WO2018047976A1 - トリプトファン酸化酵素およびその用途 - Google Patents

トリプトファン酸化酵素およびその用途 Download PDF

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amino acid
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mutation
tryptophan
acid residue
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浩輝 山口
一敏 ▲高▼橋
萌美 巽
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味の素株式会社
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    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
    • C12Y113/11011—Tryptophan 2,3-dioxygenase (1.13.11.11), i.e. indolamine 2,3-dioxygenase 2

Definitions

  • the present invention relates to tryptophan oxidase and its use.
  • Amino acids are very important as components of living organisms, and it is known that some amino acids can serve as indicators of health status.
  • Examples of amino acid measurement methods include a method using an amino acid analyzer, high performance liquid chromatography (HPLC), LC-MS, and the like, and an amino acid analysis method using an enzyme that catalyzes a specific reaction for a specific amino acid.
  • Patent Document 1 describes a method using tryptophan oxidase as a method for measuring tryptophan.
  • Patent Document 1 As an enzymatic method, for example, quantification of tryptophan using tryptophan oxidase is known (Patent Document 1, etc.).
  • An object of the present invention is to provide a mutant tryptophan oxidase suitable for practical use.
  • the present invention provides the following.
  • At least one amino acid residue of wild type tryptophan oxidase is mutated, Mutant tryptophan oxidase having higher tryptophan oxidase activity and / or stability than wild-type tryptophan oxidase.
  • the wild type tryptophan oxidase is at least one selected from the group consisting of motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14) Has two motifs, The mutation of at least one amino acid residue is for a motif selected from the group consisting of motif (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14) Including a mutation of at least one amino acid residue, The enzyme according to [1].
  • the wild type tryptophan oxidase further has at least one motif selected from the group consisting of motifs (1), (4), (6), (8), (10) and (12), [2 ] To [19] The enzyme according to any one of [19].
  • Wild type tryptophan oxidase is (A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, (B) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence comprising substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues, or (c) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the enzyme according to any one of [1] to [20], which is a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to [21 ′] C29, S57, G63, L92, K95, A105, G136, E181, G190, C321, R367, Y80, G190, K83, H
  • the mutation of at least one amino acid residue of tryptophan oxidase is at least selected from the group consisting of C29V, S57T, G63Q, L92A, K95A, A105G, G136K, G136Q, G136R, G190C, C321S, C321A, and R367K
  • Mutation of at least one amino acid residue of tryptophan oxidase is Y80C, G190C, K83C, E181C, H22C, S409C, N175C, S84C, F178C, A179C, V98C, S140C, M141C, I166C, T273C, L352C, or The enzyme according to any one of [1] to [22], which is at least one mutation selected from the group consisting of T310C.
  • the mutation of at least one amino acid residue further leads to cysteine of at least one amino acid residue in the motif selected from motifs (2), (3), (11), (13) and (14)
  • At least one amino acid residue of the motif (2) is Q68.
  • At least one amino acid residue of motif (3) is Y87;
  • At least one amino acid residue of the motif (11) is R296;
  • At least one amino acid residue of motif (13) is V363, or at least one amino acid residue of motif (14) is G396, [24]
  • the mutation of at least one amino acid residue is Y80C / G190C, K83C / E181C, H22C / S409C, Q68C / N175C, S84C / F178C, Y87C / A179C, V98C / S140C, M141C / I166C, T273C / L352C, R296C
  • the enzyme according to any one of [1] to [25] which comprises at least one combination selected from / T310C and V363C / G396C.
  • a transformant comprising the expression vector according to [28].
  • the transformant according to [29], wherein the transformant is a microorganism.
  • the transformant according to [30], wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • a tryptophan analysis kit comprising the enzyme according to any one of [1] to [26].
  • the kit according to [32] further comprising at least one of a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a tryptophan oxylate detection reagent.
  • [34] A method for detecting tryptophan in a sample using the enzyme according to any one of [1] to [26].
  • [35] A method for producing a mutant tryptophan oxidase using the transformant according to any one of [29] to [31].
  • [36] A detection system for analysis of tryptophan, comprising the device and the enzyme according to any one of [1] to [26].
  • the buffer solution or buffer salt for reaction, at least one of a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a tryptophan oxylate detection reagent, and the device is a microchannel chip according to [36] Detection system for tryptophan analysis.
  • a detection electrode, and an enzyme sensor for tryptophan analysis comprising the enzyme according to any one of [1] to [26], which is fixed or arranged on the detection electrode.
  • a mutant tryptophan oxidase having characteristics such as tryptophan oxidase activity and stability that are better than those of the wild type tryptophan enzyme is provided.
  • Such enzymes are useful for the rapid and sensitive measurement of tryptophan and / or the production of tryptophan oxylate.
  • FIG. 1 shows the residual activity of TrpOX incubated at each temperature for 15 minutes;
  • the mutant tryptophan oxidase is a tryptophan oxidase having at least one mutation (modified) with respect to the wild type tryptophan oxidase.
  • Tryptophan oxidase has tryptophan oxidase activity. Tryptophan oxidase activity consists of tryptophan (usually L-tryptophan), water and oxygen in which tryptophan oxylate (amino group of tryptophan is substituted with a ketone group). It is an enzyme activity involved in a reversible reaction to produce 2-oxo acid), ammonia and hydrogen peroxide.
  • Wild type tryptophan oxidase means tryptophan oxidase before mutation as the basis of mutant tryptophan oxidase.
  • the wild type tryptophan oxidase may be derived from a living organism (for example, microorganisms such as bacteria, actinomycetes and fungi, insects, fish, animals, plants, etc.), or a gene encoding a protein having the above motif May be an enzyme protein obtained by expressing other organisms (eg, Escherichia coli) not originally having the gene as a host. Examples of such organisms include Streptomyces sp.
  • Streptomyces bacteria such as Chromobacterium violaceum, Pseudogulbenkiania ferrooxidans Pseudogalbencyania bacteria, Janthinobacterium vividum, and Janthinobacterium.
  • Ganthinobacterium sp. Collimonas sp. Colimonas bacteria such as Duganella sp.
  • Duganella genus bacteria such as Myxococcus stipitatus, Pseudoalteromonas tunicata, Pseudoalteromonas sp. , Pseudoalteromonas luteoviolacea and other pseudoarteromonas bacteria, gamma protease, and the like.
  • wild type tryptophan oxidase examples include wild type tryptophan oxidase having at least one motif selected from the group consisting of the following motifs (1) to (14).
  • Such an enzyme has one motif selected from the group consisting of motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14), or two It is preferable to have a combination of the above motifs, more preferably at least the motif (14), and at least one motif selected from the group consisting of at least the motifs (5), (7), (9) and (10) And the motif (14) are more preferable, and it is even more preferable to have all the motifs.
  • the tryptophan oxidase before mutation may further have at least one motif selected from the group consisting of motifs (1), (4), (6), (8), (10) and (12) It is preferable to have all motifs.
  • Each motif is a motif identified by analysis of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and bacterial tryptophan oxidase, and the number of each motif is an amino acid residue in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It represents a number, specifically:
  • the motif (1) is a motif corresponding to the amino acid region of glutamic acid (E59) -leucine (L60) -glycine (G61) at positions 59 to 61 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Motif (2) is arginine (R64) -tyrosine (Y65) -serine (S66) -proline (P67) -glutamine (Q68) -leucine (L69) at positions 64 to 70 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. This is a motif corresponding to the amino acid region of histidine (H70).
  • Motif (3) is a motif corresponding to the amino acid region of tyrosine (Y87) -proline (P88) -phenylalanine (F89) -threonine (T90) at positions 87 to 90 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the motif (5) is an amino acid region of glycine (G142) -tyrosine (Y143) -aspartic acid (D144) -alanine (A145) -leucine (L146) at positions 142 to 146 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is a motif corresponding to.
  • the motif (6) is a motif corresponding to the amino acid region of leucine (L148) -proline (P149) at positions 148 to 149 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the motif (7) is an amino acid region of methionine (M155) -alanine (A156) -tyrosine (Y157) -aspartic acid (D158) -isoleucine (I159) at positions 155 to 159 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. It is a motif corresponding to.
  • the motif (9) is a motif corresponding to the amino acid region of serine (S264) -leucine (L265) at positions 264 to 265 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the motif (11) is arginine (R296) -lysine (K297) -isoleucine (I298) -tyrosine (Y299) -phenylalanine (F300) -lysine (K301) at positions 296 to 301 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the motif (14) is histidine (H394) -cysteine (C395) -glycine (G396) -tryptophan (W397) -methionine (M398) -glutamic acid (E399) at positions 394 to 400 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • G400 is a motif corresponding to the amino acid region. These motifs can be identified by comparative analysis of tryptophan oxidase sequences derived from each organism shown in Table 1. Table 1 also shows the accession number of the tryptophan oxidase gene derived from each organism and the sequence portion corresponding to each motif.
  • Motif (4) is a motif corresponding to the amino acid region of leucine (L102) -lysine (K103) at positions 102 to 103 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Motif (8) is a motif corresponding to the amino acid region of lysine (K162) -histidine (H163) -proline (P164) -glutamic acid (E165) at positions 162 to 165 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Motifs (4) and (8) can be identified by comparative analysis of tryptophan oxidase sequences from each organism shown in Table 2. Table 2 also shows the accession number of the tryptophan oxidase gene derived from each organism and the sequence portion corresponding to each motif.
  • the motif (10) is located in the amino acid region of proline (P266) -leucine (L267) -phenylalanine (F268) -lysine (K269) -glycine (G270) at positions 266 to 270 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the motif (12) is a motif corresponding to the amino acid region of phenylalanine (F308) -tyrosine (Y309) at positions 308 to 309 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the motif (13) is a motif corresponding to the amino acid region of glycine (G362) -valine (V363) -glutamic acid (E364) -phenylalanine (F365) at positions 362 to 365 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Motifs (10), (12) and (13) can be identified by comparative analysis of tryptophan oxidase sequences derived from each organism shown in Table 3. Table 3 also shows the accession number of the tryptophan oxidase gene derived from each organism and the sequence portion corresponding to each motif.
  • the tryptophan oxidase (wild-type tryptophan oxidase) before mutation may be a tryptophan oxidase having any of the following amino acid sequences (a) to (c).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is Chromobacterium violaceum-derived tryptophan oxidase, and is encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, the full-length base sequence of the Chromobacterium violaceum-derived tryptophan oxidase gene.
  • amino acid residues that are the targets of mutation are usually natural L- ⁇ -amino acids, L-alanine (A), L-asparagine (N), L -Cysteine (C), L-glutamine (Q), L-isoleucine (I), L-leucine (L), L-methionine (M), L-phenylalanine (F), L-proline (P), L- Serine (S), L-threonine (T), L-tryptophan (W), L-tyrosine (Y), L-valine (V), L-aspartic acid (D), L-glutamic acid (E), L- Arginine (R), L-histidine (H), L-lysine (K), or glycine (G).
  • the mutation is substitution, addition or insertion
  • the amino acid residue to be substituted, added or inserted is the same as the amino acid residue to be mutated as described above.
  • the amino acid sequence (b) above may contain mutations (eg, substitution, deletion, insertion, and addition) of one or several amino acid residues.
  • the number of mutations is, for example, 1 to 50, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 30, even more preferably 1 to 20, and most preferably 1 to 10 (eg, 1, 2, 3). 4 or 5).
  • the amino acid sequence of (c) above may have at least 90% or more amino acid sequence identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the percent amino acid sequence identity may preferably be 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and most preferably 98% or more or 99% or more.
  • the tryptophan oxidase activity of the protein having the amino acid sequence of (a) is 50% or more, 60% or more, 70 % Or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • the identity of the amino acid sequence is determined by, for example, the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)), FASTA by Pearson (Methods Enzymol., 183, 63 (1990) ) Can be used. Based on this algorithm BLAST, since a program called BLASTP has been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov), these programs are used with default settings, and amino acid sequence identity May be calculated. As the identity of amino acid sequences, for example, using GENETYX Ver.
  • Region, and relatively unconserved region regions that can play an important role in function from the relatively conserved region and the relatively unconserved region, respectively Since it is possible to predict areas that cannot play an important role in function, it is possible to recognize the correlation between structure and function.
  • one skilled in the art can determine the amino acid sequences of (b) and (c) into which mutations of one or more amino acid residues that improve thermal stability are introduced.
  • substitutions of amino acid residues may be conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to substitution of a predetermined amino acid residue with an amino acid residue having a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains are well known in the art.
  • such families include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), amino acids having uncharged polar side chains (Eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids with non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chain Amino acids (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), amino acids having side groups containing hydroxyl groups (eg, alcoholic, phenolic) ( Example, serine, thread Nin, tyrosine), and amino acids (e.g.
  • amino acids having an uncharged polar side chain and amino acids having a nonpolar side chain are sometimes collectively referred to as neutral amino acids.
  • the conservative substitution of amino acids is a substitution between aspartic acid and glutamic acid, a substitution between arginine and lysine and histidine, a substitution between tryptophan and phenylalanine, and between phenylalanine and valine. Or a substitution between leucine, isoleucine and alanine, and a substitution between glycine and alanine.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 contains the motifs (1) to (14) mentioned in the first example.
  • the amino acid sequences of (b) and (c) above are also selected from the group consisting of motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14)
  • motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14) are conserved, and motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14) are conserved
  • at least the motif (14) is included, and at least one motif and the motif (14) selected from the group consisting of at least the motif (5), (7), (9) and (10) More preferably, it has even more preferably all motifs.
  • Tryptophan oxidase before mutation for example, tryptophan oxidase having any of the above (a) to (c), has motifs (1), (4), (6), (8), (10) and (12) It may further have at least one motif selected from the group consisting of: It is preferable that motifs (1) to (14) are stored.
  • the mutant tryptophan oxidase may be obtained by mutating at least one amino acid residue of the tryptophan oxidase before the mutation.
  • Mutant tryptophan oxidase usually has at least one of its characteristics better than that of pre-mutation tryptophan oxidase. Examples of such characteristics include tryptophan oxidase activity and tryptophan oxidase stability (eg, thermal stability).
  • the mutant tryptophan oxidase preferably has better tryptophan oxidase activity or tryptophan oxidase stability than the wild type, and more preferably both. Confirmation of each characteristic may be performed by comparing the activities of wild-type and mutant tryptophan oxidase at a predetermined temperature according to the evaluation method in the subsequent examples and calculating the relative activity.
  • mutant tryptophan oxidase (when the wild-type activity is 100%) is preferably more than 100%, more preferably more than 101%, 103%, 104%, 105% or 110%, respectively. Preferably, it is even more preferable to exceed 120%, 130%, 140% or 150%, respectively.
  • Confirmation of the improvement of the thermal stability of tryptophan oxidase is based on the residual activity at a high temperature of wild type and mutant tryptophan oxidase at a predetermined concentration (for example, 40 ° C. or higher (preferably 45 ° C., 50 ° C. or 55 ° C.)). The residual activity after heating for 15 minutes) is compared, and the relative residual activity is calculated.
  • the residual activity of the mutant tryptophan oxidase (when the residual activity of the wild type is 100%) is preferably more than 100%, 101%, 103%, 104%, 105%, 110%, 120%, 130 % Or more, more preferably exceeding 150%, 160%, 170% or 180%, respectively.
  • Examples of amino acid mutations possessed by the mutant tryptophan oxidase include deletion of at least one amino acid residue, and substitution, addition and insertion to other amino acid residues, and usually to other amino acid residues. Is a replacement.
  • the amino acid residue mutation may be introduced into one region in the amino acid sequence, or may be introduced into a plurality of different regions.
  • the number of mutations possessed by the mutant tryptophan oxidase may be at least one, from 1 to 100, preferably from 1 to 80, more preferably from 1 to 50, from 1 to 30, from 1 to 20, -10 or 1-5.
