JP6130161B2 - 新規l−アルギニン酸化酵素、l−アルギニンの測定方法、l−アルギニンの測定用キットおよびl−アルギニン測定用の酵素センサ - Google Patents
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Description
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列;
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
(A)水と酸素の存在下、検体に上記の本発明に係るL−アルギニン酸化酵素を作用させる工程;および
(B)上記L−アルギニン酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする。
本発明に係るL−アルギニン酸化酵素は、下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とする。
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列;
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列
(i) 寄託機関の名称およびあて名
名称: 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名: 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8
(ii) 寄託日: 2013年1月18日
(iii) 受領番号: NITE AP−1511
(iv) 受託番号: NITE P−1511
本発明に係るL−アルギニンの測定方法は、
(A)水と酸素の存在下、検体に、上記の本発明に係るL−アルギニン酸化酵素を作用させる工程;および
(B)上記L−アルギニン酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程を含むことを特徴とする。
2H2O2 + 4−アミノアンチピリン + フェノール → キノンイミン色素 + 4H2O
本発明に係るL−アルギニンの定量用キットは、以下の試薬を含むことを特徴とする。
(K1)L−アルギニン酸化酵素
本発明に係るL−アルギニン測定用の酵素センサは、検出用電極の表面または近傍にL−アルギニン酸化酵素が配置されており、且つ、検出用電極は過酸化水素検出用電極であることを特徴とする。この酵素センサに用いるL−アルギニン酸化酵素は、上記の本発明に係るL−アルギニン酸化酵素である。
(1)L−アルギニン酸化酵素活性測定用試薬の調製
表1の配合に従って調製した。
L−アルギニン酸化酵素活性は、L−アミノ酸の酸化で生成される過酸化水素量を、表1の発色液を用いて比色法で求めた。具体的には、1cm石英セル中、発色液、表2に示すアミノ酸の100mM溶液および酵素液を2:2:1(容量比)の割合で混合し、30℃で反応させ、吸光度計を用いて反応開始から連続的(約1秒間隔)に550nmの吸光度を測定した。L−アルギニン酸化酵素活性の基質は、表2に示した20種類のアミノ酸(100mM溶液)を用い、ブランクでは、基質の代わりに100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を添加した。得られた吸光度変化により、下記計算式に基づきL−アルギニン酸化酵素活性を算出した。尚、上記条件で1分間に1マイクロモルの過酸化水素を与える酵素量を1Uとした。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づきL−アルギニン酸化酵素の酵素活性を算出した。
活性値(U/ml)={ΔOD/min(ΔODtest−ΔODblank)×3.1(ml)×希釈倍率}/{13×1.0(cm)×0.1(ml)}
3.1(ml):全液量
13:ミリモル吸光係数
1.0cm:セルの光路長
0.1(ml):酵素サンプル液量
(1) スクリーニング
富山県内各地から土壌試料を採取し、上記試験例1に準拠して各土壌に含まれる微生物のL−アルギニン酸化酵素活性を試験し、L−アルギニン酸化酵素活性を有する微生物をスクリーニングした。その結果、L−アルギニン酸化酵素活性を有するPseudomonas sp.BYC41−1株を見出した。
Pseudomonas sp.BYC41−1株から常法に従ってゲノムDNAを抽出し、得られたゲノムDNAを鋳型とし、PCRにより16S rDNAを増幅し、塩基配列を決定した。当該微生物の16S rDNA塩基配列を配列番号7に示す。決定された配列に基づいて、アポロンDB−BA8.0 Blastにより、相同性の高い微生物を検索した。結果を表3に示す。
本発明に係るBYC41−1株の生理・生化学性状を試験した。第一次試験の結果を表4に、第二次試験の結果を図2と表5に示す。
(1) シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株由来のL−アルギニン酸化酵素の精製
(i) シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株の培養
上記実施例1のシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株を、5mlのPseudomonas medium A培地(2.0%ポリペプトン,1.0%硫酸カリウム,0.14%塩化マグネシウム,0.2%L−アルギニン、pH7.0)に植菌し、30℃、200rpmで12時間前培養した。その後、500mlのPseudomonas medium A培地を含む2Lの坂口フラスコに植菌し、30℃、96rpmで24時間培養した。培養後、12,000×gで20分間遠心分離し、菌体を得た。
