WO2019050033A1 - バチルス科好熱細菌由来変異型グリシンオキシダーゼおよびその製造方法 - Google Patents

バチルス科好熱細菌由来変異型グリシンオキシダーゼおよびその製造方法 Download PDF

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mutant
glycine
oxidase
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木村　隆
泰史 谷
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    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y104/03—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12Y104/03019—Glycine oxidase (1.4.3.19)

Definitions

  • the present invention relates to a Bacillus subtilis thermophilic bacterium-derived mutant glycine oxidase and a method for producing the same, and more particularly to a Bacillus Bacillus thermophilic mutant-derived glycine capable of achieving both good thermal stability and good enzyme activity.
  • the present invention relates to an oxidase and a method for producing the same.
  • Glycine is an amino acid having the simplest structure without stereoisomerism of D-form or L-form and is one of the amino acids that constitute proteins, and is a raw material for biosynthesis of various biological substances (starting material Also known as As one of methods of measuring glycine, a mechanical measurement method using mass spectrometry (MS), high performance liquid chromatography (HPLC), an amino acid analyzer and the like is known. However, in the case of machine measurement, in general, the measurement equipment is expensive and the maintenance cost is high, and the operation also requires skill.
  • Non-Patent Document 1 specifically reports on glycine oxidase derived from Bacillus subtilis.
  • glycine oxidase for example, there is trade number H244K manufactured by BioVision, Inc. (BioVision, Inc), but this commercially available glycine oxidase is also derived from Bacillus subtilis, and wild-type glycine oxidase is used. It is a mutant enzyme into which a mutation has been introduced. Non-Patent Document 2 specifically reports on this mutant glycine oxidase, and a biosensor using this has also been proposed.
  • Patent Document 1 discloses a method for analyzing glycine using a modified glycine oxidase in which at least one of amino acid residues is displaced to modify properties such as enzyme activity, thermal stability, substrate specificity, etc. Is disclosed.
  • the modified glycine oxidase specifically disclosed in the example of Patent Document 1 is also derived from Bacillus subtilis, and a mutation of an amino acid residue is introduced into a wild-type glycine oxidase.
  • modified glycine oxidase disclosed in Patent Document 1 certainly enables modification of properties such as enzyme activity, heat stability, substrate specificity and the like to wild type, for example, its specific activity and the like are commercially available. It is comparable to glycine oxidase.
  • thermal stability or heat resistance
  • the thermal stability is improved by modifying the wild-type glycine oxidase, but in recent years, there is a tendency that even better thermal stability is required.
  • the present invention has been made to solve such problems, and provides a bacterial-derived mutant glycine oxidase capable of achieving good enzyme activity as well as good thermal stability, and a method for producing the same.
  • the purpose is to
  • the mutant glycine oxidase according to the present invention is a mutant enzyme in which at least one of the amino acid sequences in a wild-type glycine oxidase derived from a Bacillus family thermophilic bacterium is replaced with another amino acid in order to solve the above-mentioned problems.
  • the molecular weight is 40,000 ⁇ 2,000 daltons in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the optimum temperature is 45 ° C.
  • the mutant glycine oxidase realizes the above-mentioned enzyme properties by introducing a mutation into a wild-type glycine oxidase derived from a Bacillus family thermophilic bacterium.
  • This mutant glycine oxidase can retain a kinetic constant K m substantially within the same range as that of the conventional mutant glycine oxidase, and in addition to the conventional mutant glycine oxidase, it is also wild.
  • High thermal stability can be realized compared to type glycine oxidase, and further, higher specific activity is realized compared to conventional mutant glycine oxidase and wild type glycine oxidase. This makes it possible to achieve good thermal stability as well as good enzyme activity in the mutant glycine oxidase.
  • a partial amino acid sequence which is contained in the amino acid sequence of the wild type glycine oxidase, which binds in the order of asparagine (N), glycine (G), cysteine (C) and tyrosine (Y)
  • the amino acid sequence may be one in which glycine in the above is substituted by another amino acid.
  • the mutant glycine oxidase according to the present invention is a glycine oxidase derived from a bacillus family thermophilic bacterium, which exhibits 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the mutant enzyme may have a configuration in which the 251st amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence in which glycine is substituted for another amino acid.
  • the mutant glycine oxidase is one in which a mutation has been introduced at the above position with respect to a wild-type glycine oxidase derived from a Bacillus family thermophilic bacterium.
  • This mutant glycine oxidase can retain a kinetic constant K m substantially within the same range as that of the conventional mutant glycine oxidase, and in addition to the conventional mutant glycine oxidase, it is also wild.
  • High thermal stability can be realized compared to type glycine oxidase, and further, higher specific activity is realized compared to conventional mutant glycine oxidase and wild type glycine oxidase. This makes it possible to achieve good thermal stability as well as good enzyme activity in the mutant glycine oxidase.
  • the amino acid at position 251 in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 may have an amino acid sequence in which glycine is replaced with a basic amino acid or a hydrophobic amino acid.
  • the basic amino acid may be glutamine, arginine or histidine
  • the hydrophobic amino acid may be isoleucine or threonine
  • the other amino acid may be alanine, glutamic acid, histidine, isoleucine, asparagine, glutamine, arginine, or threonine.
  • the bacillus thermophilic bacterium is selected from the group consisting of Bacillus, Alicyclobacillus, Brevibacillus, Geobacillus, and Sulfobacillus. It may be a bacterium belonging to the genus Sulfobacillus, Paenibacillus, or Salinicoccus.
  • the present invention includes a DNA encoding the mutant glycine oxidase of the above-mentioned constitution.
  • the present invention also includes replicable recombinant DNA, which comprises the DNA of the above construction and a vector capable of autonomous replication.
  • the present invention also includes cells obtained by introducing the DNA of the above-mentioned constitution or the recombinant DNA of the above-mentioned constitution into a host cell.
  • the present invention also includes a method for producing a mutant glycine oxidase having a configuration in which cells of the above-described configuration are cultured and the above-mentioned mutant glycine oxidase is collected from a culture obtained.
  • FIG. 1 is a sequence diagram showing an amino acid sequence of wild-type glycine oxidase exemplified in the embodiment in one-letter notation in the present invention.
  • FIG. 2 is a sequence diagram showing a nucleotide sequence of a DNA encoding a wild-type glycine oxidase having the amino acid sequence of FIG.
  • FIG. 3A is a graph comparing the specific activity of each glycine oxidase in Examples and Comparative Examples
  • FIG. 3B is a graph comparing the thermal stability of each Glycine oxidase in Examples and Comparative Examples.
  • the bacterium-derived mutant glycine oxidase according to the present disclosure is a mutant enzyme in which at least one of the amino acid sequences in a wild-type glycine oxidase derived from a bacillus thermophilic bacterium is replaced with another amino acid, and is a conventional glycine oxidase It also has characteristic enzyme properties in comparison.
  • Bacillus family thermophilic bacteria The Bacillus family thermophilic bacterium from which the mutant glycine oxidase according to the present disclosure is derived is not particularly limited as long as it is a taxonomically classified Bacillus family and has thermophilic properties.
  • the thermophilic as referred to herein means that the optimum growth temperature of the bacteria is 45 ° C. or higher, or the growth limit temperature of the bacteria is 55 ° C. or higher, or both of them are satisfied. It shall be.
  • bacteria of the Bacillus family include, for example, Bacillus sp., Alicyclobacillus sp., Anoxybacillus sp., Brevibacillus sp., Geobacillus sp.
  • Bacillus sp. Alicyclobacillus sp.
  • Anoxybacillus sp. Brevibacillus sp.
  • Geobacillus sp. examples include bacteria belonging to (Halobacterus, Oceanobacterium, Oeanobacillus, Paenibacillus, Sulfobacillus, Virgibacillus, or Salinococcus). It is not particularly limited.
  • Geobacillus kaustophilus HTA 426 strain is used as a Bacillus family thermophilic bacterium.
  • the wild type glycine oxidase derived from this Geobacillus kastophilus HTA 426 strain is another Bacillus bacillus thermophilic bacterium, Geobacillus stearothermophilus, Geobacillus thermoleovorans, or Geobacillus thermoleovorans.
  • glycine oxidase As the commercially available glycine oxidase, as described above, a mutant enzyme derived from Bacillus subtilis, which is a non-thermophilic Bacillus bacterium, is known.
  • Bacillus subtilis the wild type of glycine oxidase derived from Bacillus subtilis is referred to as "B. subtilis wild type glycine oxidase", and the mutant type is referred to as "B. subtilis mutant glycine oxidase”.
  • glycine oxidase derived from G. kaustophilus HTA426 strain is also referred to as "G. kastophilus wild type glycine oxidase" for convenience of explanation.
  • HCY motif Seven types of motifs are known in subtilis wild-type glycine oxidase, for example, in the examples of Non-Patent Document 2 and Patent Document 1, mutations are introduced into one of these motifs, the HCY motif.
  • the HCY motif is located in the pathway towards substrates such as glycine towards the active center of glycine oxidase.
  • G.I Also in the case of Kaustophilus wild-type glycine oxidase, As in the case of subtilisin mutant glycine oxidase, if a mutation was introduced at a position corresponding to the wild-type HCY motif or HCY motif, it was considered earnestly considering that the enzyme activity could be improved while maintaining the thermal stability.
  • G. Caustophilus wild-type glycine oxidase Comparison of the amino acid sequence between S. subtilis wild type glycine oxidase Kaustophilus wild-type glycine oxidase includes It was revealed that there is a characteristic region not found in S. subtilis wild type glycine oxidase.
  • This characteristic region is, as shown in FIG.
  • the amino acid sequence of the wild-type amino acid sequence of kastophilus wild type glycine oxidase they bind in the order of asparagine (N) at position 250, glycine (G) at position 251, cysteine (C) at position 252, and tyrosine (Y) at position 253. It is a partial amino acid sequence.