  • wild type tryptophan oxidase contains at least one of motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14), these motifs It is preferable that at least one amino acid residue is mutated. That is, a mutation of one amino acid residue or a combination of two or more amino acid residues in motif (5), a mutation of one amino acid residue in motif (7) or two or more amino acid residues Combination of mutations, mutation of one amino acid residue in motif (9) or combination of mutations of two or more amino acid residues, mutation of one amino acid residue or two or more amino acid residues in motif (13) It is preferable to have one or more selected from the group consisting of a combination of group mutations and a mutation of one amino acid residue or two or more amino acid residue mutations in the motif (14).
  • the mutant tryptophan oxidase comprises a mutation of at least one amino acid residue in the motif (14), or at least one amino acid residue in the motif (5), at least one amino acid in the motif (7) Residue, one or more mutations selected from at least one amino acid residue in motif (9), one or more mutations selected from at least one amino acid residue in motif (11), and in motif (13) It preferably includes one or more mutations selected from at least one amino acid residue and a mutation of at least one amino acid residue in the motif (14), Including at least one amino acid residue in motif (5), one or more mutations selected from at least one amino acid residue in motif (9), and mutation of at least one amino acid residue in motif (14) It is more preferable.
  • the mutant tryptophan oxidase comprises a mutation of at least one amino acid residue in the motif (14) (eg, a C395 mutation) or a mutation of at least one amino acid residue in the motif (14) (eg, a C395) And a combination of other mutations.
  • the mutation of the amino acid residue contained in the motif (2) includes at least a mutation of Q68.
  • the Q68 mutation is preferably cysteine substitution (Q68C).
  • Q68C preferably forms an SS bond with other cysteine residues.
  • the amino acid residue mutation contained in the motif (3) preferably includes at least a Y87 mutation.
  • Y87 substitution to cysteine (Y87C) is preferable.
  • the amino acid residue mutation contained in the motif (5) preferably includes at least the A145 mutation.
  • the mutation of A145 is preferably cysteine, valine, threonine, isoleucine, serine, leucine, methionine or tyrosine (A145C, A145V, A145T, A145I, A145S, A145L, A145M, A145Y), more preferably A145C or A145V, A145V is more preferable.
  • the amino acid residue mutation contained in the motif (7) preferably includes at least a M155 mutation and / or an I159 mutation, and more preferably includes at least a M155 mutation.
  • the mutation of M155 is preferably substitution with alanine, glycine or valine (M155A, M155G, M155V), and more preferably M155A.
  • substitution with phenylalanine (I159F) is preferred.
  • the mutation of the amino acid residue contained in the motif (9) includes at least a mutation of L265.
  • substitution with isoleucine (L265I) or substitution with methionine (L265M) is preferable, and L265I is more preferable.
  • the amino acid residue mutation contained in the motif (11) preferably includes at least a R296 mutation.
  • the mutation of R296 is preferably substitution with cysteine (R296C).
  • the amino acid residue mutation contained in the motif (13) preferably includes at least a V363 mutation.
  • the V363 mutation is preferably phenylalanine, tryptophan, isoleucine, histidine, threonine, or cysteine (V363F, V363W, V363I, V363H, V363T, V363C), more preferably V363F or V363W.
  • the amino acid residue mutation contained in the motif (14) preferably includes at least a C395 or G396 mutation, and more preferably includes a C395 mutation.
  • Mutations in C395 include substitution with serine (C395S), substitution with alanine (C395A), substitution with histidine (C395H), substitution with proline (C395P), substitution with glutamine (C395Q), substitution with threonine ( C395T), substitution to methionine (C395M), substitution to glycine (C395G), substitution to phenylalanine (C395F), substitution to tyrosine (C395Y), substitution to aspartic acid (C395D), substitution to glutamic acid (C395E) ), Lysine substitution (C395K), asparagine substitution (C395N), arginine substitution (C395R) or valine substitution (C395V), preferably C395S, C395A, C395P, C395Q
  • the mutant tryptophan enzyme is preferably one or more selected from the group consisting of motifs (2), (3), (11), (13) and (14) due to mutation of at least one amino acid residue in each motif
  • An SS bond may be obtained by mutation of an amino acid residue in the motif.
  • mutations for introducing SS bonds include Q68C (motif (2)), Y87C (motif (3)), R296C (motif (11)), C363C (motif (13)), and G396C (motif (14)).
  • an SS bond can be formed between the two by mutagenesis of C363C / G396C.
  • the mutant tryptophan oxidase is a mutant form of the tryptophan enzyme having any of the above (a) to (c), the mutation site is the cysteine at position 29 (C29) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • C29, S57, G63, L92, K95, A105, G136, E181, G190, C321, and R367 mutations are preferably substituted with other amino acids.
  • the C29 mutation is preferably valine substitution (C29V).
  • the S57 mutation is preferably threonine, tryptophan, methionine, alanine, valine, tyrosine, cysteine, isoleucine, or leucine (S57T, S57W, S57M, S57A, S57V, S57Y, S57C, S57I or S57L), and S57T is preferred. More preferred.
  • the mutation of G63 is preferably substitution with glutamine (G63Q).
  • the mutation of L92 is preferably substitution with alanine (L92A).
  • the K95 mutation is preferably substitution with alanine (K95A).
  • the mutation of G136 is preferably substitution with lysine, glutamine, arginine, asparagine or glutamic acid (G136K, G136Q, G136R, G136N or G136E), and more preferably G136K.
  • substitution with glycine (A105G) is preferable.
  • substitution to cysteine (G190C) is preferable.
  • the C321 mutation is preferably substitution with serine or alanine (C321S or C321A).
  • substitution with lysine (R367K) is preferable.
  • the mutant tryptophan oxidase preferably includes at least a mutation selected from the group consisting of S57, G136, and G190.
  • mutation of Y80, G190, K83, E181, H22, S409, N175, S84, F178, A179, V98, S140, M141, I166, T273, L352, or T310 is preferably replaced with cysteine.
  • mutation of at least one amino acid residue in mutated tryptophan oxidase motif (2), (3), (11), (13) and (14) to cysteine preferably Has at least one substitution selected from Q68C (motif (2)), Y87C (motif (3)), R296C (motif (11)), V363C (motif (13)), and G396C (motif (14)) May be.
  • any of these can introduce an SS bond between the cysteine residue after substitution and other cysteine residues, or between the cysteine residues after substitution, so that the amount of free cysteine is reduced and stable.
  • Examples of combinations of amino acid residues into which a bond is introduced include Y80C / G190C, K83C / E181C, H22C / S409C, Q68C / N175C, S84C / F178C, Y87C / A179C, V98C / S140C, M141C / I166C, T273C / L352C, R296C / T310C, V363C / G396C (combination of substitution with each cysteine), and Y80C / G190C and / or K83C / E181C are more preferable.
  • amino acid residues having similar side chains include amino acids having basic side chains (eg, lysine, arginine, histidine), amino acids having acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), non-charged polar side Amino acids having chains (eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), amino acids having non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ Amino acids having branched side chains (eg, threonine, valine, isoleucine), amino acids having aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine), hydroxyl group-containing side chains (eg,
  • the mutant tryptophan oxidase has at least one motif selected from the group consisting of motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14).
  • it may have a combination of the mutation of each motif and the above point mutation (including the SS bond introduction mutation).
  • Examples of combinations of two or more mutations in the tryptophan oxidase before mutation possessed by the mutant tryptophan oxidase include the following examples. Of the following, mutation combination examples 1 to 8 are preferred, mutation examples 1 to 6 are more preferred, and mutation examples 1 and 2 are more preferred.
  • Mutation Example 1 Combination of the following mutations, preferably S57T / Y80C / G136K / A145V / G190C / L265I / C395A, more preferably S57T / Y80C / G136K / A145V / G190C / L265I / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (5)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (9)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-Necessary A combination of at least one mutation selected from the group consisting of a mutation of S57, a mutation of G136, a mutation of Y80, a mutation of G190, and a mutation of R367.
  • Mutation Example 2 Combination of the following mutations, preferably S57T / K83C / A145V / E181C / L265I / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (5)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (10)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-S57 A combination of at least one mutation selected from the group consisting of a mutation of K83, a mutation of K83, and a mutation of E181
  • Mutation Example 3 Combination of the following mutations, preferably S57T / C395A, K95A / C395A, R367K / C395A, G136K / C395A, G136Q / C395A, G136R / C395A, G63Q / C395A, A105G / C395A, L92A / C395 / G63Q / C395A, H22C / S409C / C395A, Y80C / G190C / C395A, K83C / E181C / C395A, S84C / F178C / C395A, V98C / S140C / C395A, M141C / I166C / C395 / C, C35 / A35 S57T / C395A, K95A / C395A, R367K / C395A, G136K / C3
  • Mutation Example 4 Combination of the following mutations, preferably A145C / C395A, A145V / C395A, A145T / C395A, A145I / C395A, A145S / C395A, A145L / C395A, A145M / C395A, A145Y / C395A, A57T S57T / G63Q / A145V / C395A, S57T / G63Q / G136K / A145V / C395A, G63Q / A145V / C395A, A105G / A145V / C395A, S57T / L92A / A145V / C395A, S57T / A105G / A14 / 14 / C395A, S57T / K95A / A145V / C395A, and S57T / G63Q / A145V / R367K
  • Mutation Example 5 Combination of the following mutations, preferably L265I / C395A, L265M / C395A, or S57T / L265M / C395A, more preferably L265I / C395A or L265M / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (9)-Mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (14)-Mutation of S57 as necessary
  • Mutation Example 6 Combination of the following mutations, preferably M155A / L265I / C395A, S57T / M155A / L265I / C395A, or G136K / M155A / L265I / C395A, more preferably M155A / L265I / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (7)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (9)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-Necessary And one or more mutations selected from the group consisting of mutations of S57 and G136
  • Mutation Example 7 Combination of the following mutations, preferably I159F / C395A, M155A / C395A, M155G / C395A, M155V / C395A, L92A / M155A / C395A, or K95A / M155A / C395A, more preferably I159F / C395A M155A / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (7)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-At least selected from mutation of L92 and mutation of K95, if necessary
  • I159F / C395A, M155A / C395A, M155G / C395A, M155V / C395A, L92A / M155A / C395A, or K95A / M155A / C395A more preferably I159F / C395A M155A / C395A -M
  • Mutation Example 8 Combination of the following mutations, preferably V363W / C395A, V363F / C395A, V363I / C395A, V363H / C395A, V363T / C395A, V363C / G396C / C395A, V363C / G396C / C395 / 36/36/36 / C395A, more preferably V363W / C395A, or V363F / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (13)-Mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (14)-If necessary, mutation of S57
  • Mutation Example 9 Combination of the following mutations, preferably Q68C / N175C / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (2)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-Mutation of N175 as required
  • Mutation Example 10 Combination of the following mutations, preferably Y87C / A179C / C395A A mutation of A179 A mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (3) A mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (14)
  • Mutation Example 11 Combination of the following mutations, preferably R296C / T310C / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (11)-Mutation of at least one amino acid residue contained in the motif (14)-Mutation of T310 as necessary
  • Mutation example 12 Combination of the following mutations, preferably A145V / I159F / C395A, A145C / M155A / C395A, S57T / A145V / I159F / C395A, or S57T / A145V / M155A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (5)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (7)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-Necessary Depending on the mutation of S57
  • Mutation Example 13 Combination of the following mutations, preferably A145V / V363W / C395A, S57T / A145V / V363W / C395A, or S57T / G63Q / A145V / V363F / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (5)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (13)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-Necessary
  • Mutation Example 14 Combination of the following mutations, preferably G63Q / M155A / L265I / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (7)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (9)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (14)-Necessary Depending on the mutation of G63
  • Mutation Example 15 Combination of the following mutations, preferably A145V / M155A / L265I / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (5)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (7)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (9)-Motif Mutation of at least one amino acid residue contained in (14)
  • Mutation Example 16 Combination of the following mutations, preferably S57T / A145V / L265I / V363F / C395A -Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (5)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (9)-Mutation of at least one amino acid residue contained in motif (13)-Motif Mutation of at least one amino acid residue contained in (14)-Mutation of S57 as necessary
  • the mutant tryptophan oxidase may have another peptide component (for example, a tag portion) at the C-terminal or N-terminal.
  • Other peptide components include, for example, peptide components that facilitate the purification of the target protein (eg, tag portions such as histidine tag, Strep-tag II; general purpose purification of target proteins such as glutathione-S-transferase, maltose binding protein, etc.
  • a protein component that improves the solubility of the target protein eg, Nus-tag
  • a peptide component that acts as a chaperone eg, trigger factor
  • the mutant tryptophan oxidase may have an initiation methionine residue at the N-terminus.
  • the mutant tryptophan oxidase may have additional mutations (for example, substitutions, deletions, insertions and additions) of one or several amino acid residues in addition to the mutations as long as the above-described properties are maintained. Good.
  • the number of additional mutations is, for example, 1 to 100, preferably 1 to 50, more preferably 1 to 40, still more preferably 1 to 30, most preferably 1 to 20 or 1 to 10 (eg 1, 2, 3, 4 or 5). Those skilled in the art can appropriately produce such a mutant enzyme having the above-mentioned characteristics.
  • the mutant tryptophan oxidase may be any of the following: (I) Pre-mutation tryptophan having at least one motif selected from the group consisting of motif (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14) In the amino acid sequence of the oxidase, at least one amino acid residue in the motif (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14) is mutated (
  • the amino acid represented by the mutant tryptophan oxidase ii)
  • (a) SEQ ID NO: 2 comprising a substituted amino acid sequence and having higher tryptophan oxidase activity and / or stability than the pre-mutant tryptophan oxidase
  • An amino acid sequence comprising a substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues, or (c) an SEQ ID NO.
  • the mutant tryptophan oxidase has an amino acid sequence having at least 90% or more amino acid sequence identity to the amino acid sequence of the (wild-type) tryptophan oxidase before mutation by having both the above-described mutation and additional mutation. It may be included.
  • the percent amino acid sequence identity may preferably be 92% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, and most preferably 98% or more or 99% or more. Definitions and examples of amino acid sequence identity are as described above.
  • the specification of the position of an amino acid residue where an additional mutation can be introduced in the amino acid sequence is as described above.
  • the sites where additional mutations are introduced include amino acid residues in motifs (2), (3), (5), (7), (9), (11), (13) and (14), and H22, It may be an amino acid residue other than C29, S57, G63, L92, K95, A105, G136, E181, G190, C321, R367, Y80, G190 and K83.
  • substitution of an amino acid residue may be a conservative substitution.
  • conservative substitution is as described above.
  • the mutant tryptophan oxidase can be prepared using a transformant expressing the mutant tryptophan oxidase, or using a cell-free system or the like.
  • a transformant expressing a mutant tryptophan oxidase is prepared by, for example, preparing an expression vector containing a polynucleotide encoding a polynucleotide encoding a mutant tryptophan oxidase and then introducing the expression vector into a host. Can be made.
  • the polynucleotide encoding the mutant tryptophan oxidase may be DNA or RNA, but is preferably DNA.
  • the expression vector only needs to contain a polynucleotide encoding a mutant tryptophan oxidase, and examples thereof include a cell-based vector for expressing a protein in a host and a cell-free vector utilizing a protein translation system.
  • the expression vector can also be a plasmid, viral vector, phage, integrative vector, or artificial chromosome.
  • An integrative vector may be a type of vector that is integrated entirely into the genome of the host cell. Alternatively, only part of the integrative vector (eg, an expression unit comprising the polynucleotide of the present invention encoding the mutant tryptophan oxidase of the present invention and a promoter operably linked thereto) is the genome of the host cell. It may be a vector of the type incorporated in The expression vector may further be a DNA vector or an RNA vector.
  • an expression vector in addition to a polynucleotide encoding a mutant tryptophan oxidase, an expression vector includes a region encoding a promoter, terminator and drug (eg, tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin) resistance gene. Further, it may be included.
  • the expression vector may be a plasmid or an integrative vector.
  • the expression vector may be a viral vector or a cell-free vector.
  • the expression vector contains a polynucleotide encoding another peptide component that can be added to the mutant tryptophan oxidase of the present invention on the 3 ′ or 5 ′ terminal side of the polynucleotide encoding the mutant tryptophan oxidase. May be.
  • the polynucleotide encoding another peptide component include a polynucleotide encoding a peptide component that facilitates purification of the target protein as described above, and a peptide component that improves the solubility of the target protein as described above.