上記で得られた菌体を生理食塩水(0.9%NaCl)で洗浄した後、培地20L分の菌体を100mLの20mMリン酸緩衝液(pH7.0)(KPB)に懸濁した。100mLの菌体液を15分間超音波処理し、8,000rpm、4℃で20分間遠心分離し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
20mM KPB(pH7.0)により平衡化したQ−セファロース樹脂100mlをカラムに充填し、20mM KPB(pH7.0)で透析した上記無細胞抽出液を吸着させた。500mLの20mM KPBでカラムを洗浄した後、20mM KPB(pH7.0)500mlおよび500mM NaClを含む20mM KPB(pH7.0)500mlを用いて、グラジエントによりNaCl濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、10mLずつ試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集めた。
活性が得られたフラクションに、終濃度が2Mになるように硫酸アンモニウムを添加し、これを酵素液とした。2M硫酸アンモニウムを含む20mM KPB(pH7.0)により平衡化したOctyl−セファロース樹脂100mlをカラムに充填し、活性フラクションを吸着させた。500mLの2M硫酸アンモニウムを含む20mM KPB(pH7.0)でカラムを洗浄した後、2M硫酸アンモニウムを含む20mM KPB250mlおよび20mM KPB250mlを用いて、グラジエントにより硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げ、酵素を溶出させた。活性が確認された非吸着画分を5Lの同緩衝液(×3回)で、1晩透析を行った。
中圧高速液体クロマトグラフィ(FPLC、カラム:2M硫酸アンモニウムを含む20mM KPBで平衡化したRESOURCE PHE 6mlカラム)を用いた。サンプルループに限外濾過により透析した酵素液2mlを注入し、2M硫酸アンモニウムを含む20mM KPBおよび20mM KPBを用いて、FPLCのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション(0.5ml)から活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。透析した後、限外濾過を用いて酵素液を2mLまで濃縮した。
中圧高速液体クロマトグラフィ(FPLC、カラム:20mM KPBで平衡化したMonoQ HR 10/100カラム)を用いた。サンプルループに限外ろ過(セントリコンチューブ)により濃縮した酵素液200μLを注入し、20mM KPBおよび0.5mM NaClを含む20mM KPBの2つの溶媒を用いて、FPLCのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション(0.5mL)から活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。透析した後、セントリコンを用いて酵素液を200μLまで濃縮した。以上の精製状況を、表6にまとめる。
泳動ゲルとして、36%アクリルアミド5.25ml、0.68Mトリス−HCL緩衝液(pH8.8)8.25mL、1%SDS 1.58mL、10%TEMED 187μL、2%APS 562.5μLの組成を有するゲルに、36%ポリアクリルアミド0.5mL、0.179Mトリス−HCl(pH6.8)3.5mL、1%SDS 0.5mL、10%TEMED 125μL、2%APS 375μLの組成を有する濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液(グリセロール200μL、1Mトリス−HCl(pH8.0)40μL、水360μL、2−メルカプトエタノール200μLおよび10%SDS 200μL)と等量混合した精製酵素サンプル10μLを、ランニング緩衝液(トリス3.0g、グリシン14.1gおよびSDS 10g)中、30mAで電気泳動を行った。その後、ゲルをタンパク染色液(CBB2.5g、メタノール500mL、酢酸50mLおよび水450mL)で1時間染色し、脱色液(メタノール:酢酸:水=3:1:6)でバンドが鮮明になるまで脱色した。
bovine serum albumin (66,267)
aldolase (42,200)
carbonic anhydrase (30,000)
soybean trypsin inhibitor (20,000)
精製酵素のN末端アミノ酸配列は、株式会社ニッピに分析を依頼した。精製したシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株由来L−アルギニン酸化酵素をEdman分解法によりN末端側から15残基決定した。
(1) シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株由来L−アルギニン酸化酵素遺伝子のクローニング
(i) シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株の染色体DNAの抽出