  • this characteristic region has high homology with the amino acid sequences of glycine oxidases from other Bacillus family thermophilic bacteria as described above.
  • the mutant glycine oxidase according to the present disclosure is a mutation of a wild-type glycine oxidase derived from a bacillus thermophilic bacterium against a characteristic region widely conserved in the bacillus thermophilic bacterium. It can be said that not only the enzyme activity is improved but also unexpected superior enzyme properties are obtained.
  • the bacillus family thermophilic bacterium from which the mutant glycine oxidase according to the present disclosure is derived may be classified into the bacillus family and have thermophilic properties.
  • Thermophilic bacteria of the genus Geobacillus can be mentioned, and as a more preferable example, Geobacillus caustophilus can be mentioned.
  • thermophilic bacterium belonging to the genus Geobacillus as described above, Geobacillus caustophilus, Geobacillus stearothermophilus, G. thermoleovorans, G. Bacillus thermodenitri
  • Geobacillus thermoglucosidasius Geobacillus calyboxylolyticus
  • Geobacillus bacillusus Geobacillus galactosidas (Geobacillus galactosidasius), Geobacillus zarifly (Geobacillus zalihae), and other unclassified strains of Geobacillus sp.
  • reference 2 Messele Yohannes EQUAR, Yasushi TANI, Hisaaki MIHARA "Purification and Properties of Glycine Oxidase from Pseudomonas putida KT2440" Journal of Nutritional Science and Vitaminology, Vol. 61 pp. 506-510 (2015) Phylogenetic analysis has been shown for the homology of glycine oxidase, according to which, for Bacillus, Alicyclobacillus, Brevibacillus, Geobacillus, Sulfobacilli, Paenibacillus, and Salinococcus species. It has become clear that they were differentiated from the same lineage. In other words, it is understood that the characteristic region is highly likely to be preserved at least in glycine oxidase derived from each of the genus of Bacillus bacteria.
  • thermophilic bacteria belonging to the genus Salini cocci.
  • the mutant glycine oxidase according to the present disclosure is obtained by introducing a mutation into a wild-type glycine oxidase derived from a bacillus family thermophilic bacterium, and as will be described later, the following examples will be described. Any one having the characteristic enzyme characteristics shown in (1) to (7) may be used.
  • the molecular weight is 40,000 ⁇ 2,000 daltons in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the optimum temperature is 45 ° C. under the condition of pH 8.5 in the presence of pyrophosphate.
  • the optimum pH is pH 8.0 at 37 ° C.
  • the heat stability is stable up to 70 ° C. in the presence of pyrophosphate at pH 8.5 for 1 hour.
  • the pH stability is stable within the range of pH 5.5 to 10.0 under the conditions of holding at 4 ° C. for 24 hours in the presence of pyrophosphate.
  • the specific activity is 1.2 units / mg or more.
  • Kinetic constant (Michaelis constant) K m is 0.2 mM or less.
  • (1) molecular weight is based on the molecular weight of wild-type glycine oxidase, but may be in the range of 39,000 ⁇ 1,000 daltons.
  • the (6) specific activity is preferably 2.4 units / mg or more, more preferably 4.0 units / mg or more.
  • the enzyme properties of the above (1) to (7) can be evaluated based on “evaluation of various properties of glycine oxidase” in the examples described later, but other known evaluations It may be evaluated by a method.
  • mutant glycine oxidase include, as described above, a mutant glycine oxidase derived from Geobacillus caustophilus strain HTA426 described in detail in the Examples, and this mutant glycine oxidase is exemplified in FIG.
  • SEQ ID NO: 1 the amino acid at amino acid position 251 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing has an amino acid sequence in which glycine is replaced with another amino acid, ie, amino acid shown in SEQ ID NO: 3 for the sequence Mention may be made of those having a sequence.
  • the amino acid at position 251 is indicated by Xaa which is an arbitrary amino acid, and in FIG. 1, it is illustrated that it is substituted by an arbitrary amino acid X by an arrow.
  • mutant glycine oxidase according to the present disclosure is not limited to one having a mutation of glycine at position 251 (the position 251) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3), Any one having the characteristic enzyme properties (1) to (7) may be used, but based on SEQ ID NO: 1, it is at least 95% or more homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 Or one having sequence identity), more preferably one having 97% or more homology, and still more preferably one having 98% or more homology.
  • glycine at position 251 is another basic amino acid or It is preferable to have an amino acid sequence substituted with a hydrophobic amino acid. This makes it possible to achieve better enzyme activity as compared to wild-type glycine oxidase.
  • a specific basic amino acid is not particularly limited, glutamine, arginine, histidine and the like can be mentioned.
  • specific hydrophobic amino acids are not particularly limited, and may be isoleucine or threonine.
  • the other amino acid may be any of alanine, glutamic acid, histidine, isoleucine, asparagine, glutamine, arginine or threonine.
  • the mutant glycine oxidase according to the present disclosure realizes the above-mentioned enzyme properties by introducing a mutation into a wild-type glycine oxidase derived from a Bacillus family thermophilic bacterium.
  • This mutant glycine oxidase can retain a kinetic constant K m substantially within the same range as that of the conventional mutant glycine oxidase, and in addition to the conventional mutant glycine oxidase, it is also wild.
  • High thermal stability can be achieved as compared to glycine oxidase of the type, and furthermore, high specific activity can be realized compared to conventional mutant glycine oxidase and wild-type glycine oxidase. Therefore, according to the present disclosure, it is possible to obtain a mutant glycine oxidase capable of realizing good thermal stability as well as good enzyme activity.
  • the present disclosure also includes a DNA encoding a mutant glycine oxidase of the above-described constitution.
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing shows a nucleotide sequence encoding glycine oxidase derived from Geobacillus caustophilus HTA 426 strain, and a representative example of the DNA according to the present disclosure is, for example, the base shown in SEQ ID NO: 2 A DNA having a base sequence into which a mutation has been introduced in the sequence can be mentioned.
  • guanine-guanine-cytosine in which the codon composed of the nucleotides 751 to 753 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing encodes glycine
  • Mention may be made of DNA having a base sequence substituted from the codon of GGC) to a codon encoding another amino acid, ie, DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 4 the nucleotides 751 to 753 encoding the 251st amino acid are indicated by n which is an arbitrary nucleotide, and in FIG. It is illustrated.
  • the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a DNA encoding a wild-type glycine oxidase derived from Geobacillus caustophilus HTA 426 strain. Therefore, the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 can be said to be a DNA in which the codon corresponding to glycine at position 251 is replaced with a codon encoding another amino acid in the DNA encoding wild type glycine oxidase.
  • the DNA according to the present disclosure is not limited to the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, but may be, for example, a DNA having a base sequence homologous to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, It may be a DNA having another base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the DNA according to the present disclosure may be a mutant DNA in which a mutation is introduced at a position excluding a codon corresponding to the 251st amino acid in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • mutant DNA one having a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 within the range that retains the activity of the mutant glycine oxidase to encode Can be mentioned.
  • the number of bases to be deleted, substituted or added is usually 1 to 120, preferably 1 to 60, and more preferably 1 to 30. .
  • the present disclosure also includes replicable recombinant DNA, which comprises a DNA encoding a mutant glycine oxidase of the above-described constitution and a vector capable of autonomous replication.
  • a plasmid vector typically, a plasmid vector can be mentioned.
  • Specific plasmid vectors include pBR-based plasmids such as pBR322; pUC-based plasmids such as pUC18, pUC19, pUC118, and pUC119; pBluescript II, pBluescript II SK (+/-), pBluescript II KS (+/-), pBluescript PBS based plasmids such as XR, pBluescript II RI; pET based plasmids such as pET-3a to 3d, pET-11a to d, pET-14b, pET-15b, pET-21a to 21d; pGEX-1, pGEX-2T , PGEX series plasmids such as pGEX-3X; pTZ series plasmids such as pTZ4, pTZ5, pTZ12, pTZ-18R, pTZ-19R etc; pSU series plasmids such as pSU0, pSU7
  • plasmids can be appropriately selected according to various conditions such as the type of cell to be a host (host) and the type of expression system.
  • a phage vector or the like may be used as a vector capable of autonomous replication.
  • a DNA (or a gene) encoding mutant glycine oxidase and a vector are digested (cleaved) with a known type II restriction enzyme, and these DNA fragments and vector fragments are optionally annealed After treatment, a method of ligation using a DNA ligase or the like can be mentioned, but it is not particularly limited.
  • the replicable recombinant DNA having the above-described configuration may contain the DNA encoding the mutant glycine oxidase having the above-described configuration and a DNA other than an autonomously replicable vector.
  • it may contain DNA encoding a control sequence which is not contained in an autonomously replicable vector, or it may contain DNA (or a gene or the like) encoding another protein or peptide.
  • the mutant glycine oxidase having the above constitution may be incorporated into a replicable recombinant DNA so as to constitute a chimeric protein together with other proteins and peptides.
  • Such recombinant DNA can be introduced into cells that serve as known hosts. Therefore, the present disclosure also includes a transformant obtained by introducing a replicable recombinant DNA into a host cell, which comprises a DNA encoding the mutant glycine oxidase of the above-described configuration and a vector capable of autonomous replication.
  • Host cells generally include microorganisms such as E. coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, but are not limited thereto, and may be plant cells or animal cells. .
  • both host cells for replicating replicable recombinant DNA and host cells for producing mutant glycine oxidase having the above-mentioned constitution by the replicated recombinant DNA also use E. coli. .
  • the present disclosure is not limited thereto.
  • E. coli when replicating replicable recombinant DNA, E. coli is used as a host cell, and when producing mutant glycine oxidase having the above configuration, the host cell may be used.
  • Bacillus subtilis or bacteria of the genus Bacillus may be used.
  • the transformation method for introducing the recombinant DNA having the above constitution into the host cell, that is, the transformation method, and any known method may be used depending on the type of host cell or the type of autonomously replicable vector.
