CN110551670A

CN110551670A - 一种生产l-亮氨酸的基因工程菌及其应用

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Publication number: CN110551670A
Application number: CN201910886078.0A
Authority: CN
Inventors: 张成林; 徐庆阳; 李燕军; 张宇; 李英滋; 朱福周; 卢楠; 韩世宝; 董解荣; 王子申; 徐昊; 李子翼
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110551670B

Abstract

本发明涉及一种生产L‑亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。所述基因工程菌是通过在宿主细胞中过表达解除L‑亮氨酸反馈抑制异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M、解除L‑异亮氨酸反馈抑制乙酰乳酸合酶编码基因ilvBN^M、3‑异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB、3‑异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD，leuA^M编码的乙酰羟酸合成酶在解除了L‑亮氨酸对其的反馈抑制作用，且其活性较野生型leuA编码的异丙基苹果酸合成酶未见明显降低；本发明所述的L‑亮氨酸基因工程菌无营养缺陷、生长快、发酵周期短、产量高、转化率高，经过40‑44h发酵后，发酵液中的L‑亮氨酸浓度达到60.5‑69.6g/L。

Description

一种生产L-亮氨酸的基因工程菌及其应用

技术领域：

本发明涉及一种生产L-亮氨酸的基因工程菌及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术：

L-亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。L-亮氨酸是合成蛋白质和激素原料，在人体生命活动中扮演着至关重要角色。因此，L-亮氨酸在食品和医药等行业具有非常广泛的市场及应用前景。

工业上L-亮氨酸的合成方法包括毛发提取法和发酵法。然而提取法具有原料来源受限制、生产成本高、污染环境等不足，由此发酵法是生产L-亮氨酸的主流方法。目前，L-亮氨酸的工业生产菌种主要由诱变获得，具有营养缺陷、生长慢、遗传性状不稳定等不足，从而引起发酵周期长、发酵性能不稳定、产量和转化率低等问题。

发明内容：

为了克服目前野生型异丙基苹果酸合成酶受L-亮氨酸反馈抑制以及现有L-亮氨酸生产菌株生长慢、营养缺陷、发酵不稳定等不足，本发明提供一种解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶突变体及其编码基因，并利用该基因构建生产L-亮氨酸的基因工程菌。

本发明解决述问题的技术方案之一是：提供一个解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述异丙基苹果酸合成酶突变体的编码基因为leuA^M，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

所述异丙基苹果酸合成酶突变体来自一株谷氨酸棒杆菌突变株，所述突变株筛选过程如下：以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/L亮氨酸氧肟酸盐的基本培养基上筛选出菌株LEU262；以LEU262为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/Lβ-羟基亮氨酸的基本培养基上筛选出菌株LEU741。

提取LEU741基因组，通过设计引物进行PCR扩增2-异丙基苹果酸合成酶编码基因，将PCR产物回收后进行测序，发现该基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶相对于来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的野生型2-异丙基苹果酸合成酶发生如下氨基酸突变：F7L，I14F，I51S，G127D，I197V，F370L，K380M，R529H，G561D，V596A。

在本发明中采用如下定义：

1、异丙基苹果酸合成酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示2-异丙基苹果酸合成酶突变体中突变的氨基酸。如F7L，表示位置7的氨基酸由野生型2-异丙基苹果酸合成酶的Phe替换成Leu，F7表示第7位的氨基酸为Phe，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中野生型2-异丙基苹果酸合成酶的氨基酸序列编号。

本发明中，leuA代表野生型2-异丙基苹果酸合成酶编码基因(SEQ ID NO.4所示)，LEUA代表野生型2-异丙基苹果酸合成酶(SEQ ID NO.3所示)；leuA^M为2-异丙基苹果酸合成酶突变体基因(SEQ ID NO.2所示)；LEUA^M为2-异丙基苹果酸合成酶突变体(SEQ ID NO.1所示)。突变前后的氨基酸对照如下表：