  • polynucleotide examples include a polynucleotide encoding a peptide component that functions as a chaperone, and a polynucleotide encoding a protein component having another function, a domain of the protein, or a peptide component as a linker connecting them.
  • Various expression vectors containing polynucleotides encoding other peptide components are available. Therefore, such an expression vector may be used for preparing an expression vector containing a polynucleotide encoding a mutant tryptophan oxidase.
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding a peptide component that facilitates purification of the target protein, a peptide component that improves the solubility of the target protein
  • Expression vector containing a polynucleotide encoding a protein eg, pET-50b
  • an expression vector containing a polynucleotide encoding a peptide component that acts as a chaperone eg, pCold TF
  • a protein having another function or a domain of a protein eg. pCold TF
  • the expression vector may contain a region encoding a protease cleavage site between a polynucleotide encoding a mutant tryptophan oxidase and a polynucleotide encoding another peptide component. As a result, it is possible to cleave the mutant tryptophan oxidase and other peptide components added thereto after protein expression.
  • Examples of hosts for expressing the mutant tryptophan oxidase include Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria (eg, Corynebacterium glutamicum), and Bacillus genus.
  • Escherichia bacteria such as Escherichia coli, Corynebacterium bacteria (eg, Corynebacterium glutamicum), and Bacillus genus.
  • Various prokaryotic cells including bacteria (eg, Bacillus subtilis), bacteria belonging to the genus Saccharomyces (eg, Saccharomyces cerevisiae), bacteria belonging to the genus Pichia (eg, Pichia stipitis) , Aspergillus bacteria [eg, Aspergillus oryzae] It is possible to use various eukaryotic cells and dimethyl.
  • a strain lacking a predetermined gene may be used.
  • the transformant include a transformant having an expression vector in the cytoplasm, and
  • the transformant expressing the mutant tryptophan oxidase can be cultured in a medium having the composition described below, for example, using a predetermined culture apparatus (eg, test tube, flask, jar fermenter).
  • the culture conditions can be set as appropriate.
  • the culture temperature may be 10 ° C. to 37 ° C.
  • the pH may be 6.5 to 7.5
  • the culture time may be 1 hour to 100 hours.
  • the dissolved oxygen concentration (DO value) in the culture solution may be used as a control index.
  • the aeration / stirring conditions can be controlled so that the relative dissolved oxygen concentration DO value when the atmospheric oxygen concentration is 21%, for example, does not fall below 1-10%, preferably below 3-8%. I can do it.
  • the culture may be batch culture or fed-batch culture. In the case of fed-batch culture, the culture can be continued by continuously or discontinuously adding a solution serving as a sugar source or a solution containing phosphoric acid to the culture solution.
  • E. coli can be selected from Escherichia coli JM109 strain, DH5 ⁇ strain, HB101 strain, BL21 (DE3) strain, etc. . Methods for performing transformation and methods for selecting transformants are also described in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor press (2001/01/15) and the like. Hereinafter, a method for producing transformed E. coli and producing a predetermined enzyme using the same will be described more specifically as an example.
  • E. coli As a promoter for expressing a polynucleotide encoding a mutant tryptophan oxidase, usually E. coli is used. promoters used for heterologous protein production in E. coli can be used, such as PhoA, PhoC, T7 promoter, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, T5 promoter, etc. A strong promoter is mentioned, and PhoA, PhoC, and lac are preferable.
  • the vectors include pUC (eg, pUC19, pUC18), pSTV, pBR (eg, pBR322), pHSG (eg, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398), RSF (eg, RSF1010), pACYC177 (eg, pACYC177, pACYC184). ), PMW (eg, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218), pQE (eg, pQE30), and derivatives thereof.
  • phage DNA vectors may be used.
  • an expression vector containing a promoter and capable of expressing the inserted DNA sequence may be used.
  • the vector may be pUC, pSTV, pMW.
  • a terminator which is a transcription termination sequence, may be linked downstream of the polynucleotide encoding the mutant tryptophan oxidase.
  • Examples of such terminators include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, and E. coli trpA gene terminator.
  • a so-called multicopy type is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from ColE1, such as a pUC-type plasmid or a pBR322-type plasmid.
  • the derivative guide_body is mentioned.
  • the “derivative” means one obtained by modifying a plasmid by base substitution, deletion, insertion and / or addition.
  • the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • a marker such as an ampicillin resistance gene.
  • an expression vector having a strong promoter is commercially available [eg, pUC system (manufactured by Takara Bio Inc.), pPROK system (manufactured by Clontech), pKK233-2 (manufactured by Clontech)].
  • a mutant tryptophan oxidase can be obtained by transforming Escherichia coli using the obtained expression vector and culturing the Escherichia coli.
  • the medium a medium usually used for culturing Escherichia coli such as M9-casamino acid medium and LB medium may be used.
  • the culture medium may contain a predetermined carbon source, nitrogen source, and coenzyme (eg, pyridoxine hydrochloride).
  • coenzyme eg, pyridoxine hydrochloride
  • peptone, yeast extract, NaCl, glucose, MgSO 4 , ammonium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, ferric sulfate, manganese sulfate, and the like may be used.
  • Culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of the vector marker, promoter, host fungus and the like used.
  • Mutant tryptophan oxidase can be obtained as a crushed product and a lysate by recovering the transformant and then crushing the cell (eg, sonication, homogenization) or lysing (eg, lysozyme treatment). it can.
  • the mutated tryptophan oxidase of the present invention can be obtained by subjecting such crushed material and lysate to techniques such as extraction, precipitation, filtration, and column chromatography.
  • Mutant tryptophan oxidase can be used for analysis of tryptophan. Such an analysis method may include measuring tryptophan contained in a test sample using a mutant tryptophan oxidase. *
  • the test sample is not particularly limited as long as it is a sample suspected of containing tryptophan.
  • biological samples eg, blood, urine, saliva, tears, etc.
  • food and beverage products eg, nutritional drinks and amino acid drinks
  • Tryptophan in the test sample may be at a low concentration (eg, a concentration of less than 1 mM such as 1 ⁇ M or more but less than 1 mM) or a high concentration (eg, a concentration of 1 mM or more such as 1 mM or more but less than 1 M).
  • a low concentration eg, a concentration of less than 1 mM such as 1 ⁇ M or more but less than 1 mM
  • a high concentration eg, a concentration of 1 mM or more such as 1 mM or more but less than 1 M.
  • the detection target in the analysis of tryptophan is not particularly limited as long as tryptophan can be measured, and may be any of tryptophan oxylate produced and NH 3 or H 2 O 2 produced as a by-product.
  • the product of the conjugation reaction may be detected by conjugation with another reaction. Examples of such a conjugation reaction include the following conjugation reactions.
  • Tryptophan oxidation reaction Reaction catalyzed by tryptophan oxidase Tryptophan + H 2 O + O 2 ⁇ Tryptophan oxylate + NH 3 + H 2 O 2 Conjugation reaction) Reaction catalyzed by peroxidase 2H 2 O 2 + 4-aminoantipyrine + phenol ⁇ quinone imine dye + 4H 2 O
  • tryptophan can be measured using 4-aminoantipyrine, phenol, and peroxidase in addition to mutant tryptophan oxidase.
  • a test sample is mixed with 4-aminoantipyrine (4-aminoantipyrine) and phenol and peroxidase in an aqueous solution (eg, a buffer solution), and then the mixed sample is subjected to the enzyme reaction described above.
  • tryptophan is measured by detecting the absorbance (about 500 nm) of the produced quinoneimine dye. Measurements can be made qualitatively or quantitatively.
  • the measurement may be performed, for example, based on an endpoint method in which measurement is performed until all the substrates have reacted, or may be performed based on a rate method (initial velocity method).
  • a rate method initial velocity method
  • the mutant tryptophan oxidase does not react with amino acids other than tryptophan (eg, L- ⁇ -amino acid) or has extremely low reactivity with it. Therefore, even when an amino acid other than tryptophan is contained in the test sample, the amount of tryptophan in the test sample can be specifically evaluated by using the mutant tryptophan oxidase.
  • amino acids other than tryptophan eg, L- ⁇ -amino acid
  • mutant tryptophan oxidase can be used for a hydrogen peroxide electrode.
  • a hydrogen peroxide electrode By using such a hydrogen peroxide electrode, the amount of tryptophan in the test sample can be specifically evaluated.
  • the mutant tryptophan oxidase can be included in a kit for tryptophan analysis.
  • the tryptophan analysis kit may further include at least one of other reagents such as a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a tryptophan oxylate detection reagent (indolepyruvic acid detection reagent). it can.
  • other reagents such as a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a tryptophan oxylate detection reagent (indolepyruvic acid detection reagent).
  • the reaction buffer solution or buffer salt can be used to maintain the pH in the reaction solution at a value suitable for the target enzyme reaction.
  • the hydrogen peroxide detection reagent can be used when hydrogen peroxide is detected by, for example, color development or fluorescence.
  • a reagent include a combination of a peroxidase and a color former that can be a substrate thereof, and specific examples include, for example, a combination of horseradish peroxidase, 4-aminoantipyrine, and phenol, but are not limited to this combination. . *
  • ammonia detection reagent examples include an indophenol method in which phenol and hypochlorous acid are combined. *
  • tryptophan oxylate detection reagent examples include 2-oxo acid reductase. *
  • the mutant tryptophan oxidase can be used as a component of a detection system for tryptophan analysis together with the device.
  • the mutant tryptophan oxidase may exist as a unit independent of the microdevice that can be supplied into the device at the time of use, but may be previously injected, fixed or arranged in the device.
  • the mutant tryptophan oxidase is provided in a form that has been previously injected, fixed or placed in the device. Fixation or placement of tryptophan oxidase on the device can be done directly or indirectly.
  • a microdevice such as a microchannel chip having a channel can be suitably used. *
  • the detection system for tryptophan analysis may contain other components.
  • other components include at least one of a reaction buffer or buffer salt, a hydrogen peroxide detection reagent, an ammonia detection reagent, and a tryptophan oxylate detection reagent.
  • all of the other components may be provided in a form accommodated in the device.
  • some of the other components may be provided in a form accommodated in the device, and the remaining components may be provided in a form not accommodated in the device (eg, a form accommodated in a different container).
  • elements not contained in the device may be used by being injected into the device during the measurement of the target substance.
  • Examples of the device include 1) a first zone for preparing a mixed solution by mixing the sample and the component of (c), and contacting the prepared mixed solution with a mutant tryptophan oxidase, A device comprising a second zone for detecting tryptophan (a device in which the mixing and detection steps are performed in different zones); 2) mixing the sample, the component of (c) and the mutant tryptophan oxidase A device comprising an area for detecting tryptophan by a mutant tryptophan oxidase (a device in which the mixing and detection steps are carried out in the same area); and 3) a sample and components of (c) (and necessary Detecting tryptophan by the flow path that allows mixing with the mutant tryptophan oxidase) and the mutant tryptophan oxidase Device with an area for the sample (injecting the sample into the inlet of the device, the liquid is sent through the flow path and the sample etc.
  • the device 3 is automatically mixed, and the tryptophan in the obtained mixture is automatically detected in the detection area Device).
  • the device 3 particularly the device 3 in the form of a microchannel device is preferable.
  • the mutant tryptophan oxidase may be provided in the liquid flowing through the flow path, or may be provided in a form fixed or arranged in the detection zone, but is preferably fixed or arranged in the detection zone. Provided in a deployed form.
  • the mutant tryptophan oxidase can also be used as an enzyme sensor for tryptophan analysis.
  • the enzyme sensor for tryptophan analysis includes, for example, a detection electrode and a mutant tryptophan oxidase immobilized or arranged on the detection electrode.
  • the mutant tryptophan oxidase is immobilized or placed directly or indirectly on the electrode.
  • the detection electrode examples include a hydrogen peroxide detection electrode, and more specifically, an enzyme type hydrogen peroxide detection electrode and a diaphragm type hydrogen peroxide detection electrode.
  • a hydrogen peroxide detection electrode and more specifically, an enzyme type hydrogen peroxide detection electrode and a diaphragm type hydrogen peroxide detection electrode.
  • Example 1 Expression and purification of TrpOX A recombinant expression system of TrpOX using Escherichia coli was constructed. First, a plasmid for recombinant expression was constructed. The target gene was amplified from the base sequence of the TrpOX gene (SEQ ID NO: 1) using DNA primer 1 (SEQ ID NO: 3) and DNA primer (SEQ ID NO: 4) according to a standard PCR method. Subsequently, the PCR product and pET24a (Merck) were digested with NdeI (Takara Bio Inc.) and HindIII (Takara Bio Inc.), and FastGene Plasmid Mini Kit (Nippon Genetics Co., Ltd.) was used.
  • TrpOX was prepared as follows. First, inoculated from a glycerol stock of pET24a-TrpOX-BL21 (DE3) to an LB plate containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, followed by stationary culture at 37 ° C. overnight. 6 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin was put into a 50 ml capacity tube, a single colony on the LB plate was inoculated, and cultured at 37 ° C. until the value of OD600 reached about 0.6. Subsequently, the mixture was allowed to stand at 16 ° C.
  • IPTG was added to a final concentration of 1.0 mM
  • the cells were cultured overnight at 16 ° C. with swirling shaking, and then collected in a 2.0 ml tube.
  • the cells are suspended in a crushing buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 75 mM imidazole, pH 8.0), strength H using an ultrasonic crusher (BIOLUPTER, Cosmo Bio Inc.), interval 30 seconds, Crushed twice for 10 minutes.
  • the crushed liquid was centrifuged at 13000 ⁇ g for 15 minutes to recover the supernatant, and then purified using His Spin Trap (GE Healthcare Japan) or TALON Spin Columns (Takara Bio).
  • washing buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 75 mM imidazole, pH 8.0
  • elution buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole
  • PH 8.0 elution buffer
  • a crushing buffer and a washing buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl
  • an elution buffer 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0
  • TrpOX mutant was prepared as follows. Using QuickChange Lightning site-Directed Mutagenesis Kits (Agilent Technology Co., Ltd.), mutation was introduced into the TrpOX gene using pET28a-TrpOX as a template according to the protocol attached to the product. When introducing a plurality of mutations, mutations were added by using a plasmid containing the mutation as a template. Using this mutated plasmid, various TrpOX mutants were obtained by recombinant expression and purification according to the method described in Example 1.
  • Example 3 Evaluation of activity and thermal stability (1) The activity and thermal stability of the TrpOX wild-type and mutants prepared in Example 1 and Example 2 were evaluated by the following procedure. Each TrpOX prepared to 0.1 mg / ml is dispensed into a microtube, incubated at either 4 ° C. or 45 ° C. for 15 minutes, and then 100 mM Tris-HCl so that TrpOX is 0.02 mg / ml. , PH 8.0.
  • reaction liquids A and B were prepared.
  • Reaction solution A 2 mM phenol, 200 mM Tris-HCl pH 8.0
  • Reaction solution B 100 mM 4-aminoantipyrine, 1500 U / ml peroxidase
  • a solution obtained by adding 10 ⁇ l of TrpOX prepared to 0.02 mg / ml to a mixed solution of 49 ⁇ l of reaction solution A, 2 ⁇ l of reaction solution B, 29 ⁇ l of ultrapure water, and 10 ⁇ l of 0.1M Trp in a 96-well microplate The time course of absorbance at a wavelength of 505 nm was measured with a microplate reader (xMark Microplate Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc.).
  • Table 4 shows the relative activity and residual activity of each TrpOX variant. In Table 4, the relative activity compared to the control is the ratio of the activity of each TrpOX variant after treatment at 4 ° C.
  • the residual activity after heat treatment is the ratio of the activity of each TrpOX variant after heat treatment (treatment at 45 ° C for 15 minutes) to 100% activity after treatment at 4 ° C for 15 minutes for each TrpOX variant.
  • Tables 5 and 6 show the relative activity and residual activity of each TrpOX mutant into which mutations were introduced using the TrpOX (C395A) gene as a template.
  • the TrpOX mutants in Table 6 are mutants in which mutations aimed at introducing SS bonds are introduced into TrpOX (C395A).
