，1986，Z.Naturforsch 41c，69-78；Gaines等，1982 Planta 156，233-240)，拟南芥arogenate脱氢酶都对酪氨酸，(此酶的反应产物)非常敏感，但对1mM的苯基丙氨酸以及1mM的p-羟苯基丙酮酸不敏感。酪氨酸的抑制作用与arogenate竞争(TyrA-ATc的Ki值是14μM，TyrA-ATc的Ki值是8μM和TyrA-ATc的Ki值是12μM)，但不与NADP竞争。
实施例7：Synechocystis的arogenate脱氢酶的鉴定和生化特征分析
实施例1中鉴定了编码拟南芥arogenate脱氢酶的基因序列(TyrA)，这使得鉴定菌株Synechocystis(登录号：1652956)中的arogenate脱氢酶成为可能。最初曾把此基因描述为编码“预苯酸脱氢酶”的基因。它从Synechocystis基因组库中分离出并按照实施例5所描述的步骤产生此酶，方式与拟南芥此酶的产生方式相同。所产生的酶的生化特征分析可证明它是一种arogenate脱氢酶而不是预苯酸脱氢酶。Synechocystis arogenate脱氢酶的生化特征分析可用从转化的大肠杆菌菌株纯化的可溶性蛋白抽提物进行。Arogenate脱氢酶的活性测定按照实施例4所描述的方法进行。此酶显示了严格依赖NADP的arogenate脱氢酶活性。当存在NAD时则不能检测到arogenate酶活性，无论用何种辅因子(NADP或NAD)都不能检测到预苯酸脱氢酶活性。此外，1mM浓度的预苯酸不能抑制此酶的arogenate脱氢酶活性。Synechocystis arogenate脱氢酶具有Michaelis-Menten类型的行为(图4)。其米氏常数对NADP是6μM，对arogenate是107μM。
实施例8：其它植物arogenate脱氢酶的鉴定
实施例1中鉴定了编码拟南芥arogenate脱氢酶的基因序列(TyrA)，这使得鉴定拟南芥中的其它arogenate脱氢酶成为可能。此新基因(登录号：AC0342561；SEQ ID NO：8)起初的注释是“含有与Picea glauca的胚胎丰富蛋白(EMB20)相似的基因”。它也有一个推定的叶绿体转运肽序列，但没有重复区域。
TyrA基因序列也使得可能鉴定公众EST(表达序列标签)数据库中的另外两个编码arogenate脱氢酶的cDNA序列。这些cDNA中的一个不完整，对应于西红柿cDNA(TC41067；SEQ ID NO：22).此cDNA的不完整特性使得不能确定它是否是TyrA的复制本，因为它的3’末端终止在对应于Tyr-AT1的D356密码子之后。第二个cDNA对应于Picea glauca的完整cDNA(登录号：L47749；SEQ ID NO：10)且没有重复区域。此Picea glauca的注释是一种“胚胎丰富蛋白”。
序列表
<110>阿方蒂农科股份有限公司(Aventis CropScience SA)
<120>除草剂的新靶标和对所述的除草剂有抗性的转基因植物
<130>033146F1
<150>FR 00/15723
<151>2000-12-05
<160>30
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2082
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>转运肽
<222>(1)..(174)
<220>
<221>内含子
<222>(1089)..(1181)
<400>1
atgatctttc aatctcattc tcatcatctt cttctctatc aatcctcatc ttcctcctcc 60
ttcttcttcc tcccaaagct catcaccaaa cctcctctct ccctctcatt tacctctctt 120
tcctcaatgc tcccttctct ctctctctcc accgccaacc gccacctctc cgtcaccgac 180
accatccctc ttcccaactc caactccaac gccacccctc ctctccgtat cgccatcatc 240
ggattcggaa actacggcca attccttgcc gaaaccctaa tttctcaagg ccacattctc 300
ttcgctcact cccgatccga tcactcctcc gccgctcgcc gtctcggtgt ctcatacttc 360
accgatcttc acgatctctg cgaacgtcat cctgacgtag tccttctctg tacttcaatc 420
ctctccatag agaatattct caaaacgttg ccgtttcaga gactccgtcg caacactctc 480
ttcgttgatg ttctctccgt taaagagttt gctaaaactc ttctccttca atacttacct 540
gaagatttcg atattctttg tacacatcca atgtttggtc ctcagagtgt gagttcaaat 600
catggctgga gaggattaag atttgtgtat gataaagtta ggattgggga agagagattg 660
agagtctcaa ggtgtgagag ttttcttgag atttttgtta gagaaggatg tgagatggtg 720
gagatgagtg ttactgatca tgataagttt gctgctgaat cacagtttat aactcatact 780
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acgtcaatcc tttcgactga aaaagttctc gagtcactac cgtttcagag actgaagaga 1500
agcacacttt ttgtggatgt actctcagta aaagagttcc cgaggaattt atttcttcaa 1560
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gtggagatgt cgtgtgctga acatgattgg catgctgctg gatcacagtt tatcacacac 1800
acagtgggaa ggcttctgga gaagctgagc ttggaatcta ctcctataga taccaaaggt 1860
tatgagacat tgctaaaact ggtggagaat actgctggtg acagctttga tctgtactat 1920
ggactatttt tatacaatcc taatgcaatg gaacagcttg agaggtttca tgtggctttt 1980
gaatcattga agacacagct ctttggacga ctacattctc aacattctca tgagctagct 2040
aaatcatctt ccccaaagac aactaagcta ttaactagct aa 2082
<210>2
<211>1981
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1980)
<220>
<221>转运肽
<222>(1)..(174)
<400>2
atg atc ttt caa tct cat tct cat cat ctt ctt ctc tat caa tcc tca 48
Met Ile Phe Gln Ser His Ser His His Leu Leu Leu Tyr Gln Ser Ser
1 5 10 15
tct tcc tcc tcc ttc ttc ttc ctc cca aag ctc atc acc aaa cct cct 96
Ser Ser Ser Ser Phe Phe Phe Leu Pro Lys Leu Ile Thr Lys Pro Pro
20 25 30
ctc tcc ctc tca ttt acc tct ctt tcc tca atg ctc cct tct ctc tct 144
Leu Ser Leu Ser Phe Thr Ser Leu Ser Ser Met Leu Pro Ser Leu Ser
35 40 45
ctc tcc acc gcc aac cgc cac ctc tcc gtc acc gac acc atc cct ctt 192
Leu Ser Thr Ala Asn Arg His Leu Ser Val Thr Asp Thr Ile Pro Leu
50 55 60
ccc aac tcc aac tcc aac gcc acc cct cct ctc cgt atc gcc atc atc 240
Pro Asn Ser Asn Ser Asn Ala Thr Pro Pro Leu Arg Ile Ala Ile Ile
65 70 75 80
gga ttc gga aac tac ggc caa ttc ctt gcc gaa acc cta att tct caa 288
Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Gln Phe Leu Ala Glu Thr Leu Ile Ser Gln
85 90 95
ggc cac att ctc ttc gct cac tcc cga tcc gat cac tcc tcc gcc gct 336
Gly His Ile Leu Phe Ala His Ser Arg Ser Asp His Ser Ser Ala Ala
100 105 110
cgc cgt ctc ggt gtc tca tac ttc acc gat ctt cac gat ctc tgc gaa 384
Arg Arg Leu Gly Val Ser Tyr Phe Thr Asp Leu His Asp Leu Cys Glu
115 120 125
cgt cat cct gac gta gtc ctt ctc tgt act tca atc ctc tcc ata gag 432
Arg His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys Thr Ser Ile Leu Ser Ile Glu
130 135 140
aat att ctc aaa acg ttg ccg ttt cag aga ctc cgt cgc aac act ctc 480
Asn Ile Leu Lys Thr Leu Pro Phe Gln Arg Leu Arg Arg Asn Thr Leu
145 150 155 160
ttc gtt gat gtt ctc tcc gtt aaa gag ttt gct aaa act ctt ctc ctt 528
Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu Phe Ala Lys Thr Leu Leu Leu
165 170 175
caa tac tta cct gaa gat ttc gat att ctt tgt aca cat cca atg ttt 576
Gln Tyr Leu Pro Glu Asp Phe Asp Ile Leu Cys Thr His Pro Met Phe
180 185 190
ggt cct cag agt gtg agt tca aat cat ggc tgg aga gga tta aga ttt 624
Gly Pro Gln Ser Val Ser Ser Asn His Gly Trp Arg Gly Leu Arg Phe
195 200 205
gtg tat gat aaa gtt agg att ggg gaa gag aga ttg aga gtc tca agg 672
Val Tyr Asp Lys Val Arg Ile Gly Glu Glu Arg Leu Arg Val Ser Arg
210 215 220
tgt gag agt ttt ctt gag att ttt gtt aga gaa gga tgt gag atg gtg 720
Cys Glu Ser Phe Leu Glu Ile Phe Val Arg Glu Gly Cys Glu Met Val
225 230 235 240
gag atg agt gtt act gat cat gat aag ttt gct gct gaa tca cag ttt 768
Glu Met Ser Val Thr Asp His Asp Lys Phe Ala Ala Glu Ser Gln Phe
245 250 255
ata act cat act ctt ggt agg ctt ttg ggg atg ttg aag ttg ata tcg 816
Ile Thr His Thr Leu Gly Arg Leu Leu Gly Met Leu Lys Leu Ile Ser
260 265 270
acg ccg att aat acg aaa ggg tac gag gcg ttg ctt gat tta gct gag 864
Thr Pro Ile Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Ala Leu Leu Asp Leu Ala Glu
275 280 285
aat att tgt ggg gat agt ttt gat ttg tat tat ggg ttg ttt gtg tat 912
Asn Ile Cys Gly Asp Ser Phe Asp Leu Tyr Tyr Gly Leu Phe Val Tyr
290 295 300
aat aac aac tct ttg gag gtg tta gag agg att gat ttg gct ttc gag 960
Asn Asn Asn Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Ile Asp Leu Ala Phe Glu
305 310 315 320
gct ttg cgt aag gag ctt ttt agt cgg ctt cac ggt gtt gtg agg aag 1008
Ala Leu Arg Lys Glu Leu Phe Ser Arg Leu His Gly Val Val Arg Lys
325 330 335
cag tct ttt gaa ggt gaa gca aag aaa gtt cat gtt ttt cca aat tgt 1056