所述2-异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M，具有如下酶学特性：在L-亮氨酸浓度为0-15mmol/L条件下，LEUA^M酶活性无明显变化，即该突变体解除了L-亮氨酸对其反馈抑制作用；且在L-亮氨酸浓度为0-15mmol/L条件下LEUA^M的酶活性与野生型2-异丙基苹果酸合成酶LEUA在L-亮氨酸浓度为0mmol/L条件下相比无明显降低。

本发明解决述问题的技术方案之二是：提供一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌是通过在宿主细胞中过表达本发明所述解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M、解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M、3-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB、3-异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD获得的。

所述宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等；

所述ilvBN^M基因编码的乙酰羟酸合成酶解除了L-异亮氨酸的反馈抑制，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

所述leuB基因可以来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌等，如Genbank编号为b0073、JW5807、NCgl1237、BSU28270、BAMF_2634的leuB基因。

所述leuCD基因可以来自大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌等，如Genbank编号为b0071、b0072、JW0070、JW0071、NCgl1262、NCgl1263、BSU28250、BSU28260、BAMF_2632、BAMF_2633的leuCD基因。

优选地，所述生产L-亮氨酸的基因工程菌为TE03，是以大肠杆菌杆菌(Escherichia coli)W3110为宿主细胞，过表达SEQ ID NO.2所示的leuA^M基因，SEQ IDNO.5所示的ilvBN^M基因，SEQ ID NO.6所示的leuBCD(大肠杆菌里leuB和leuCD组成一个操纵子leuBCD)获得；

进一步地，上述基因工程菌的构建方法如下：

(1)分别扩增异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M、乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M基因，并分别构建基因组整合片段；

(2)扩增leuBCD基因，并与质粒连接，获得重组质粒；

(3)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将上述基因组整合片段和重组质粒依次在宿主细胞内表达；

进一步地，所述构建方法具体如下：

(1)以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别PCR扩增获得异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M、以及UHF和DHF片段(分别为lacI基因上、下游同源臂)，并通过重叠PCR获得重组片段UHF-leuA^M-DHF；

所述UHF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述DHF的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

(2)利用相同的原理获得lacZ基因上、下游同源臂UHFA和DHFB片段以及ilvBN^M基因片段，通过重叠PCR将UHFA、DHFB和ilvBN^M构建重组片段UHF-ilvBN^M-DHF；

所述UHFA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述DHFB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

(3)以大肠杆菌W3110基因组为模板，PCR扩增获得leuBCD基因，并与质粒pTrc99a连接，获得重组质粒pTR-leuBCD；

(4)L-亮氨酸基因工程菌TE03的构建

分别将PG-1和PG-2及PG-3和PG-4在52℃条件下退火，然后连接至质粒pGRB，获得pGRB1和pGRB2；以大肠杆菌W3110为出发菌株，分别将pGRB1和UHF-leuA^M-DHF转化至大肠杆菌W3110，获得重组菌株TE01；以菌株TE01为出发菌株，分别将pGRB2和UHFA-ilvBN^M-DHFB转化至TE01，获得菌株TE02；将pTR-leuBCD转化至TE02获得TE03。

本发明还提供利用上述基因工程菌发酵合成L-亮氨酸的方法，具体如下：

以5％-10％接种量将种子培养物接至发酵培养基中进行发酵培养，溶氧维持在20-40％，pH维持在6.5-7.5，培养温度30-35℃，发酵周期40-48h，发酵过程中维持残糖浓度为0-0.4％(W/V)；

发酵结束时，发酵液中的L-亮氨酸浓度达到60.5-69.6g/L。

所述发酵培养基成分为：葡萄糖25g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉4g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄ 1.5g/L，FeSO₄15mg/L，MnSO₄15mg/L，VB1 0.01mg/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。

有益效果：

1、本发明所述leuA^M基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶具有如下特点：该酶解除了L-亮氨酸对其的反馈抑制作用(图1)，在L-亮氨酸浓度为0-15mmol/L条件下，LEUA^M酶活性无明显变化，且其活性较野生型leuA编码的2-异丙基苹果酸合成酶未见明显降低(图2)