  • the relative activity compared to the control is the ratio of the activity of each TrpOX variant after treatment at 4 ° C. for 15 minutes to the control (TrpOX (C395A)) 100% activity after treatment at 4 ° C. for 15 minutes. It is.
  • the residual activity after heat treatment is the ratio of the activity of each TrpOX variant after heat treatment (treatment at 45 ° C for 15 minutes) to 100% activity after treatment at 4 ° C for 15 minutes for each TrpOX variant.
  • the controls in Table 4 are the wild type results, and the controls in Tables 5 and 6 are the results for TrpOX (C395A).
  • mutation introduction into S57 (S57T, etc.), mutation introduction into G136 (G136Q, G136R, G136K, etc.), mutation introduction into motif (5) (A145I, A145S, A145C, etc.), motif (13 ) Mutation introduction (V363F, V363I etc.), mutation introduction into motif (13) (V363W etc.), mutation introduction into G63 (G63Q etc.), mutation introduction into motif (5) (A145T, A145V etc.), Improving tryptophan oxidase activity and / or thermal stability by combining mutation introduction (M155A, M155G, M155V, etc.) into motif (7) and mutation introduction (C395A, etc.) into motif (14) You can see that
  • mutation introduction such as C395A
  • an SS bond was introduced between cysteines after mutation in these combinations, thereby reducing the amount of free cysteine and improving the properties of tryptophan
  • TrpOX multiple mutants and evaluation of activity and thermal stability Expression of TrpOX prepared by introducing multiple mutation points into the target TrpOX by the method described in Example 2
  • the method described in Example 1 was performed.
  • Purification of TrpOX was carried out by inoculating a LB plate containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, and statically culturing overnight at 37 ° C., placing 2 ml of LB liquid medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin in a 12 ml tube, The cells were cultured at 37 ° C with swirling shaking.
  • the bacterial cells were suspended in a crushing buffer (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0), and crushed using an ultrasonic crusher (ISOSONOR 201M, Kubota Corporation) for 20 minutes.
  • the crushed liquid was centrifuged at 15000 ⁇ g for 15 minutes to collect the supernatant, and then passed through a 0.22 ⁇ m filter, and purified using AKTA Explorer 10S and HisTrap FF cloud 1 ml (GE healthcare).
  • the buffers used were column equilibration and washing buffer (50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0) and elution buffer (50 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0).
  • the flow rate was 1 mL / min.
  • the column was equilibrated and washed with a washing buffer, and eluted with a 5 mL gradient having an imidazole concentration of 20-500 mM. Sampling was performed 0.5 mL at a time, and the collected elution fractions were stored on ice.
  • the buffers used for purification with HiTrap Q HP were column equilibration and washing buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0) and elution buffer (50 mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH 8.0), with a flow rate of 1 mL. / Min.
  • the sample was diluted 20-fold with equilibration and washing buffer, applied to an anion exchange column, washed with column equilibration and washing buffer, and eluted with a 5 mL gradient of NaCl concentration 0-500 mM.
  • Sampling was performed at 0.5 mL each, and the collected elution fraction was exchanged with a dialysis buffer (100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7.5) and stored at 4 ° C.
  • Table 7 shows the results of evaluating the activity and heat resistance of mutants into which a plurality of mutations were introduced using the TrpOX (C395A) gene as a template.
  • the relative activity compared to the control and the residual activity after the heat treatment are the same as in Tables 5 and 6 except that the temperature of the heat treatment is 50 ° C or 55 ° C.
  • the control in Table 7 is the result of TrpOX (C395A).
  • Example 5 Evaluation of activity and thermal stability (2) Mutations shown in Table 8 were introduced into wild-type TrpOX prepared in Example 1 in the same manner as in Example 2 to prepare mutants. The activity and thermal stability of each mutant were evaluated in the same manner as in Example 3 except that incubation was performed at 50 ° C instead of 45 ° C. Table 8 shows the relative activity of the mutants and the relative residual activity after heating at 50 ° C. for 15 minutes. In Table 8, the relative activity compared to the control is the ratio of the activity of each TrpOX variant after treatment at 4 ° C. for 15 minutes to the control (wild type TrpOX) after treatment for 15 minutes at 4 ° C. for 15 minutes. .
  • the relative residual activity is the residual activity of each TrpOX mutant after heat treatment (treatment at 50 ° C. for 15 minutes) relative to 100% of the residual activity after heat treatment (treatment at 50 ° C. for 15 minutes) of the control (wild type TrpOX). Is the ratio.
  • TrpOX C395A
  • C.I The temperature dependence of TrpOX (S57T / Y80C / G136K / A145V / G190C / L265I / C395A) was confirmed. Reaction and measurement were performed using a 96-well microplate. Dispense each TrpOX prepared to 1.0 mg / ml into a microtube, 4 ° C, 35 ° C, 40 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C, 75 ° C, 80 ° C.
  • TrpOX was diluted with 100 mM Tris-HCl pH 8.0 to 0.02 mg / ml.
  • reaction solution A was 49 ⁇ l
  • reaction solution B was 2 ⁇ l
  • ultrapure water was 29 ⁇ l
  • 0.1 M Trp was mixed with 10 ⁇ l of 0.02 mg / ml.
  • the time-dependent change in absorbance at a wavelength of 505 nm of the solution prepared by adding 10 ⁇ l of TrpOX was measured with a microplate reader (xMark Microplate Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc.).
  • TrpOX shows a marked decrease in activity from 45 ° C to 50 ° C
  • TrpOX shows high activity even after incubation at 55 ° C and is thermally stable. The sex was greatly improved.
  • TrpOX S57T / G136K / A145V / L265I / C395A mutant. Reaction and measurement were performed at 37 ° C. using a 96-well plate.
  • the following reaction solution A and reaction solution B were prepared.
  • Reaction solution A 0.2M HEPES pH 8.0
  • Reaction solution B 100 mM TOOS, 100 mM 4-aminoantipyrine, 1500 U / ml peroxidase, 2 M NaCl
  • the amount of change in absorbance ( ⁇ Abs) before and after addition of the enzyme solution was (Abs 555 nm (rear) -Abs 800 nm (rear))-(Abs 555 nm (front)- Abs 800 nm (previous)) ⁇ 270 ⁇ 300.
  • a calibration curve was created from the relationship between ⁇ Abs and Trp concentration when using a Trp aqueous solution as a specimen, and the Trp concentration in human plasma was determined from ⁇ Abs when using human plasma as a specimen.
  • a calibration curve was prepared using the average value when three experiments were performed at each Trp concentration, and human plasma of the same lot was measured three times and compared with the analysis value (45.4 ⁇ M) by an amino acid analyzer. The results are shown in Table 9.
  • the mutant tryptophan oxidase according to the present invention has an improved tryptophan oxidase activity compared to the wild type, and thus is useful for rapid and sensitive measurement of tryptophan and / or production of tryptophan oxylate. It is shown that. In addition, it exhibits better thermal stability than the wild type, and in particular, can exhibit better thermal stability in an aqueous solution, indicating that it is useful as a tryptophan test reagent, particularly a liquid test reagent.
  • a mutant tryptophan oxidase useful for rapid, sensitive and specific measurement of tryptophan or for producing tryptophan oxylate and its use are provided. Therefore, the present invention is useful in a wide range of fields such as biological research, health nutrition, medical care, and food production.

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Abstract

本発明は、実用化に適した変異型トリプトファン酸化酵素を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、野生型トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が野生型トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素、およびその用途を提供する。変異型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）のうち少なくとも１つを有する野生型トリプトファン酸化酵素に由来することが好ましく、これらのいずれかのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異を有していることが好ましい。変異型トリプトファン酸化酵素は、配列番号２で表されるアミノ酸配列およびこれと相同な配列において、１以上のアミノ酸残基の変異を有していることも好ましい。

Description

トリプトファン酸化酵素およびその用途
　本発明は、トリプトファン酸化酵素およびその用途に関する。
　アミノ酸は生体の構成要素として非常に重要であり、幾つかのアミノ酸が健康状態の指標となり得ることが知られている。アミノ酸の測定方法としては、アミノ酸アナライザー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）やＬＣ－ＭＳなどの機器を用いた方法、特定のアミノ酸に対する特定の反応を触媒する酵素を用いたアミノ酸の分析法がある。特許文献１には、トリプトファンの測定方法としては、トリプトファン酸化酵素を利用する方法が記載されている。
　酵素法としては例えば、トリプトファン酸化酵素を用いるトリプトファンの定量が知られている（特許文献１等）。
特許第５２１２９９６号公報
　しかし、機器を用いた方法においては、大型で高価な機器を使う必要があり、しかも機器の維持とオペレーションに専門知識と習熟を必要とするため、導入、維持、利用に高額のコストを必要とする。また、原理上、各検体をシーケンシャルに分析する必要があるため、多検体を分析する際には長時間を必要とする。また、トリプトファン酸化酵素を利用する方法においては、実用化に際しより高い安定性および活性を有する酵素が求められている。
　本発明は、実用化に適した変異型トリプトファン酸化酵素を提供することを目的とする。
　本発明は、以下を提供する。
〔１〕野生型トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
　トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が野生型トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素。
〔２〕野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有し、
　少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれるモチーフに対する少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
〔１〕に記載の酵素。
　　モチーフ（２）：Ｒ６４－Ｙ６５－Ｓ６６－Ｐ６７－Ｑ６８－Ｌ６９－Ｈ７０
　　モチーフ（３）：Ｙ８７－Ｐ８８－Ｆ８９－Ｔ９０
　　モチーフ（５）：Ｇ１４２－Ｙ１４３－Ｄ１４４－Ａ１４５－Ｌ１４６
　　モチーフ（７）：Ｍ１５５－Ａ１５６－Ｙ１５７－Ｄ１５８－Ｉ１５９
　　モチーフ（９）：Ｓ２６４－Ｌ２６５
　　モチーフ（１１）：Ｒ２９６－Ｋ２９７－Ｉ２９８－Ｙ２９９－Ｆ３００－Ｋ３０１
　　モチーフ（１３）：Ｇ３６２－Ｖ３６３－Ｅ３６４－Ｆ３６５
　　モチーフ（１４）：Ｈ３９４－Ｃ３９５－Ｇ３９６－Ｗ３９７－Ｍ３９８－Ｅ３９９－Ｇ４００
〔３〕モチーフ（２）中、Ｑ６８の変異を少なくとも含む、〔２〕に記載の酵素。
〔４〕Ｑ６８の変異は、Ｑ６８Ｃである、〔３〕に記載の酵素。
〔５〕モチーフ（３）中、Ｙ８７の変異を少なくとも含む、〔２〕～〔４〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔６〕Ｙ８７の変異は、Ｙ８７Ｃである、〔５〕に記載の酵素。
〔７〕モチーフ（５）中、Ａ１４５の変異を少なくとも含む、〔２〕～〔６〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔８〕Ａ１４５の変異は、Ａ１４５Ｃ、Ａ１４５Ｖ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｉ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｌ、Ａ１４５ＭまたはＡ１４５Ｙである、〔７〕に記載の酵素。
〔９〕モチーフ（７）中のＭ１５５および／またはＩ１５９の変異を少なくとも含む、〔２〕～〔８〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１０〕Ｍ１５５の変異は、Ｍ１５５Ａ、Ｍ１５５ＧまたはＭ１５５Ｖである、〔９〕に記載の酵素。
〔１１〕Ｉ１５９の変異は、Ｉ１５９Ｆである、〔９〕または〔１０〕に記載の酵素。
〔１２〕モチーフ（９）中のＬ２６５の変異を少なくとも含む、〔２〕～〔１１〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１３〕Ｌ２６５の変異は、Ｌ２６５ＩまたはＬ２６５Ｍである、〔１２〕に記載の酵素。
〔１４〕モチーフ（１１）中のＲ２９６の変異を少なくとも含む、〔２〕～〔１３〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１５〕Ｒ２９６の変異は、Ｒ２９６Ｃである、〔１４〕に記載の酵素。
〔１６〕モチーフ（１３）中のＶ３６３の変異を少なくとも含む、〔２〕～〔１５〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１７〕Ｖ３６３の変異は、Ｖ３６３Ｆ、Ｖ３６３Ｗ、Ｖ３６３Ｉ、Ｖ３６３Ｈ、Ｖ３６３Ｔ、またはＶ３６３Ｃである、〔１６〕に記載の酵素。
〔１８〕モチーフ（１４）中のＣ３９５の変異を少なくとも含む、〔２〕～〔１７〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔１９〕Ｃ３９５の変異は、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ３９５Ｐ、Ｃ３９５ＱまたはＣ３９５Ｙである、〔１８〕に記載の酵素。
〔２０〕野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有する、〔２〕～〔１９〕のいずれか１項に記載の酵素。
　　モチーフ（１）：Ｅ５９－Ｌ６０－Ｇ６１
　　モチーフ（４）：Ｌ１０２－Ｋ１０３
　　モチーフ（６）：Ｌ１４８－Ｐ１４９
　　モチーフ（８）：Ｋ１６２－Ｈ１６３－Ｐ１６４－Ｅ１６５
　　モチーフ（１０）：Ｐ２６６－Ｌ２６７－Ｆ２６８－Ｋ２６９－Ｇ２７０
　　モチーフ（１２）：Ｆ３０８－Ｙ３０９
〔２１〕野生型トリプトファン酸化酵素は、
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を有するタンパク質である、〔１〕～〔２０〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２１´〕Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、Ｔ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
