CN114480352A

CN114480352A - 一种碱性蛋白酶突变体及其用途

Info

Publication number: CN114480352A
Application number: CN202210097345.8A
Authority: CN
Inventors: 路福平; 李玉; 刘逸寒; 杨子璇; 宋广超; 王兴吉; 李庆刚; 刘文龙
Original assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Shandong Lonct Enzymes Co ltd; Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2022-01-26
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-01-26
Also published as: CN112662654A; CN114480352B

Abstract

本发明主要通过DNA改组技术，利用DNaseI消化地衣芽胞杆菌来源和克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因，纯化回收目的片段，通过无引物PCR和有引物PCR构建碱性蛋白酶突变库，筛选获得了一种碱性蛋白酶活力显著提高的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。适宜条件下，突变体碱性蛋白酶活力为61.75U/mL，相比野生型有显著提高。

Description

一种碱性蛋白酶突变体及其用途

技术领域

本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其用途。

背景技术

蛋白酶是一种具有复杂结构与功能的水解酶，能够裂解肽键产生短肽或氨基酸。按照最适pH值的不同，蛋白酶可分为三种类型：酸性蛋白酶，最适pH为2.0～5.0，主要来源于真菌；中性蛋白酶，最适pH为7.0，主要来源于植物；碱性蛋白酶，最适pH为8.0及以上，主要来源于微生物。蛋白酶作为最重要的工业酶制剂之一，销售额占所有酶制剂销售量的60％以上，在洗涤剂、医药、食品、皮革、丝绸、摄影等领域有着广泛的应用。

合成洗涤剂被用作清洁剂已有100多年的历史。目前，合成洗涤剂已经成为世界各地人们日常生活中不可或缺的一部分。然而，合成洗涤剂中的磷酸盐等成分对生态系统的负面影响逐渐得到了人们的重视。因此，作为洗涤剂中有害化学物质的环保型替代品，洗涤剂酶已迅速发展成为一个包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶在内的广阔领域。洗涤剂工业中通常使用的酶是碱性酶，因为洗涤剂的pH值通常在9.0到12.0之间。在洗涤剂使用的碱性酶中，碱性蛋白酶占据首位，占全球蛋白酶销量的40％。因此，开发一种高活力的碱性蛋白酶有助于降低洗涤剂蛋白酶成本并提高洗涤剂蛋白酶的生产效率。

定向进化，又称非理性设计，它不需要依赖于可靠的蛋白质结构和结构-功能关系等因素，而是在实验室中模拟自然进化机制，进而构建酶分子的体外进化条件，并定向筛选获得具有理想性能的突变体。DNA改组技术是定向进化技术的一种，该技术可以通过利用DNaseI将基因打断成一定的大小的片段,通过无引物PCR，使片段间发生错配，从而构建大型突变文库。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种碱性蛋白酶活力提高的碱性蛋白酶突变体。本发明主要通过DNA改组技术，利用DNaseI消化地衣芽胞杆菌来源和克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因，纯化回收目的片段，通过无引物PCR和有引物PCR构建碱性蛋白酶突变库，筛选获得了碱性蛋白酶活力显著提高的突变体。

本发明目的之一是，提供一种碱性蛋白酶突变体，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明目的之二是，提供编码所述碱性蛋白酶突变体的基因。

在本发明一种具体实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明目的之三是，提供包含所述碱性蛋白酶突变体的基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。

在本发明一种具体实施方式中，所述载体是pWB980。

本发明目的之四是，提供包含所述编码基因或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是适合于从本发明的基因或载体生产本发明的碱性蛋白酶突变体的任何宿主，例如枯草芽孢杆菌。

在本发明一种具体实施方式中，所述宿主细胞是枯草芽胞杆菌WB600。

本发明目的之五是，提供本发明所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸；并且，所述碱性蛋白酶突变体相比野生型具有提高的碱性蛋白酶活力。

本发明目的之六是，提供制备本发明所述碱性蛋白酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述碱性蛋白酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述碱性蛋白酶突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将碱性蛋白酶突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。