  • a typical transformation method for example, in the case of bacteria such as E. coli, an electroporation method, a method of making cells competent cells with calcium chloride, and the like can be mentioned.
  • the host cell is a yeast, a method of partially removing the cell wall of the yeast cell and spheroplasting, a lithium acetate method or the like can be used.
  • the host cell is a fungus, a plant cell or an animal cell, a particle cancer method or a transfection method can also be used.
  • the present disclosure includes not only a transformant obtained by introducing a recombinant DNA into a host cell, which comprises a DNA encoding a mutant glycine oxidase of the above-described configuration and a vector capable of autonomous replication, but also the above-mentioned transformant. Also included are cells in which a DNA encoding a constitutive mutant glycine oxidase has been introduced into the genome of the host cell.
  • the method for introducing the DNA encoding the mutant glycine oxidase of the above constitution into the genome of the host cell is not particularly limited. For example, if the host cell is Saccharomyces cerevisiae or its related species, YIp type plasmid is used.
  • the DNA can be integrated into the chromosome.
  • the DNA can be integrated into a chromosome or the like using genome editing technology.
  • the culture of the transformant or DNA-incorporated cell obtained in this manner may be performed using a known nutrient medium depending on various conditions such as the type of host cell or the purpose of culture.
  • a known nutrient medium depending on various conditions such as the type of host cell or the purpose of culture.
  • E. coli as a host to replicate a recombinant DNA
  • LB medium LB culture solution
  • a known medium corresponding to the type of the transformant or cell is produced. Should be used.
  • various known additives may be added to the culture medium.
  • the mutant glycine oxidase according to the present disclosure is prepared by introducing (or incorporating) a DNA encoding the mutant glycine oxidase into a host cell by various methods to prepare a transformant (or a cell incorporating DNA). It can be produced by culturing this transformant (or DNA-incorporated cell). Therefore, the present disclosure also includes a method for producing a mutant glycine oxidase in which such cells are cultured and the mutant glycine oxidase having the above-described configuration is collected from the obtained culture.
  • the culture scale of the cells is not particularly limited.
  • a liquid medium culture medium
  • a test tube or a flask it may be a large scale culture using a jar fermenter, or a large scale culture using a tank at an industrial level.
  • the method for collecting the mutant glycine oxidase having the above-mentioned configuration from cultured cells is not particularly limited, and known methods can be used.
  • the expressed mutant glycine oxidase is accumulated in the cells, the cultured cells are collected, the cells are disrupted by a known method to obtain a crude enzyme solution, and the crude enzyme solution is obtained by a known method.
  • Mutant glycine oxidase may be collected by purification or concentration. If it is not necessary to purify or concentrate, the above crude enzyme solution may be used as a mutant glycine oxidase according to the present disclosure.
  • the mutant glycine oxidase may be collected from the entire culture including the cultured cells and the culture solution.
  • the mutant glycine oxidase according to the present disclosure can retain the kinetic constant K m substantially within the same range as that of the conventional mutant glycine oxidase, and can also be a conventional mutation.
  • the mutant glycine oxidase according to the present disclosure can be easily produced, for example, by introducing a DNA encoding the mutant glycine oxidase into a host cell. Therefore, it becomes possible to mass-produce the mutant glycine oxidase according to the present disclosure at an industrial level, and, for example, as a reagent for enzyme measurement of glycine or as a reagent for an automatic measurement system of glycine etc. It will also be possible to
  • HTA 426 strain was used as a bacillus bacterium from which wild-type glycine oxidase was derived in this example (for convenience of explanation, Geobacillus kaustophilus HTA 426 strain is referred to as "HTA 426" below) And abbreviated it).
  • HTA 426 is available, for example, from RIKEN RIKEN BioResource Center (RIKEN BRC) Microorganism Material Development Laboratory (JCM) (JCM 12893).
  • the assay buffer one having a composition of 1 mM sodium pyrophosphate (pH 8.5), 5 mM 4-aminoantipyrine, 20 mM phenol is used, and the optimum conditions are in the presence of 10 mM pyrophosphate and 1 mM glycine (substrate) It was at 37 ° C.
  • the method of measuring the enzyme activity of glycine oxidase in the present example that is, the method of measuring the enzyme activity performed according to the method described in Non-Patent Document 1 using the above-mentioned assay buffer, It is called "measurement method”.
  • the optimum pH is 10 mM phosphate buffer (pH 7.0 to 7.5), 10 mM HEPES buffer (pH 7.5 to 8.0) in place of the above-mentioned assay buffer in this method for measuring glycine oxidase activity
  • 10 mM pyrophosphate buffer pH 8.0 to 8.5
  • pyrophosphate and carbonate mixed buffer 5 mM pyrophosphate and 5 mM carbonate buffer, pH 9.0 to 10.0
  • thermostability is measured by changing the reaction temperature in the range of 30 to 90 ° C. and incubating for 15 minutes or 1 hour in the method for measuring glycine oxidase activity, and measuring the remaining enzyme activity, 37 ° C. It was evaluated as relative activity based on enzyme activity.
  • the pH stability is determined by replacing 100 mM phosphate buffer (pH 5.5 to 7.5) with 10 mM pyrophosphate buffer (pH 8.0 to 8.5) in place of the above-mentioned assay buffer in this method for measuring glycine oxidase activity. After incubation at 4 ° C. for 24 hours with pyrophosphate and carbonate mixed buffer (5 mM pyrophosphate and 5 mM carbonate buffer, pH 9.0 to 10.0), the remaining enzyme activity is measured, pH 8. It was evaluated as a relative activity based on the enzyme activity of 5.
  • the specific activity was calculated by dividing the enzyme activity (unit: unit [U]) of the enzyme sample used in the present method for measuring glycine oxidase activity by the enzyme mass (unit: mg) contained in the enzyme sample .
  • the enzyme mass is the mass of the protein contained in the enzyme sample, and was quantified by measuring the absorbance at 595 nm by the Bradford method.
  • wild type glycine oxidase The amino acid sequence of wild type glycine oxidase is shown in FIG. 1 and SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the base sequence of the gene (DNA) encoding wild type glycine oxidase is shown in FIG. 2 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Also, for convenience of explanation, wild-type glycine oxidase is abbreviated as "WT-GOX".
  • H244K is a mutant-type enzyme obtained by introducing a mutation into a wild-type glycine oxidase derived from Bacillus subtilis (B. subtilis) which is not a thermophilic bacterium, and the introduction of the mutation is a non-patent document. It is carried out by the method described in 2.
  • Example 1 As described in the above embodiment, in WT-GOX of Comparative Example 1, the partial amino acid sequence at position 248 (position 248) to position 255 (position 255) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: It has become clear that it is a characteristic area unique to heat bacteria. Therefore, a mutation was introduced into the characteristic region of this WT-GOX based on the method described in Non-Patent Document 2, and a plasmid vector containing a glycine oxidase gene into which mutations were randomly introduced was obtained. For convenience of explanation, in this example, the mutant glycine oxidase is abbreviated as “V-GOX”.
  • the plasmid vector was introduced into the host cell (E. coli BL21 (DE3)) to confirm the expression of V-GOX.
  • E. coli BL21 DE3
  • sequence analysis was performed on these 14 types of V-GOX, and their enzyme activities were measured.
  • V-GOX1 to V-GOX8 eight types of V-GOX (V-GOX1 to V-GOX8) could be identified.
  • the amino acid at position 251 (position 251) in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 is one in which glycine (Gly, G) is substituted with another amino acid.
  • the enzyme activity in Table 2 is shown as a ratio (fold) of the enzyme reaction rate (use of a crude enzyme solution) of V-GOX based on WT-GOX as the standard (1).
  • V-GOX1 having the amino acid sequence in which the amino acid at position 251 (position 251) is substituted with glycine (Gly, G) to glutamine (Gln, Q) has the highest enzyme activity It was shown. Therefore, the V-GOX1 was purified, and then its molecular weight (SDS-PAGE), optimum temperature, optimum pH, thermal stability, pH stability, specific activity, kinetic constant Km were evaluated. The results of the specific activity, the thermal stability and the kinetic constant K m are shown in the above Table 1, and the specific activity is shown in FIG. 3A and the thermal stability is also shown in FIG. 3B. The evaluation results of the enzyme properties are shown in Table 3 together with the conditions.
  • the enzyme of Comparative Example 1 that is, WT-GOX derived from HTA 426 is the enzyme of Comparative Example 2, that is, a commercially available mutant glycine oxidase derived from Bacillus subtilis which is not a thermophilic bacterium. Its thermal stability is 15 ° C. higher than that of H244K, which shows excellent thermal stability, but its specific activity is greatly inferior. As for the kinetic constants K m, towards the WT-GOX in Comparative Example 1 is higher than H244K of Comparative Example 2.
  • V-GOX1 which was the most active of the enzymes of Example 1, was 5.7 times that of WT-GOX of Comparative Example 1 and 3.3 compared with H244K of Comparative Example 2. It has twice the specific activity.
  • the thermal stability of V-GOX1 is 10 ° C. higher than that of WT-GOX of Comparative Example 1, and is also 25 ° C. higher than H244K of Comparative Example 2.
  • the kinetic constant K m of V-GOX1 is a value lower than that of WT-GOX of Comparative Example 1 and is a value that is comparable to the value of H244K of Comparative Example 2 it can.
  • the mutant enzymes of V-GOX1 to V-GOX8 obtained by introducing a mutation into a characteristic region of a bacillus family thermophilic bacterium are also, it has higher enzyme activity than WT-GOX.
  • V-GOX8 which has the lowest enzyme activity, has a reaction rate 2.5 times or more that of WT-GOX.
  • V-GOX 2 to 8 have substantially the same enzyme properties as V-GOX 1 shown in Table 3 although not specifically shown. Therefore, not only V-GOX1 but also seven enzymes of V-GOX 2 to 8 have both excellent enzyme activity and excellent thermal stability, and the kinetic constant K m is also a conventional mutant enzyme And has a value that does not change much. Therefore, it can be seen that V-GOX 1-8 is a characteristic mutant enzyme having enzyme properties as shown in Table 3 as compared to WT-GOX.