〔１〕～〔２０〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２２〕トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｃ２９Ｖ、Ｓ５７Ｔ、Ｇ６３Ｑ、Ｌ９２Ａ、Ｋ９５Ａ、Ａ１０５Ｇ、Ｇ１３６Ｋ、Ｇ１３６Ｑ、Ｇ１３６Ｒ、Ｇ１９０Ｃ、Ｃ３２１Ｓ、Ｃ３２１Ａ、およびＲ３６７Ｋからなる群より選ばれる少なくとも１つの変異である、〔１〕～〔２１´〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２３〕トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｙ８０Ｃ、Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ、Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ、Ｓ４０９Ｃ、Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ、Ｆ１７８Ｃ、Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ、Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ、Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ、Ｌ３５２Ｃ、またはＴ３１０Ｃからなる群より選ばれる少なくとも１つの変異である、〔１〕～〔２２〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２４〕少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、さらに、モチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）から選ばれるモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基のシステインへの変異を含む、〔１〕～〔２３〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２５〕モチーフ（２）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＱ６８である、
　モチーフ（３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＹ８７である、
　モチーフ（１１）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＲ２９６である、
　モチーフ（１３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＶ３６３である、または
　モチーフ（１４）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＧ３９６である、
〔２４〕に記載の酵素。
〔２６〕少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０ＣおよびＶ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃから選ばれる少なくとも１つの組み合わせを含む、〔１〕～〔２５〕のいずれか１項に記載の酵素。
〔２７〕〔１〕～〔２６〕のいずれか１項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
〔２８〕〔２７〕に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔２９〕〔２８〕に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
〔３０〕形質転換体が微生物である、〔２９〕に記載の形質転換体。
〔３１〕微生物がエシェリヒア・コリである、〔３０〕に記載の形質転換体。
〔３２〕〔１〕～〔２６〕のいずれか１項に記載の酵素を含むトリプトファン分析用キット。
〔３３〕反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬の少なくとも一つをさらに含む、〔３２〕に記載のキット。
〔３４〕〔１〕～〔２６〕のいずれか１項に記載の酵素を用いる、検体中のトリプトファンの検出方法。
〔３５〕〔２９〕～〔３１〕のいずれか１項に記載の形質転換体を用いる、変異型トリプトファン酸化酵素の製造方法。
〔３６〕デバイス、および〔１〕～〔２６〕のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用検出系。
〔３７〕反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬の少なくとも一つをさらに含み、かつデバイスがマイクロ流路チップである、〔３６〕に記載のトリプトファン分析用検出系。
〔３８〕検出用電極、および検出用電極に固定または配置された、〔１〕～〔２６〕のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用酵素センサー。
　本発明によれば、トリプトファン酸化酵素活性、安定性等の特性が野生型トリプトファン酵素と比較して良好な変異型トリプトファン酸化酵素が提供される。斯かる酵素は、トリプトファンの迅速かつ高感度な測定、および／またはトリプトファンオキシレートの製造に有用である。
図１は、各温度で１５分間インキュベートしたＴｒｐＯＸの残存活性を示した図である；Ａ：野生型ＴｒｐＯＸ；Ｂ：ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）；Ｃ：ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）。
　変異型トリプトファン酸化酵素とは、野生型トリプトファン酸化酵素に対し少なくとも１つの変異を有する（改変されている）トリプトファン酸化酵素である。トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン酸化酵素活性を有し、トリプトファン酸化酵素活性とは、トリプトファン（通常はＬ－トリプトファン）、水および酸素から、トリプトファンオキシレート（トリプトファンのアミノ基がケトン基に置換されてなる２－オキソ酸）、アンモニアおよび過酸化水素を生成する可逆反応に関与する酵素活性である。
　野生型トリプトファン酸化酵素とは、変異型トリプトファン酸化酵素の基礎としての変異前のトリプトファン酸化酵素を意味する。野生型トリプトファン酸化酵素は、生物（例えば、細菌、放線菌および真菌等の微生物、昆虫、魚類、動物、植物等）に由来するものであってもよいし、上記モチーフを有するタンパク質をコードする遺伝子をその遺伝子を本来有しない他の生物（例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ））を宿主として発現させて得られる酵素タンパク質であってもよい。斯かる生物としては例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．等のストレプトマイセス属細菌、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ等のクロモバクテリウム属細菌、Ｐｓｅｕｄｏｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ　ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等のシュードガルベンキアニア属細菌、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｖｉｄｕｍ、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｇａｒｉｃｉｄａｍｎｏｓｕｍ、Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．等のジャンチノバクテリウム属細菌、Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ　ｓｐ．等のコリモナス属細菌、Ｄｕｇａｎｅｌｌａ　ｓｐ．等のデュガネラ属細菌、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ等のミクソコッカス属細菌、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｔｕｎｉｃａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　ｌｕｔｅｏｖｉｏｌａｃｅａ等のシュードアルテロモナス属細菌、ｇａｍｍａ　ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどが挙げられる。
　野生型トリプトファン酸化酵素としては例えば、以下のモチーフ（１）～（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型トリプトファン酸化酵素が挙げられるが、以下のモチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する野生型トリプトファン酸化酵素が好ましい。斯かる酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる１つのモチーフ、または２つ以上のモチーフの組み合わせを有することが好ましく、少なくともモチーフ（１４）を含むことがより好ましく、少なくともモチーフ（５）、（７）、（９）および（１０）からなる群より選ばれる１以上のモチーフとモチーフ（１４）とを有することがさらに好ましく、すべてのモチーフを有することがさらにより好ましい。変異前のトリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有していてもよく、すべてのモチーフを有することが好ましい。
　　モチーフ（１）：Ｅ５９－Ｌ６０－Ｇ６１
　　モチーフ（２）：Ｒ６４－Ｙ６５－Ｓ６６－Ｐ６７－Ｑ６８－Ｌ６９－Ｈ７０
　　モチーフ（３）：Ｙ８７－Ｐ８８－Ｆ８９－Ｔ９０
　　モチーフ（４）：Ｌ１０２－Ｋ１０３
　　モチーフ（５）：Ｇ１４２－Ｙ１４３－Ｄ１４４－Ａ１４５－Ｌ１４６
　　モチーフ（６）：Ｌ１４８－Ｐ１４９
　　モチーフ（７）：Ｍ１５５－Ａ１５６－Ｙ１５７－Ｄ１５８－Ｉ１５９
　　モチーフ（８）：Ｋ１６２－Ｈ１６３－Ｐ１６４－Ｅ１６５
　　モチーフ（９）：Ｓ２６４－Ｌ２６５
　　モチーフ（１０）：Ｐ２６６－Ｌ２６７－Ｆ２６８－Ｋ２６９－Ｇ２７０
　　モチーフ（１１）：Ｒ２９６－Ｋ２９７－Ｉ２９８－Ｙ２９９－Ｆ３００－Ｋ３０１
　　モチーフ（１２）：Ｆ３０８－Ｙ３０９
　　モチーフ（１３）：Ｇ３６２－Ｖ３６３－Ｅ３６４－Ｆ３６５
　　モチーフ（１４）：Ｈ３９４－Ｃ３９５－Ｇ３９６－Ｗ３９７－Ｍ３９８－Ｅ３９９－Ｇ４００
　各モチーフは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と細菌由来のトリプトファン酸化酵素の解析により特定されたモチーフであり、各モチーフの数字は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基番号を表し、具体的には以下のとおりである。
　モチーフ（１）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の５９～６１位のグルタミン酸（Ｅ５９）－ロイシン（Ｌ６０）－グリシン（Ｇ６１）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（２）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の６４～７０位のアルギニン（Ｒ６４）－チロシン（Ｙ６５）－セリン（Ｓ６６）－プロリン（Ｐ６７）－グルタミン（Ｑ６８）－ロイシン（Ｌ６９）－ヒスチジン（Ｈ７０）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（３）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の８７～９０位のチロシン（Ｙ８７）－プロリン（Ｐ８８）－フェニルアラニン（Ｆ８９）－スレオニン（Ｔ９０）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（５）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１４２～１４６位のグリシン（Ｇ１４２）－チロシン（Ｙ１４３）－アスパラギン酸（Ｄ１４４）－アラニン（Ａ１４５）－ロイシン（Ｌ１４６）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（６）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１４８～１４９位のロイシン（Ｌ１４８）－プロリン（Ｐ１４９）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（７）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１５５～１５９位のメチオニン（Ｍ１５５）－アラニン（Ａ１５６）－チロシン（Ｙ１５７）－アスパラギン酸（Ｄ１５８）－イソロイシン（Ｉ１５９）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（９）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の２６４～２６５位のセリン（Ｓ２６４）－ロイシン（Ｌ２６５）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１１）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の２９６～３０１位のアルギニン（Ｒ２９６）－リジン（Ｋ２９７）－イソロイシン（Ｉ２９８）－チロシン（Ｙ２９９）－フェニルアラニン（Ｆ３００）－リジン（Ｋ３０１）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１４）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の３９４～４００位のヒスチジン（Ｈ３９４）－システイン（Ｃ３９５）－グリシン（Ｇ３９６）－トリプトファン（Ｗ３９７）－メチオニン（Ｍ３９８）－グルタミン酸（Ｅ３９９）－グリシン（Ｇ４００）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。これらのモチーフは、表１に示す各生物由来のトリプトファン酸化酵素の配列の比較解析により特定され得る。表１に、各生物由来のトリプトファン酸化酵素遺伝子のアクセッション番号、各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　モチーフ（４）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１０２～１０３位のロイシン（Ｌ１０２）－リジン（Ｋ１０３）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（８）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の１６２～１６５位のリジン（Ｋ１６２）－ヒスチジン（Ｈ１６３）－プロリン（Ｐ１６４）－グルタミン酸（Ｅ１６５）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（４）および（８）は、表２に示す各生物由来のトリプトファン酸化酵素の配列の比較解析により特定され得る。表２に、各生物由来のトリプトファン酸化酵素遺伝子のアクセッション番号、各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　モチーフ（１０）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の２６６～２７０位のプロリン（Ｐ２６６）－ロイシン（Ｌ２６７）－フェニルアラニン（Ｆ２６８）－リジン（Ｋ２６９）－グリシン（Ｇ２７０）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１２）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の３０８～３０９位のフェニルアラニン（Ｆ３０８）－チロシン（Ｙ３０９）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１３）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の３６２～３６５位のグリシン（Ｇ３６２）－バリン（Ｖ３６３）－グルタミン酸（Ｅ３６４）－フェニルアラニン（Ｆ３６５）のアミノ酸領域に相当するモチーフである。モチーフ（１０）、（１２）および（１３）は、表３に示す各生物由来のトリプトファン酸化酵素の配列の比較解析により特定され得る。表３に、各生物由来のトリプトファン酸化酵素遺伝子のアクセッション番号、各モチーフに対応する配列部分も併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　一方、変異前のトリプトファン酸化酵素（野生型トリプトファン酸化酵素）は、以下のアミノ酸配列（ａ）～（ｃ）のいずれかを有するトリプトファン酸化酵素であってもよい。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
　配列番号２で表されるアミノ酸配列は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来トリプトファン酸化酵素であり、配列番号１で表される塩基配列、すなわち、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来トリプトファン酸化酵素遺伝子の完全長の塩基配列によりコードされる。
　本発明において置換、欠失、挿入、付加等の変異の対象であるアミノ酸残基は、通常は天然のＬ－α－アミノ酸である、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、Ｌ－バリン（Ｖ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、またはＬ－リジン（Ｋ）、あるいはグリシン（Ｇ）である。変異が置換、付加または挿入である場合、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、上述した変異されるアミノ酸残基と同様である。以下、アミノ酸の表記について、Ｌおよびαを省略することがある。
　上記（ｂ）のアミノ酸配列は、１または数個のアミノ酸残基の変異（例、置換、欠失、挿入、および付加）を含んでいてもよい。変異の数は、例えば１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～３０個、さらにより好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個（例、１、２、３、４または５個）である。
　上記（ｃ）のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有していてもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。
　（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列で特定されるタンパク質は、同一条件で測定された場合、上記（ａ）のアミノ酸配列を有するタンパク質のトリプトファン酸化酵素活性の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の活性を有することが好ましい。
　本明細書においてアミノ酸配列の同一性は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、アミノ酸配列の同一性を計算してもよい。また、アミノ酸配列の同一性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ　Ｓｉｚｅ　ｔｏ　Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定でＳｉｍｉｌａｒｉｔｙをｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。アミノ酸配列の同一性として、これらの計算で導き出される値のうち、最も低い値を採用してもよい。
　（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して変異が導入され得るアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸配列のアライメントを参考にして変異を導入することができる。具体的には、当業者は、１）複数のホモログのアミノ酸配列（例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列、および他のホモログのアミノ酸配列）を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、熱安定性を向上させる１以上のアミノ酸残基の変異が導入される、（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列を決定することができる。
　（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列の調製のため、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の変異が導入され、かつ当該アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。本明細書において用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸および非極性側鎖を有するアミノ酸を包括的に、中性アミノ酸と呼称することがある。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列は、上記第１の例で挙げたモチーフ（１）～（１４）を含む。上記（ｂ）および（ｃ）のアミノ酸配列も、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフが保存されていることが好ましく、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）が保存されていることが好ましく、少なくともモチーフ（１４）を含むことがより好ましく、少なくともモチーフ（５）、（７）、（９）および（１０）からなる群より選ばれる１以上のモチーフとモチーフ（１４）とを有することがさらに好ましく、すべてのモチーフを有することがさらにより好ましい。変異前のトリプトファン酸化酵素、例えば上記（ａ）～（ｃ）のいずれかを有するトリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有していてもよく、モチーフ（１）～（１４）が保存されていることが好ましい。
　本発明において変異型トリプトファン酸化酵素は、上記変異前のトリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基を変異させたものであり得る。
　変異型トリプトファン酸化酵素は通常、変異前のトリプトファン酸化酵素と比較してその特性の少なくとも１つが良好である。斯かる特性としては例えば、トリプトファン酸化酵素活性、トリプトファン酸化酵素の安定性（例えば、熱安定性）が挙げられる。変異型トリプトファン酸化酵素は、野生型と比較して、トリプトファン酸化酵素活性、トリプトファン酸化酵素の安定性のいずれかが良好であることが好ましく、両方が良好であることがより好ましい。各特性の確認は、後段の実施例の評価方法に従い所定の温度における野生型と変異型トリプトファン酸化酵素の活性を比較し、相対活性を算出することにより行えばよい。変異型トリプトファン酸化酵素の相対活性（野生型の活性を１００％とした場合）は、１００％を超えることが好ましく、１０１％、１０３％、１０４％、１０５％または１１０％をそれぞれ超えることがより好ましく、１２０％、１３０％、１４０％または１５０％をそれぞれ超えることがさらにより好ましい。トリプトファン酸化酵素の熱安定性の改善の確認は、所定の濃度における野生型と変異型トリプトファン酸化酵素の高温における残存活性（例えば、４０℃以上（好ましくは、４５℃、５０℃又は５５℃）で１５分加熱後の残存活性）を比較し、相対残存活性を算出するにより行うことができる。変異型トリプトファン酸化酵素の残存活性（野生型の残存活性を１００％とした場合）は、１００％を超えることが好ましく、１０１％、１０３％、１０４％、１０５％、１１０％、１２０％、１３０％または１４０％をそれぞれ超えることがより好ましく、１５０％、１６０％、１７０％または１８０％をそれぞれ超えることがさらにより好ましい。