有益效果：

1、本发明利用DNA改组技术，在体外对克劳氏芽胞杆菌来源碱性蛋白酶和地衣芽胞杆菌来源碱性蛋白酶进行定向进化，获得酶活力提高的碱性蛋白酶突变体PROM，适宜条件下，突变体碱性蛋白酶活力为61.75U/mL，相比亲本的克劳氏芽孢杆菌CPR(15.63U/mL)和地衣芽孢杆菌LPR(46.87U/mL)均有显著提高。

2、本发明利用碱性蛋白酶突变体的基因在芽胞杆菌表达系统中进行了表达，得到碱性蛋白酶突变体重组菌株，利用重组菌株发酵培养，从发酵产物中分离或纯化可得到碱性蛋白酶突变体。

附图说明

图1：CPR、LPR与突变体PROM的酶活力对比。

图2：突变体PROM的最适温度。

图3：突变体PROM的最适pH。

图4：突变体PROM的温度稳定性。

图5：突变体PROM的pH稳定性。

图6：突变体PROM与地衣芽孢杆菌LPR的蛋白胶图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2、碱性蛋白酶突变体的标识

在本发明中，cpr表示克劳氏芽胞杆菌来源碱性蛋白酶的基因序列(如SEQ ID NO：1所示)，lpr表示地衣芽胞杆菌来源碱性蛋白酶的基因序列(如SEQ ID NO：3所示)，prom则表示碱性蛋白酶突变体的基因序列(如SEQ ID NO：5所示)；CPR表示克劳氏芽胞杆菌来源碱性蛋白酶(氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，LPR表示地衣芽胞杆菌来源碱性蛋白酶(如SEQID NO：4所示)，PROM表示碱性蛋白酶突变体(其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)。

本发明所用培养基及酶活测定方法如下：

LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；

枯草芽胞杆菌感受态制备培养基：

SP-A盐溶液：(NH4)₂SO₄ 4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 28g/L，KH₂PO₄ 12g/L，柠檬酸钠2g/L；

SP-B盐溶液：MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；

100×CAYE溶液：酪蛋白水解物20g/L，酵母粉100g/L；

SPI(200mL)：SP-A盐溶液98mL，SP-B盐溶液98mL，50％葡萄糖2mL，100×CAYE 2mL；

SPII培养基(600mL)：SPI 588mL，50mmol/L CaCl₂ 6mL，250mmol/L MgCl₂ 6mL；

100×EGTA溶液：10mmol/L EGTA溶液。

碱性蛋白酶活力的测定：

以Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(AAPF)为底物，以对硝基苯胺(pNA)为标准物。

样品的准备：取100μL用蒸馏水稀释后的酶液放入96孔板中，加入20μL6mmol/LAAPF溶液，混合均匀，40℃水浴中准确加热10min后，立即置于冰上终止反应，测定其中的pNA含量。每一样品设3次重复，结果取平均数。

对照品的准备：与样品的准备方法相同，区别在于96孔板中加入的是灭活后的酶液。

其中，酶液和AAPF溶液混合之前，两种溶液均在40℃水浴中预热2min以上。

酶活力定义：在40℃条件下每毫升酶液在每min内水解AAPF产生1μmol pNA的酶量(U/mL)。

本发明的技术方案概述如下：

1.使用DNaseI分别消化来自克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)的碱性蛋白酶基因和来自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的碱性蛋白酶基因，纯化回收100bp左右的目的片段；

2.构建含有碱性蛋白酶突变体基因的枯草芽胞杆菌重组菌株：

(1)通过无引物PCR，使纯化的片段互为引物扩增；

(2)通过有引物PCR，扩增碱性蛋白酶突变体基因；

(3)将所述碱性蛋白酶突变体编码基因进行酶切，连接到表达载体，得到携带碱性蛋白酶突变体编码基因的重组载体；

(2)将重组载体转入枯草芽胞杆菌宿主WB600中，经过抗性筛选得到重组菌株，将重组菌株经过96孔深孔板发酵并测定酶活力，获得碱性蛋白酶活力提高的碱性蛋白酶突变体；