Gln Ser Phe Glu Gly Glu Ala Lys Lys Val His Val Phe Pro Asn Cys
340 345 350
ggt gaa aat gat gct tct ttg gat atg atg agg tca gaa gat gtt gtt 1104
Gly Glu Asn Asp Ala Ser Leu Asp Met Met Arg Ser Glu Asp Val Val
355 360 365
gtg aag tat gaa tat aac tcc cag gtg tct ggt agt gtt aat gac ggt 1152
Val Lys Tyr Glu Tyr Asn Ser Gln Val Ser Gly Ser Val Asn Asp Gly
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Ser Arg Leu Lys Ile Gly Ile Val Gly Phe Gly Asn Phe Gly Gln Phe
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cta ggt aaa acc atg gtc aag cag ggt cac act gtg tta gct tat tcc 1248
Leu Gly Lys Thr Met Val Lys Gln Gly His Thr Val Leu Ala Tyr Ser
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aga agt gac tac act gat gaa gca gca aag ctc ggt gtt tcg tat ttt 1296
Arg Ser Asp Tyr Thr Asp Glu Ala Ala Lys Leu Gly Val Ser Tyr Phe
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tca gat ctt gat gat cta ttt gaa gag cat cct gaa gtt att att ctc 1344
Ser Asp Leu Asp Asp Leu Phe Glu Glu His Pro Glu Val Ile Ile Leu
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Gln Arg Leu Lys Arg Ser Thr Leu Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys
465 470 475 480
gag ttc ccg agg aat tta ttt ctt caa act ctc cca caa gat ttt gat 1488
Glu Phe Pro Arg Asn Leu Phe Leu Gln Thr Leu Pro Gln Asp Phe Asp
485 490 495
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gat aga aga aaa tcg agg tgt aac agt ttt ctt gat att ttt gcc cgt 1632
Asp Arg Arg Lys Ser Arg Cys Asn Ser Phe Leu Asp Ile Phe Ala Arg
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Leu Leu Lys Leu Val Glu Asn Thr Ala Gly Asp Ser Phe Asp Leu Tyr
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515 520 525
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ggg atg ttg aag ttg ata tcg acg ccg att aat acg aaa ggg tac gag 672
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100 105 110
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Gln His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys Thr Ser Ile Leu Ser Thr Glu
115 120 125
tca gtc ctc aga tca ttc cct ttc caa cgt ctc cgt cgt agc aca ctc 432
Ser Val Leu Arg Ser Phe Pro Phe Gln Arg Leu Arg Arg Ser Thr Leu
130 135 140
ttc gtc gat gtt ctc tcc gtt aag gaa ttc cca aaa gcc ctc ttc att 480
Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu Phe Pro Lys Ala Leu Phe Ile
145 150 155 160
aaa tac ctt cct aag gag ttt gac att ctc tgt act cat cca atg ttt 528
Lys Tyr Leu Pro Lys Glu Phe Asp Ile Leu Cys Thr His Pro Met Phe
165 170 175
gga cct gag agt ggt aag cat tct tgg tct ggc ttg ccc ttt gtc tac 576
Gly Pro Glu Ser Gly Lys His Ser Trp Ser Gly Leu Pro Phe Val Tyr
180 185 190
gat aag gtg aga atc gga gac gca gct tca aga caa gag agg tgt gag 624
Asp Lys Val Arg Ile Gly Asp Ala Ala Ser Arg Gln Glu Arg Cys Glu
195 200 205
aag ttt cta aga att ttt gag aat gaa ggt tgc aag atg gtt gaa atg 672
Lys Phe Leu Arg Ile Phe Glu Asn Glu Gly Cys Lys Met Val Glu Met
210 215 220
agc tgt gag aag cat gat tat tac gca gct gga tcg caa ttc gtg acg 720
Ser Cys Glu Lys His Asp Tyr Tyr Ala Ala Gly Ser Gln Phe Val Thr
225 230 235 240
cat act atg gga agg gtt ttg gag aaa tat gga gtt gag tct tcg ccg 768
His Thr Met Gly Arg Val Leu Glu Lys Tyr Gly Val Glu Ser Ser Pro
245 250 255
att aac acc aaa ggt tat gag acg ttg ttg gat ttg gtg gag aac aca 816
Ile Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asp Leu Val Glu Asn Thr
260 265 270
tcg agt gat agc ttt gag ctt ttc tac ggt ttg ttt atg tat aat ccg 864
Ser Ser Asp Ser Phe Glu Leu Phe Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Pro
275 280 285
aat gct ctt gaa cag ttg gag aga ttg gat atg gct ttt gag tct gtt 912
Asn Ala Leu Glu Gln Leu Glu Arg Leu Asp Met Ala Phe Glu Ser Val
290 295 300
aag aag gag ctg ttt ggg aga tta cat cag caa tac agg aag caa atg 960
Lys Lys Glu Leu Phe Gly Arg Leu His Gln Gln Tyr Arg Lys Gln Met
305 310 315 320
ttt ggt ggg gag gtt caa tcg ccc aag aaa act gag cag aaa ttg ctc 1008
Phe Gly Gly Glu Val Gln Ser Pro Lys Lys Thr Glu Gln Lys Leu Leu
325 330 335
aat gat ggt ggt gtt gtt cct atg aat gat ata tca tca tca tca tca 1056
Asn Asp Gly Gly Val Val Pro Met Asn Asp Ile Ser Ser Ser Ser Ser
340 345 350
tca tca tca tca tca tct taa 1077
Ser Ser Ser Ser Ser Ser
355
<210>9
<211>358
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>9
Met Leu Leu His Phe Ser Pro Ala Lys Pro Leu Ile Ser Pro Pro Asn
1 5 10 15
Leu Arg Arg Asn Ser Pro Thr Phe Leu Ile Ser Pro Pro Arg Ser Leu
20 25 30
Arg Ile Arg Ala Ile Asp Ala Ala Gln Ile Phe Asp Tyr Glu Thr Gln
35 40 45
Leu Lys Ser Glu Tyr Arg Lys Ser Ser Ala Leu Lys Ile Ala Val Leu
50 55 60
Gly Phe Gly Asn Phe Gly Gln Phe Leu Ser Lys Thr Leu Ile Arg His
65 70 75 80
Gly His Asp Leu Ile Thr His Ser Arg Ser Asp Tyr Ser Asp Ala Ala
85 90 95
Asn Ser Ile Gly Ala Arg Phe Phe Asp Asn Pro His Asp Leu Cys Glu
100 105 110
Gln His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys Thr Ser Ile Leu Ser Thr Glu
115 120 125
Ser Val Leu Arg Ser Phe Pro Phe Gln Arg Leu Arg Arg Ser Thr Leu
130 135 140
Phe Val Asp Val Leu Ser ValLys Glu Phe Pro Lys Ala Leu Phe Ile
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Pro Lys Glu Phe Asp Ile Leu Cys Thr His Pro Met Phe
165 170 175
Gly Pro Glu Ser Gly Lys His Ser Trp Ser Gly Leu Pro Phe Val Tyr
180 185 190
Asp Lys Val Arg Ile Gly Asp Ala Ala Ser Arg Gln Glu Arg Cys Glu
195 200 205
Lys Phe Leu Arg Ile Phe Glu Asn Glu Gly Cys Lys Met Val Glu Met
210 215 220
Ser Cys Glu Lys His Asp Tyr Tyr Ala Ala Gly Ser Gln Phe Val Thr
225 230 235 240
His Thr Met Gly Arg Val Leu Glu Lys Tyr Gly Val Glu Ser Ser Pro
245 250 255
Ile Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asp Leu Val Glu Asn Thr
260 265 270
Ser Ser Asp Ser Phe Glu Leu Phe Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Pro
275 280 285
Asn Ala Leu Glu Gln Leu Glu Arg Leu Asp Met Ala Phe Glu Ser Val
290 295 300
Lys Lys Glu Leu Phe Gly Arg Leu His Gln Gln Tyr Arg Lys Gln Met
305 310 315 320
Phe Gly Gly Glu Val Gln Ser Pro Lys Lys Thr Glu Gln Lys Leu Leu
325330335
Asn Asp Gly Gly Val Val Pro Met Asn Asp Ile Ser Ser Ser Ser Ser
340 345 350
Ser Ser Ser Ser Ser Ser
355
<210>10
<211>1476
<212>DNA
<213>灰绿云杉(Picea glauca)
<220>
<221>CDS
<222>(96)..(980)
<400>10
accagtttta gatattcatc aaggtcttgc ctgctttgtt ttaggcaatt ccctccagta 60
ccaagccctc ttctcagaaa actccctccg cggca atg cct ctt cat ttc tca 113
Met Pro Leu His Phe Ser
1 5
tgg aat cca aca gaa gac cct cac aca gta cgc cct act gag gct ctc 161