2、本发明所述的L-亮氨酸基因工程菌TE03无营养缺陷、生长快、发酵周期短、产量高、转化率高，经过40-48h发酵后，发酵液中的L-亮氨酸浓度达到60.5-69.6g/L(图3)。

附图说明：

图1 L-亮氨酸对leuA和leuA^M基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶活性的影响；

图2 leuA^M与leuA编码的2-异丙基苹果酸合成酶活性对比；

图3 L-异亮氨酸对ilvBN和ilvBN^M基因编码的乙酰羟酸合酶活性的影响；

图4 ilvBN^M与ilvBN编码的乙酰羟酸合酶活性对比；

图5 L-亮氨酸基因工程菌TE03发酵过程曲线；

图6过表达leuA^M对L-亮氨酸合成的影响。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所构建的生产L-亮氨酸的基因工程菌，是通过在宿主细胞中过表达本发明获得的解除L-亮氨酸反馈抑制异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M、解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M、3-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB、3-异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD获得；

在一些实施例方式中，宿主细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等；

在一些实施方式中，ilvBN^M基因来源于抗L-异亮氨酸结构类似物α-氨基丁酸和硫代异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌；

在一些实施方式中，leuB基因是Genbank编号为b0073、JW5807、NCgl1237、BSU28270或BAMF_2634的leuB基因。

在一些实施方式中，leuCD基因是Genbank编号为b0071、b0072、JW0070、JW0071、NCgl1262、NCgl1263、BSU28250、BSU28260、BAMF_2632或BAMF_2633的leuCD基因。

上述来源的宿主细胞、ilvBN^M基因、leuB基因及leuCD基因均可实现本发明所述的效果，以下实施例，以大肠杆菌杆菌(Escherichia coli)W3110为宿主细胞，过表达SEQ IDNO.2所示的leuA^M基因、SEQ ID NO.5所示的ilvBN^M基因，SEQ ID NO.6所示的leuBCD(大肠杆菌里leuB和leuCD组成一个操纵子leuBCD)为例，构建生产L-亮氨酸的基因工程菌为TE03，对本发明做示例性说明。

以下实施例所用引物序列列表：

实施例1：解除L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M的获得

(1)抗L-亮氨酸结构类似物突变株的筛选

①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032菌悬液的制备

将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032接种至LB液体培养基，于32℃，200rpm，培养12h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤3次后重悬，使得OD₆₀₀＝0.6-0.8，取10μL菌悬液涂在载片上。

②常压室温等离子诱变

诱变参数为：载片置于气流端口2mm处，功率120W，气流量10SLM，作用时间20s。

③抗L-亮氨酸结构类似物α-氨基丁酸突变株的筛选

将步骤②诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L亮氨酸氧肟酸盐的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。

④菌株产L-亮氨酸能力测定

将步骤③筛选的菌株利用种子培养基进行96孔板培养，然后以5％的接种量接种至含发酵培养基的96孔板进行发酵实验，菌株LEU262的L-亮氨酸产量最高。

⑤抗L-亮氨酸结构类似物硫代异亮氨酸突变株的筛选及产L-亮氨酸能力测定

以LEU262为诱变对象，重复步骤①和②，将诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L β-羟基亮氨酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。重复步骤④，LEU741的L-亮氨酸产量最高。

⑥培养基

种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄ 4g/L，KH₂PO₄ 2.5g/L，MnSO₄0.5g/L，玉米浆30mL/L，pH 6.5-7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基：葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄ 4g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，MnSO₄0.02 g/L，V_B1 0.002g/L，玉米浆30mL/L。pH 6.5-7.0，115℃高压蒸汽灭菌15min。

⑦检测方法

将发酵液于8000g离心5min后取上清液，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对其进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(15mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm，根据高效液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间及峰面积对比，确定L-亮氨酸产量。

(2)解除L-亮氨酸反馈抑制异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M突变体的获得

提取LEU741基因组，利用引物leuA-1’和leuA-2’进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、50℃30s、72℃2min 30个循环，72℃10min 1个循环，反应体系为100μL。取10μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增的目的片段回收后连接至pMD^TM18-T Vector并转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，然后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养上，于37℃倒置培养24h。挑取3个单克隆，提取重组质粒并测定其序列。