  • glycine (G) which is amino acid 251 (position 251) of WT-GOX is alanine (A), glutamic acid (E), histidine It is substituted by various amino acids such as (H), isoleucine (I), asparagine (N), glutamine (Q), arginine (R), or threonine (T). Therefore, it is understood that substituting glycine with an amino acid other than glycine can provide V-GOX having higher activity than WT-GOX. In particular, it is also understood that substitution of glycine with any of the above eight types facilitates obtaining a highly active V-GOX.
  • amino acids substituted from glycine in relatively high enzyme activity V-GOX 1-5 are basic or hydrophobic amino acids. That is, glutamine which is a substituted amino acid of V-GOX1, arginine which is a substituted amino acid of V-GOX3, and histidine which is a substituted amino acid of V-GOX4 are all basic amino acids and substituted amino acids of V-GOX2. Certain isoleucine and threonine, which is a substituted amino acid of V-GOX5, are both hydrophobic amino acids. Therefore, it is understood that the amino acid substituted from glycine in WT-GOX is preferably a basic amino acid or a hydrophobic amino acid.
  • the present invention achieves both good enzyme activity and good heat stability obtained by introducing a mutation to a glycine oxidase derived from a Bacillus family thermophilic bacterium including Bacillus genus or Geobacillus genus thermophilic bacterium. In the field related to the mutant glycine oxidases, they can be used widely and suitably.

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Abstract

変異型グリシンオキシダーゼは、バチルス科好熱細菌に由来する野生型のアミノ酸配列の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換したものであり、次の酵素性質を有する。分子量：ＳＤＳ－ＰＡＧＥで４０，０００±２，０００ダルトン。至適温度：ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５の条件で４５℃。至適ｐＨ：ピロリン酸塩存在下、３７℃の条件でｐＨ８．０。熱安定性：ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５、１時間保持の条件で７０℃まで安定。ｐＨ安定性：ピロリン酸塩存在下、４℃、２４時間保持の条件でｐＨ５．５～１０．０の範囲内で安定。比活性：１．２ユニット／ｍｇ以上。速度論定数Ｋｍ：０．２ｍＭ以下。

Description

バチルス科好熱細菌由来変異型グリシンオキシダーゼおよびその製造方法
　本発明は、バチルス科好熱細菌由来変異型グリシンオキシダーゼおよびその製造方法に関し、特に、良好な熱安定性と良好な酵素活性とを両立することが可能な、バチルス科好熱細菌由来変異型グリシンオキシダーゼおよびその製造方法に関する。
　グリシンは、Ｄ体またはＬ体の立体異性を持たない最も単純な構造を有するアミノ酸であり、タンパク質を構成するアミノ酸の１種であるとともに、種々の生体物質を生合成する際の原料（出発物質）としても知られている。グリシンを測定する方法の一つとしては、質量分析法（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アミノ酸分析装置等を用いた機械測定法が知られている。ただし、機械測定法では一般に、測定機器が高価かつ維持費用が高コストであるとともに、操作にも熟練を要する。
　そこで、より低コストかつ簡便な測定方法として、グリシンに作用するグリシンオキシダーゼを用いた酵素測定法等も提案されている。代表的なグリシンオキシダーゼの一つに、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来のものが知られている。例えば、非特許文献１には、バチルス・スブチリス由来のグリシンオキシダーゼについて具体的な報告がなされている。
　また、現在市販されているグリシンオキシダーゼとしては、例えば、バイオビジョン社（BioVision, Inc）製の商品番号Ｈ２４４Ｋが挙げられるが、この市販グリシンオキシダーゼもバチルス・スブチリス由来であり、野生型のグリシンオキシダーゼに変異を導入した変異型酵素である。非特許文献２には、この変異型グリシンオキシダーゼについて具体的な報告がなされているとともに、これを用いたバイオセンサーも提案されている。
　さらに、特許文献１には、アミノ酸残基の少なくとも１つを変位させて、酵素活性、熱安定性、基質特異性等の特性を改変した改変グリシン酸化酵素と、これを用いたグリシンの分析方法が開示されている。特許文献１の実施例で具体的に開示される改変グリシン酸化酵素も、バチルス・スブチリス由来であり、野生型のグリシン酸化酵素に対してアミノ酸残基の変異を導入したものである。
国際公開第２０１４／１５７７０５号
Yoshiaki Nishiya, Tadayuki Imanaka, "Purification and characterization of a novel glycine oxidase from Bacillus subtilis" FEBS (Federation of European Biochemical Societies) Letter Vol.438 pp.263-266 (1998) Elena Rosini, Luciano Piubelli, Gianluca Molla, Luca Frattini, Mattia Valentino, Antonio Varriale, Sabato D'Auria and Loredano Pollegioni, "Novel biosensors based on oprimized glycine oxidase" FEBS (Federation of European Biochemical Societies) Journal Vol.281 pp.3460-3472(2014)
　特許文献１に開示の改変グリシン酸化酵素は、確かに野生型に対して、酵素活性、熱安定性、基質特異性等の特性の改変を可能としているが、例えば、その比活性等は市販のグリシンオキシダーゼと同程度となっている。
　また近年、産業上の利用性を向上するために、各種酵素に対しては、より高温の条件下でも良好な酵素活性を保持できるような熱安定性（あるいは耐熱性）が求められている。特許文献１においても、野生型のグリシン酸化酵素を改変することで熱安定性の改善を図っているが、最近では、より一層良好な熱安定性が求められる傾向にある。
　本発明はこのような課題を解決するためになされたものであって、良好な酵素活性とともに良好な熱安定性も実現することが可能な、細菌由来の変異型グリシンオキシダーゼとその製造方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る変異型グリシンオキシダーゼは、前記の課題を解決するために、バチルス科好熱細菌に由来する野生型グリシンオキシダーゼにおけるアミノ酸配列の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換した変異型酵素であり、分子量が、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、４０，０００±２，０００ダルトンであり、至適温度が、ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５の条件で４５℃であり、至適ｐＨが、ピロリン酸塩存在下、３７℃の条件でｐＨ８．０であり、熱安定性が、ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５、１時間保持の条件で７０℃まで安定であり、ｐＨ安定性が、ピロリン酸塩存在下、４℃、２４時間保持の条件でｐＨ５．５～１０．０の範囲内で安定であり、比活性が１．２ユニット／ｍｇ以上であり、速度論定数（ミカエリス定数）Ｋｍが０．２ｍＭ以下である構成である。
　前記構成によれば、変異型グリシンオキシダーゼは、バチルス科好熱細菌由来の野生型グリシンオキシダーゼに対して変異を導入することで前記の酵素性質を実現している。この変異型グリシンオキシダーゼは、従来の変異型グリシンオキシダーゼに比べても実質的に同程度の範囲内となる速度論定数Ｋｍを保持することができるとともに、従来の変異型グリシンオキシダーゼだけでなく野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い熱安定性を実現することができ、さらには、従来の変異型グリシンオキシダーゼおよび野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い比活性を実現したものである。これにより、変異型グリシンオキシダーゼにおいて、良好な酵素活性とともに良好な熱安定性も実現することが可能となる。
　前記構成の変異型グリシンオキシダーゼにおいては、前記野生型グリシンオキシダーゼのアミノ酸配列に含まれる、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、システイン（Ｃ）、およびチロシン（Ｙ）の順で結合する部分アミノ酸配列におけるグリシンを他のアミノ酸に置換したものである構成であってもよい。
　また、本発明に係る変異型グリシンオキシダーゼは、前記の課題を解決するために、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を示す、バチルス科好熱細菌に由来するグリシンオキシダーゼの変異型酵素であって、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２５１番目のアミノ酸が、グリシンから他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する構成であってもよい。
　前記構成によれば、変異型グリシンオキシダーゼは、バチルス科好熱細菌由来の野生型グリシンオキシダーゼに対して前記の位置に変異を導入したものである。この変異型グリシンオキシダーゼは、従来の変異型グリシンオキシダーゼに比べても実質的に同程度の範囲内となる速度論定数Ｋｍを保持することができるとともに、従来の変異型グリシンオキシダーゼだけでなく野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い熱安定性を実現することができ、さらには、従来の変異型グリシンオキシダーゼおよび野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い比活性を実現したものである。これにより、変異型グリシンオキシダーゼにおいて、良好な酵素活性とともに良好な熱安定性も実現することが可能となる。
　また、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼにおいては、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２５１番目のアミノ酸が、グリシンから塩基性アミノ酸または疎水性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する構成であってもよい。