Trp Asn Pro Thr Glu Asp Pro His Thr Val Arg Pro Thr Glu Ala Leu
10 15 20
agg aat cag agc aat gga cgt cgc ggg gcc cct cga tta aga aga ata 209
Arg Asn Gln Ser Asn Gly Arg Arg Gly Ala Pro Arg Leu Arg Arg Ile
25 30 35
aaa tcc att aaa tat tgg cat cgt agg gtt tgg aaa cta cca cca att 257
Lys Ser Ile Lys Tyr Trp His Arg Arg Val Trp Lys Leu Pro Pro Ile
40 45 50
tct ggt gaa aac cat ggt gaa gcc ggg cca ccc ggt gct cgc cca ttc 305
Ser Gly Glu Asn His Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg Pro Phe
55 60 65 70
cag gac gga cta tac gga ggc cac tgc gag atc ggg gtt caa ttc ttc 353
Gln Asp Gly Leu Tyr Gly Gly His Cys Glu Ile Gly Val Gln Phe Phe
75 80 85
aga gac gcg gac gat ttc tgc gaa gag cat cca gag atc ata ctg atg 401
Arg Asp Ala Asp Asp Phe Cys Glu Glu His Pro Glu Ile Ile Leu Met
90 95 100
tgc gca tcc atc act ttg gtg gga gga cgt gct gaa gtc tct gcc aac 449
Cys Ala Ser Ile Thr Leu Val Gly Gly Arg Ala Glu Val Ser Ala Asn
105 110 115
aca gcg cct gaa gag gag tac gct ttt cgc aga cgt cct gtc tgt gaa 497
Thr Ala Pro Glu Glu Glu Tyr Ala Phe Arg Arg Arg Pro Val Cys Glu
120 125 130
aga gtt tcc gca ccg gtt gtt cct gca ggt ttt gtc gcc cga gtc gat 545
Arg Val Ser Ala Pro Val Val Pro Ala Gly Phe Val Ala Arg Val Asp
135 140 145 150
gtg ctg tgc act cat ccc atg ttt ggt cca gag agc agc aag gac gat 593
Val Leu Cys Thr His Pro Met Phe Gly Pro Glu Ser Ser Lys Asp Asp
155 160 165
ttg ggc gac ctc cct ttc gtt tac gat aag gtt agg gtt tct aac gaa 641
Leu Gly Asp Leu Pro Phe Val Tyr Asp Lys Val Arg Val Ser Asn Glu
170 1751 80
ggt ttg aga gcc aag cac tgc gag cgt ttt ctc aac ata ttt tcg tgc 689
Gly Leu Arg Ala Lys His Cys Glu Arg Phe Leu Asn Ile Phe Ser Cys
185 190 195
gag ggc tgc cgg atg gtc gag atg tcg tgt gca gaa cat gat cgc tat 737
Glu Gly Cys Arg Met Val Glu Met Ser Cys Ala Glu His Asp Arg Tyr
200 205 210
gtc gcg gag agc caa ttc att acc cac acc gtt ggg agg atg ttg ggg 785
Val Ala Glu Ser Gln Phe Ile Thr His Thr Val Gly Arg Met Leu Gly
215 220 225 230
agg ctg ggc ttg gag tcc act ccg att gct acc aag ggt tat gag aaa 833
Arg Leu Gly Leu Glu Ser Thr Pro Ile Ala Thr Lys Gly Tyr Glu Lys
235 240 245
tta ctg gaa gtg gcc tgg aat att gcc ggg gat agt ttt gat att tat 881
Leu Leu Glu Val Ala Trp Asn Ile Ala Gly Asp Ser Phe Asp Ile Tyr
250 255 260
tat gga ctc ttc atg tat aat gtc aat tcg att gaa caa atc gag agg 929
Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Val Asn Ser Ile Glu Gln Ile Glu Arg
265 270 275
tta gat atg gcg ttc aat tca ctc aag aac gag gtt tcg ggt tca aat 977
Leu Asp Met Ala Phe Asn Ser Leu Lys Asn Glu Val Ser Gly Ser Asn
280 285 290
taa gaattttaaa ggtttcgatt tgcttgaagc ggcttgtgta tgaagtacca 1030
295
tttgtagaca ataatgaatt cgagaatgtt gttcaagatg aaatggttaa gaaggatggg 1090
tctcgtgtga gaagaaaacc aagataaatg gttgcgtagt ggtccagaaa tctgcattca 1150
ttactgaatg attctacatg gagtgagtaa gcattgattg aattccaaga cgagtgaaag 1210
agtttgatga atggaatatg tctgtattcc aaatttaata aatgaaaaat attgcaggtt 1270
gctatatgca atggttcttc tatatccccg aaggacaaat gacagatata agttctctgg 1330
cacttgtcag aaaacttcta tgtttgtagc cataaaacat tttccgaaag tggaactttt 1390
ctagaactta taggggaaat aatccctatg caaacactgt atgagtccca ttgacctttc 1450
tttctcattt catttcattt ttgtct 1476
<210>11
<211>294
<212>PRT
<213>灰绿云杉(Picea glauca)
<400>11
Met Pro Leu His Phe Ser Trp Asn Pro Thr Glu Asp Pro His Thr Val
1 5 10 15
Arg Pro Thr Glu Ala Leu Arg Asn Gln Ser Asn Gly Arg Arg Gly Ala
20 25 30
Pro Arg Leu Arg Arg Ile Lys Ser Ile Lys Tyr Trp His Arg Arg Val
35 40 45
Trp Lys Leu Pro Pro Ile Ser Gly Glu Asn His Gly Glu Ala Gly Pro
50 55 60
Pro Gly Ala Arg Pro Phe Gln Asp Gly Leu Tyr Gly Gly His Cys Glu
65 70 75 80
Ile Gly Val Gln Phe Phe Arg Asp Ala Asp Asp Phe Cys Glu Glu His
85 90 95
Pro Glu Ile Ile Leu Met Cys Ala Ser Ile Thr Leu Val Gly Gly Arg
100 105 110
Ala Glu Val Ser Ala Asn Thr Ala Pro Glu Glu Glu Tyr Ala Phe Arg
115 120 125
Arg Arg Pro Val Cys Glu Arg Val Ser Ala Pro Val Val Pro Ala Gly
130 135 140
Phe Val Ala Arg Val Asp Val Leu Cys Thr His Pro Met Phe Gly Pro
145 150 155 160
Glu Ser Ser Lys Asp Asp Leu Gly Asp Leu Pro Phe Val Tyr Asp Lys
165 170 175
Val Arg Val Ser Asn Glu Gly Leu Arg Ala Lys His Cys Glu Arg Phe
180 185 190
Leu Asn Ile Phe Ser Cys Glu Gly Cys Arg Met Val Glu Met Ser Cys
195 200 205
Ala Glu His Asp Arg Tyr Val Ala Glu Ser Gln Phe Ile Thr His Thr
210 215 220
Val Gly Arg Met Leu Gly Arg Leu Gly Leu Glu Ser Thr Pro Ile Ala
225 230 235 240
Thr Lys Gly Tyr Glu Lys Leu Leu Glu Val Ala Trp Asn Ile Ala Gly
245 250 255
Asp Ser Phe Asp Ile Tyr Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Val Asn Ser
260 265 270
Ile Glu Gln Ile Glu Arg Leu Asp Met Ala Phe Asn Ser Leu Lys Asn
275 280 285
Glu Val Ser Gly Ser Asn
290
<210>12
<211>840
<212>DNA
<213>集胞藻属(Synechocystis sp.)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(840)
<400>12
atg aaa att ggt gtt gtt ggt ttg ggt tta att ggg gct tcc ttg gcg 48
Met Lys Ile Gly Val Val Gly Leu Gly Leu Ile Gly Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
gga gac ttg cgt cgt cgg ggc cat tat ttg att ggg gtt tct cgg caa 96
Gly Asp Leu Arg Arg Arg Gly His Tyr Leu Ile Gly Val Ser Arg Gln
20 25 30
caa agc acc tgt gaa aaa gca gtg gaa aga caa ttg gtg gat gaa gcg 144
Gln Ser Thr Cys Glu Lys Ala Val Glu Arg Gln Leu Val Asp Glu Ala
35 40 45
ggt caa gat tta tct ctt ctc caa aca gca aaa ata att ttt ctt tgt 192
Gly Gln Asp Leu Ser Leu Leu Gln Thr Ala Lys Ile Ile Phe Leu Cys
50 55 60
act cct ata caa tta att ttg cct acc cta gag aag ctt att ccc cat 240
Thr Pro Ile Gln Leu Ile Leu Pro Thr Leu Glu Lys Leu Ile Pro His
65 70 75 80
cta tcg ccc aca gcc att gtc act gat gtg gcc tct gta aaa acg gcg 288
Leu Ser Pro Thr Ala Ile Val Thr Asp Val Ala Ser Val Lys Thr Ala
85 90 95
atc gcc gag ccg gcc agt caa ctt tgg tct ggg ttc att ggt ggt cac 336
Ile Ala Glu Pro Ala Ser Gln Leu Trp Ser Gly Phe Ile Gly Gly His
100 105 110
ccc atg gcc ggc aca gcg gcc cag ggc atc gac ggg gcg gaa gaa aat 384
Pro Met Ala Gly Thr Ala Ala Gln Gly Ile Asp Gly Ala Glu Glu Asn
115120125
tta ttt gtc aac gct ccc tat gtg ctc act ccc acc gaa tat act gac 432
Leu Phe Val Asn Ala Pro Tyr Val Leu Thr Pro Thr Glu Tyr Thr Asp
130 135 140
cca gag caa ttg gct tgt tta cgt tca gtg ttg gaa ccc ctg ggg gta 480
Pro Glu Gln Leu Ala Cys Leu Arg Ser Val Leu Glu Pro Leu Gly Val
145 150 155 160
aaa att tac ctc tgc act ccc gca gac cat gac caa gca gta gcc tgg 528
Lys Ile Tyr Leu Cys Thr Pro Ala Asp His Asp Gln Ala Val Ala Trp
165 170 175