3.重组菌株通过摇瓶发酵制备碱性蛋白酶突变体；

4.通过碱性蛋白酶活力测定，获得碱性蛋白酶活力提高的的突变体PROM。

5.测序验证，碱性蛋白酶突变体PROM的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的，其编码基因prom的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

实施例1：野生型碱性蛋白酶PRO重组菌株的构建

1.1合成并扩增野生型碱性蛋白酶基因cpr和lpr

根据GenBank：FJ940727.1获得克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因cpr的序列(如SEQ ID NO：1所示)，根据GenBank:AY590140.1获得地衣芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因lpr的序列(如SEQ ID NO：3所示)，委托生物公司合成上述基因序列，并通过PCR进行扩增，引物序列如下：

cpr引物P1：F 5’-CCCAAGCTT GCGCAATCAGTGCCATGG-3’；

cpr引物P2：R 5’-CGCGGATCCTTATTGATTAGCGTGTTGCCGC-3’；

lpr引物P1：F 5’-CCCAAGCTTATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGC-3’；

lpr引物P2：R 5’-CGCGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGACATTG-3’；

以P1和P2作为上、下游引物进行扩增；

其扩增的反应体系为：

上游引物P1	1.5μL
		下游引物P2	1.5μL
DNA模板	2.0μL
		PrimerStar酶	25μL
ddH<sub>2</sub>O	20μL

扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：95℃30s；退火：56℃15s；延伸：72℃2min；反应30个循环；延伸：72℃10min。

1.2表达载体的线性化

提取pWB980质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册。经HindIII和BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。

1.3将经HindIII和BamHI双酶切的目标片段(cpr、lpr)和载体片段连接形成重组质粒pWB980-cpr和pWB980-lpr，将重组质粒转化进枯草芽胞杆菌WB600中，经测序验证序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示。

1.4摇瓶发酵

将上述重组菌株接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜发酵LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，取上清液为粗酶液。

实施例2：利用DNA改组方法获得碱性蛋白酶突变体

2.1用DNaseI分别消化碱性蛋白酶基因cpr和lpr，进行琼脂糖凝胶电泳，再由DNA凝胶回收试剂盒回收100bp左右的片段；

DNaseI消化体系为：

DNA	3μL
		DNaseI(1U/μL)	1μL
ddH<sub>2</sub>O	21μL

反应条件：15℃消化20min，后90℃加热10min以终止反应。

2.2无引物PCR

使cpr和lpr纯化的片段互为引物扩增，将获得的PCR产物使用DNA纯化回收试剂盒进行回收。

其扩增的反应体系为：

lpr基因片段	10μL
		cpr基因片段	10μL
dNTPs	1μL
		TaqDNA聚合酶	25μL
ddH<sub>2</sub>O	4μL

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸1min反应55个循环；72℃延伸10min。

2.3碱性蛋白酶突变库的构建

以上述回收产物作为模板，通过PCR扩增构建碱性蛋白酶突变库。

设计引物如下：

引物P1：F 5’-CCCAAGCTTGCTCAACCGGCGAAAAATG-3’；

引物P2：R 5’-CGCGGATCCTTATTGATTAGCGTGTTGCCGC-3’；

其扩增的反应体系为：

扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min反应20个循环；72℃延伸10min。

2.4将获得的碱性蛋白酶突变体基因分别克隆入表达载体pWB980中，得到若干重组质粒pWB980-promx，将重组质粒pWB980-promx转化枯草芽胞杆菌WB600中，获得能表达碱性蛋白酶突变体的重组菌株。

实施例3：碱性蛋白酶突变体的筛选

3.1 96孔深孔板初筛

将实施例2获得的重组菌株接种于卡那霉素抗性平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于5mL LB培养基(卡那霉素抗性)，37℃、220r/min振荡培养12h，之后以2％的接种量接种于96孔深孔板，37℃、600r/min振荡培养48h，即可制备获得碱性蛋白酶酶液。

