CN103923870B - 一种生产纳他霉素的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产纳他霉素的基因工程菌及其构建方法与应用，该基因工程菌分类命名为褐黄孢链霉菌(Streptomyces？gilvosporeus)，于2014年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.8901。该发明利用胆固醇氧化酶基因pimE构建重组质粒，并通过大肠杆菌-褐黄孢链霉菌的接合转移方式将pimE基因整合至褐黄孢链霉菌的基因组中，筛选获得阳性接合子，该基因工程菌可增大PimE蛋白在发酵液中的密度，PimE蛋白作为信号蛋白提高纳他霉素基因簇的转录水平，大幅度地提高纳他霉素的发酵产量，从而降低生产成本，带来巨大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产纳他霉素的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
纳他霉素(Natamycin)，又称为匹马霉素，是一种26环四烯大环内酯类抗真菌剂，具有天然、广谱、高效、低毒的特点。这种抗生素不仅可以有效抑制酵母和霉菌的生长，而且可以有效防止丝状真菌黄曲霉毒素的产生。在医药领域，可以广泛应用于治疗由真菌引起的疾病。在食品领域，由于纳他霉素的广谱性及对于哺乳动物的低毒性，1982年被美国FDA批准可以作为一种食品防腐剂使用，并归类为GRAS(generallyregardassafe)产品之列，1997年我国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂。目前纳他霉素已经在50多个国家被广泛应用于乳制品、肉制品、发酵酒、饮料等食品的生产和保藏。
随着纳他霉素在医药及食品行业的不断开发，其需求量不断增加。但由于目前其发酵水平偏低，导致生产成本很高，严重制约其在各领域的应用。纳他霉素生产菌株的基因组上，负责纳他霉素生物合成基因簇含16个ORF(openreadingframe)。MartaV.Mendes等人实验证明其中的pimE基因编码的PimE蛋白可作为纳他霉素合成的信号蛋白。该基因的敲除，不仅阻断了PimE蛋白的合成，同时也无纳他霉素的产生；而在敲除该基因的突变体中加入不同来源的PimE蛋白均可不同程度的激发纳他霉素的产生。
PimE蛋白即胆固醇氧化酶(cholesteroloxidase,简称COD)，是胆固醇降解代谢过程中的第一个酶，能专一性地催化底物胆固醇生成胆甾-4-烯-3-酮。微生物是胆固醇氧化酶最为主要的来源。国内外学者对微生物来源的胆固醇氧化酶的特性、结构、应用和基因克隆等方面进行了广泛研究，取得了较大进展。胆固醇氧化酶最早用于动物血清中胆固醇含量的检测，近年来发现它在生化制药、食品加工、抗虫基因工程等方面也具有良好的应用价值，而其在提高多烯大环内酯类抗真菌剂生物产量方面的应用还未见文献报道。
中国专利CN103555755A公开了一种利用vgb基因构建的抗贫氧高密度发酵纳他霉素基因工程菌株及其应用,该发明提供了一种利用vgb基因构建的抗贫氧高密度发酵纳他霉素的基因工程菌株，其利用透明颤菌血红蛋白基因vgb构建重组质粒，通过接合转移的方式将vgb基因整合入褐黄孢链霉菌基因组中，获得可直接用于纳他霉素发酵生产的重组基因工程菌株，重组菌中VHb的表达可有效解决纳他霉素发酵生产中的氧供求矛盾，大幅度提高纳他霉素的产量，降低生产成本，带来巨大的经济效益,该专利是从解决纳他霉素发酵生产中的氧供求矛盾出发，构建工程菌提高纳他霉素产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产纳他霉素的基因工程菌及其构建方法与应用。
一种生产纳他霉素的基因工程菌，菌株名为swjs-801，分类命名为褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)，保藏号为CGMCCNo.8901，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014年03月07日。
本发明的基因工程菌，含有两个拷贝pimE基因。
本发明所提供的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：扩增pimE基因及红霉素抗性基因启动子(Pemr*)；融合片段Pemr*-pimE，将Pemr*-pimE基因片段插入载体，构建重组质粒；利用接合转移的方式转化褐黄孢链霉菌，抗生素筛选获得含有两个拷贝pimE基因的重组工程菌，通过摇瓶发酵实验筛选纳他霉素产量最高的重组菌进行保藏。
所述启动子为红霉素抗性基因(Emr)强启动子。
所述的重组质粒为pSET152-pimE，重组质粒还包括构建重组质粒pSET152-pimE过程中的pMG36e和pSET152载体，其中pMG36e含有Emr基因启动子序列，pSET152含有质粒转移所需元件及噬菌体的整合酶和整合位点，重组质粒pSET152-pimE是融合片段Pemr*-pimE经单酶切后连接入pSET152质粒中构建而成。
所述接合转移的步骤具体为将重组质粒导入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，将重组大肠杆菌与褐黄孢链霉菌共培养于MS(优选含10mMMgCl2)固体培养基上，30℃培养16-20h，然后涂布1mL无菌水(优选含0.5mg萘啶酮酸和1mg安普霉素)覆盖平板，30℃恒温培养至长出转化子。
所述的摇瓶发酵实验条件为29℃，转速为200～250rpm，发酵96～120h。