　変異型トリプトファン酸化酵素が有するアミノ酸の変異としては例えば、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、ならびに、他のアミノ酸残基への置換、付加および挿入が挙げられ、通常は他のアミノ酸残基への置換である。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。変異型トリプトファン酸化酵素が有する変異の数は少なくとも１つであればよく、１～１００個、好ましくは１～８０個、より好ましくは１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個又は１～５個である。
　野生型トリプトファン酸化酵素がモチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つを含む場合、これらのモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異していることが好ましい。すなわち、モチーフ（５）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（７）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（９）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、モチーフ（１３）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせ、およびモチーフ（１４）中の１つのアミノ酸残基の変異又は２つ以上のアミノ酸残基の変異の組み合わせからなる群より選ばれる１つ以上を有することが好ましい。
　変異型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含むか、もしくは、モチーフ（５）中の少なくとも１つのアミノ酸残基、モチーフ（７）中の少なくとも１つのアミノ酸残基、モチーフ（９）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異、モチーフ（１１）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異、およびモチーフ（１３）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異と、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含むことが好ましく、
　モチーフ（５）中の少なくとも１つのアミノ酸残基、モチーフ（９）中の少なくとも１つのアミノ酸残基から選ばれる１以上の変異、およびモチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含むことがより好ましい。
　変異型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異（例えばＣ３９５の変異）を含むか、又は、モチーフ（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異（例えばＣ３９５の変異）と他の変異の組み合わせを含むことが好ましい。
　モチーフ（２）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＱ６８の変異を含むことが好ましい。Ｑ６８の変異は、システインへの置換（Ｑ６８Ｃ）が好ましい。Ｑ６８Ｃは、他のシステイン残基との間でＳＳ結合を形成することが好ましい。
　モチーフ（３）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＹ８７の変異を含むことが好ましい。Ｙ８７の変異は、システインへの置換（Ｙ８７Ｃ）が好ましい。
　モチーフ（５）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＡ１４５の変異を含むことが好ましい。Ａ１４５の変異は、システイン、バリン、スレオニン、イソロイシン、セリン、ロイシン、メチオニンまたはチロシンへの置換（Ａ１４５Ｃ、Ａ１４５Ｖ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｉ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｌ、Ａ１４５Ｍ、Ａ１４５Ｙ）が好ましく、Ａ１４５ＣまたはＡ１４５Ｖがより好ましく、Ａ１４５Ｖがさらに好ましい。
　モチーフ（７）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＭ１５５の変異および／またはＩ１５９の変異を含むことが好ましく、少なくともＭ１５５の変異を含むことがより好ましい。Ｍ１５５の変異は、アラニン、グリシンまたはバリンへの置換（Ｍ１５５Ａ、Ｍ１５５Ｇ、Ｍ１５５Ｖ）が好ましく、Ｍ１５５Ａがより好ましい。Ｉ１５９の変異は、フェニルアラニンへの置換（Ｉ１５９Ｆ）が好ましい。
　モチーフ（９）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＬ２６５の変異を含むことが好ましい。Ｌ２６５の変異は、イソロイシンへの置換（Ｌ２６５Ｉ）またはメチオニンへの置換（Ｌ２６５Ｍ）が好ましく、Ｌ２６５Ｉがより好ましい。
　モチーフ（１１）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＲ２９６の変異を含むことが好ましい。Ｒ２９６の変異は、システインへの置換（Ｒ２９６Ｃ）が好ましい。
　モチーフ（１３）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＶ３６３の変異を含むことが好ましい。Ｖ３６３の変異は、フェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシン、ヒスチジン、スレオニン、またはシステインへの置換（Ｖ３６３Ｆ、Ｖ３６３Ｗ、Ｖ３６３Ｉ、Ｖ３６３Ｈ、Ｖ３６３Ｔ、Ｖ３６３Ｃ）が好ましく、Ｖ３６３ＦまたはＶ３６３Ｗがより好ましい。
　モチーフ（１４）に含まれるアミノ酸残基の変異は、少なくともＣ３９５またはＧ３９６の変異を含むことが好ましく、Ｃ３９５の変異を含むことがより好ましい。Ｃ３９５の変異は、セリンへの置換（Ｃ３９５Ｓ）、アラニンへの置換（Ｃ３９５Ａ）、ヒスチジンへの置換（Ｃ３９５Ｈ）、プロリンへの置換（Ｃ３９５Ｐ）、グルタミンへの置換（Ｃ３９５Ｑ）、スレオニンへの置換（Ｃ３９５Ｔ）、メチオニンへの置換（Ｃ３９５Ｍ）、グリシンへの置換（Ｃ３９５Ｇ）、フェニルアラニンへの置換（Ｃ３９５Ｆ）、チロシンへの置換（Ｃ３９５Ｙ）、アスパラギン酸への置換（Ｃ３９５Ｄ）、グルタミン酸への置換（Ｃ３９５Ｅ）、リジンへの置換（Ｃ３９５Ｋ）、アスパラギンへの置換（Ｃ３９５Ｎ）、アルギニンへの置換（Ｃ３９５Ｒ）またはバリンへの置換（Ｃ３９５Ｖ）であることが好ましく、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ３９５Ｐ、Ｃ３９５ＱまたはＣ３９５Ｙがより好ましく、Ｃ３９５Ｓ又はＣ３９５Ａがさらに好ましい。Ｇ３９６の変異は、システインへの置換（Ｇ３９６Ｃ）が好ましい。
　変異型トリプトファン酵素は、各モチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基の変異により、好ましくはモチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる１以上のモチーフ中のアミノ酸残基の変異により、ＳＳ結合を有してもよい。ＳＳ結合導入の変異としては例えば、Ｑ６８Ｃ（モチーフ（２））、Ｙ８７Ｃ（モチーフ（３）），Ｒ２９６Ｃ（モチーフ（１１））、Ｃ３６３Ｃ（モチーフ（１３））、Ｇ３９６Ｃ（モチーフ（１４））が挙げられ、これらのうち、Ｃ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃの変異導入により両者の間にＳＳ結合が形成され得る。
　変異型トリプトファン酸化酵素が、上記（ａ）～（ｃ）のいずれかを有するトリプトファン酵素の変異型である場合の変異箇所は、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち２９位のシステイン（Ｃ２９）、５７位のセリン（Ｓ５７）、６３位のグリシン（Ｇ６３）、９２位のロイシン（Ｌ９２）、９５位のリジン（Ｋ９５）、１０５位のアラニン（Ａ１０５）、１３６位のグリシン（Ｇ１３６）、１８１位のグルタミン酸（Ｅ１８１）、１９０位のグリシン（Ｇ１９０）、３２１位のシステイン（Ｃ３２１）、３６７位のアルギニン（Ｒ３６７）、８３位のリジン（Ｋ８３）、８０位のチロシン（Ｙ８０）、１９０位のグリシン（Ｇ１９０）、２２位のヒスチジン（Ｈ２２）、４０９位のセリン（Ｓ４０９）、１７５位のアスパラギン（Ｎ１７５）、８４位のセリン（Ｓ８４）、１７８位のフェニルアラニン（Ｆ１７８）、１７９位のアラニン（Ａ１７９）、９８位のバリン（Ｖ９８）、１４０位のセリン（Ｓ１４０）、１４１位のメチオニン（Ｍ１４１）、１６６イソロイシン（Ｉ１６６）、２７３位のトリプトファン（Ｔ２７３）、３５２位のロイシン（Ｌ３５２）、３１０位のスレオニン（Ｔ３１０）からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基に相当する残基の変異（好ましくは他のアミノ酸残基への置換）を有することが好ましい。上記群より選ばれる１つの変異でもよいし、２つ以上の組み合わせでもよい。
　Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、およびＲ３６７の変異は、それぞれの他のアミノ酸への置換が好ましい。Ｃ２９の変異は、バリンへの置換（Ｃ２９Ｖ）が好ましい。Ｓ５７の変異は、スレオニン、トリプトファン、メチオニン、アラニン、バリン、チロシン、システイン、イソロイシン、またはロイシンへの置換（Ｓ５７Ｔ、Ｓ５７Ｗ、Ｓ５７Ｍ、Ｓ５７Ａ、Ｓ５７Ｖ、Ｓ５７Ｙ、Ｓ５７Ｃ、Ｓ５７ＩまたはＳ５７Ｌ）が好ましく、Ｓ５７Ｔがより好ましい。Ｇ６３の変異は、グルタミンへの置換（Ｇ６３Ｑ）が好ましい。Ｌ９２の変異は、アラニンへの置換（Ｌ９２Ａ）が好ましい。Ｋ９５の変異は、アラニンへの置換（Ｋ９５Ａ）が好ましい。Ｇ１３６の変異は、リジン、グルタミン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン酸への置換（Ｇ１３６Ｋ、Ｇ１３６Ｑ、Ｇ１３６Ｒ、Ｇ１３６ＮまたはＧ１３６Ｅ）が好ましく、Ｇ１３６Ｋがより好ましい。Ａ１０５の変異は、グリシンへの置換（Ａ１０５Ｇ）が好ましい。Ｇ１９０の変異は、システインへの置換（Ｇ１９０Ｃ）が好ましい。Ｃ３２１の変異は、セリンまたはアラニンへの置換（Ｃ３２１ＳまたはＣ３２１Ａ）が好ましい。Ｒ３６７の変異は、リジンへの置換（Ｒ３６７Ｋ）が好ましい。変異型トリプトファン酸化酵素は、Ｓ５７、Ｇ１３６、およびＧ１９０からなる群より選ばれる変異を少なくとも含むことが好ましい。
　Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｅ１８１、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、またはＴ３１０の変異は、それぞれのシステインへの置換が好ましい。これらの変異と共にまたは独立して、変異型トリプトファン酸化酵素のモチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基のシステインへの変異、好ましくはＱ６８Ｃ（モチーフ（２））、Ｙ８７Ｃ（モチーフ（３））、Ｒ２９６Ｃ（モチーフ（１１））、Ｖ３６３Ｃ（モチーフ（１３））、およびＧ３９６Ｃ（モチーフ（１４））から選ばれる少なくとも１つの置換を有してもよい。これらのいずれかにより、置換後のシステイン残基と他のシステイン残基との間に、または置換後のシステイン残基の間にＳＳ結合が導入され得るので、遊離のシステイン量を低下させて安定性を改善することができる。結合が導入されるアミノ酸残基の組み合わせとしては例えば、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０Ｃ、Ｖ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃ（それぞれのシステインへの置換の組み合わせ）が挙げられ、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、および／または、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃがより好ましい。
　なお、好ましい変異後のアミノ酸残基は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられてもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸残基としては例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基含有側鎖（例、アルコール、フェノキシ基含有側鎖）を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。
　変異型トリプトファン酸化酵素が、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する変異前（野生型）トリプトファン酸化酵素に対する変異を有する場合には、それぞれのモチーフの変異と上記点変異（ＳＳ結合導入変異も含む）との組み合わせを有していてもよい。
　変異型トリプトファン酸化酵素が有する、変異前のトリプトファン酸化酵素における２以上の変異の組み合わせとしては、以下の例が挙げられる。以下のうち変異組み合わせ例１～８が好ましく、変異例１～６がより好ましく、変異例１および２がさらに好ましい。
変異例１：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異、Ｇ１３６の変異、Ｙ８０の変異、Ｇ１９０の変異、およびＲ３６７の変異からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異の組み合わせ
変異例２：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｋ８３Ｃ／Ａ１４５Ｖ／Ｅ１８１Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１０）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・Ｓ５７の変異、Ｋ８３の変異、およびＥ１８１の変異からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異の組み合わせ
変異例３：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ｋ９５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｒ３６７Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｒ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ６３Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１０５Ｇ／Ｃ３９５Ａ、Ｌ９２Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ／Ｃ３９５Ａ、およびＴ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ｋ９５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｒ３６７Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ１３６Ｋ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ６３Ｑ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１０５Ｇ／Ｃ３９５Ａ、およびＬ９２Ａ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｈ２２の変異、Ｓ５７の変異、Ｇ６３の変異、Ｙ８０の変異、Ｋ８３の変異、Ｓ８４の変異、Ｌ９２の変異、Ｋ９５の変異、Ｖ９８の変異、Ａ１０５の変異、Ｇ１３６の変異、Ｓ１４０の変異、Ｍ１４１の変異、Ｉ１６６の変異、Ｆ１７８の変異、Ｅ１８１の変異、Ｇ１９０の変異、Ｔ２７３の変異、Ｌ３５２の変異、Ｒ３６７の変異、およびＳ４０９の変異からなる群より選ばれる少なくとも１つの変異の組み合わせ
変異例４：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｓ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｌ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｍ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｙ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１０５Ｇ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｌ９２Ａ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１０５Ｇ／Ａ１４５Ｖ、Ｓ５７Ｔ／Ｋ９５Ａ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｋ９５Ａ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、およびＳ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｒ３６７Ｋ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ａ１４５Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、およびＳ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異、Ｇ６３の変異、Ｌ９２の変異、Ｋ９５の変異、およびＡ１０５の変異、およびＲ３６７の変異からなる群より選ばれる１つ以上の変異
変異例５：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ｌ２６５Ｍ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ｌ２６５Ｍ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、またはＬ２６５Ｍ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異
変異例６：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、またはＧ１３６Ｋ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異、およびＧ１３６の変異からなる群より選ばれる１以上の変異
変異例７：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ｇ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ｖ／Ｃ３９５Ａ、Ｌ９２Ａ／Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、またはＫ９５Ａ／Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｌ９２の変異、およびＫ９５の変異から選ばれる少なくとも１つの変異
変異例８：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｉ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｈ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｔ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃ／Ｃ３９５Ａ、Ｖ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、より好ましくは、Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、またはＶ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（１３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異
変異例９：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（２）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｎ１７５の変異
変異例１０：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ／Ｃ３９５Ａ
　・Ａ１７９の変異
　・モチーフ（３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
変異例１１：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０Ｃ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（１１）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｔ３１０の変異
変異例１２：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｖ／Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、Ａ１４５Ｃ／Ｍ１５５Ａ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｉ１５９Ｆ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｍ１５５Ａ
　・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異
変異例１３：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｖ／Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｖ３６３Ｗ／Ｃ３９５Ａ、またはＳ５７Ｔ／Ｇ６３Ｑ／Ａ１４５Ｖ／Ｖ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異、およびＧ６３の変異からなる群より選ばれる１以上の変異
変異例１４：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｇ６３Ｑ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｇ６３の変異
変異例１５：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ａ１４５Ｖ／Ｍ１５５Ａ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（７）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
変異例１６：以下の変異の組み合わせ、好ましくは、Ｓ５７Ｔ／Ａ１４５Ｖ／Ｌ２６５Ｉ／Ｖ３６３Ｆ／Ｃ３９５Ａ
　・モチーフ（５）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（９）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１３）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・モチーフ（１４）に含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異
　・必要に応じて、Ｓ５７の変異
　変異型トリプトファン酸化酵素は、Ｃ末端またはＮ末端に、他のペプチド成分（例えば、タグ部分）を有していてもよい。他のペプチド成分としては例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ　ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に汎用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ－ｔａｇ）；シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）；他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分が挙げられる。変異型トリプトファン酸化酵素は、Ｎ末端に開始メチオニン残基を有していてもよい。