　また、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼにおいては、前記塩基性アミノ酸が、グルタミン、アルギニン、またはヒスチジンであり、前記疎水性アミノ酸が、イソロイシンまたはスレオニンである構成であってもよい。
　また、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼにおいては、前記他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、またはスレオニンである構成であってもよい。
　また、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼにおいては、前記バチルス科好熱細菌が、バチルス（Bacillus）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属、ゲオバチルス（Geobacillus）属、スルホバチルス（Sulfobacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、または、サリニコッカス（Salinicoccus）属に属する細菌である構成であってもよい。
　また、本発明には、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡが含まれる。
　また、本発明には、前記構成のＤＮＡと自律複製可能なベクターとを含む、複製可能な組換えＤＮＡも含まれる。
　また、本発明には、前記構成のＤＮＡ、または、前記構成の組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる細胞も含まれる。
　また、本発明には、前記構成の細胞を培養し、得られる培養物から前記変異型グリシンオキシダーゼを採取する構成の変異型グリシンオキシダーゼの製造方法も含まれる。
　本発明の上記目的、他の目的、特徴、および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
　本発明では、以上の構成により、良好な酵素活性とともに良好な熱安定性も実現することが可能な、細菌由来の変異型グリシンオキシダーゼとその製造方法を提供することができる、という効果を奏する。
図１は、本発明において、実施の形態で例示する野生型グリシンオキシダーゼのアミノ酸配列を１文字表示で示す配列図である。 図２は、図１のアミノ酸配列を有する野生型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を示す配列図である。 図３Ａは、実施例および比較例におけるそれぞれのグリシンオキシダーゼの比活性を対比するグラフであり、図３Ｂは、実施例および比較例におけるそれぞれのグリシンオキシダーゼの熱安定性を対比するグラフである。
　本開示に係る細菌由来の変異型グリシンオキシダーゼは、バチルス科好熱細菌に由来する野生型グリシンオキシダーゼにおけるアミノ酸配列の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換した変異型酵素であり、従来のグリシンオキシダーゼに比較しても特徴的な酵素特性を有している。
　［バチルス科好熱細菌］
　本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼの由来となるバチルス科好熱細菌は、特に限定されず、分類学上、バチルス科（Bacillaceae）に分類され、かつ、好熱性を有する細菌であればよい。ここでいう好熱性とは、当該細菌の至適生育温度が４５℃以上であるか、または、当該細菌の生育限界温度が５５℃以上であるか、もしくはその両方を満たしていることを意味するものとする。
　バチルス科の細菌としては、具体的には、例えば、バチルス（Bacillus）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アノキシバチルス（Anoxybacillus）属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属、ゲオバチルス（Geobacillus）属、ハロバチルス（Halobacillus）属、オセアノバチルス（Oceanobacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、スルホバチルス（Sulfobacillus）属、ビルジバチルス（Virgibacillus）属、または、サリニコッカス（Salinicoccus）属等に属する細菌を挙げることができるが、特に限定されない。
　後述する実施例では、バチルス科好熱細菌として、ゲオバチルス・カウストフィルス（Geobacillus kaustophilus）ＨＴＡ４２６株を用いている。このゲオバチルス・カウストフィルスＨＴＡ４２６株由来の野生型グリシンオキシダーゼは、他のバチルス科好熱細菌である、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Geobacillus thermoleovorans）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）、およびゲオバチルス・スブテラネウス（Geobacillus subterraneus）のそれぞれに由来するグリシンオキシダーゼのアミノ酸配列との間で、高い相同性を有する特徴的領域が存在する。
　市販のグリシンオキシダーゼとしては、前記の通り、非好熱性のバチルス科細菌であるバチルス・スブチリス由来の変異型酵素が知られている。なお、説明の便宜上、バチルス・スブチリス由来のグリシンオキシダーゼのうち野生型のものを、「Ｂ．スブチリス野生型グリシンオキシダーゼ」と称し、変異型のものを「Ｂ．スブチリス変異型グリシンオキシダーゼ」と称する。また、ゲオバチルス・カウストフィルス（G. kaustophilus）ＨＴＡ４２６株由来のグリシンオキシダーゼも、説明の便宜上「Ｇ．カウストフィルス野生型グリシンオキシダーゼ」と称する。
　Ｂ．スブチリス野生型グリシンオキシダーゼの立体構造は、例えば、非特許文献２において報告されており、Ｇ．カウストフィルス野生型グリシンオキシダーゼの立体構造は、例えば、参考文献１：Takako Shiono, Takaomi Nomura, Yoshiaki Nishiya, Ryoichi Arai, "Crystal structure of glycine oxidase from Geobacillus kaustophilus" Photon Factory Activity Report 2014#32, PART B, Users' Report (Biological Science, No.204), 2015において報告されている。
　Ｂ．スブチリス野生型グリシンオキシダーゼでは、７種のモチーフが知られており、例えば、非特許文献２および特許文献１の実施例では、これらモチーフの一つであるＨＣＹモチーフに変異を導入している。ＨＣＹモチーフは、グリシン等の基質がグリシンオキシダーゼの活性中心に向かう経路に位置する。
　Ｇ．カウストフィルス野生型グリシンオキシダーゼは、後述する実施例でも実験的に例証しているように、Ｂ．スブチリス変異型グリシンオキシダーゼよりも優れた熱安定性を有するものの、酵素活性については大きく劣っている。
　そこで、本発明者らは、Ｇ．カウストフィルス野生型グリシンオキシダーゼにおいても、Ｂ．スブチリス変異型グリシンオキシダーゼと同様に、野生型のＨＣＹモチーフまたはＨＣＹモチーフに相当する位置に変異を導入すれば、熱安定性を維持しつつ酵素活性を向上できるのではないかと考え、鋭意検討した。ところが、Ｇ．カウストフィルス野生型グリシンオキシダーゼと、Ｂ．スブチリス野生型グリシンオキシダーゼとの間でアミノ酸配列を比較したところ、Ｇ．カウストフィルス野生型グリシンオキシダーゼには、Ｂ．スブチリス野生型グリシンオキシダーゼには見られない特徴的領域が存在することが明らかとなった。
　この特徴的領域は、図１に示すように、Ｇ．カウストフィルス野生型グリシンオキシダーゼのアミノ酸配列においては、２５０番目のアスパラギン（Ｎ）、２５１番目のグリシン（Ｇ）、２５２番目のシステイン（Ｃ）、および２５３番目のチロシン（Ｙ）の順で結合する部分アミノ酸配列である。しかも、この特徴的領域は、前記の通り、他のバチルス科好熱細菌由来のグリシンオキシダーゼのアミノ酸配列との間で高い相同性を有していることも明らかとなった。
　そこで、後述する実施例でも説明するように、この特徴的領域に対して変異の導入を試みたところ、２５１番目のグリシンを他のアミノ酸に置き換えた変異型グリシンオキシダーゼにおいては、野生型よりも酵素活性が向上することに加え、熱安定性が維持されるどころか向上し、さらには、速度論定数（ミカエリス定数）Ｋｍも野生型より低くなることが明らかとなった。
　したがって、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、バチルス科好熱細菌由来の野生型グリシンオキシダーゼに対して、当該バチルス科好熱細菌において広く保存される特徴的領域に対して変異を導入することで、単に酵素活性が向上するだけでなく、予想外の優れた酵素性質も得られたものであるということができる。
　それゆえ、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼの由来となるバチルス科好熱細菌は、前記の通り、バチルス科に分類され、かつ、好熱性を有するものであればよいが、代表的には、ゲオバチルス属の好熱細菌を挙げることができ、より好ましい一例としては、ゲオバチルス・カウストフィルスを挙げることができる。
　また、ゲオバチルス属の好熱細菌としては、前記の通り、ゲオバチルス・カウストフィルス、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（G. thermoleovorans）、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）、およびゲオバチルス・スブテラネウス（G. subterraneus）に加え、ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス（Geobacillus thermoglucosidasius）、ゲオバチルス・カルボキシロシロシリチクス（Geobacillus calboxylosilyticus）、ゲオバチルス・テピダマンス（Geobacillus tepidamans）、ゲオバチルス・カラクトシダシウス（Geobacillus galactosidasius）、ゲオバチルス・ザリハエ（Geobacillus zalihae）、その他の分類されないゲオバチルス属（Geobacillus sp.）の株等が挙げられるが特に限定されない。
　ここで、例えば、参考文献２：Messele Yohannes EQUAR, Yasushi TANI, Hisaaki MIHARA "Purification and Properties of Glycine Oxidase from Pseudomonas putida KT2440" Journal of Nutritional Science and Vitaminology, Vol.61 pp.506-510 (2015)には、グリシンオキシダーゼの相同性に関して系統発生的な解析が示されており、これによれば、バチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、ゲオバチルス属、スルホバチルス属、パエニバチルス属、およびサリニコッカス属については、同系統から分化していったことが明らかとなっている。言い換えれば、バチルス科細菌の中でも、少なくともこれら各属由来のグリシンオキシダーゼにおいては、特徴的領域が保存されている可能性が高いことがわかる。
　それゆえ、本開示において、グリシンオキシダーゼの由来となるバチルス科好熱細菌のより好ましい一例としては、ゲオバチルス属以外としては、バチルス属、アリシクロバチルス属、ブレビバチルス属、スルホバチルス属、パエニバチルス属、またはサリニコッカス属に属する好熱細菌を挙げることができる。
　［変異型グリシンオキシダーゼ］
　本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、前記の通り、バチルス科好熱細菌由来の野生型グリシンオキシダーゼに変異を導入することにより得られるものであり、後述する実施例にも示すように、次の（１）～（７）に示す特徴的な酵素特性を有するものであればよい。
（１）分子量が、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）において、４０，０００±２，０００ダルトンである。
（２）至適温度が、ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５の条件で４５℃である。
（３）至適ｐＨが、ピロリン酸塩存在下、３７℃の条件でｐＨ８．０である。
