发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产乙酰氨基葡萄糖枯草芽孢杆菌工程菌,是将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1克隆到枯草芽孢杆菌,同时敲除该枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因nagA、乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB及乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP构建而成的枯草芽孢杆菌工程菌。
所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因如NCBI-Gene ID:850529所示;乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因如NCBI-Gene ID:936621所示;乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因nagB如NCBI-Gene ID:936619所示;乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因nagP如NCBI-Gene ID:938807所示。
所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因通过表达载体pP43NMK进行表达;所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis168。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述枯草芽孢杆菌工程菌的方法,具体方法如下:
敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因(nagP),阻断宿主菌从胞外转运乙酰氨基葡萄糖至胞内的途径。在此基础上,进一步敲除在已敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因(nagB),阻断乙酰氨基葡萄糖降解途径。在已敲除nagP、nagA及nagB的宿主菌内,运用表达载体pP43NMK过量表达酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1),通过代谢工程改造,实现乙酰氨基葡萄糖产量的提高。
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵:
种子培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10。
发酵培养基(g/L):葡萄糖20,胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl10。
培养条件:将37℃C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基,于37℃C、200rpm条件下培养30h。
乙酰氨基葡萄糖的测定方法:
高效液相色谱(HPLC)检测法:Agilent1200,RID检测器,NH2柱(250×4.6mm,5μm),流动相:70%乙腈,流速0.75mL/min,柱温30℃C,进样体积为10μL。
本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外积累,其浓度可达到1.23gL,为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单,便于使用,具有很好地应用前景。
具体实施方式
实施例1敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因(nagP)
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168,购自美国典型微生物保藏中心,ATCC No.27370)乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因(nagP)上下游序列,设计敲除框同源臂扩增引物,左臂上下游引物分别为:nagP-L-F:5’-AATGAGATGCCTGTGTCGGAATA-3’和nagP-L-R:
5’-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATCCACTCTCCAAACGAGTTGATAC-3’;右臂上下游引物分别为:nagP-R-F:
5’-ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCCGCGGTCTTAACCGGGTTA-3’和nagP-R-R:
5’-TACGACAACGCCCAGCTTC-3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)基因组中扩增nagP敲除框左、右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列(南京农业大学,闫新博士惠赠,NCBI accessionno.EU541492),设计引物,扩增博来霉素抗性基因(zeo),上下游引物分别为:nagP-Z-F:
5’-GTATCAACTCGTTTGGAGAGTGGATAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’和nagP-Z-R:
5’-TAAAGATAACCCGGTTAAGACCGCGGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3’。通过融合PCR方法,将敲除框左、右臂及抗性基因融合为nagP敲除框。通过测序确认nagP敲除框构建成功。
将构建好的敲除框转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168),通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证,确认乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因(nagP)敲除成功,得到重组枯草芽孢杆菌的构建BSGN1。
实施例2敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因(nagB)
将质粒pTSC(南京农业大学,闫新博士惠赠,NCBI accession no.EU864234)转化已敲除nagP重组枯草芽孢杆菌,消除博来霉素抗性。由于乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因(nagB)在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)基因组同一操纵子内,因此采用一次同源重组即可同时敲除nagA及nagB两个基因。
根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因(nagB)上下游序列,设计敲除框同源臂扩增引物,左臂上下游引物分别为:nagAB-L-F:
5’-CTGTATCAATGATTTTCATGGTCTCTT-3’,nagAB-L-R:
5’-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCTCATTTTCTGTCACGATCGCAA-3’;右臂上下游引物分别为:nagAB-R-F:
5’-ACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCAAGGAACATGCTGACTTATGAATATCA-3’,
nagAB-R-F:5’-CAAAAAGGTGGAAACCGATTATT-3’。运用上述引物从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis168)基因组中扩增nagA、nagB敲除框中包含的左臂和右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒序列(NCBI accession no.EU541492),设计引物,扩增博来霉素抗性基因(zeo),上下游引物分别为:nagAB-Z-F:
5’-ACATTGCGATCGTGACAGAAAATGAGAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’,nagAB-Z-R:5’-ATATTCATAAGTCAGCATGTTCCTTGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3’。通过融合PCR方法,将敲除框左、右臂及抗性基因融合为nagA、nagB敲除框。通过测序确认nagA、nagB敲除框构建成功。
将构建好的nagA、nagB敲除框转化枯草芽孢杆菌(BSGN1),通过博来霉素抗性平板筛选,菌落PCR验证,确认乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因(nagB)敲除,得到重组枯草芽孢杆菌的构建BSGN3。
实施例3构建产乙酰氨基葡萄糖重组枯草芽孢杆菌
根据NCBI上公布的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C,购自美国典型微生物保藏中心,ATCC204508)中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1),设计引物GNA1-F:
5’-GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCTTACCCGATGGATTTTATA-3’,GNA1-R:5’-CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3’。使用上述引物从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)基因组中扩增氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1)。扩增片段经KpnI和HIndIII双酶切后连接至pP43NMK表达载体(美国弗吉尼亚理工大学,张晓舟博士惠赠)。酶切验证并测序,确认重组质粒pP43-GNA1构建成功。
将构建好的表达载体pP43-GNA1转化枯草芽孢杆菌BSGN3。采用GNA1-F及GNA1-R引物挑选转化子进行菌落PCR,出现480bp条带,验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
实施例4发酵生产乙酰氨基葡萄糖
将37℃C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基,于37℃C、200rpm条件下培养30h。发酵30h,发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到1.23gL。通过在已敲除乙酰氨基葡萄糖转运蛋白编码基因(nagP)宿主菌中进一步敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因(nagA)和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因(nagB),并且在已敲除nagP、nagA及nagB宿主中过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1),实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量的提高。