att tcc cat tta cct gta atg gtg agt gct gct tta atc caa gcc tgt 576
Ile Ser His Leu Pro Val Met Val Ser Ala Ala Leu Ile Gln Ala Cys
180 185 190
gcc ggt gaa aaa gat ggg gat att ctc aaa cta gcc caa aat ttg gcc 624
Ala Gly Glu Lys Asp Gly Asp Ile Leu Lys Leu Ala Gln Asn Leu Ala
195200205
agt tcg ggt ttt cgg gat acc agt cgg gtg gga ggc ggc aac ccg gag 672
Ser Ser Gly Phe Arg Asp Thr Ser Arg Val Gly Gly Gly Asn Pro Glu
210 215 220
ttg ggc acc atg atg gcc acc tat aac caa cgg gct ttg cta aaa agt 720
Leu Gly Thr Met Met Ala Thr Tyr Asn Gln Arg Ala Leu Leu Lys Ser
225 230 235 240
ttg caa gac tat cgt cag cac ctg gat cag cta att acc cta att agt 768
Leu Gln Asp Tyr Arg Gln His Leu Asp Gln Leu Ile Thr Leu Ile Ser
245 250 255
aac caa caa tgg cct gaa ctc cat cgt ctt tta caa caa acc aac ggc 816
Asn Gln Gln Trp Pro Glu Leu His Arg Leu Leu Gln Gln Thr Asn Gly
260 265 270
gat cgg gac aag tat gtt gaa taa 840
Asp Arg Asp Lys Tyr Val Glu
275280
<210>13
<211>279
<212>PRT
<213>集胞藻属(Synechocystis sp.)
<400>13
Met Lys Ile Gly Val Val Gly Leu Gly Leu Ile Gly Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Leu Arg Arg Arg Gly His Tyr Leu Ile Gly Val Ser Arg Gln
20 25 30
Gln Ser Thr Cys Glu Lys Ala Val Glu Arg Gln Leu Val Asp Glu Ala
35 40 45
Gly Gln Asp Leu Ser Leu Leu Gln Thr Ala Lys Ile Ile Phe Leu Cys
50 55 60
Thr Pro Ile Gln Leu Ile Leu Pro Thr Leu Glu Lys Leu Ile Pro His
65 70 75 80
Leu Ser Pro Thr Ala Ile Val Thr Asp Val Ala Ser Val Lys Thr Ala
85 90 95
Ile Ala Glu Pro Ala Ser Gln Leu Trp Ser Gly Phe Ile Gly Gly His
100 105 110
Pro Met Ala Gly Thr Ala Ala Gln Gly Ile Asp Gly Ala Glu Glu Asn
115 120 125
Leu Phe Val Asn Ala Pro Tyr Val Leu Thr Pro Thr Glu Tyr Thr Asp
130 135 140
Pro Glu Gln Leu Ala Cys Leu Arg Ser Val Leu Glu Pro Leu Gly Val
145 150 155 160
Lys Ile Tyr Leu Cys Thr Pro Ala Asp His Asp Gln Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ile Ser His Leu Pro Val Met Val Ser Ala Ala Leu Ile Gln Ala Cys
180 185 190
Ala Gly Glu Lys Asp Gly Asp Ile Leu Lys Leu Ala Gln Asn Leu Ala
195 200 205
Ser Ser Gly Phe Arg Asp Thr Ser Arg Val Gly Gly Gly Asn Pro Glu
210 215 220
Leu Gly Thr Met Met Ala Thr Tyr Asn Gln Arg Ala Leu Leu Lys Ser
225 230 235 240
Leu Gln Asp Tyr Arg Gln His Leu Asp Gln Leu Ile Thr Leu Ile Ser
245 250 255
Asn Gln Gln Trp Pro Glu Leu His Arg Leu Leu Gln Gln Thr Asn Gly
260 265 270
Asp Arg Asp Lys Tyr Val Glu
275
<210>14
<211>1359
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1359)
<400>14
atg gta tca gag gat aag att gag caa tgg aaa gcc aca aaa gtc att 48
Met Val Ser Glu Asp Lys Ile Glu Gln Trp Lys Ala Thr Lys Val Ile
1 5 10 15
ggt ata att ggt ctg ggt gat atg ggc cta tta tac gct aat aaa ttt 96
Gly Ile Ile Gly Leu Gly Asp Met Gly Leu Leu Tyr Ala Asn Lys Phe
20 25 30
aca gat gct gga tgg ggt gtt ata tgt tgt gat agg gaa gaa tat tat 144
Thr Asp Ala Gly Trp Gly Val Ile Cys Cys Asp Arg Glu Glu Tyr Tyr
35 40 45
gat gaa ctg aaa gaa aaa tat gcc tca gct aaa ttc gaa ctg gtg aaa 192
Asp Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Ala Ser Ala Lys Phe Glu Leu Val Lys
50 55 60
aat ggt cat ttg gta tcc agg caa agc gac tat att atc tat agt gtt 240
Asn Gly His Leu Val Ser Arg Gln Ser Asp Tyr Ile Ile Tyr Ser Val
65 70 75 80
gaa gca tcc aat att agt aag atc gtc gca acg tat gga cca tct tct 288
Glu Ala Ser Asn Ile Ser Lys Ile Val Ala Thr Tyr Gly Pro Ser Ser
85 90 95
aag gtt gga aca att gtt ggg ggt caa acg agt tgt aag ctg ccg gaa 336
Lys Val Gly Thr Ile Val Gly Gly Gln Thr Ser Cys Lys Leu Pro Glu
100 105 110
atc gag gct ttc gaa aag tat tta ccc aag gac tgc gac atc att acc 384
Ile Glu Ala Phe Glu Lys Tyr Leu Pro Lys Asp Cys Asp Ile Ile Thr
115 120 125
gtg cat tcc ctt cat ggg cct aaa gtt aat act gaa ggc caa cca cta 432
Val His Ser Leu His Gly Pro Lys Val Asn Thr Glu Gly Gln Pro Leu
130 135 140
gtt att atc aat cac aga tca cag tac cca gaa tct ttt gag ttc gtt 480
Val Ile Ile Asn His Arg Ser Gln Tyr Pro Glu Ser Phe Glu Phe Val
145 150 155 160
aat tct gtt atg gca tgt ttg aaa agt aag caa gtt tat ttg aca tat 528
Asn Ser Val Met Ala Cys Leu Lys Ser Lys Gln Val Tyr Leu Thr Tyr
165 170 175
gaa gag cat gac aag att acc gct gat aca caa gct gtg aca cat gct 576
Glu Glu His Asp Lys Ile Thr Ala Asp Thr Gln Ala Val Thr His Ala
180 185 190
gct ttc tta agt atg gga tct gcg tgg gca aag ata aag att tat cct 624
Ala Phe Leu Ser Met Gly Ser Ala Trp Ala Lys Ile Lys Ile Tyr Pro
195 200 205
tgg act ctg ggt gta aac aaa tgg tac ggt ggc cta gaa aat gtg aaa 672
Trp Thr Leu Gly Val Asn Lys Trp Tyr Gly Gly Leu Glu Asn Val Lys
210 215 220
gtt aat ata tca cta aga atc tat tcg aac aag tgg cat gtt tac gca 720
Val Asn Ile Ser Leu Arg Ile Tyr Ser Asn Lys Trp His Val Tyr Ala
225 230 235 240
gga tta gcc ata aca aac cca agt gca cat cag caa att ctt caa tat 768
Gly Leu Ala Ile Thr Asn Pro Ser Ala His Gln Gln Ile Leu Gln Tyr
245 250 255
gca acc agt gca aca gaa cta ttt agt tta atg ata gat aac aaa gaa 816
Ala Thr Ser Ala Thr Glu Leu Phe Ser Leu Met Ile Asp Asn Lys Glu
260 265 270
caa gaa ctt act gat aga cta tta aaa gct aag caa ttt gta ttt gga 864
Gln Glu Leu Thr Asp Arg Leu Leu Lys Ala Lys Gln Phe Val Phe Gly
275 280 285
aag cat act ggt ctc tta cta ttg gat gac acg att tta gag aaa tat 912
Lys His Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asp Asp Thr Ile Leu Glu Lys Tyr
290 295 300
tcg cta tca aaa agc agc att ggt aac agc aac aat tgc aag cca gtg 960
Ser Leu Ser Lys Ser Ser Ile Gly Asn Ser Asn Asn Cys Lys Pro Val
305 310 315 320
ccg aat tca cat tta tca ttg ttg gcg att gtt gat tcg tgg ttt caa 1008
Pro Asn Ser His Leu Ser Leu Leu Ala Ile Val Asp Ser Trp Phe Gln
325 330 335
ctt ggt att gat cca tat gat cat atg att tgt tcg acg cca tta ttc 1056
Leu Gly Ile Asp Pro Tyr Asp His Met Ile Cys Ser Thr Pro Leu Phe
340 345 350
aga ata ttc ctg ggt gtg tcc gaa tat ctt ttt tta aaa cct ggc tta 1104
Arg Ile Phe Leu Gly Val Ser Glu Tyr Leu Phe Leu Lys Pro Gly Leu
355 360 365
tta gaa cag aca att gat gca gct atc cat gat aaa tca ttc ata aaa 1152
Leu Glu Gln Thr Ile Asp Ala Ala Ile His Asp Lys Ser Phe Ile Lys
370 375 380
gat gat tta gaa ttt gtt att tcg gct aga gaa tgg agc tcg gtt gtt 1200
Asp Asp Leu Glu Phe Val Ile Ser Ala Arg Glu Trp Ser Ser Val Val
385 390 395 400
tct ttt gcc aat ttt gat ata tac aaa aag caa ttt cag agt gtt caa 1248
Ser Phe Ala Asn Phe Asp Ile Tyr Lys Lys Gln Phe Gln Ser Val Gln
405 410 415
aag ttc ttt gag cca atg ctt cca gag gct aat ctc att ggc aac gag 1296
Lys Phe Phe Glu Pro Met Leu Pro Glu Ala Asn Leu Ile Gly Asn Glu
420 425 430