　変異型トリプトファン酸化酵素は、上述した特性が保持される限り、上記変異に加え、１または数個のアミノ酸残基の追加変異（例えば、置換、欠失、挿入および付加）を有していてもよい。追加変異の数は、例えば１～１００個、好ましくは１～５０個、より好ましくは１～４０個、さらにより好ましくは１～３０個、最も好ましくは１～２０個または１～１０個（例、１、２、３、４または５個）である。当業者は、上述した特性を保持するこのような変異型酵素を適宜作製することができる。
　したがって、変異型トリプトファン酸化酵素は、以下のいずれかであってもよい：
（ｉ）モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有する変異前トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列において、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列を含み、かつ、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が変異前トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素
（ｉｉ）（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異前トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列におけるＨ２２、Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、およびＴ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を有し、かつ、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が変異前トリプトファン酸化酵素よりも高い変異型トリプトファン酸化酵素
（ｉｉｉ）（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する変異前トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列における、Ｈ２２、Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、およびＴ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基、およびモチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異（例えば、置換）したアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の追加変異を有するアミノ酸配列を有し、かつ、トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が変異前トリプトファン酸化酵素よりも高い変異型トリプトファン酸化酵素。
　変異型トリプトファン酸化酵素は、上述した変異および追加変異の双方を有することにより、変異前の（野生型）トリプトファン酸化酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。アミノ酸配列の同一性パーセントは、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上または９９％以上であってもよい。アミノ酸配列の同一性の定義および例は、前述したとおりである。
　アミノ酸配列において追加変異が導入され得るアミノ酸残基の位置の特定に関しては、前述のとおりである。追加変異が導入される部位は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）中のアミノ酸残基、およびＨ２２、Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０およびＫ８３以外のアミノ酸残基であってもよい。
　アミノ酸残基の追加変異が置換である場合、アミノ酸残基のこのような置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」の定義および例については前述のとおりである。
　変異型トリプトファン酸化酵素は、変異型トリプトファン酸化酵素を発現する形質転換体を用いて、または無細胞系等を用いて、調製することができる。変異型トリプトファン酸化酵素を発現する形質転換体は、例えば、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製し、次いで、この発現ベクターを宿主に導入することにより作製できる。変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
　発現ベクターは、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含んでいればよく、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、本発明の変異型トリプトファン酸化酵素をコードする本発明のポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
　発現ベクターは、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドに加えて、プロモーター、ターミネーターおよび薬剤（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン）耐性遺伝子をコードする領域等の領域をさらに含んでもよい。発現ベクターは、プラスミドであっても組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであってもよい。発現ベクターは、ウイルスベクターであっても無細胞系用ベクターであってもよい。発現ベクターは、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドに対して３’または５’末端側に、本発明の変異型トリプトファン酸化酵素に付加され得る他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含んでいてもよい。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、上述したような目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、上述したような目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチド、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む種々の発現ベクターが利用可能である。したがって、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの作製のため、このような発現ベクターを利用してもよい。例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＥＴ－５１ｂ、ｐＥＴ－４１ａ、ｐＭＡＬ－ｐ５Ｇ）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＥＴ－５０ｂ）、シャペロンとして働くペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例、ｐＣｏｌｄ　ＴＦ）、他の機能をもつタンパク質あるいはタンパク質のドメインあるいはそれらとをつなぐリンカーとしてのペプチド成分をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを利用することができる。発現ベクターは、プロテアーゼによる切断部位をコードする領域を、変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド成分をコードするポリヌクレオチドとの間に含んでいてもよい。これにより、変異型トリプトファン酸化酵素とそれに付加された他のペプチド成分との切断がタンパク質発現後に可能となる。
　変異型トリプトファン酸化酵素を発現させるための宿主としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属細菌、コリネバクテリウム属細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、およびバチルス属細菌〔例、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕をはじめとする種々の原核細胞、サッカロマイセス属細菌〔例、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、ピヒア属細菌〔例、ピヒア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）〕、アスペルギルス属細菌〔例、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）〕をはじめとする種々の真核細胞を用いることができる。宿主としては、所定の遺伝子を欠損する株を用いてもよい。形質転換体としては、例えば、細胞質中に発現ベクターを保有する形質転換体、およびゲノム上に目的遺伝子が導入された形質転換体が挙げられる。
　変異型トリプトファン酸化酵素を発現する形質転換体は、所定の培養装置（例、試験管、フラスコ、ジャーファーメンター）を用いて、例えば後述の組成を有する培地において培養することができる。培養条件は適宜設定することができる。具体的には、培養温度は１０℃～３７℃であってもよく、ｐＨは６．５～７．５であってもよく、培養時間は１時間～１００時間であってもよい。また、溶存酸素濃度を管理しつつ培養を行ってもよい。この場合、培養液中の溶存酸素濃度（ＤＯ値）を制御の指標として用いることがある。大気中の酸素濃度を２１％とした場合の相対的な溶存酸素濃度ＤＯ値が、例えば１～１０％を、好ましくは３～８％を下回らない様に、通気・攪拌条件を制御することが出来る。また、培養はバッチ培養であっても、フェドバッチ培養であっても良い。フェドバッチ培養の場合は糖源となる溶液やリン酸を含む溶液を培養液に連続的あるいは不連続的に逐次添加して、培養を継続することもできる。
　形質転換される宿主は、上述したとおりであるが、大腸菌について詳述すると、大腸菌Ｋ１２株亜種のエシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株などから選択することが出来る。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ（２００１／０１／１５）などにも記載されている。以下、形質転換された大腸菌を作製し、これを用いて所定の酵素を製造する方法を、一例としてより具体的に説明する。
　変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させるプロモーターとしては、通常Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種タンパク質生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ５プロモーター等の強力なプロモーターが挙げられ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＣ、ｌａｃが好ましい。ベクターとしては例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体等が挙げられる。他のベクターとしては、ファージＤＮＡのベクターを利用してもよい。さらに、プロモーターを含み、挿入ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクターを使用してもよい。好ましくは、ベクターは、ｐＵＣ、ｐＳＴＶ、ｐＭＷであってもよい。
　変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結配列であるターミネーターを連結してもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
　変異型トリプトファン酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。
　形質転換体を選別するために、ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている〔例、ｐＵＣ系（タカラバイオ社製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３－２（クローンテック製）〕。
　得られた発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養することにより、変異型トリプトファン酸化酵素を得ることができる。
　培地としては、Ｍ９－カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。培地は、所定の炭素源、窒素源、補酵素（例、塩酸ピリドキシン）を含有していてもよい。具体的には、ペプトン、酵母エキス、ＮａＣｌ、グルコース、ＭｇＳＯ４、硫酸アンモニウム、リン酸２水素カリウム、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、などを用いても良い。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモーター、宿主菌等の種類に応じて適宜選択される。
　変異型トリプトファン酸化酵素を回収するには、以下の方法などがある。変異型トリプトファン酸化酵素は、形質転換体を回収した後、菌体を破砕（例、ソニケーション、ホモジナイゼーション）あるいは溶解（例、リゾチーム処理）することにより、破砕物および溶解物として得ることができる。このような破砕物および溶解物を、抽出、沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法に供することにより、本発明の変異型トリプトファン酸化酵素を得ることができる。
　変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファンの分析に用いることができる。斯かる分析方法は、変異型トリプトファン酸化酵素を用いて被検試料中に含まれるトリプトファンを測定することを含み得る。　
　被検試料としては、トリプトファンを含有すると疑われる試料である限り特に限定されず、例えば、生体由来試料（例、血液、尿、唾液、涙など）や食飲料品（例、栄養ドリンクやアミノ酸飲料など）が挙げられる。被検試料中のトリプトファンは、低濃度（例、１μＭ以上１ｍＭ未満等の１ｍＭ未満の濃度）であっても、高濃度（例、１ｍＭ以上１Ｍ未満等の１ｍＭ以上の濃度）であってもよい。　
　トリプトファンの分析における検出対象は、トリプトファンを測定できる限り特に限定されず、生成するトリプトファンオキシレート、および副生するＮＨ3またはＨ2Ｏ2のいずれでもよい。あるいは、他の反応と共役させて、共役反応の生成物を検出してもよい。このような共役反応としては、例えば、以下の共役反応が挙げられる。　
トリプトファン酸化反応）トリプトファン酸化酵素により触媒される反応
　トリプトファン＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2→トリプトファンオキシレート＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2
共役反応）ペルオキシダーゼにより触媒される反応
　２Ｈ2Ｏ2＋４－アミノアンチピリン＋フェノール→キノンイミン色素＋４Ｈ2Ｏ　
　上記共役反応を利用する場合、トリプトファンの測定は、変異型トリプトファン酸化酵素に加えて、４－アミノアンチピリンおよびフェノール、ならびにペルオキシダーゼを用いて行うことができる。具体的には、水溶液（例、緩衝液）中において、被検試料を４－アミノアンチピリン（４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）およびフェノール、ならびにペルオキシダーゼと混合し、次いで、混合試料を上記の酵素反応に供し、最後に、生成したキノンイミン色素（ｑｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ　ｄｙｅ）の吸光度（約５００ｎｍ）を検出することにより、トリプトファンが測定される。測定は、定性的または定量的に行うことができる。測定は、例えば、全ての基質が反応するまで測定を行うエンドポイント法に基づいて行われてもよいし、レート法（初速度法）に基づいて行われてもよい。なお、酸化反応において必要とされる酸素量は微量であるため、反応系中の溶存酸素により必要な酸素量が賄えることから、通常、反応系中へ酸素や酸素を含む気体を強制的に供給する必要はない。　
　変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン以外のアミノ酸（例、Ｌ－α－アミノ酸）に対して反応しないか、またはそれに対する反応性が極めて低い。したがって、被験試料中にトリプトファン以外のアミノ酸が含まれている場合も、変異型トリプトファン酸化酵素を用いることで、被験試料中のトリプトファンの量を特異的に評価することができる。
　また、変異型トリプトファン酸化酵素は過酸化水素電極に用いることができる。斯かる過酸化水素電極を用いることで、被験試料中のトリプトファンの量を特異的に評価することができる。　
　さらに、変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン分析用キットに含めることができる。トリプトファン分析キットは、他の試薬、例えば反応用緩衝液または緩衝塩、、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬（インドールピルビン酸検出試薬）の少なくとも一つをさらに含むことができる。　
　反応用緩衝液または緩衝塩は、反応液中のｐＨを目的の酵素反応に適した値に維持するために利用できる。
　過酸化水素検出用試薬は、過酸化水素の検出を例えば発色や蛍光などによって行う場合に利用できる。斯かる試薬としては例えば、ペルオキシダーゼとその基質となり得る発色剤の組み合わせが挙げられ、具体的には、例えば西洋わさびペルオキシダーゼと４－アミノアンチピリンおよびフェノールの組み合わせなどが挙げられるが、この組み合わせに限定されない。　
　アンモニア検出試薬としては、例えばフェノールと次亜塩素酸を組み合わせたインドフェノール法などが挙げられる。　
　トリプトファンオキシレート検出試薬としては、例えば２－オキソ酸還元酵素などが挙げられる。　
　変異型トリプトファン酸化酵素は、デバイスと共に、トリプトファン分析用検出系の構成要素とすることができる。変異型トリプトファン酸化酵素は、使用の際にデバイス中に供給され得るマイクロデバイスとは独立したユニットとして存在していてもよいが、予めデバイスに、注入、固定または配置されていてもよい。好ましくは、変異型トリプトファン酸化酵素は、予めデバイスに注入、固定または配置された形態で提供される。トリプトファン酸化酵素のデバイスへの固定または配置は、直接的または間接的に行われる。デバイスとしては、例えば、流路を備えるマイクロ流路チップ等のマイクロデバイスを好適に用いることができる。　
　トリプトファン分析用検出系は、他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては例えば、反応用緩衝液または緩衝塩、過酸化水素検出試薬、アンモニア検出試薬およびトリプトファンオキシレート検出試薬の少なくとも一つが挙げられる。トリプトファン分析用検出系では、上記他の構成要素の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、上記他の構成要素の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない要素は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。
　デバイスとしては、例えば、１）試料と（ｃ）の構成要素とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、変異型トリプトファン酸化酵素と接触させて、トリプトファンを検出するための第２区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が異なる区域中で行われるデバイス）；２）試料と（ｃ）の構成要素と変異型トリプトファン酸化酵素とを混合して、変異型トリプトファン酸化酵素によりトリプトファンを検出するための区域を備えるデバイス（混合および検出の各工程が同一区域中で行われるデバイス）；ならびに３）試料と（ｃ）の構成要素と（および必要に応じて変異型トリプトファン酸化酵素と）の混合を可能にする流路、および変異型トリプトファン酸化酵素によりトリプトファンを検出するための区域を備えるデバイス（デバイスの注入口に試料を注入すると、流路を介して送液されて試料等が自動的に混合され、得られた混合液中のトリプトファンが検出区域中で自動検出されるデバイス）が挙げられる。自動化の観点からは、３）のデバイス、特にマイクロ流路デバイスの形態である３）のデバイスが好ましい。３）のデバイスでは、変異型トリプトファン酸化酵素は、流路を流れる送液中に提供されても、検出区域に固定または配置された形態で提供されてもよいが、好ましくは検出区域に固定または配置された形態で提供される。　
　変異型トリプトファン酸化酵素は、トリプトファン分析用酵素センサーとして利用することもできる。トリプトファン分析用酵素センサーは例えば、検出用電極、および検出用電極に固定または配置された変異型トリプトファン酸化酵素を含む。変異型トリプトファン酸化酵素は、電極に直接または間接的に固定または配置される。　
　検出用電極としては例えば、過酸化水素検出用電極が挙げられ、より具体的には例えば、酵素式過酸化水素検出用電極や隔膜式過酸化水素検出用電極が挙げられる。これにより、トリプトファン酸化酵素活性によりトリプトファンが酸化された際に生じる過酸化水素を検出することで、トリプトファンの分析が可能となる。それ以外の構成は、公知のセンサーで採用されている構成をそのまま、あるいは適宜改変して利用することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕ＴｒｐＯＸの発現と精製
　大腸菌を用いたＴｒｐＯＸの組替え発現系を構築した。まず、組換え発現用のプラスミドを構築した。ＴｒｐＯＸ遺伝子の塩基配列（配列番号１）をＤＮＡプライマー１（配列番号３）およびＤＮＡプライマー（配列番号４）を用いて、標準的なＰＣＲ法に従って目的遺伝子を増幅した。続いて、ＮｄｅＩ（タカラバイオ株式会社）とＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ産物とｐＥＴ２４ａ（メルク株式会社）を制限酵素消化し、ＦａｓｔＧｅｎｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（日本ジェネティクス株式会社）を用いて除タンパク質および不要なＤＮＡ断片を除去した。得られた産物を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡績株式会社）を用いてライゲーションし、標準的な方法に従ってライゲーション産物による大腸菌ＸＬ－１０　ｇｏｌｄの形質転換体を取得した。大腸菌ＸＬ－１０　ｇｏｌｄの形質転換体からプラスミドを抽出し、標準的なＤＮＡ配列の解析法を用いて、プラスミドへの目的遺伝子の挿入を確認した。目的遺伝子が挿入されたプラスミドを、以後、ｐＥＴ２４ａ－ＴｒｐＯＸ、ｐＥＴ２４ａ－ＴｒｐＯＸによるＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体をｐＥＴ２４ａ－ＴｒｐＯＸ－ＢＬ２１（ＤＥ３）と呼ぶ。
　ＴｒｐＯＸの調製は、下記のようにして行った。まず、ｐＥＴ２４ａ－ＴｒｐＯＸ－ＢＬ２１（ＤＥ３）のグリセロールストックから５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩、静置培養した。５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地６ｍｌを５０ｍｌ容量のチューブに入れ、ＬＢプレート上のシングルコロニーを植菌し、３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。続いて、１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に２．０ｍｌチューブに集菌した。破砕用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，７５ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０)にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＢＩＯＬＵＰＴＥＲ、コスモ・バイオ株式会社）を用いて強度Ｈ、インターバル３０秒、１０分間で２回破砕した。この破砕液を１３０００×ｇで１５分間遠心し上清を回収した後、Ｈｉｓ　Ｓｐｉｎ　Ｔｒａｐ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）もしくはＴＡＬＯＮ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓ（タカラバイオ株式会社）を用いて精製を行った。精製は製品添付のプロトコルに従ったが、Ｈｉｓ　Ｓｐｉｎ　Ｔｒａｐを用いる場合、洗浄バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，７５ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）、溶出バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０)を使用した。一方、ＴＡＬＯＮ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎｓを使用する場合は破砕用バッファーおよび洗浄バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ）、溶出バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）を用いた。洗浄、溶出はそれぞれ２回ずつ行い、回収した溶出画分は氷上で保存した。