分别测定上述酶液的碱性蛋白酶活力，将所有突变体的酶活与野生型碱性蛋白酶酶活比较，最终筛选到1株碱性蛋白酶活力显著提高的菌株。

3.2摇瓶复筛

将上述重组菌株接种于5mL的LB液体培养基(含卡那霉素，50μg/mL)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50mL新鲜LB培养基中，继续以37℃，220r/min培养48h，取上清为粗酶液，测定所得的酶液的碱性蛋白酶活力，得到一株碱性蛋白酶活力显著提高的菌株。

实施例4：碱性蛋白酶突变体序列的确定

将上述菌株提取碱性蛋白酶基因序列，并进行测序(北京华大生物工程公司)，结果表明，扩增得到了碱性蛋白酶突变体基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，将该编码基因命名为prom。

实施例5：碱性蛋白酶突变体酶学性质考察

将实施例1和实施例3获得的碱性蛋白酶粗酶液使用70％饱和度的硫酸铵进行盐析。形成的沉淀使用MES缓冲液(20mmol/L,pH 7.0；缓冲液A)透析，保留液在缓冲液A预平衡的CM–Sephadex色谱柱(2.5×20cm)上进行离子交换层析，使用含有0～1mol/L NaCl的缓冲液A对蛋白质进行线性梯度洗脱。将含有蛋白酶活性的洗脱液加到用缓冲液A预平衡的Superdex G-75凝胶柱(1.6×80cm)上。然后用缓冲液A(0.5ml/min)洗脱纯化后的蛋白质。纯化后的酶液经冷冻干燥制得碱性蛋白酶酶粉，经纯净水溶解后用于酶学性质考察。

碱性蛋白酶的酶活力：在40℃和pH＝10的条件下测定碱性蛋白酶的酶活(如图1所示)，CPR、LPR和PROM的酶活力分别为15.63U/mL、46.87U/mL和61.75U/mL。

碱性蛋白酶突变体的最适温度：在pH＝10的条件下分别测定其在30-80℃之间的酶活(如图2所示)，PROM的最适温度为60℃。

碱性蛋白酶突变体的最适pH：在温度60℃的条件下分别测定其在pH＝7.0-12.0之间的酶活(如图3所示)，PROM的最适pH为10.0。

碱性蛋白酶突变体的热稳定性：在pH＝10的条件下测定其在20-60℃之间保温20h后的残余酶活(如图4所示)，分别在20℃、30℃、40℃、50℃和60℃条件下保温20h后，PROM残余酶活分别为96.69％、86.02％、80.42％、67.47％和53.27％。

碱性蛋白酶突变体的pH稳定性：在40℃温度条件下测定其在pH＝7.0-11.0之间保温20h后的残余酶活(如图5所示)，分别在pH 7.0、8.0、9.0、10.0和11.0条件下保温20h后，PROM残余酶活为74.39％、81.42％、85.43％、80.43％和63.92％。

虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。

序列表

<110> 天津科技大学、山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一种碱性蛋白酶突变体及其用途

<150> 202110116007X

<151> 2021-01-28

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> DNA

<213> 克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)