上述的重组质粒及工程菌在制备纳他霉素中的应用。
种子培养基各成分的重量百分比为：葡萄糖1％，大豆蛋白胨0.5％，酵母粉0.3％，麦芽浸粉0.3％，pH7.0～7.5，在115℃条件下蒸汽灭菌30min。
发酵培养基各成分的重量百分比为：蛋白胨2％，酵母粉0.45％，NaCl0.2％，MgSO4·7H2O0.1％，pH7.5，121℃温度下蒸汽灭菌20min；葡萄糖6％，在115℃条件下单独蒸汽灭菌30min后加入。
发酵结束后，取1mL发酵液离心取上清，检测PimE的活性；另取1mL发酵液，加入9mL的甲醇，超声萃取20min，离心，上清液经0.22μm的滤膜过滤后，经HPLC测定纳他霉素的产量。
本发明的有益效果：
本发明提供了利用pimE基因构建的高产纳他霉素的基因工程菌株，构建方法为将pimE基因整合入纳他霉素产生菌中，通过pimE的表达，增大PimE蛋白在发酵液中的密度，PimE蛋白作为信号蛋白提高纳他霉素基因簇的转录水平，从而提高纳他霉素的产量，所构建基因工程菌株应用于纳他霉素生产中，可提高产量约为40％，大大降低了纳他霉素的生产成本，带来巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
本发明的基因工程菌，分类命名为褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)，已于2014年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.8901；
图1为重组菌PCR验证；
泳道M：1kbDNAmarker；泳道1：以质粒pSET152-pimE为模板扩增抗性基因(aac)的PCR结果；泳道2：以原始菌基因组为模板扩增抗性基因(aac)的PCR结果；泳道3～10：以重组菌基因组为模板扩增抗性基因(aac)的PCR结果。
具体实施方式
实施例1
重组质粒pSET152-pimE的构建：
(1)根据GenBank收录的Emr基因启动子Pemr*序列及下游所融合基因片段，分别设计上下游引物：
上游引物Pemr-F：
5’-GCGAGGATGAAGAGGATGAGGAGGC-3’(下划实线标示为XbaI酶切位点)；
下游引物Pemr-R：
5’-CTGGTTCTCGAACAT-3’(下划虚线标示为下游片段部分序列)。
以质粒pMG36e为模板，PCR扩增获得Emr基因启动子Pemr*序列：
(2)根据GenBank收录的pimE基因序列及上游所融合基因片段，分别设计上下游引物：
上游引物pimE-F：
5’-CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGTTCGAGAACCAG-3’(下划虚线标示为上游片段部分序列)；
下游引物pimE-R：
5’-GCCTAGGCGGCCTTGACGT-3’(下划实线标示为XbaI酶切位点)。
以原始菌基因组为模板，PCR扩增获得pimE基因：
(3)按照常规PCR方法进行Pemr*及pimE基因的各自独立扩增，确定目的条带，切胶回收，在同一PCR反应体系中，加入摩尔数比为1:1的Pemr*和pimE基因，不添加引物，使用DNA聚合酶进行两个片段的互补延伸，8～10个循环，以形成全长的融合PCR产物；再以融合PCR产物为模板，以一对外侧引物Pemr-F、pimE-R进行融合片段的全长扩增，即得到融合片段Pemr*-pimE。
(4)将融合片段Pemr*-pimE与载体pSET152分别用XbaI单酶切，切胶回收后，以3:1～10:1的摩尔比混合，加入T4连接酶，16℃连接过夜，将连接产物转化于TSB法制备的大肠杆菌感受态细胞E.coliET12567，涂布含25μg/mL的卡那霉素、25μg/mL的氯霉素和50μg/mL的安普霉素抗性的LB固体平板，挑取转化子，提取质粒进行酶切验证，获得重组质粒pSET152-pimE。
重组褐黄孢链霉菌的构建：
采用大肠杆菌-褐黄孢链霉菌属间接合转移的方式，具体构建方法如下：
(1)挑取含重组质粒pSET152-pimE的大肠杆菌E.coliET12567单菌落于LB培养基中(含25μg/mL的卡那霉素，25μg/mL的氯霉素和50μg/mL的安普霉素)，37℃振荡培养过夜；
(2)按2％接种量，将活化过夜的重组E.coliET12567转接于新鲜的LB培养基中(含卡那霉素25μg/mL、氯霉素25μg/mL和安普霉素50μg/mL，37℃培养至OD600＝0.4～0.6，离心，用等体积的LB培养基洗涤菌体两次，重悬于0.1倍体积的LB培养基中；
(3)处理重组E.coliET12567的同时，刮取约108个褐黄孢链霉菌的孢子于500μL2×YT培养基中，50℃热激10分钟后冷却，或将于MS固体培养基上培养3-4d的菌丝体，用2-3mL的20％的甘油收集，备用；
(4)取500μL重组E.coliET12567与等体积热激处理的褐黄孢链霉菌孢子悬液或等体积的褐黄孢链霉菌菌丝体混匀，轻悬，去除约4/5上清后，将混合的细胞重悬于剩余的液体中；
(5)将混合细胞涂布于含10mMMgCl2的MS固体培养基上，30℃培养16～20h；
(6)涂布1mL无菌水(含0.5mg萘啶酮酸和1mg安普霉素)覆盖平板，30℃继续培养至长出转化子；
(7)挑取转化子于MS培养基上(含25μg/mL的萘啶酮酸和30μg/mL的安普霉素)进行反复筛选；
液体培养基中活化得到各转化子，提取各转化子的基因组DNA，用引物
Ass(5'-TCCCCGCGGGGTTCATGTGCAGCTCCATCA-3')和