（４）熱安定性が、ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５、１時間保持の条件で７０℃まで安定である。
（５）ｐＨ安定性が、ピロリン酸塩存在下、４℃、２４時間保持の条件でｐＨ５．５～１０．０の範囲内で安定である。
（６）比活性が１．２ユニット／ｍｇ以上である。
（７）速度論定数（ミカエリス定数）Ｋｍが０．２ｍＭ以下である。
　ここで、上記の酵素特性のうち（１）分子量については、野生型グリシンオキシダーゼの分子量を基準としたものであるが、３９，０００±１，０００ダルトンの範囲内であってもよい。また、（６）比活性については、２．４ユニット／ｍｇ以上であると好ましく、４．０ユニット／ｍｇ以上であるとより好ましい。
　なお、前記の（１）～（７）の酵素特性は、本開示においては、後述する実施例における「グリシンオキシダーゼの諸性質の評価」に基づいて評価することができるが、公知の他の評価方法で評価してもよい。
　より具体的な変異型グリシンオキシダーゼとしては、前記の通り、実施例で詳細に説明するゲオバチルス・カウストフィルスＨＴＡ４２６株由来の変異型グリシンオキシダーゼを挙げることができ、この変異型グリシンオキシダーゼは、図１に示すように、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列における２５１番目のアミノ酸が、グリシンから他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するもの、すなわち、配列用の配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。なお、配列番号３では、２５１番目（２５１位）のアミノ酸を任意のアミノ酸であるＸａａで示しており、図１では、矢印で任意のアミノ酸Ｘに置換されていることを図示している。
　もちろん、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列における２５１番目（２５１位）のグリシンが変異されたもの（配列番号３のアミノ酸配列を有するもの）に限定されず、前記（１）～（７）の特徴的な酵素性質を有するものであればよいが、配列番号１を基準とすれば、この配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の相同性（または配列同一性）を有するものであればよく、より好ましくは９７％以上の相同性を有するものであればよく、さらに好ましくは９８％以上の相同性を有するものであればよい。
　また、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、後述する実施例で説明しているように、配列番号１を基準とした場合に、２５１番目（２５１位）のグリシンが、他の塩基性アミノ酸または疎水性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するものであると好ましい。これにより、野生型グリシンオキシダーゼと比較してより良好な酵素活性を実現することが可能となる。具体的な塩基性アミノ酸は特に限定されないが、グルタミン、アルギニン、またはヒスチジン等を挙げることができる。また、具体的な疎水性アミノ酸も特に限定されないが、イソロイシンまたはスレオニンを挙げることができる。あるいは、後述する実施例で説明するように、他のアミノ酸としては、アラニン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、またはスレオニンのいずれかであってもよい。
　このように、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、バチルス科好熱細菌由来の野生型グリシンオキシダーゼに対して変異を導入することで前記の酵素性質を実現したものである。この変異型グリシンオキシダーゼでは、従来の変異型グリシンオキシダーゼに比べても実質的に同程度の範囲内となる速度論定数Ｋｍを保持することができるとともに、従来の変異型グリシンオキシダーゼだけでなく野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い熱安定性を実現することができ、さらには、従来の変異型グリシンオキシダーゼおよび野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い比活性を実現することができる。それゆえ、本開示によれば、良好な酵素活性とともに良好な熱安定性も実現することが可能な変異型グリシンオキシダーゼを得ることができる。
　［変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡ］
　本開示には、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡも含まれる。配列表の配列番号２は、ゲオバチルス・カウストフィルスＨＴＡ４２６株由来のグリシンオキシダーゼをコードした塩基配列を示すが、本開示に係るＤＮＡの代表的な一例としては、例えば、この配列番号２に示す塩基配列において変異を導入した塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
　このようなＤＮＡとして、例えば、図２に示すように、配列表の配列番号２で示される塩基配列における７５１～７５３番目のヌクレオチドで構成されるコドンが、グリシンをコードするグアニン－グアニン－シトシン（ＧＧＣ）のコドンから他のアミノ酸をコードするコドンに置換された塩基配列を有するＤＮＡ、すなわち、配列表の配列番号４に示される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。なお、配列番号４においては、２５１番目のアミノ酸をコードする７５１～７５３番目のヌクレオチドを任意のヌクレオチドであるｎで示しており、図２では、矢印により任意のヌクレオチドＮに置換されていることを図示している。
　配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡは、前記の通り、ゲオバチルス・カウストフィルスＨＴＡ４２６株由来の野生型グリシンオキシダーゼをコードしたＤＮＡである。したがって、配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡは、野生型グリシンオキシダーゼをコードしたＤＮＡにおいて、２５１番目のグリシンに対応するコドンが別のアミノ酸をコードするコドンに置換されたＤＮＡということができる。
　ここで、本開示に係るＤＮＡは、配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡに限定されず、例えば、配列番号４に示す塩基配列に相同的な塩基配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする他の塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。また、本開示に係るＤＮＡは、配列番号４に示す塩基配列において、２５１番目のアミノ酸に相当するコドンを除いた位置に変異が導入された変異ＤＮＡであってもよい。この変異ＤＮＡにおいては、コードする変異型グリシンオキシダーゼの活性を保持する範囲で、配列番号４に示される塩基配列において１個または２個以上の塩基が欠失、置換もしくは付加した塩基配列を有するものが挙げられる。欠失、置換もしくは付加する塩基の個数としては、通常、１～１２０個の範囲内であればよく、１～６０個の範囲内であることが好ましく、１～３０個の範囲内がより好ましい。
　また、本開示には、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターとを含む、複製可能な組換えＤＮＡも含まれる。このような自律複製可能なベクターとしては、代表的には、プラスミドベクターを挙げることができる。
　具体的なプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２等のｐＢＲ系プラスミド；ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等のｐＵＣ系プラスミド；pBlueScript II，pBluescript II SK(+/-)，pBluescript II KS(+/-)，pBluescript II XR，pBluescript II RI等のｐＢＳ系プラスミド；ｐＥＴ－３ａ～３ｄ，ｐＥＴ－１１ａ～ｄ，ｐＥＴ－１４ｂ，ｐＥＴ－１５ｂ，ｐＥＴ－２１ａ～２１ｄ等のｐＥＴ系プラスミド；ｐＧＥＸ－１，ｐＧＥＸ－２Ｔ，ｐＧＥＸ－３Ｘ等のｐＧＥＸ系プラスミド；ｐＴＺ４，ｐＴＺ５，ｐＴＺ１２，ｐＴＺ－１８Ｒ，ｐＴＺ－１９Ｒ等のｐＴＺ系プラスミド；ｐＳＵ０，ｐＳＵ７，ｐＳＵ２２，ｐＳＵ２３等のｐＳＵ系プラスミド；ｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４，ｐＨＹ系プラスミド，ｐＮＵ系プラスミド，ｐＮＹ３２６，ｐＮＣ系プラスミド等のバチルス属系プラスミド；ｐＨＶ１４，ＴＲｐ７，ＹＥｐ系プラスミド，ｐＢＳ７等のシャトルベクタープラスミド；等を挙げることができる。
　これらプラスミドは、宿主（ホスト）となる細胞の種類、発現系の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。また、自律複製可能なベクターとしては、ファージベクター等であってもよい。
　自律複製可能なベクターに、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡを挿入する方法は特に限定されず、公知の方法を好適に用いることができる。一般的には、例えば、変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡ（または遺伝子）と、ベクターとを公知のＩＩ型制限酵素で消化（切断）し、これらＤＮＡ断片およびベクター断片を、必要に応じてアニーリング処理した後に、ＤＮＡリガーゼ等を用いてライゲーションする方法が挙げられるが特に限定されない。
　なお、前記構成の複製可能な組換えＤＮＡには、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡ、および、自律複製可能なベクター以外のＤＮＡを含んでいてもよい。例えば、自律複製可能なベクターに含まれない制御配列をコードするＤＮＡを含んでもよいし、他のタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ（または遺伝子等）を含んでもよい。このとき、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼは、他のタンパク質およびペプチドとともにキメラタンパク質を構成するように、複製可能な組換えＤＮＡ中に組み込まれてもよい。
　［変異型グリシンオキシダーゼの製造方法等］
　このような組換えＤＮＡは、公知の宿主となる細胞に導入することができる。したがって、本開示には、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターとを含む、複製可能な組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体も含まれる。宿主細胞としては、一般的には、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母等の微生物を挙げることができるが、これに限定されず、植物細胞であってもよいし動物細胞であってもよい。
　後述する実施例では、複製可能な組換えＤＮＡを複製する際の宿主細胞も、複製した組換えＤＮＡにより前記構成の変異型グリシンオキシダーゼを生産する際の宿主細胞も、いずれも大腸菌を用いている。しかしながら、本開示はこれに限定されず、例えば、複製可能な組換えＤＮＡを複製する際には、宿主細胞として大腸菌を用い、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼを生産する際には、宿主細胞として枯草菌すなわちバチルス属の細菌を用いてもよい。また、近年では、バチルス科細菌の１種であるブレビバチルス属の細菌を宿主としたタンパク質発現系が構築されて市販されている。そこで、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼを生産する際には、宿主細胞としてブレビバチルス属の細菌を用いてもよい。
　宿主細胞に前記構成の組換えＤＮＡを導入する方法、すなわち、形質転換法は特に限定されず、宿主細胞の種類または自律複製可能なベクターの種類等に応じた公知の方法を用いることができる。代表的な形質転換法としては、例えば、大腸菌等の細菌であれば、エレクトロポレーション法、塩化カルシウムにより細胞をコンピテントセル化する方法等を挙げることができる。宿主細胞が酵母であれば、当該酵母細胞の細胞壁を部分的に除去してスフェロプラスト化する方法、あるいは、酢酸リチウム法等を用いることができる。また、宿主細胞が真菌、植物細胞、または動物細胞であれば、パーティクル・ガン法またはトランスフェクション法等も用いることができる。