〔実施例２〕ＴｒｐＯＸ変異体の調製
　ＴｒｐＯＸ変異体を、下記のようにして調製した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔｓ（アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、ｐＥＴ２８ａ－ＴｒｐＯＸを鋳型として製品添付のプロトコルに従い、ＴｒｐＯＸ遺伝子への変異導入を行った。変異を複数導入する際には、変異を入れたプラスミドを鋳型として用い変異を追加していくことで行った。この変異導入済みプラスミドを用いて、実施例１に記載の方法に従って、組換え発現、精製を行うことで様々なＴｒｐＯＸ変異体を取得した。
〔実施例３〕活性および熱安定性の評価（１）
　実施例１および実施例２で調製したＴｒｐＯＸの野生型および変異体の活性および熱安定性の評価は、下記手順にて行った。０．１ｍｇ／ｍｌに調製した各ＴｒｐＯＸをマイクロチューブへ分注し、４℃、４５℃のいずれかの温度で１５分間インキュベートした後に、ＴｒｐＯＸを０．０２ｍｇ／ｍｌとなるように１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０で希釈した。
　下記反応液ＡおよびＢを調製した。
反応液Ａ：２ｍＭ　フェノール、２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０
反応液Ｂ：１００ｍＭ　４－アミノアンチピリン、１５００Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ
　９６穴マイクロプレートに反応液Ａを４９μｌ、反応液Ｂを２μｌ、超純水を２９μｌ、０．１Ｍ　Ｔｒｐを１０μｌ混合した溶液に対して０．０２ｍｇ／ｍｌに調製したＴｒｐＯＸを１０μｌ加えた溶液の、波長５０５ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（ｘＭａｒｋ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で測定した。表４は、各ＴｒｐＯＸ変異体の相対活性および残存活性である。表４中、コントロールと比較した相対活性は、コントロール（野生型ＴｒｐＯＸ）の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性の比である。表４中、熱処理後の残存活性は、各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する加熱処理（４５℃で１５分間処理）後の各ＴｒｐＯＸ変異体の活性の比である。
　表５および表６は、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の遺伝子を鋳型として変異を導入した各ＴｒｐＯＸ変異体の相対活性および残存活性である。表６のＴｒｐＯＸ変異体は、ＳＳ結合導入を目的とした変異がＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）に導入された変異体である。表５及び６中、コントロールと比較した相対活性は、コントロール（ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ））の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性の比である。熱処理後の残存活性は、各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する加熱処理（４５℃で１５分間処理）後の各ＴｒｐＯＸ変異体の活性の比である。表４中のコントロールは、野生型の結果であり、表５および６中のコントロールは、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表４の結果から、Ｃ２９への変異導入（Ｃ２９Ｖなど）、Ｓ５７への変異導入（Ｓ５７Ｔなど）、Ｇ６３への変異導入（Ｇ６３Ｑなど）、Ｇ１３６への変異導入（Ｇ１３６Ｋなど）、モチーフ（５）への変異導入（Ａ１４５Ｖなど）、モチーフ（９）への変異導入（Ｌ２６５Ｉなど）、Ｃ３２１への変異導入（例えばＣ３２１Ａ）、モチーフ（１３）への変異導入（Ｖ３６３Ｗなど）、および、モチーフ（１４）への変異導入（Ｃ３９５Ａなど）により、トリプトファン酸化酵素活性および／または熱安定性を向上させることができることが分かる。
　表５の結果から、Ｓ５７への変異導入（Ｓ５７Ｔなど）、Ｇ１３６への変異導入（Ｇ１３６Ｑ、Ｇ１３６Ｒ、Ｇ１３６Ｋなど）、モチーフ（５）への変異導入（Ａ１４５Ｉ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｃなど）、モチーフ（１３）への変異導入（Ｖ３６３Ｆ、Ｖ３６３Ｉなど）、モチーフ（１３）への変異導入（Ｖ３６３Ｗなど）、Ｇ６３への変異導入（Ｇ６３Ｑなど）、モチーフ（５）への変異導入（Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｖなど）、モチーフ（７）への変異導入（Ｍ１５５Ａ、Ｍ１５５Ｇ、Ｍ１５５Ｖなど）と、モチーフ（１４）への変異導入（Ｃ３９５Ａなど）とを組み合わせることにより、トリプトファン酸化酵素活性および／または熱安定性を向上させることができることが分かる。
　表６の結果より、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、モチーフ（２）中のアミノ酸残基（Ｑ６８Ｃなど）／Ｎ１７５Ｃ、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、モチーフ（３）から選ばれるアミノ酸残基（Ｙ８７Ｃなど）／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、またはモチーフ（１３）中のアミノ酸残基（Ｖ３６３Ｃなど）／Ｇ３９６Ｃ、またはモチーフ（１１）中のアミノ酸残基（Ｒ２９６Ｃなど）／Ｔ３１０Ｃと、モチーフ（１４）への変異導入（Ｃ３９５Ａなど）とを組み合わせることにより、トリプトファン酸化酵素の熱安定性を向上させることができ、さらにトリプトファン酸化酵素活性も向上させ得ることが分かる。これらの組み合わせの変異後のシステイン間にはＳＳ結合が導入され、これにより遊離システイン量が減少し、トリプトファン酸化酵素の特性が向上したものと考えられる。
〔実施例４〕ＴｒｐＯＸ多重変異体の調製と活性および熱安定性の評価
　実施例２に記載に記載の方法で目的とするＴｒｐＯＸに対して複数変異点を導入することで調製したＴｒｐＯＸの発現は、実施例１に記載の方法に従い行った。ＴｒｐＯＸの精製は、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートへ植菌し、３７℃で一晩静置培養した菌体を、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍｌを１２ｍｌ容量のチューブに入れて、３７℃で旋回振盪にて培養した。続いて、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地１５０ｍｌ容量のフラスコに培養液を１．５ｍｌ加え３７℃でＯＤ６００の値が０．６程度になるまで旋回振盪にて培養した。続いて、１６℃の下３０分間静置し、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭとなるように添加し、１６℃で旋回振盪にて一晩培養した後に５０ｍｌチューブに入れ、菌体洗浄バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）にて菌体を洗浄した後に集菌した。
　破砕用バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）にて菌体を懸濁し、超音波破砕機（ＩＳＯＮＡＴＯＲ　２０１Ｍ、久保田商事株式会社)を用いて１８０Ｗ，２０分間破砕した。この破砕液を１５０００×ｇで１５分間遠心し上清を回収した後，０．２２μｍフィルターに通し、ＡＫＴＡ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　１０ＳとＨｉｓＴｒａｐ　ＦＦ　ｃｒｕｄｅ　１ｍｌ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製を行った。用いたバッファーは、カラム平衡化および洗浄バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０)と、溶出バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，５００ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０)で、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。サンプルを供与後に、カラム平衡化および洗浄バッファーにて洗浄を行い、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度２０－５００ｍＭのグラジエント５ｍＬで溶出した。サンプリングは０．５ｍＬずつ行い、回収した溶出画分は氷上で保存した。
　次に、ＡＫＴＡ　Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　１０ＳとＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰ　１ｍＬを用いて、陰イオン交換カラムによる精製を行った。ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰでの精製に用いたバッファーは、カラム平衡化および洗浄バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）と、溶出バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で、流速は１ｍＬ／ｍｉｎとした。サンプルを平衡化および洗浄バッファーで２０倍希釈し、陰イオン交換カラムに供した後、カラム平衡化および洗浄バッファーにて洗浄を行い、ＮａＣｌ濃度０－５００ｍＭのグラジエント５ｍＬで溶出した。サンプリングは０．５ｍＬずつ行い回収した溶出画分は透析バッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，３００ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）にて溶液交換を行い４℃に保存した。
　活性および熱安定性の評価は、４５℃の代わりに５０℃、５５℃でインキュベートを行った以外は、実施例３に従った。表７は、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の遺伝子を鋳型として変異を複数導入した変異体の活性および耐熱性を評価した結果である。表７中、コントロールと比較した相対活性、及び、熱処理後の残存活性は、加熱処理の温度が５０℃または５５℃であるほかは、表５および６のそれぞれと同義である。表７中のコントロールは、ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７より、上述した変異例１～１６で示した変異型トリプトファン酸化酵素はいずれも、トリプトファン酸化酵素活性および／または熱安定性が向上していることが分かる。
〔実施例５〕活性および熱安定性の評価（２）
　実施例１で調製した野生型ＴｒｐＯＸに対し実施例２と同様にして表８に示す変異を導入して変異体を調整した。各変異体の活性および熱安定性を、４５℃の代わりに５０℃でインキュベートを行った以外は、実施例３と同様にして評価した。表８に、変異体の相対活性および５０℃、１５分間加熱後の相対残存活性を示した。表８中、コントロールと比較した相対活性は、コントロール（野生型ＴｒｐＯＸ）の４℃で１５分間処理後の活性１００％に対する、各ＴｒｐＯＸ変異体の４℃で１５分処理後の活性の比である。相対残存活性は、コントロール（野生型ＴｒｐＯＸ）の加熱処理（５０℃で１５分間処理）後の残存活性１００％に対する、加熱処理（５０℃で１５分間処理）後の各ＴｒｐＯＸ変異体の残存活性の比である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８の結果から、モチーフ（１４）への変異導入によりトリプトファン酸化酵素活性を向上させることができること、モチーフ（１４）の中でもＣ３９５への変異導入によりトリプトファン酸化酵素活性および熱安定性を向上させることができることが分かる。
〔実施例６〕温度依存性の評価
　Ａ．野生型ＴｒｐＯＸと、Ｂ．ＴｒｐＯＸ（Ｃ３９５Ａ）、および、Ｃ．ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）について温度依存性を確認した。反応、測定は９６穴マイクロプレートを用いて行った。１．０ｍｇ／ｍｌに調製した各ＴｒｐＯＸをマイクロチューブへ分注し、４℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃でそれぞれ１５分間インキュベートした後に、ＴｒｐＯＸを０．０２ｍｇ／ｍｌとなるように１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０で希釈した。実施例３の反応液Ａと反応液Ｂを用いて、反応液Ａを４９μｌ、反応液Ｂを２μｌ、超純水を２９μｌ、０．１Ｍ　Ｔｒｐを１０μｌ混合した溶液に対して０．０２ｍｇ／ｍｌに調製したＴｒｐＯＸを１０μｌ加えた溶液の、波長５０５ｎｍにおける吸光度の経時変化をマイクロプレートリーダー（ｘＭａｒｋ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．)で測定した。一定時間経過した後の各温度でインキュベートした酵素の残存活性を図１に示す。野生型ＴｒｐＯＸは４５℃から５０℃において顕著な活性低下を示すのに対してＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｙ８０Ｃ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｇ１９０Ｃ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）は５５℃でインキュベート後も高い活性を示し、熱安定性が大きく改善されていた。
〔実施例７〕血漿中Ｔｒｐの定量分析
　ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）変異体を用いて、ヒト血漿中のＴｒｐを定量分析した。反応、測定は９６穴プレートを用いて３７℃で行った。ＴｒｐＯＸ（Ｓ５７Ｔ／Ｇ１３６Ｋ／Ａ１４５Ｖ／Ｌ２６５Ｉ／Ｃ３９５Ａ）変異体を１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５，３００ｍＭ　ＮａＣｌ溶液で０．５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。下記反応液Ａおよび反応液Ｂを調製した。
反応液Ａ：０．２Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ８．０
反応液Ｂ：１００ｍＭ　ＴＯＯＳ，１００ｍＭ　４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ，１５００Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ，２Ｍ　ＮａＣｌ
　９６穴マイクロプレートに反応液Ａを１５０μｌ、反応液Ｂを３９μｌ、超純水を５１μｌ、検体（Ｔｒｐ水溶液もしくは血漿）を３０μｌ加えた溶液に対して０．５ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。検体を添加する際は各希釈倍率（１０倍、２０倍、２５倍)に応じて添加量を調製した。ＴｒｐＯＸを３０μｌ加え混合する前および混合後一定時間の５５５ｎｍおよび８００ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ　５５５ｎｍ（前）、Ａｂｓ　５５５ｎｍ（後）、Ａｂｓ　８００ｎｍ（前）、Ａｂｓ　８００ｎｍ（後）)をマイクロプレートリーダー（Ｍ２ｅ，モレキュラーデバイス社）にて測定した。
　反応前後の各測定ポイントにおける吸光度の値を用いて、酵素液添加の前後における吸光度の変化量（ΔＡｂｓ）は、（Ａｂｓ　５５５ｎｍ（後）－Ａｂｓ　８００ｎｍ（後）)－（Ａｂｓ　５５５ｎｍ（前）－Ａｂｓ　８００ｎｍ（前））×２７０÷３００として求めた。検体としてＴｒｐ水溶液を用いた際のΔＡｂｓとＴｒｐ濃度との関係から検量線を作成し、検体としてヒト血漿を用いた際のΔＡｂｓから、ヒト血漿中のＴｒｐ濃度を求めた。検量線は、各Ｔｒｐ濃度において３回実験を行った際の平均値を用いて作成し、同一ロットのヒト血漿を３回測定して、アミノ酸アナライザーによる分析値（４５．４μＭ）と比較した。結果を表９として示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例の結果は、本発明による変異型トリプトファン酸化酵素はトリプトファン酸化酵素活性が野生型より向上しているため、トリプトファンの迅速かつ高感度な測定、および／またはトリプトファンオキシレートの製造に有用であることを示している。また、野生型より良好な熱安定性を示し、中でも水溶液中で良好な熱安定性を示し得ることから、トリプトファン検査試薬、中でも液状の検査試薬として有用であることを示している。
　本発明によれば、トリプトファンの迅速、高感度、かつ特異的な測定に、またはトリプトファンオキシレートの製造に有用な変異型トリプトファン酸化酵素およびその用途が提供される。従って本発明は、生体研究、健康栄養、医療、食品製造などの広範な分野において有用である。

Claims (20)

  1. 　野生型トリプトファン酸化酵素の少なくとも１つのアミノ酸残基が変異しており、
    　トリプトファン酸化酵素活性および／または安定性が野生型トリプトファン酸化酵素よりも高い、変異型トリプトファン酸化酵素。
  2. 　野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフを有し、
    　少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、モチーフ（２）、（３）、（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれるモチーフに対する少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
    請求項１に記載の酵素。
    　　モチーフ（２）：Ｒ６４－Ｙ６５－Ｓ６６－Ｐ６７－Ｑ６８－Ｌ６９－Ｈ７０
    　　モチーフ（３）：Ｙ８７－Ｐ８８－Ｆ８９－Ｔ９０
    　　モチーフ（５）：Ｇ１４２－Ｙ１４３－Ｄ１４４－Ａ１４５－Ｌ１４６
    　　モチーフ（７）：Ｍ１５５－Ａ１５６－Ｙ１５７－Ｄ１５８－Ｉ１５９
    　　モチーフ（９）：Ｓ２６４－Ｌ２６５
    　　モチーフ（１１）：Ｒ２９６－Ｋ２９７－Ｉ２９８－Ｙ２９９－Ｆ３００－Ｋ３０１
    　　モチーフ（１３）：Ｇ３６２－Ｖ３６３－Ｅ３６４－Ｆ３６５
    　　モチーフ（１４）：Ｈ３９４－Ｃ３９５－Ｇ３９６－Ｗ３９７－Ｍ３９８－Ｅ３９９－Ｇ４００
  3. 　モチーフ（９）中のＬ２６５の変異を少なくとも含む、請求項２に記載の酵素。
  4. 　Ｌ２６５の変異は、Ｌ２６５ＩまたはＬ２６５Ｍである、請求項３に記載の酵素。
  5. 　モチーフ（１４）中のＣ３９５の変異を少なくとも含む、請求項２～４のいずれか１項に記載の酵素。
  6. 　Ｃ３９５の変異は、Ｃ３９５Ｓ、Ｃ３９５Ａ、Ｃ３９５Ｐ、Ｃ３９５ＱまたはＣ３９５Ｙである、請求項５に記載の酵素。
  7. 　野生型トリプトファン酸化酵素は、モチーフ（１）、（４）、（６）、（８）、（１０）および（１２）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモチーフをさらに有する、請求項２～６のいずれか１項に記載の酵素。
    　　モチーフ（１）：Ｅ５９－Ｌ６０－Ｇ６１
    　　モチーフ（４）：Ｌ１０２－Ｋ１０３
    　　モチーフ（６）：Ｌ１４８－Ｐ１４９
    　　モチーフ（８）：Ｋ１６２－Ｈ１６３－Ｐ１６４－Ｅ１６５
    　　モチーフ（１０）：Ｐ２６６－Ｌ２６７－Ｆ２６８－Ｋ２６９－Ｇ２７０
    　　モチーフ（１２）：Ｆ３０８－Ｙ３０９
  8. 　野生型トリプトファン酸化酵素は、
    （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列、または
    （ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
    を有するタンパク質である、請求項１～７のいずれか１項に記載の酵素。
  9. 　Ｃ２９、Ｓ５７、Ｇ６３、Ｌ９２、Ｋ９５、Ａ１０５、Ｇ１３６、Ｅ１８１、Ｇ１９０、Ｃ３２１、Ｒ３６７、Ｙ８０、Ｇ１９０、Ｋ８３、Ｈ２２、Ｓ４０９、Ｎ１７５、Ｓ８４、Ｆ１７８、Ａ１７９、Ｖ９８、Ｓ１４０、Ｍ１４１、Ｉ１６６、Ｔ２７３、Ｌ３５２、Ｔ３１０からなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を含む、
    請求項１～８のいずれか１項に記載の酵素。
  10. 　少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、さらに、モチーフ（２）、（３）、（１１）、（１３）および（１４）からなる群より選ばれるモチーフ中の少なくとも１つのアミノ酸残基のシステインへの変異を含む、請求項２～９のいずれか１項に記載の酵素。
  11. 　モチーフ（２）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＱ６８である、
    　モチーフ（３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＹ８７である、
    　モチーフ（１１）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＲ２９６である、
    　モチーフ（１３）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＶ３６３である、または
    　モチーフ（１４）の少なくとも１つのアミノ酸残基がＧ３９６である、
    請求項１０に記載の酵素。
  12. 　少なくとも１つのアミノ酸残基の変異は、Ｙ８０Ｃ／Ｇ１９０Ｃ、Ｋ８３Ｃ／Ｅ１８１Ｃ、Ｈ２２Ｃ／Ｓ４０９Ｃ、Ｑ６８Ｃ／Ｎ１７５Ｃ、Ｓ８４Ｃ／Ｆ１７８Ｃ、Ｙ８７Ｃ／Ａ１７９Ｃ、Ｖ９８Ｃ／Ｓ１４０Ｃ、Ｍ１４１Ｃ／Ｉ１６６Ｃ、Ｔ２７３Ｃ／Ｌ３５２Ｃ、Ｒ２９６Ｃ／Ｔ３１０ＣおよびＶ３６３Ｃ／Ｇ３９６Ｃから選ばれる少なくとも１つの組み合わせを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の酵素。
  13. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の酵素をコードするポリヌクレオチド。
  14. 　請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  15. 　請求項１４に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
  16. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の酵素を含むトリプトファン分析用キット。
  17. 　請求項１～１２のいずれか１項に記載の酵素を用いる、検体中のトリプトファンの検出方法。
  18. 　請求項１５に記載の形質転換体を用いる、変異型トリプトファン酸化酵素の製造方法。
  19. 　デバイス、および請求項１～１２のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用検出系。
  20. 　検出用電極、および検出用電極に固定または配置された、請求項１～１２のいずれか一項に記載の酵素を含む、トリプトファン分析用酵素センサー。
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