<400> 1

gcgcaatcag tgccatgggg aattagccgt gtgcaagccc cagctgccca taaccgtgga 60

ttgacaggtt ctggtgtaaa agttgctgtc ctcgatacag gtatttccac tcatccagac 120

ttaaatattc gtggtggcgc tagctttgta ccaggggaac catccactca agatgggaat 180

gggcatggca cgcatgtggc cgggacgatt gctgctttaa acaattcgat tggcgttctt 240

ggcgtagcgc cgagcgcgga actatacgct gttaaagtat taggggcgag cggttcaggt 300

tcggtcagct cgattgccca aggattggaa tgggcaggga acaatggcat gcacgttgct 360

aatttgagtt taggaagccc ttcgccaagt gccacacttg agcaagctgt taatagcgcg 420

acttctagag gcgttcttgt tgtagcggca tctgggaatt caggtgcagg ctcaatcagc 480

tatccggccc gttatgcgaa cgcaatggca gtcggagcta ctgaccaaaa caacaaccgc 540

gccagctttt cacagtatgg cgcagggctt gacattgtcg caccaggtgt aaacgtgcag 600

agcacatacc caggttcaac gtatgccagc ttaaacggta catcgatggc tactcctcat 660

gttgcaggtg cagcagccct tgttaaacaa aagaacccat cttggtccaa tgtacaaatc 720

cgcaatcatc taaagaatac ggcaacgagc ttaggaagca cgaacttgta tggaagcgga 780

cttgtcaatg cagaagcggc aacacgctaa 810

<210> 2

<211> 269

<212> PRT

<213> 克劳氏芽胞杆菌(Bacillus clausii)

<400> 2

Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala

1 5 10 15

His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp

20 25 30

Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr

50 55 60

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu

65 70 75 80

Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala

85 90 95

Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala

100 105 110

Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser

115 120 125

Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly

130 135 140

Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln

165 170 175

Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile

180 185 190

Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr

195 200 205

Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile

225 230 235 240

Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

260 265

<210> 3

<211> 1137

<212> DNA

<213> 地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 3

atgaggaaaa agagtttttg gcttgggatg ctgacggcct tcatgctcgt gttcacgatg 60

gcattcagcg attccgcttc tgctgctcaa ccggcgaaaa atgttgaaaa ggattatatt 120

gtcggattta agtcaggagt gaaaaccgca tctgtcaaaa aggacatcat caaagagagc 180

ggcggaaaag tggacaagca gtttagaatc atcaacgcgg caaaagcgaa gctagacaaa 240

gaagcgctta aggaagtcaa aaatgatccg gatgtcgctt atgtggaaga ggatcatgtg 300

gcccatgcct tggcgcaaac cgttccttac ggcattcctc tcattaaagc ggacaaagtg 360

caggctcaag gctttaaggg agcgaatgta aaagtagccg tcctggatac aggaatccaa 420

gcttctcatc cggacttgaa cgtagtcggc ggagcaagct ttgtggctgg cgaagcttat 480

aacaccgacg gcaacggaca cggcacacat gttgccggta cagtagctgc gcttgacaat 540

acaacgggtg tattaggcgt tgcgccaagc gtatccttgt acgcggttaa agtactgaat 600

tcaagcggaa gcggatcata cagcggcatt gtaagcggaa tcgagtgggc gacaacaaac 660

ggcatggatg ttatcaatat gagccttggg ggagcatcag gctcgacagc gatgaaacag 720

gcagtcgaca atgcatatgc aagaggggtt gtcgttgtag ctgcagcagg gaacagcgga 780

tcttcaggaa acacgaatac aattggctat cctgcgaaat acgattctgt catcgctgtt 840

ggcgcggtag actctaacag caacagagct tcattttcca gtgtgggagc agagcttgaa 900

gtcatggctc ctggcgcagg cgtatacagc acttacccaa cgaacactta tgcaacattg 960

aacggaacgt caatggcttc tcctcatgta gcgggagcag cagctttgat cttgtcaaaa 1020

catccgaacc tttcagcttc acaagtccgc aaccgtctct ccagcacggc gacttatttg 1080

ggaagctcct tctactatgg gaaaggtctg atcaatgtcg aagctgccgc tcaataa 1137

<210> 4

<211> 378

<212> PRT

<213> 地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 4

Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met Leu

1 5 10 15

Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala

20 25 30

Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys

35 40 45

Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys Val

50 55 60

Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp Lys

65 70 75 80

Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val Glu

85 90 95

Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile

100 105 110

Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys Gly Ala

115 120 125

Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro

130 135 140

Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr

145 150 155 160

Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala

165 170 175

Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Val Ser

180 185 190

Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser

195 200 205

Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val

210 215 220

Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln

225 230 235 240

Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala

245 250 255

Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala

260 265 270

Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn

275 280 285

Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro

290 295 300

Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu

305 310 315 320

Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu

325 330 335

Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg

340 345 350

Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys

355 360 365

Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln

370 375

<210> 5

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctcaaccgg cgaaaaatgt tgaaaaggat tatattgtcg gatttaagtc aggagtgaaa 60