atg ata aaa acc att ctg agt cat tct agt gac cgt tcg gcc gct gaa 1344
Met Ile Lys Thr Ile Leu Ser His Ser Ser Asp Arg Ser Ala Ala Glu
435 440 445
aaa aga aat aca taa 1359
Lys Arg Asn Thr
450
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<211>452
<212>PRT
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>15
Met Val Ser Glu Asp Lys Ile Glu Gln Trp Lys Ala Thr Lys Val Ile
1 5 10 15
Gly Ile Ile Gly Leu Gly Asp Met Gly Leu Leu Tyr Ala Asn Lys Phe
20 25 30
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35 40 45
Asp Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Ala Ser Ala Lys Phe Glu Leu Val Lys
50 55 60
Asn Gly His Leu Val Ser Arg Gln Ser Asp Tyr Ile Ile Tyr Ser Val
65 70 75 80
Glu Ala Ser Asn Ile Ser Lys Ile Val Ala Thr Tyr Gly Pro Ser Ser
85 90 95
Lys Val Gly Thr Ile Val Gly Gly Gln Thr Ser Cys Lys Leu Pro Glu
100 105 110
Ile Glu Ala Phe Glu Lys Tyr Leu Pro Lys Asp Cys Asp Ile Ile Thr
115 120 125
Val His Ser Leu His Gly Pro Lys Val Asn Thr Glu Gly Gln Pro Leu
130 135 140
Val Ile Ile Asn His Arg Ser Gln Tyr Pro Glu Ser Phe Glu Phe Val
145 150 155 160
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165 170 175
Glu Glu His Asp Lys Ile Thr Ala Asp Thr Gln Ala Val Thr His Ala
180 185 190
Ala Phe Leu Ser Met Gly Ser Ala Trp Ala Lys Ile Lys Ile Tyr Pro
195 200 205
Trp Thr Leu Gly Val Asn Lys Trp Tyr Gly Gly Leu Glu Asn Val Lys
210 215 220
Val Asn Ile Ser Leu Arg Ile Tyr Ser Asn Lys Trp His Val Tyr Ala
225 230 235 240
Gly Leu Ala Ile Thr Asn Pro Ser Ala His Gln Gln Ile Leu Gln Tyr
245 250 255
Ala Thr Ser Ala Thr Glu Leu Phe Ser Leu Met Ile Asp Asn Lys Glu
260 265 270
Gln Glu Leu Thr Asp Arg Leu Leu Lys Ala Lys Gln Phe Val Phe Gly
275 280 285
Lys His Thr Gly Leu Leu Leu Leu Asp Asp Thr Ile Leu Glu Lys Tyr
290 295 300
Ser Leu Ser Lys Ser Ser Ile Gly Asn Ser Asn Asn Cys Lys Pro Val
305 310 315 320
Pro Asn Ser His Leu Ser Leu Leu Ala Ile Val Asp Ser Trp Phe Gln
325 330 335
Leu Gly Ile Asp Pro Tyr Asp His Met Ile Cys Ser Thr Pro Leu Phe
340 345 350
Arg Ile Phe Leu Gly Val Ser Glu Tyr Leu Phe Leu Lys Pro Gly Leu
355 360 365
Leu Glu Gln Thr Ile Asp Ala Ala Ile His Asp Lys Ser Phe Ile Lys
370 375 380
Asp Asp Leu Glu Phe Val Ile Ser Ala Arg Glu Trp Ser Ser Val Val
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Ser Phe Ala Asn Phe Asp Ile Tyr Lys Lys Gln Phe Gln Ser Val Gln
405 410 415
Lys Phe Phe Glu Pro Met Leu Pro Glu Ala Asn Leu Ile Gly Asn Glu
420 425 430
Met Ile Lys Thr Ile Leu Ser His Ser Ser Asp Arg Ser Ala Ala Glu
435 440 445
Lys Arg Asn Thr
450
<210>16
<211>1116
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1116)
<400>16
atg aat caa atg aaa gat aca ata ttg ctc gcc ggt ctc gga ttg ata 48
Met Asn Gln Met Lys Asp Thr Ile Leu Leu Ala Gly Leu Gly Leu Ile
1 5 10 15
ggc ggt tcg att gcc cta gcc atc aaa aaa aat cat ccc ggc aaa cgg 96
Gly Gly Ser Ile Ala Leu Ala Ile Lys Lys Asn His Pro Gly Lys Arg
20 25 30
att atc gga atc gac atc tct gat gaa cag gcg gta gcg gca tta aaa 144
Ile Ile Gly Ile Asp Ile Ser Asp Glu Gln Ala Val Ala Ala Leu Lys
35 40 45
tta ggc gtg ata gac gat cgt gct gat tcg ttt att agc ggt gtg aaa 192
Leu Gly Val Ile Asp Asp Arg Ala Asp Ser Phe Ile Ser Gly Val Lys
50 55 60
gag gca gct aca gta atc att gcg aca cct gtt gaa caa aca ctg gtt 240
Glu Ala Ala Thr Val Ile Ile Ala Thr Pro Val Glu Gln Thr Leu Val
65 70 75 80
atg ctt gaa gag ctg gct cat tca gga att gaa cat gag ctt ttg att 288
Met Leu Glu Glu Leu Ala His Ser Gly Ile Glu His Glu Leu Leu Ile
85 90 95
acg gat gta gga agc aca aag caa aaa gtg gtt gat tac gct gat caa 336
Thr Asp Val Gly Ser Thr Lys Gln Lys Val Val Asp Tyr Ala Asp Gln
100 105 110
gtg ctg cct agc cgc tat caa ttt gtc gga ggg cat ccg atg gcg ggt 384
Val Leu Pro Ser Arg Tyr Gln Phe Val Gly Gly His Pro Met Ala Gly
115 120 125
tca cat aaa tca gga gtg gcc gct gcg aag gag ttc ctg ttt gaa aat 432
Ser His Lys Ser Gly Val Ala Ala Ala Lys Glu Phe Leu Phe Glu Asn
130 135 140
gca ttt tat att tta acg cca ggc cag aaa acg gac aaa caa gct gtg 480
Ala Phe Tyr Ile Leu Thr Pro Gly Gln Lys Thr Asp Lys Gln Ala Val
145 150 155 160
gaa cag tta aaa aac ctg ctg aag ggg acg aat gcc cat ttt gtg gaa 528
Glu Gln Leu Lys Asn Leu Leu Lys Gly Thr Asn Ala His Phe Val Glu
165 170 175
atg tcg cca gag gag cat gat ggc gtt aca agc gta atc agt cat ttt 576
Met Ser Pro Glu Glu His Asp Gly Val Thr Ser Val Ile Ser His Phe
180 185 190
ccg cat att gta gca gct agc ctt gtt cac caa acc cat cat tcg gaa 624
Pro His Ile Val Ala Ala Ser Leu Val His Gln Thr His His Ser Glu
195 200 205
aac ctg tat ccg ctt gtt aag cgt ttt gct gcc ggc ggg ttc aga gat 672
Asn Leu Tyr Pro Leu Val Lys Arg Phe Ala Ala Gly Gly Phe Arg Asp
210 215 220
att aca agg att gca tca agc agc ccg gca atg tgg cgg gat att tta 720
Ile Thr Arg Ile Ala Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Arg Asp Ile Leu
225 230 235 240
tta cat aat aaa gat aaa atc tta gac cgt ttt gat gag tgg att cgt 768
Leu His Asn Lys Asp Lys Ile Leu Asp Arg Phe Asp Glu Trp Ile Arg
245 250 255
gaa att gac aag atc cgt aca tat gta gaa caa gaa gat gcg gaa aat 816
Glu Ile Asp Lys Ile Arg Thr Tyr Val Glu Gln Glu Asp Ala Glu Asn
260 265 270
cta ttt cgt tat ttt aaa aca gcc aag gat tat cgc gac ggg ctg ccg 864
Leu Phe Arg Tyr Phe Lys Thr Ala Lys Asp Tyr Arg Asp Gly Leu Pro
275 280 285
ctt cgg cag aag gga gcg ata cct gca ttt tat gat tta tat gtg gat 912
Leu Arg Gln Lys Gly Ala Ile Pro Ala Phe Tyr Asp Leu Tyr Val Asp
290 295 300
gta ccc gat cat ccg ggt gta ata tcc gag ata aca gcg atc tta gct 960
Val Pro Asp His Pro Gly Val Ile Ser Glu Ile Thr Ala Ile Leu Ala
305 310 315 320
gcg gag cgc atc agt atc acg aat atc cgc att atc gaa aca cga gag 1008
Ala Glu Arg Ile Ser Ile Thr Asn Ile Arg Ile Ile Glu Thr Arg Glu
325 330 335
gat att aac ggg att tta agg atc agt ttt cag tct gat gac gac cgc 1056
Asp Ile Asn Gly Ile Leu Arg Ile Ser Phe Gln Ser Asp Asp Asp Arg
340 345 350
aaa agg gca gaa caa tgc att gaa gcc cgg gcg gaa tat gaa act ttt 1104
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tat gct gat tga 1116
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<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>17
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Gly Gly Ser Ile Ala Leu Ala Ile Lys Lys Asn His Pro Gly Lys Arg
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Leu Gly Val Ile Asp Asp Arg Ala Asp Ser Phe Ile Ser Gly Val Lys
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Met Leu Glu Glu Leu Ala His Ser Gly Ile Glu His Glu Leu Leu Ile