Aca(5'-GGTAACTATTGCCGTCTCAGCCAATCGACTGGCGAGCGGCA-3')扩增安普霉素抗性基因(aac)，做进一步验证如图1，证实了重组质粒pSET152-pimE的成功整合。
本发明的基因工程菌，分类命名为褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)，已于2014年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.8901。
Streptomycesgilvosporeusswjs-801在纳他霉素发酵中的应用：
用无菌水洗涤褐黄孢链霉菌Streptomycesgilvosporeus和重组菌Streptomycesgilvosporeusswjs-801的斜面孢子，制成孢子悬液(约108个/mL)；按2％接种量接种到5mL的种子培养基中，29℃振荡培养48h；再按2％接种量转接至装液量为30mL种子培养基的250mL的三角瓶中，培养16-20h；然后以5％的接种量转接至装有30mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，29℃，转速220rpm，发酵120h。
发酵结束后分别测定PimE的活性及纳他霉素的产量。
PimE活性测定步骤如下：
(1)分别取Streptomycesgilvosporeus与Streptomycesgilvosporeusswjs-801发酵液1mL离心，去除沉淀取上清进行酶活力分析；
(2)按照比色法测定胆固醇氧化酶酶活，方法：3mL溶液A(4-氨基-安替比林，1mmol/L；苯酚，6mmol/L；过氧化物酶，5000U/L；磷酸钾缓冲液，25mmol/LpH7.5)，150μL溶液B(胆固醇，8.26g/L；TritonX-100,4.26％；异丙醇为溶剂)，50μL酶液，混匀，37℃，反应5min，沸水浴3min，于500nm测吸光度，通过比色法即可测定过氧化氢的量，从而计算出胆固醇氧化酶的酶活力单位。计算公式为：
酶活力(U/mL)＝(0.1738*OD500+0.0009)*(V1/V2)*n/T
其中：OD500为500nm处光吸收值，V1为反应液总体积，V2为酶液体积，n为稀释倍数，T为反应时间。C＝0.1738*OD500+0.0009为过氧化氢标准曲线。
(3)酶活力数据如表1所示。如结果所示，重组菌株较出发菌株酶活力明显提高，证明了整合入褐黄孢链霉菌染色体的pimE的表达。
纳他霉素产量测定方法：
取1mL发酵液，加入9mL甲醇，超声萃取20min后，离心(1000rpm,10min),上清液经0.22μm的滤膜过滤后进行HPLC分析，于紫外303nm检测出发菌株Streptomycesgilvosporeus与重组菌株Streptomycesgilvosporeusswjs-801的纳他霉素产量，结果如表1所示。
如结果所示，由于pimE的高表达，重组菌株较出发菌株产量提高约40％。
表1纳他霉素产量与PimE酶活力比较
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (9)
1.一种生产纳他霉素的基因工程菌，其特征在于，分类命名为褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)，已于2014年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.8901。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有两个拷贝pimE基因。
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：扩增pimE基因及Emr基因启动子；融合片段Pemr*-pimE，将Pemr*-pimE基因片段插入载体，构建重组质粒；利用接合转移的方式转化褐黄孢链霉菌，安普霉素筛选获得含有两个拷贝pimE基因的重组工程菌，通过摇瓶发酵实验筛选获得高产纳他霉素的重组菌。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述启动子为红霉素抗性基因强启动子。
5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的重组质粒为pSET152-pimE。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述重组质粒还包括pMG36e载体和pSET152载体，其中pMG36e载体含有Emr基因启动子序列，pSET152载体含有质粒转移所需元件及噬菌体φ31的整合酶和整合位点。
7.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述接合转移的步骤具体为：将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，将重组大肠杆菌与褐黄孢链霉菌共培养于MS固体培养基上，30℃培养16-20h，然后涂布1mL无菌水覆盖平板，30℃恒温培养至长出转化子，所述MS固体培养基中含10mMMgCl2，所述无菌水中含0.5mg萘啶酮酸和1mg安普霉素。
8.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的摇瓶发酵实验条件为29℃，转速为200～250rpm，发酵96～120h。
9.权利要求1或2所述工程菌在制备纳他霉素中的应用。
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