accgcatctg tcaaaaagga catcatcaaa gagagcggcg gaaaagtgga caagcagttt 120

agaatcatca acgcggcaaa agcgaagcta gacaaagaag cgcttaagga agtcaaaaat 180

gatccggatg tcgcttatgt ggaagaggat catgtggccc atgccttggc gcaaaccgtt 240

ccttacggca ttcctctcat taaagcggac aaagtgcagg ctcaaggctt taagggagcg 300

aatgtaaaag tagccgtcct ggatacagga atccaagcct ctcatccgga cttgaacgta 360

gtcggcggag caagttttgt ggctggcgag gcttataaca ccgacggcaa cggacacggc 420

acacatgttg ccggtacagt agctgcgctt gacaatacaa cgggtgtatt aggcgttgcg 480

ccaagcgtat ccttgtacgc ggttaaagta ctgaactcaa gcggaagcgg atcatacagc 540

ggcattgtaa gcggaatcga gtgggcgaca acaaacggca tggatgttat caatatgagc 600

cttgggggag catcaggctc gacagcgatg aaacaggcag tagacaatgc atatgcaaga 660

ggggttgtcg ttgtagcagc agcagggaac agcggatctt caggaaacac gaatacaatt 720

ggctatcctg cgaaatacga ttctgtcatc gctgttggcg cggtagactc taacagcaac 780

agagcttcat tttccagtgt gggagcagag cttgaagtca tggctcctgg cgcaggcgta 840

tacagcactt acccaacgaa cacttatgca acattgaacg gaacgtcaat ggcttctcct 900

catgtagcgg gagcagcagc tttgatcttg tcaaaacatc cgaacctttc agcttcacaa 960

gtccgcaacc gtctctccag cacggcgact tatttgggaa gctccttcta ctatgggaaa 1020

ggtctgatca atgtcgaagc tgccgctcaa atggcagtcg gagctactga ccaaaacaac 1080

aaccgcgcca gcttttcaca gtatggcgca gggcttgaca ttgtcgcacc aggtgtaaac 1140

gtgcagagca catacccagg ttcaacgtat gccagcttaa acggtacatc gatggctact 1200

cctcatgttg caggtgcagc agcccttgtt aaacaaaaga acccatcttg gtccaatgta 1260

caaatccgca atcatctaaa gaatacggca acgagcttag gaagcacgaa cttgtatgga 1320

agcggacttg tcaatgcaga agcggcaaca cgctaa 1356

<210> 6

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Gln Pro Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys

1 5 10 15

Ser Gly Val Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser

20 25 30

Gly Gly Lys Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala

35 40 45

Lys Leu Asp Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val

50 55 60

Ala Tyr Val Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val

65 70 75 80

Pro Tyr Gly Ile Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Val Gln Ala Gln Gly

85 90 95

Phe Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln

100 105 110

Ala Ser His Pro Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala

115 120 125

Gly Glu Ala Tyr Asn Thr Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Val Ala

130 135 140

Gly Thr Val Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Leu Gly Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser

165 170 175

Gly Ser Tyr Ser Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn

180 185 190

Gly Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr

195 200 205

Ala Met Lys Gln Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val

210 215 220

Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile

225 230 235 240

Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp

245 250 255

Ser Asn Ser Asn Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu

260 265 270

Val Met Ala Pro Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr

275 280 285

Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly

290 295 300

Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln

305 310 315 320

Val Arg Asn Arg Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe

325 330 335

Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Glu Ala Ala Ala Gln Met Ala

340 345 350

Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr

355 360 365

Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr

370 375 380

Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr

385 390 395 400

Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser

405 410 415

Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser

420 425 430

Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala

435 440 445

Ala Thr Arg

450

Claims

1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO：6所示。

2.编码权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的基因。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体。

5.如权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述载体是pWB980。

6.如权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌WB600。

7.权利要求1所述碱性蛋白酶突变体的用途，其用于水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸。

8.如权利要求7所述用途，其特征在于，所述突变体相比野生型具有提高的碱性蛋白酶活力。