测序结果表明，与野生型leuA相比，突变后基因编码的2-异丙基苹果酸合成酶发生了F7L，I14F，I51S，G127D，I197V，F370L，K380M，R529H，G561D，V596A突变，将该突变体命名为LEUA^M，编码基因命名为leuA^M。

(3)异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M与野生型异丙基苹果酸合成酶LEUA的酶学性质比较

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和LEU741基因组为模板，利用引物LA-1和LA-2进行PCR扩增，产物回收后连接至经BamH I酶切的pET-His质粒，然后转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得菌株E.coli-leuA和E.coli-leuA^M。利用IPTG对E.coli-leuA和E.coli-leuA^M诱导表达重组蛋白LEUA和LEUA^M，收集菌体，用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)重悬后进行超声破碎并离心后取上清液。

LEUA^M和LEUA的酶活性测定方法如下：

取10μL上述上清液至990μL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 7.5含400mmol/L谷氨酸钾、20μL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、3mmol/L乙酰辅酶A、4mmol/L酮异戊酸)。于30℃反应1h后，加入100μL硫酸(3mol/L)，并于65℃处理15min以终止反应。在反应过程中，2-异丙基苹果酸合成酶可催化乙酰辅酶A生成辅酶A，后者在OD₄₁₂处有最大吸光度。根据该原理利用分光光度测定每分钟OD₄₁₂的变化值并计算生成的辅酶A，从而计算酶活性。结果如图2所示，LEUA^M和LEUA的活性分别为12.1和13.5nmol/(min·mg总蛋白)，二者无明显差异。

L-亮氨酸对LEUA^M和LEUA的酶活性影响测定方法如下：向上述反应液中分别加入0、2、4、6、8、10、12、15mmol/L L-亮氨酸，然后测定辅酶A生成量，以考察LEUA^M解除L-亮氨酸的反馈抑制作用。

将L-亮氨酸添加浓度为0时的酶活性定义为100％，其余L-亮氨酸浓度条件下的LEUA^M和LEUA的酶活性与之相比即为相对酶活性。

结果如图1所示，LEUA的相对酶活性随L-亮氨酸浓度增加迅速降低，L-亮氨酸浓度高于6mmol/L时，几乎无活性，表明该酶受L-亮氨酸反馈抑制作用；而突变体LEUA^M的相对活性随L-亮氨酸浓度的增加无明显变化，表明其解除了L-亮氨酸的反馈抑制作用。

综合以上结果，2-异丙基苹果酸合成酶突变体LEUA^M解除了L-亮氨酸的反馈抑制作用，同时其活性较野生型LEUA相比未见明显降低。

实施例2解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M的获得

(1)抗L-异亮氨酸结构类似物突变株的筛选

①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032菌悬液的制备

②常压室温等离子诱变

诱变参数为：载片置于气流端口2mm处，功率120W，气流量10SLM，作用时间25s。

③抗L-异亮氨酸结构类似物α-氨基丁酸突变株的筛选

将步骤②诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L α-氨基丁酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。

④菌株产L-异亮氨酸能力测定

将步骤③筛选的菌株利用种子培养基进行96孔板培养，然后以10％的接种量接种至含发酵培养基的96孔板进行发酵实验，ILE396的L-异亮氨酸产量最高。

⑤抗L-异亮氨酸结构类似物硫代异亮氨酸突变株的筛选及产L-异亮氨酸能力测定

以ILE396为诱变对象，重复步骤①和②，将诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。重复步骤④，ILE693的L-异亮氨酸产量最高。

⑥培养基

种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄2g/L，MnSO₄ 0.6g/L，玉米浆40mL，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖80g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.6g/L，MnSO₄0.015g/L，V_B1 0.001g/L，玉米浆30mL。pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