　さらに、本開示には、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターとを含む、組換えＤＮＡを、宿主細胞に導入して得られる、形質転換体だけでなく、前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞のゲノムに導入した細胞も含まれる。前記構成の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞のゲノムに導入する方法は特に限定されないが、例えば、宿主細胞が出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）またはその近縁種であればＹＩｐ型プラスミドを用いて、染色体に前記ＤＮＡを組み込むことができる。また、宿主細胞の種類に関わらず、ゲノム編集の技術を用いて染色体等に前記ＤＮＡを組み込むことができる。
　このようにして得られる形質転換体またはＤＮＡ組み込み細胞の培養は、宿主細胞の種類または培養の目的等の諸条件に応じて公知の栄養培地を用いて培養すればよい。例えば、大腸菌をホストとして組換えＤＮＡを複製する場合には、ＬＢ培地（ＬＢ培養液）等を用いればよい。また、前記構成の形質転換体または前記構成のＤＮＡ組み込み細胞を培養して前記構成の変異型グリシンオキシダーゼを生産する場合には、形質転換体または細胞の種類に応じた公知の培地（培養液）を用いればよい。また、諸条件に応じて、培地に対して公知のさまざまな添加成分を添加してもよい。
　このように、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、当該変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡを種々の方法により宿主細胞に導入（または組み込み）して形質転換体（またはＤＮＡ組み込み細胞）を作製し、この形質転換体（またはＤＮＡ組み込み細胞）を培養することによって生産することができる。それゆえ、本開示には、このような細胞を培養し、得られる培養物から前記構成の変異型グリシンオキシダーゼを採取する変異型グリシンオキシダーゼの製造方法も含まれる。
　本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼの製造方法では、細胞の培養スケールは特に限定されず、例えば液体培地（培養液）を用いた場合には、試験管またはフラスコを用いた少量培養であってもよいし、ジャーファーメンターを用いた大量培養であってもよいし、産業レベルであればタンクを用いた大量培養であってもよい。
　培養した細胞から前記構成の変異型グリシンオキシダーゼを採取する方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。発現した変異型グリシンオキシダーゼが細胞内に蓄積される場合には、培養した細胞を集菌し、公知の方法で細胞を破砕して粗酵素液を取得し、この粗酵素液を公知の方法で精製または濃縮することにより、変異型グリシンオキシダーゼを採取すればよい。精製または濃縮する必要がなければ、前記の粗酵素液を、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼとして用いればよい。また、発現した変異型グリシンオキシダーゼが細胞外に有意に分泌される場合には、培養細胞および培養液を含む培養物全体から変異型グリシンオキシダーゼを採取すればよい。
　このように、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、従来の変異型グリシンオキシダーゼに比べても実質的に同程度の範囲内となる速度論定数Ｋｍを保持することができるとともに、従来の変異型グリシンオキシダーゼだけでなく野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い熱安定性を実現することができ、さらには、従来の変異型グリシンオキシダーゼおよび野生型グリシンオキシダーゼに比べても高い比活性を実現したものである。それゆえ、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、グリシンの酵素測定に好適に用いることができる。
　また、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼは、前記の通り、当該変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞に導入すること等により、容易に生産することができる。それゆえ、本開示に係る変異型グリシンオキシダーゼを産業レベルで大量生産することも可能になるとともに、例えば、グリシンの酵素測定用試薬、あるいは、グリシンの自動測定システム用の試薬等として安定的にユーザーに提供することも可能になる。
　本発明について、実施例および比較例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例および比較例において用いられたバチルス科細菌、並びに、クローニング方法および酵素活性測定等については次に示すようにして実施した。
　（バチルス科細菌）
　本実施例で野生型グリシンオキシダーゼの由来としたバチルス科細菌としては、ゲオバチルス・カウストフィルス（Geobacillus kaustophilus ）ＨＴＡ４２６株を用いた（説明の便宜上、ゲオバチルス・カウストフィルスＨＴＡ４２６株を、以下「ＨＴＡ４２６」と略す）。なお、ＨＴＡ４２６は、例えば、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）微生物材料開発室（ＪＣＭ）より入手可能である（ＪＣＭ１２８９３）。
　（グリシンオキシダーゼのクローニング）
　ＨＴＡ４２６からのグリシンオキシダーゼのクローニングは、非特許文献１に記載の方法にしたがって行った。ただし、ベクターとしては、ｐＥＴ－１５ｂのプラスミドベクターを用いるとともに、宿主細胞（ホスト）としては、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いた。
　（グリシンオキシダーゼの酵素活性測定）
　グリシンオキシダーゼの酵素活性の測定についても、非特許文献１に記載の方法にしたがって行った。
　ただし、アッセイバッファーとしては、１ｍＭ　ピロリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）、５ｍＭ　４－アミノアンチピリン、２０ｍＭ　フェノールの組成のものを用い、至適条件は、１０ｍＭ　ピロリン酸塩および１ｍＭ　グリシン（基質）存在下で３７℃とした。
　なお、本実施例におけるグリシンオキシダーゼの酵素活性の測定方法、すなわち、前記のアッセイバッファーを用いて非特許文献１に記載の方法にしたがって行う酵素活性の測定方法を、説明の便宜上「本グリシンオキシダーゼ活性測定方法」と称する。
　（グリシンオキシダーゼの諸性質の評価）
　グリシンオキシダーゼの諸性質の評価は、それぞれ次に説明する条件および／または方法にしたがって行なった。
　（１）分子量は、非特許文献１に記載の方法にしたがって、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により決定した。
　（２）至適温度は、本グリシンオキシダーゼ活性測定方法において、測定温度を２５～４５℃の範囲内で変更することにより評価した。
　（３）至適ｐＨは、本グリシンオキシダーゼ活性測定方法において、前記のアッセイバッファーに代えて、１０ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７．０～７．５）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５～８．０）、１０ｍＭ　ピロリン酸バッファー（ｐＨ８．０～８．５）、並びに、ピロリン酸および炭酸混合バッファー（５ｍＭ　ピロリン酸および５ｍＭ　炭酸バッファー、ｐＨ９．０～１０．０）をそれぞれ用いてｐＨを変更することにより評価した。
　（４）熱安定性は、本グリシンオキシダーゼ活性測定方法において、反応温度を３０～９０℃の範囲内で変更し、１５分間または１時間保温した後に、残存する酵素活性を測定し、３７℃の酵素活性を基準とする相対活性として評価した。
　（５）ｐＨ安定性は、本グリシンオキシダーゼ活性測定方法において、前記アッセイバッファーに代えて、１００ｍＭ　リン酸バッファー（ｐＨ５．５～７．５）、１０ｍＭ　ピロリン酸バッファー（ｐＨ８．０～８．５）、並びに、ピロリン酸および炭酸混合バッファー（５ｍＭ　ピロリン酸および５ｍＭ　炭酸バッファー、ｐＨ９．０～１０．０）を用い、２４時間４℃の条件で保温した後に、残存する酵素活性を測定し、ｐＨ８．５の酵素活性を基準とする相対活性として評価した。
　（６）比活性は、本グリシンオキシダーゼ活性測定方法に用いた酵素試料の酵素活性（単位：ユニット［Ｕ］）を当該酵素試料に含まれる酵素質量（単位：ｍｇ）で除算することにより算出した。なお、酵素質量は、酵素試料に含まれるタンパク質の質量であり、Bradford法により５９５ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。
　（７）速度論定数（ミカエリス定数）Ｋｍは、本グリシンオキシダーゼ活性測定方法において、基質濃度を変更して酵素活性を測定し、ミカエリス・メンテン式に基づいて算出した。
　（比較例１）
　ＨＴＡ４２６由来の野生型グリシンオキシダーゼについて、その比活性、熱安定性、速度論定数Ｋｍを前記の通り評価した。その結果を表１に示すとともに、比活性については図３Ａに、熱安定性については図３Ｂにも示す。
　なお、野生型グリシンオキシダーゼのアミノ酸配列を図１および配列表の配列番号１に示し、野生型グリシンオキシダーゼをコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列を図２および配列表の配列番号２に示す。また、説明の便宜上、野生型グリシンオキシダーゼを「ＷＴ－ＧＯＸ」と略記する。
　（比較例２）
　市販のグリシンオキシダーゼである、BioVision, Inc製の商品番号Ｈ２４４Ｋについて、その比活性、熱安定性、速度論定数Ｋｍを前記の通り評価した。その結果を表１に示すとともに、比活性については図３Ａに、熱安定性については図３Ｂにも示す。
　なお、Ｈ２４４Ｋは、好熱菌ではないバチルス科細菌であるバチルス・スブチリス（B. subtilis）由来の野生型グリシンオキシダーゼに変異を導入した変異型酵素ものであり、その変異の導入は、非特許文献２に記載の方法により行われている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（実施例１）
　前記実施の形態で説明した通り、比較例１のＷＴ－ＧＯＸにおいては、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２４８番目（２４８位）～２５５番目（２５５位）の部分アミノ酸配列が、バチルス科好熱細菌に特有の特徴的領域であることが明らかとなった。そこで、このＷＴ－ＧＯＸの特徴的領域に対して非特許文献２に記載の方法に基づいて変異を導入し、ランダムに変異が導入されたグリシンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターを得た。なお、説明の便宜上、本実施例では、変異型グリシンオキシダーゼを「Ｖ－ＧＯＸ」と略記する。
　このようにしてプラスミドベクターを、非特許文献１に記載の方法に基づいて、前記の宿主細胞（E. coli ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入してＶ－ＧＯＸの発現を確認した。得られたコロニーのうち２０４種について酵素活性を確認したところ、高活性を示すＶ－ＧＯＸを発現する１４種のコロニーが確認された。そこで、これら１４種のＶ－ＧＯＸについてシーケンス解析するとともに、その酵素活性を測定した。
　その結果、表２に示すように、８種のＶ－ＧＯＸ（Ｖ－ＧＯＸ１～Ｖ－ＧＯＸ８）を特定することができた。これらＶ－ＧＯＸでは、配列番号１で示されるアミノ酸配列における２５１番目（２５１位）のアミノ酸が、グリシン（Gly, Ｇ）から他のアミノ酸に置換されたものである。なお、表２における酵素活性は、ＷＴ－ＧＯＸを基準（１）としたときのＶ－ＧＯＸの酵素反応速度（粗酵素溶液使用）の比率（倍）として示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらＶ－ＧＯＸ１～Ｖ－ＧＯＸ８の中でも、２５１番目（２５１位）のアミノ酸がグリシン（Gly, Ｇ）からグルタミン（Gln, Ｑ）に置換されたアミノ酸配列を有するＶ－ＧＯＸ１が最も高い酵素活性を示していた。そこで、このＶ－ＧＯＸ１について、精製を行った後にその分子量（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、至適温度、至適ｐＨ、熱安定性、ｐＨ安定性、比活性、速度論定数Ｋｍを評価した。比活性、熱安定性および速度論定数Ｋｍの結果を前記表１に示とともに、比活性については図３Ａに、熱安定性については図３Ｂにも示し、さらに、これらを含むＶ－ＧＯＸ１の酵素性質の評価結果をその条件とともに表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　（実施例および比較例の対比）