上記実施例1のシュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株をTGY培地3mLに植菌し、30℃、200rpmで12時間培養した。培養液1mLを、15,000rpm、4℃で5分間遠心分離し、集菌した。菌体をSTE緩衝液(NaCl 0.58g、1Mトリス−HCl(pH8.0)1mLおよび0.5M EDTA(pH8.0)200μLを水で100mLに定量したもの)1mLで洗浄した後、同緩衝液に懸濁した。68℃で15分間加熱した後、15,000rpm、4℃で5分間遠心分離し、上清を除いた。別途、リゾチーム5mg、10mg/mL RNase 10mL(以下、当該溶液を「1液」という)を準備した。また、グルコース0.9g、1Mトリス−HCl(pH8.0)2.5ml、0.5M EDTA(pH8.0)2mLを含む溶液に超純水を加え、総量を100mLにした。当該溶液1mLと、上記1液10mLを混合した。上記遠心分離沈殿物を、当該混合液300μLに懸濁した。37℃で30分間インキュベートした後、プロテイナーゼK液(プロテイナーゼK 10mg/1液1mL)6μLを加え、穏やかに混合し、37℃で10分間インキュベートした。N−ラウロイルザリコシン3mgを加えて、穏やかに混合した後、37℃で3時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム処理を穏やかに2回行った。上清300μLに5M NaCl溶液10μLとエタノール600μLを加えて混合した後、15,000rpm、4℃で10分間遠心分離した。70%エタノールで洗浄した後、風乾し、TE緩衝液100μLに溶解し、目的とする染色体DNAを得た。
PCR反応液の組成は、水35μL、10×LA Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmolプライマー1(5’−TATAATCATATGAGCCAGACCCAGCCATTGGATG−3’)(配列番号3)1μL、100pmolプライマー2(5’−TATTACTCGAGTCATGCTTTGATCCCTGTGTAGGCG−3’)(配列番号4)1μL、鋳型DNA2μLおよびLA Taq 1μLとした。PCR反応の条件は、(i)98℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)72℃で2分間、および(ii)までを30サイクルとした。増幅した遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE(USA)社のGel−Mゲル抽出キットを用いて抽出した。
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー1とプライマー2を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、1.6μLの各プライマー、1.6μLの鋳型DNA、1μLのBigDyeプレミックスソリューション、1.5μLの5xBigDyeシーケンシングバッファーと4.9μLの滅菌水とし、全量10μLとした。PCR反応の条件は、(i)96℃で2分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間、(v)(ii)〜(iv)を25回、および(vi)72℃で5分間とした。PCR産物に、1μLの3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)、1μLの0.125M EDTAと25μLのエタノールを加え、室温で15分間放置した後、15,000rpm、4℃で8分間遠心分離することにより沈殿させた。上清を廃棄した後、10μLの Hi Di Formamideを加え、100℃で5分間加熱した後に、氷水で急冷したものをABI PRISM 310 Genetic Analyzerで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はGenetyxで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。配列番号2に、シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株由来のL−アルギニン酸化酵素遺伝子配列から予測される1次構造を示した。
ライゲーション反応の組成は、PCR産物5μL、pT7 Blue T−Vecter(Novagen)1μL、ライゲーションミックス(Takara)6μLとし、16℃で30分間反応させた。大腸菌(E.coli JM109)のコンピテントセル100μLに12μLのライゲーション反応液を加え、ヒートショック法で形質転換した。80μg/mLのアンピシリンを含むLB培地(1.0%ポリペプトン,0.5%イースト抽出物および1.0% NaCl)に生育したコロニーを数株選抜してプラスミド抽出し、0.7%アガロース電気泳動により、インサートの有無を確認した。
(i) シュードモナス・エスピー(Pseudomonas sp.)BYC41−1株由来のL−アルギニン酸化酵素遺伝子の増幅
PCR反応液の組成は、水35μL、10×LA Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmolプライマー1(5’−ATATTCTAGAGAAGGAGGCATAGTGGATGAGCCAGACCCAGCCATT−3’)(配列番号5)1μL、100pmolプライマー2(5’−ATATCTCGAGTCATGCTTTGATCCCTGTGT−3’)(配列番号6)1μL、鋳型DNA2μLおよびLA Taq 1μLとした。PCR反応の条件は、(i)98℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)72℃で2分間、および(ii)までを30サイクルとした。