⑦检测方法

将发酵液于8000g离心5min后取上清液，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对其进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(15mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm，根据高效液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间及峰面积对比，确定L-异亮氨酸产量。

(2)解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M突变体的获得

提取ILE693基因组，利用引物ilvBN-1和ilvBN-2进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min 30个循环，72℃10min 1个循环，反应体系为100μL。取10μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增的目的片段回收后连接至pMD^TM18-T Vector并转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，然后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养上，于37℃倒置培养24h。挑取3个单克隆，提取重组质粒并测定其序列。

测序结果表明，与野生型ilvBN相比，突变后基因编码的乙酰羟酸合成酶发生了K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H674L突变，将该突变体命名为ILVBN^M，编码基因命名为ilvBN^M(SEQ ID NO.5)。

(3)乙酰羟酸合成酶突变体ILVBN^M与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN的酶学性质比较

分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和ILE693基因组为模板，利用引物IV-1和IV-2进行PCR扩增，产物回收后连接至经BamH I酶切的pET-His质粒，然后转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得菌株E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBN^M。利用IPTG对E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBN^M诱导表达重组蛋白ILVBN和ILVBN^M，收集菌体，用100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.8)重悬后进行超声破碎并离心后取上清液。

ILVBN^M和ILVBN的酶活性测定方法如下：取100μL上述上清液至1mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.8含100mmol/L丙酮酸钠、100mmol/L 2-酮丁酸、10mmol/LMgCl₂，0.2mmol/L焦磷酸硫胺素)，于37℃反应1h后，加入100μL硫酸(3mol/L)，并于65℃处理15min以终止反应。将上述反应液与1mL 0.5％肌酸和1mLα-萘酚溶液(含2.5mol/LNaOH)混合，于65℃处理20min后冷却取室温，利用分光光度测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量(OD₅₂₅)。结果如图4所示，ILVBN^M和ILVBN的活性分别为16.7和16.9nmol/(min·mg总蛋白)，二者无明显差异。

L-异亮氨酸对ILVBN^M和ILVBN的酶活性影响测定方法如下：向上述反应液中分别加入0、2、4、6、8、10、12mmol/LL-异亮氨酸，然后测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量，以考察ILVBN^M解除L-异亮氨酸的反馈抑制作用。将L-异亮氨酸添加浓度为0时的酶活性定义为100％，其余L-异亮氨酸浓度条件下的ILVBN^M和ILVBN的酶活性与之相比即为相对酶活性。结果如图3所示，ILVBN的相对酶活性随L-异亮氨酸浓度增加迅速降低，L-异亮氨酸浓度高于8mmol/L时，几乎无活性，表明该酶受L-异亮氨酸反馈抑制作用；而突变体ILVBN^M的相对活性随L-异亮氨酸浓度的增加无明显变化，表明其解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用。

综合以上结果，乙酰羟酸合成酶突变体ILVBN^M解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用，同时其活性较野生型ILVBN相比未见降低。

实施例3：L-亮氨酸生产菌TE03的构建

(1)重组片段UHF-leuA^M-DHF的构建

以人工合成的包含leuA^M基因的质粒为模板、以LEUA-3和LEUA-4为引物，进行PCR扩增，获得leuA^M；

以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别利用引物LEUA-1和LEUA-2以及LEUA-5和LEUA-6扩增获得片段UHF和DHF，UHF和DHF分别为lacI基因的上、下游同源臂；以UHF、DHF和leuA^M为模板，利用引物LEUA-1和LEUA-6进行PCR扩增，回收后即为重组片段UHF-leuA^M-DHF。

(2)重组片段UHFA-ilvBN^M-DHFB的构建

以人工合成的包含ilvBN^M基因的质粒为模板、以IlvB-3和IlvB-4为引物，进行PCR扩增，获得ilvBN^M；以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别利用引物IlvB-1和IlvB-2以及IlvB-5和IlvB-6扩增获得片段UHFA和DHFB，UHFA和DHFB分别为lacZ基因的上、下游同源臂；以UHFA、DHFB和ilvBN^M为模板，利用引物IlvBN-1和IlvBN-6进行PCR扩增，回收后即为重组片段UHFA-ilvBN^M-DHFB。