　表１および図３Ａ，図３Ｂから明らかなように、比較例１の酵素すなわちＨＴＡ４２６由来のＷＴ－ＧＯＸは、比較例２の酵素すなわち好熱細菌ではないバチルス・スブチリス由来の市販の変異型グリシンオキシダーゼであるＨ２４４Ｋに比べて、その熱安定性が１５℃高くなっており、優れた熱安定性を示すものの、その比活性は大きく劣っている。また、速度論定数Ｋｍについては、比較例１のＷＴ－ＧＯＸの方が比較例２のＨ２４４Ｋよりも高くなっている。
　これに対して、実施例１の酵素のうち最も高活性であったＶ－ＧＯＸ１は、比較例１のＷＴ－ＧＯＸに比べて５．７倍、比較例２のＨ２４４Ｋに比べても３．３倍の比活性を有している。また、Ｖ－ＧＯＸ１の熱安定性は、比較例１のＷＴ－ＧＯＸに比べても１０℃高くなっており、比較例２のＨ２４４Ｋに比べれば、２５℃も高くなっている。しかも、Ｖ－ＧＯＸ１の速度論定数Ｋｍは、比較例１のＷＴ－ＧＯＸよりも低い値となっており、比較例２のＨ２４４Ｋの値と比べても遜色ない程度の値であるということができる。
　また、表２から明らかなように、ＷＴ－ＧＯＸのアミノ酸配列のうち、バチルス科好熱細菌に特徴的領域に変異を導入することで得られるＶ－ＧＯＸ１～Ｖ－ＧＯＸ８の変異酵素は、いずれもＷＴ－ＧＯＸよりも高い酵素活性を有するものとなっている。これら８種類の中で最も酵素活性の低いＶ－ＧＯＸ８であっても、ＷＴ－ＧＯＸに比べて２．５倍以上の反応速度を有している。
　また、Ｖ－ＧＯＸ２～８は、具体的に示さないが、表３に示すＶ－ＧＯＸ１と同様の酵素性質を実質的に有している。それゆえ、Ｖ－ＧＯＸ１だけでなく、Ｖ－ＧＯＸ２～８の７種類の酵素においても、優れた酵素活性と優れた熱安定性とを両立しており、速度論定数Ｋｍも従来の変異酵素と大きく変わらない値を有している。それゆえ、Ｖ－ＧＯＸ１～８は、ＷＴ－ＧＯＸに比べて表３に示すような酵素特性を有する特徴的な変異酵素であることがわかる。
　さらに、表２にから明らかなように、Ｖ－ＧＯＸ１～８においては、ＷＴ－ＧＯＸの２５１番目（２５１位）のアミノ酸であるグリシン（Ｇ）が、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、またはスレオニン（Ｔ）という多様なアミノ酸に置換されている。それゆえ、グリシンをグリシン以外のアミノ酸に置換することで、ＷＴ－ＧＯＸよりも高活性のＶ－ＧＯＸが得られることがわかる。特に、グリシンが前記８種類のいずれかに置換されることで、高活性のＶ－ＧＯＸが得られやすくなることもわかる。
　加えて、相対的に酵素活性の高いＶ－ＧＯＸ１～５においてグリシンから置換されたアミノ酸は、塩基性または疎水性アミノ酸となっている。すなわち、Ｖ－ＧＯＸ１の置換アミノ酸であるグルタミン、Ｖ－ＧＯＸ３の置換アミノ酸であるアルギニン、並びに、Ｖ－ＧＯＸ４の置換アミノ酸であるヒスチジンは、いずれも塩基性アミノ酸であり、Ｖ－ＧＯＸ２の置換アミノ酸であるイソロイシン、並びに、Ｖ－ＧＯＸ５の置換アミノ酸であるスレオニンは、いずれも疎水性アミノ酸である。それゆえ、ＷＴ－ＧＯＸにおいてグリシンから置換されるアミノ酸は、塩基性アミノ酸または疎水性アミノ酸であることが好ましいことがわかる。
　なお、本発明は前記実施の形態の記載に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態や複数の変形例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施形態が明らかである。従って、上記説明は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造及び／又は機能の詳細を実質的に変更できる。
　本発明は、バチルス属またはゲオバチルス属の好熱細菌を含むバチルス科の好熱細菌に由来するグリシンオキシダーゼに対して変異を導入して得られる、良好な酵素活性と良好な熱安定性とを両立させた変異型グリシンオキシダーゼに関する分野に、広く好適に用いることができる。

Claims (11)

  1. 　バチルス科好熱細菌に由来する野生型グリシンオキシダーゼにおけるアミノ酸配列の少なくとも１つを他のアミノ酸に置換した変異型酵素であり、
    　分子量が、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、４０，０００±２，０００ダルトンであり、
    　至適温度が、ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５の条件で４５℃であり、
    　至適ｐＨが、ピロリン酸塩存在下、３７℃の条件でｐＨ８．０であり、
    　熱安定性が、ピロリン酸塩存在下、ｐＨ８．５、１時間保持の条件で７０℃まで安定であり、
    　ｐＨ安定性が、ピロリン酸塩存在下、４℃、２４時間保持の条件でｐＨ５．５～１０．０の範囲内で安定であり、
    　比活性が１．２ユニット／ｍｇ以上であり、
    　速度論定数（ミカエリス定数）Ｋｍが０．２ｍＭ以下であることを特徴とする、
    変異型グリシンオキシダーゼ。
  2. 　前記野生型グリシンオキシダーゼのアミノ酸配列に含まれる、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、システイン（Ｃ）、およびチロシン（Ｙ）の順で結合する部分アミノ酸配列におけるグリシンを他のアミノ酸に置換したものであることを特徴とする、
    請求項１に記載の変異型グリシンオキシダーゼ。
  3. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を示す、バチルス科好熱細菌に由来するグリシンオキシダーゼの変異型酵素であって、
    　配列番号１で示されるアミノ酸配列における２５１番目のアミノ酸が、グリシンから他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、
    変異型グリシンオキシダーゼ。
  4. 　配列番号１で示されるアミノ酸配列における２５１番目のアミノ酸が、グリシンから塩基性アミノ酸または疎水性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、
    請求項３に記載の変異型グリシンオキシダーゼ。
  5. 　前記塩基性アミノ酸が、グルタミン、アルギニン、またはヒスチジンであり、前記疎水性アミノ酸が、イソロイシンまたはスレオニンであることを特徴とする、
    請求項４に記載の変異型グリシンオキシダーゼ。
  6. 　前記他のアミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、またはスレオニンであることを特徴とする、
    請求項３に記載の変異型グリシンオキシダーゼ。
  7. 　前記バチルス科好熱細菌が、バチルス（Bacillus）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属、ゲオバチルス（Geobacillus）属、スルホバチルス（Sulfobacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、または、サリニコッカス（Salinicoccus）属に属する細菌であることを特徴とする、
    請求項１から６のいずれか１項に記載の変異型グリシンオキシダーゼ。
  8. 　請求項１から７のいずれか１項に記載の変異型グリシンオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
  9. 　請求項８に記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターとを含む、複製可能な組換えＤＮＡ。
  10. 　請求項８に記載のＤＮＡ、または、請求項９に記載の組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる細胞。
  11. 　請求項１０に記載の細胞を培養し、得られる培養物から前記変異型グリシンオキシダーゼを採取することを特徴とする、
    変異型グリシンオキシダーゼの製造方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041011A (zh) * 2019-09-10 2020-04-21 华中农业大学 一种草甘膦氧化酶突变体及其克隆、表达与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014157705A1 (ja) 2013-03-29 2014-10-02 味の素株式会社 改変グリシン酸化酵素

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014157705A1 (ja) 2013-03-29 2014-10-02 味の素株式会社 改変グリシン酸化酵素

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELENA ROSINILUCIANO PIUBELLIGIANLUCA MOLLALUCA FRATTINIMATTIA VALENTINOANTONIO VARRIALESABATO D'AURIALOREDANO POLLEGIONI: "Novel biosensors based on oprimized glycine oxidase", FEBS (FEDERATION OF EUROPEAN BIOCHEMICAL SOCIETIES) JOURNAL, vol. 281, 2014, pages 3460 - 3472, XP055580928, DOI: 10.1111/febs.12873
MARTINEZ-MARTINEZ, IRENE ET AL.: "Characterization and structural modeling of a novel thermostable glycine oxidase from Geobacillus kaustophilus HTA426", PROTEINS, vol. 70, no. 4, 2008, pages 1429 - 1441, XP055580926 *
MESSELE YOHANNES EQUARYASUSHI TANIHISAAKI MIHARA: "Purification and Properties of Glycine Oxidase from Pseudomonas putida KT2440", JOURNAL OF NUTRITIONAL SCIENCE AND VITAMINOLOGY, vol. 61, 2015, pages 506 - 510
ROSINI, ELENA ET AL.: "Novel biosensors based on optimized glycine oxidase", THE FEBS JOURNAL, vol. 281, no. 15, 2014, pages 3460 - 3472, XP055580928 *
See also references of EP3683313A4
YOSHIAKI NISHIYARYOICHI ARAI: "Crystal structure of glycine oxidase from Geobacillus kaustophilus", PHOTON FACTORY ACTIVITY REPORT 2014 # 32, PART B, USERS' REPORT (BIOLOGICAL SCIENCE, NO.204, 2015
YOSHIAKI NISHIYATADAYUKI IMANAKA: "Purification and characterization of a novel glycine oxidase from Bacillus subtilis", FEBS (FEDERATION OF EUROPEAN BIOCHEMICAL SOCIETIES) LETTER, vol. 438, 1998, pages 263 - 266, XP004258603, DOI: 10.1016/S0014-5793(98)01313-1

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111041011A (zh) * 2019-09-10 2020-04-21 华中农业大学 一种草甘膦氧化酶突变体及其克隆、表达与应用
CN111041011B (zh) * 2019-09-10 2021-04-27 华中农业大学 一种草甘膦氧化酶突变体及其克隆、表达与应用

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