PCR反応で得られた、PCR産物5μLに、1μL XbaIと1μL XhoIを加え、37℃で1時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、5μL DNA、1μL pET15b(増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの)、6μLライゲーションMixとし、16℃で30分間インキュベートした。得られたライゲーション反応液全量を、ヒートショック法により、大腸菌(E.coli BL21)に導入した。
80μg/mLのアンピシリンを含む4LのLB培地(1.0%ポリペプトン、0.5%イースト抽出物、1.0% NaCl、pH7.0)に組換え大腸菌(BL21)を植菌し、16℃で12時間培養後、0.5mM IPTGを添加して、引き続き30℃で12時間培養してL−アミノ酸オキシダーゼを誘導した。大型遠心機を用いて5,000rpm、4℃で10分間遠心分離することにより集菌し、生理食塩水(0.9% NaCl)で洗浄した後、100mLの20mMリン酸緩衝液(pH7.0)(KPB)に懸濁した。100mLの菌体液を15分間超音波処理し、8,000rpm、4℃で20分間遠心分離することにより得られた上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液を(1)(iii)〜(vi)と同様の手法で精製を行った。
精製酵素標品の酵素活性を、基質濃度をより低い5mMとした以外は表2におけるアミノ酸をそれぞれ単独に含有する測定試薬にて測定した。結果を図4と表7に示す。
上記実施例1(1)にて精製したL−アルギニン酸化酵素標品を用いて、上記試験例1のL−アルギニン測定用試薬組成物を調製した。本試薬組成物を用い、L−アルギニン測定を実施した。検体として、0〜200μMのL−アルギニン水溶液と、L−アルギニンを0〜200μM含む血漿試料を調製した。血漿試料の測定結果を図5(1)に、両試料のL−アルギニン濃度と吸光度との関係を図5(2)に示す。
上記試験例1において、反応温度を20〜65℃に変化させ、本発明に係るL−アルギニン酸化酵素の活性を測定した。結果を図6に示す。
上記試験例1において、緩衝液を変更することにより反応液のpHを4〜10に変化させ、本発明に係るL−アルギニン酸化酵素の活性を測定した。なお、pH4〜5.5ではクエン酸緩衝液を、pH5.5〜8.5ではリン酸緩衝液を、pH8.5〜9ではトリス塩酸緩衝液を、pH9〜10ではグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。結果を図7に示す。
Claims (13)
- 下記の(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有することを特徴とするL−アルギニン酸化酵素。
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列;
(2)配列番号2に記載のアミノ酸配列において1から数個のアミノ酸の欠失、置換および/または付加を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列;
(3)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、且つL−アルギニン酸化酵素活性を有するアミノ酸配列。 - 請求項1に記載のアミノ酸配列(1)〜(3)の何れかをコードすることを特徴とする核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
- L−アルギニンを測定するための方法であって:
(A)水と酸素の存在下、検体に請求項1に記載のL−アルギニン酸化酵素を作用させる工程;および
(B)上記L−アルギニン酸化酵素の作用による反応生成物の少なくとも一種の量を計測する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 工程(B)において測定する反応生成物が過酸化水素である請求項4に記載の方法。
- ペルオキシダーゼ反応により過酸化水素の量を計測する請求項5に記載の方法。
- 工程(B)において測定する反応生成物がアンモニアである請求項4に記載の方法。
- 工程(B)において測定する反応生成物がL−アルギニンの脱アミノ化生成物である請求項4に記載の方法。
- 請求項1に記載のL−アルギニン酸化酵素を含むことを特徴とするL−アルギニンの測定用キット。
- 反応用緩衝液、過酸化水素検出用試薬、アンモニア検出試薬、およびL−アルギニンの脱アミノ化生成物検出薬の少なくとも一つをさらに含む請求項9に記載のキット。
- L−アルギニン測定用の酵素センサであって、
検出用電極の表面または近傍に請求項1に記載のL−アルギニン酸化酵素が配置されており、且つ
検出用電極は過酸化水素検出用電極であることを特徴とする酵素センサ。 - 過酸化水素検出用電極は、酵素式過酸化水素電極または隔膜式過酸化水素電極である請求項11に記載の酵素センサ。
- Pseudomonas sp. BYC41−1株(受託番号:NITE P−1511)。
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