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Thr Asp Val Gly Ser Thr Lys Gln Lys Val Val Asp Tyr Ala Asp Gln
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Val Leu Pro Ser Arg Tyr Gln Phe Val Gly Gly His Pro Met Ala Gly
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Ser His Lys Ser Gly Val Ala Ala Ala Lys Glu Phe Leu Phe Glu Asn
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Ala Phe Tyr Ile Leu Thr Pro Gly Gln Lys Thr Asp Lys Gln Ala Val
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Glu Gln Leu Lys Asn Leu Leu Lys Gly Thr Asn Ala His Phe Val Glu
165 170 175
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Asn Leu Tyr Pro Leu Val Lys Arg Phe Ala Ala Gly Gly Phe Arg Asp
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Ile Thr Arg Ile Ala Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Arg Asp Ile Leu
225 230 235 240
Leu His Asn Lys Asp Lys Ile Leu Asp Arg Phe Asp Glu Trp Ile Arg
245 250 255
Glu Ile Asp Lys Ile Arg Thr Tyr Val Glu Gln Glu Asp Ala Glu Asn
260 265 270
Leu Phe Arg Tyr Phe Lys Thr Ala Lys Asp Tyr Arg Asp Gly Leu Pro
275 280 285
Leu Arg Gln Lys Gly Ala Ile Pro Ala Phe Tyr Asp Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Val Pro Asp His Pro Gly Val Ile Ser Glu Ile Thr Ala Ile Leu Ala
305 310 315 320
Ala Glu Arg Ile Ser Ile Thr Asn Ile Arg Ile Ile Glu Thr Arg Glu
325 330 335
Asp Ile Asn Gly Ile Leu Arg Ile Ser Phe Gln Ser Asp Asp Asp Arg
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<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1122)
<400>18
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Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp
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aaa gcg ctg ctg aat tta tta gcg aag cgt ctg gaa ctg gtt gct gaa 96
Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu
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Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg Arg Ala Glu Ala Glu Ala Leu
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Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg
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Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro
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tca ctg cgt ccg gtg gtt atc gtc ggc ggt ggc ggt cag atg gga cgc 336
Ser Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg
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Leu Phe Glu Lys Met Leu Thr Leu Ser Gly Tyr Gln Val Arg Ile Leu
115 120 125
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Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly
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atg gtg att gtt agt gtg cca atc cac gtt act gag caa gtt att ggc 480
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145 150 155 160
aaa tta ccg cct tta ccg aaa gat tgt att ctg gtc gat ctg gca tca 528
Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser
165 170 175
gtg aaa aat ggg cca tta cag gcc atg ctg gtg gcg cat gat ggt ccg 576
Val Lys Asn Gly Pro Leu Gln Ala Met Leu Val Ala His Asp Gly Pro
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195 200 205
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Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile
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Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg
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cac ttt gct act ttt gct tac ggg ctg cac ctg gca gaa gaa aat gtt 816
His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val
260 265 270
cag ctt gag caa ctt ctg gcg ctc tct tcg ccg att tac cgc ctt gag 864
Gln Leu Glu Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu
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Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala
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gac atc att atg tcg tca gag cgt aat ctg gcg tta atc aaa cgt tac 960
Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr
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tat aag cgt ttc ggc gag gcg att gag ttg ctg gag cag ggc gat aag 1008
Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys
325 330 335
cag gcg ttt att gac agt ttc cgc aag gtg gag cac tgg ttc ggc gat 1056
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<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
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Ser Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Gly Gly Gln Met Gly Arg
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Glu Gln His Asp Trp Asp Arg Ala Ala Asp Ile Val Ala Asp Ala Gly
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Met Val Ile Val Ser Val Pro Ile His Val Thr Glu Gln Val Ile Gly
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180 185 190
Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala
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Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala
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305 310 315 320
Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala Ile Glu Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys
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<212>DNA
<213>草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)
<220>
<221>CDS
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<400>20
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Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Ser Val Asp
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aaa gcg ctg ctg gat ctg ctg gct aag cga ctg gaa ctg gtg gcc gag 96
Lys Ala Leu Leu Asp Leu Leu Ala Lys Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu
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cgt gag gcg tcg atg ctg gct tcg cgt cgc aaa gag gcc gaa gcg ctc 192
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Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg
65 70 75 80
gaa tcc tat acc agc gag aat gat aaa ggc ttt aaa acc ctc tgt cct 288
Glu Ser Tyr Thr Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro
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Glu Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Lys Gly Gln Met Gly Arg
100 105 110
ctg ttt gaa aaa atg ctc ggg cta tca ggc tac acg gtt aaa acg ctg 384
Leu Phe Glu Lys Met Leu Gly Leu Ser Gly Tyr Thr Val Lys Thr Leu
115 120 125
gat aaa gag gac tgg cct cag gct gag act ctg ctc agc gat gcc gga 432
Asp Lys Glu Asp Trp Pro Gln Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ala Gly
130 135 140
atg gtg atc att agc gtg ccg att cac ctg acc gag cag gtg att gcc 480
Met Val Ile Ile Ser Val Pro Ile His Leu Thr Glu Gln Val Ile Ala
145 150 155 160
caa ctg cca cca ctg ccg gaa gat tgt att ctg gtc gat ctg gcg tca 528
Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser
165 170 175
gtc aaa aac cgg cct ctg cag gca atg ctg gct gcc cat aac ggg cct 576
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195 200 205
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tgg ttc ctg gag cag att cag gtc tgg ggt gcg cgt ctg cat cgt atc 720
Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile
225 230 235 240
agc gct gtt gag cat gac cag aac atg gca ttc att cag gcg ctg cgt 768
Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg
245 250 255
cac ttt gct acc ttc gct tat ggt ctg cat tta gcc gaa gag aac gtc 816
His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val
260 265 270
aat ctg gat cag ctg ctg gcg ctc tcg tcg ccc att tac cgg ctt gaa 864
Asn Leu Asp Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu
275 280 285
ctg gcg atg gtg ggg cgg ttg ttc gct cag gat ccg caa ctc tat gcg 912
Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala
290 295 300
gat atc atc atg tct tca gag agt aat ctg gcg ctg ata aaa cgc tat 960
Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Ser Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr
305 310 315 320
tac cag cgg ttt ggt gaa gcg att gcg ctg ctg gag cag ggc gac aag 1008
Tyr Gln Arg Phe Gly Glu Ala Ile Ala Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys
325 330 335
cag gcg ttt atc gcc agc ttt aac cgg gtt gaa cag tgg ttt ggc gat 1056
Gln Ala Phe Ile Ala Ser Phe Asn Arg Val Glu Gln Trp Phe Gly Asp
340 345 350
cac gca aaa cgc ttc ctg gtc gaa agc cga agc ctg ttg cga tcg gcc 1104
His Ala Lys Arg Phe Leu Val Glu Ser Arg Ser Leu Leu Arg Ser Ala
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<211>373
<212>PRT
<213>草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)
<400>21
Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gln Ile Asp Ser Val Asp
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50 55 60
Gly Val Pro Pro Asp Leu Ile Glu Asp Val Leu Arg Arg Val Met Arg
65 70 75 80
Glu Ser Tyr Thr Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro
85 90 95
Glu Leu Arg Pro Val Val Ile Val Gly Gly Lys Gly Gln Met Gly Arg
100 105 110
Leu Phe Glu Lys Met Leu Gly Leu Ser Gly Tyr Thr Val Lys Thr Leu
115 120 125
Asp Lys Glu Asp Trp Pro Gln Ala Glu Thr Leu Leu Ser Asp Ala Gly
130 135 140
Met Val Ile Ile Ser Val Pro Ile His Leu Thr Glu Gln Val Ile Ala
145 150 155 160
Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu Asp Cys Ile Leu Val Asp Leu Ala Ser
165 170 175
Val Lys Asn Arg Pro Leu Gln Ala Met Leu Ala Ala His Asn Gly Pro
180 185 190
Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala
195 200 205
Lys Gln Val Val Val Trp Cys Asp Gly Arg Gln Pro Glu Ala Tyr Gln
210 215 220
Trp Phe Leu Glu Gln Ile Gln Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg Ile
225 230 235 240
Ser Ala Val Glu His Asp Gln Asn Met Ala Phe Ile Gln Ala Leu Arg
245 250 255
His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val
260 265 270
Asn Leu Asp Gln Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro Ile Tyr Arg Leu Glu
275 280 285
Leu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gln Asp Pro Gln Leu Tyr Ala
290 295 300
Asp Ile Ile Met Ser Ser Glu Ser Asn Leu Ala Leu Ile Lys Arg Tyr
305 310 315 320
Tyr Gln Arg Phe Gly Glu Ala Ile Ala Leu Leu Glu Gln Gly Asp Lys
325 330 335
Gln Ala Phe Ile Ala Ser Phe Asn Arg Val Glu Gln Trp Phe Gly Asp
340 345 350
His Ala Lys Arg Phe Leu Val Glu Ser Arg Ser Leu Leu Arg Ser Ala
355 360 365
Asn Asp Ser Arg Pro
370
<210>22
<211>1129
<212>DNA
<213>番茄(Lycopersicon esculentun)
<400>22
atgttttccc tttcatctat acaatctaac aatattcaat ctcaatcatc ttcgtcgcta 60
ctcttcaatc atcatcacca gcattcaact atttcaactc ggtttcatca ccaccgccta 120
ctcttccctc tccgtgccca aaatagcgac ttaactacag ccaccaccaa taacaactat 180
gtcgatcttg atgacaatct aaccagactt gataaatttt caaaatcatt aagtatttcg 240
aatatcgaag aaaatacatc attaaatccc ctcttatgtt ccaataacaa gctcaaaata 300
gctatcatag gctttggaaa ctttggacaa tttattgcca aatcctttat caaacaaggc 360
catgttgtat tagctcattc acgtagtgat tattccctca tagcacaatc ccttaatgtc 420
cacttctttc aagatcctaa tgacttatgt gaacaacatc ctgacgttat tttactttgc 480
acatccatca attcactcga aaacgtcatt cgttcccttc ccatccaaaa gcttaaacgt 540
aacacacttt tcgtagacgt attatcagtc aaagaattcc cgaaaaacat ttttcttcaa 600
tcactaccaa aagaatttga tattttgtgt actcatccta tgtttggtcc aacaagtggt 660
aaagacaatt ggaaaggact accatttatg tatgacaaag ttagaattgg acaagaagag 720
tcaagaatta aaagagtcaa caattttatc aacatttttg taaaagaagg ttgtagaatg 780
gttgaaatga gttgtagtga acatgacaag tatgctgctg gatcacaatt tattacacat 840
actattggaa gaatgttaca aagacttggg acacaaacaa ctcctataaa cacaaaagga 900
tatgaaagtt tgttgaattt gatggagaat acaactagtg atagttttga tttgtattgt 960
ggtttgctta tgtataacaa taattcaatg gaggtgttag agaaactaga tgcagcattg 1020
gatagtttga aaagggaatt atttggacaa gttcttcaaa agttggagaa aagagtggaa 1080
aagggaagta agttagcttt acctactcct gattttagta agaaaattg 1129
<210>23
<211>32
<212>DNA
<213>人丁序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P1
<400>23
tctccatatg atctttcaat ctcattctca tc 32
<210>24
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P2
<400>24
ctaactaact aactacatac ctcatcatat cc 32
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>人丁序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P3
<400>25
cctctctttc catatgctcc cttctc 26
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P4
<400>26
ccgccagcca cctccatatg accgacacca tcc 33
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P5
<400>27
cgccacccct catatgcgta tcgcc 25
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P6
<400>28
gatgcatctt tgcatatgat gaggtcagaa gatg 34
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P7
<400>29
cagtataatt agtagtcaag gatcctgact gagag 35
<210>30
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：寡核苷酸P8
<400>30
gctaaaactc ttctccttca atacttacct g 31
Claims (60)
1.一种能耐受以参与预苯酸转变为L-酪氨酸的代谢步骤中任一步骤的酶为靶酶的除草化合物的植物细胞，其特征在于，它包括了一个编码预苯酸脱氢酶的基因并在它的组织中表达所述的酶。
2.如权利要求1所述的植物细胞，其特征在于，它能耐受以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物。
3.如权利要求2所述的植物细胞，其特征在于，它能耐受除草剂化合物，所述除草剂化合物以arogenate脱氢酶为靶酶。
4.如权利要求3所述的植物细胞，其特征在于，所述arogenate脱氢酶是以多核苷酸编码的。
5.如权利要求4所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的多核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：13所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)的多聚核苷酸杂交的分离的多核苷酸。
(c)与(a)或(b)的多聚核苷酸有同源性的分离的多核苷酸；
(d)(a)，(b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
6.如权利要求5所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列标示符SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多核苷酸。
7.如权利要求4所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自以下的多核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQ ID NO：11所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸；
(c)与(a)或(b)所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；
(d)(a)，(b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
8.如权利要求7所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列标示符SEQ ID NO：10的多核苷酸。
9.如权利要求4-8任一所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于植物。
10.如权利要求6所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
11.如权利要求8所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于灰绿云衫(Picea glauca)。
12.如权利要求11所述的植物细胞，其特征在于，所述酶来源于植物。
13.如权利要求10所述的植物细胞，其特征在于，所述arogenate脱氢酶是以多核苷酸编码的，所述多核苷酸选自以下的一个多聚核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQ ID NO：13所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)所述多核苷酸杂交的分离的多核苷酸。
(c)与(a)或(b)所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；
(d)(a)、(b)或(c)所述多核苷酸的片段。
14.如权利要求13所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包括选自序列标示符SEQID NO：11的多核苷酸。
15.如权利要求13或14所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于细菌。
16.如权利要求15所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于集胞藻属的细菌。
17.如权利要求16所述的植物细胞，其特征在于，所述酶来源于细菌。
18.如权利要求13-17任一所述的植物细胞，其特征在于，所述除草剂化合物是用鉴定以具有arogenate脱氢酶活性的酶为靶酶的除草化合物的方法得到的，该方法包括步骤：
(a)至少准备两个样品，每一个在溶液中含有等量的arogenate脱氢酶；
(b)其中的一个样品用一种化合物处理；
(c)测定所述的每一样品的arogenate脱氢酶活性；
(d)当(c)步骤测定的经处理样品的酶活性比未处理样品的酶活性明显低时，则可以认定步骤(b)中所用的化合物是一种除草化合物；
(e)将步骤(d)中所鉴定的化合物的除草活性通过用所述的化合物处理植物予以验证。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所用的具有arogenate脱氢酶活性的酶是由多核苷酸编码的。
20.如权利要求19所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的多核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：13所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)的多聚核苷酸杂交的分离的多核苷酸。
(c)与(a)或(b)的多聚核苷酸有同源性的分离的多核苷酸；
(d)(a)，(b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
21.如权利要求20所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列标示符SEQID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQID NO：6或SEQ ID NO：8的多核苷酸。
22.如权利要求19所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自以下的多核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQID NO：11所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸；
(c)与(a)或(b)所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；
(d)(a)，(b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
23.如权利要求22所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列标示符SEQ ID NO：10的多核苷酸。
24.如权利要求19-23任一所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于植物。
25.如权利要求21所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
26.如权利要求23所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于灰绿云衫(Picea glauca)。
27.如权利要求1所述的植物细胞，其特征在于，它能耐受以预苯酸氨基转移酶为靶酶的除草剂化合物。
28.如权利要求1至27任一项所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因是一种酵母基因。
29.如权利要求28所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因来源于酵母菌属的酵母菌。
30.如权利要求28所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因的由序列标示符是SEQ ID NO：14。
31.如权利要求1至27任一项所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因是来源于细菌。
32.如权利要求31所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因是来源于芽胞杆菌属细菌。
33.如权利要求32所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因的序列标示符是SEQ ID NO：16.
34.如权利要求31所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因是来源于大肠杆菌属细菌。
35.如权利要求34所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因的序列标示符是SEQ ID NO：18.
36.如权利要求31所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因是来源于Erwinia属细菌。
37.如权利要求36所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它的编码预苯酸脱氢酶的基因的序列标示符是SEQ ID NO：20.
38.如权利要求1至37任一项所述的耐受性植物细胞，其特征在于，它除了含有嵌合基因外，至少还含有编码一个感兴趣蛋白质的多聚核苷酸的另一个基因，所述嵌合基因至少包含功能上相互联系的以下成分：
(a)在宿主生物中有功能的启动子；
(b)编码arogenate脱氢酶的活性的酶的多核苷酸；
(c)在宿主生物中有功能的终止子元件。
39.如权利要求38所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的多核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：13所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)的多聚核苷酸杂交的分离的多核苷酸。
(c)与(a)或(b)的多聚核苷酸有同源性的分离的多核苷酸；
(d)(a)，(b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
40.如权利要求39所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列标示符SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的多核苷酸。
41.如权利要求38所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自以下的多核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQID NO：11所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸；
(c)与(a)或(b)所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；
(d)(a)，(b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
42.如权利要求41所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包含选自序列标示符SEQ ID NO：10的多核苷酸。
43.如权利要求38-42任一所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于植物。
44.如权利要求40所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
45.如权利要求42所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于灰绿云衫(Picea glauca)。
46.如权利要求38所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸选自以下的一个多聚核苷酸：
(a)编码由序列标示符SEQ ID NO：13所描述的多肽的分离的多核苷酸；
(b)与(a)所述多核苷酸杂交的分离的多核苷酸。
(c)与(a)或(b)所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸；
(d)(a)、(b)或(c)所述多核苷酸的片段。
47.如权利要求46所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸包括选自序列标示符SEQ ID NO：11的多核苷酸。
48.如权利要求46或47所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于细菌。
49.如权利要求48所述的植物细胞，其特征在于，所述多核苷酸来源于集胞藻属的细菌。
50.如权利要求38所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述启动子是组成型启动子。
51.如权利要求38所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述启动子是诱导型启动子。
52.如权利要求38-51任一所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述嵌合基因还包括在所述的宿主生物中有功能的信号肽或转运肽。
53.如权利要求38-52任一所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述宿主生物是微生物。
54.如权利要求38-52任一所述的耐受性植物细胞，其特征在于，所述宿主生物是植物细胞或植物。
55.一种获得对以参与预苯酸转变为L-酪氨酸的代谢步骤中任一步骤的酶为靶酶的除草剂化合物有耐受性的植物的方法，其特征在于，该方法用编码预苯酸脱氢酶的基因通过一种使它能在植物组织中表达的方法转化所述的植物。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，该方法用于产生对以arogenate脱氢酶为靶酶的除草剂化合物有耐受性的植物。
57.如权利要求55所述的方法，其特征在于，该方法用于产生对以预苯酸脱氢酶为靶酶的除草剂化合物有耐受性的植物。
58.如权利要求55至57任一项所述的方法，其特征在于，预苯酸脱氢酶来源于酵母。
59.如权利要求55至57任一项所述的方法，其特征在于，预苯酸脱氢酶来源于真菌。
60.如权利要求55至57任一项所述的方法，其特征在于，预苯酸脱氢酶来源于细菌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20091021 |