(3)重组质粒pTR-leuBCD的构建

以大肠杆菌W3110基因组为模板、以leuBCD-1和leuBCD-2为引物，进行PCR扩增，获得leuBCD(在大肠杆菌里leuB和leuCD组成一个操纵子leuBCD)，将质粒pTrc99a经BamH I酶切，经电泳、切胶回收后与leuBCD连接，获得重组质粒pTR-leuBCD。

(4)L-亮氨酸基因工程菌TE03的构建

分别将PG-1和PG-2以及PG-3和PG-4于52℃条件下退火，然后分别连接至质粒pGRB，获得pGRB1和pGRB2。其中PG-1和PG-2及PG-3和PG-4为用于Cas9识别W3110基因组lacI和lacZ基因序列的引导序列单链DNA，二者退火后成为双链DNA，可与pGRB连接。将pREDCas9质粒转化入大肠杆菌W3110，挑取阳性克隆菌，获得W3110-pREDCas9菌株。分别将pGRB1和UHF-leuA^M-DHF转化至W3110-pREDCas9，挑取阳性克隆菌，进行pGRB-gRNA和pREDCas9质粒的消除，即获得TE01菌株。同理将pGRB2和UHFA-ilvBN^M-DHFB转化至含pREDCas9的TE01，获得TE02。将pTR-leuBCD转化至TE02获得TE03。

实施例4：L-亮氨酸生产菌TE03的发酵罐发酵实验

(1)种子培养

用接种环将3-5支经新鲜斜面活化的TE03全部接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.5-7.5，溶氧维持在20-50％，通风量3-5m³/h，搅拌转速400-500rpm，32℃培养6-8h。

(2)发酵罐发酵

以5％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度35℃，通风量3-5m³/h，搅拌转速600rpm，溶氧维持在20-40％，流加浓度为80％(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.5-7.5，发酵周期48h(发酵过程曲线如图5)。

(3)发酵液中L-亮氨酸的检测

方法同实施例1(1)⑦，经检测，发酵44h时L-亮氨酸产量最高，达到69.6g/L，转化率为19.1％。

其中：种子培养组成为：

葡萄糖14g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄ 1g/L，FeSO₄10mg/L，MnSO₄10mg/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。

发酵培养基组成为：

葡萄糖25g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉4g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄ 1.5g/L，FeSO₄15mg/L，MnSO₄15mg/L，VB1 0.01mg/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。

实施例5过表达leuA^M对L-亮氨酸合成的影响

采用实例1中相同的方法，分别构建①ilvBN^M和leuBCD过表达菌TE04，②ilvBN、leuA和leuBCD过表达菌株TE05，③ilvBN^M、leuA和leuBCD过表达菌株TE06，④ilvBN、leuA^M和leuBCD过表达菌株TE07，采用实施例4相同的方法进行发酵实验。经检测，经发酵44h，TE03的L-亮氨酸产量最高(69.2g/L)，其次为TE07(35.37g/L)和TE06(18.16g/L)，TE04和TE05的L-亮氨酸产量最低分别为0.12和2.15g/L(图6)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种生产L-亮氨酸的基因工程菌及其应用

<130> 1

<141> 2019-09-19

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Ser Pro Asn Asp Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Lys Phe Glu Thr

1 5 10 15

Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg

20 25 30

Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val

35 40 45

Glu Asp Ser Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr

50 55 60

Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala

65 70 75 80

Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu

85 90 95

Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala

100 105 110

Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Asp Met

115 120 125

Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His

130 135 140

Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile

145 150 155 160

Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe

165 170 175

Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu

180 185 190

Leu Ile Lys Thr Val Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp

195 200 205

Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys

210 215 220

Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn

225 230 235 240

Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn

245 250 255

Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg

260 265 270

Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly

275 280 285

Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu

290 295 300

Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val

305 310 315 320

Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp

325 330 335

Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln

340 345 350

Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr

355 360 365

Ala Leu Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Met Gly Leu Asp Ala

370 375 380

Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp

385 390 395 400

Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp

405 410 415

Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser

420 425 430

Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly

435 440 445

Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln

450 455 460

Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp

465 470 475 480

Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln

485 490 495

Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser

500 505 510

Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly

515 520 525

His Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu

530 535 540

Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser

545 550 555 560

Asp Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly

565 570 575

Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser

580 585 590

Leu Lys Ala Ala Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His

595 600 605

Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val

610 615

<210> 2

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgtctccta acgatgcatt gatctccgca cctgccaagt tcgaaacccc agttgggcct 60

cgcaacgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120

tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat agttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180

aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240

ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300

ggcttcaaag aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360

cgtgagatca tcgaaaagga catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420

gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480

gtgcacttct acaactccac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540

gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactaa tcaagaccgt cgctcaggat 600

tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660

gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720

ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780

tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840

ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900

gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960

accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020

cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080

tacggcggtg acctggtctt caccgctctc tccggttccc accaggacgc tgtgaacatg 1140

ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200

gaacagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260

ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320

tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380

accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440

gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500

gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560

ggcaaggacg tcaccgtcga tggccacggc aacggcccac tggccgctta cgccaacgcg 1620

ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccgcacctcg 1680

gacgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740

ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagcgac ctccgccgta 1800

aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgtcta a 1851

<210> 3

<211> 616

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)

<400> 3

Met Ser Pro Asn Asp Ala Phe Ile Ser Ala Pro Ala Lys Ile Glu Thr

1 5 10 15

Pro Val Gly Pro Arg Asn Glu Gly Gln Pro Ala Trp Asn Lys Gln Arg

20 25 30

Gly Ser Ser Met Pro Val Asn Arg Tyr Met Pro Phe Glu Val Glu Val

35 40 45

Glu Asp Ile Ser Leu Pro Asp Arg Thr Trp Pro Asp Lys Lys Ile Thr

50 55 60

Val Ala Pro Gln Trp Cys Ala Val Asp Leu Arg Asp Gly Asn Gln Ala

65 70 75 80

Leu Ile Asp Pro Met Ser Pro Glu Arg Lys Arg Arg Met Phe Glu Leu

85 90 95

Leu Val Gln Met Gly Phe Lys Glu Ile Glu Val Gly Phe Pro Ser Ala

100 105 110

Ser Gln Thr Asp Phe Asp Phe Val Arg Glu Ile Ile Glu Lys Gly Met

115 120 125

Ile Pro Asp Asp Val Thr Ile Gln Val Leu Val Gln Ala Arg Glu His

130 135 140

Leu Ile Arg Arg Thr Phe Glu Ala Cys Glu Gly Ala Lys Asn Val Ile

145 150 155 160

Val His Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Ile Leu Gln Arg Asn Val Val Phe

165 170 175

Arg Met Asp Lys Val Gln Val Lys Lys Leu Ala Thr Asp Ala Ala Glu

180 185 190

Leu Ile Lys Thr Ile Ala Gln Asp Tyr Pro Asp Thr Asn Trp Arg Trp

195 200 205

Gln Tyr Ser Pro Glu Ser Phe Thr Gly Thr Glu Val Glu Tyr Ala Lys

210 215 220

Glu Val Val Asp Ala Val Val Glu Val Met Asp Pro Thr Pro Glu Asn

225 230 235 240

Pro Met Ile Ile Asn Leu Pro Ser Thr Val Glu Met Ile Thr Pro Asn

245 250 255

Val Tyr Ala Asp Ser Ile Glu Trp Met His Arg Asn Leu Asn Arg Arg

260 265 270

Asp Ser Ile Ile Leu Ser Leu His Pro His Asn Asp Arg Gly Thr Gly

275 280 285

Val Gly Ala Ala Glu Leu Gly Tyr Met Ala Gly Ala Asp Arg Ile Glu

290 295 300

Gly Cys Leu Phe Gly Asn Gly Glu Arg Thr Gly Asn Val Cys Leu Val

305 310 315 320

Thr Leu Ala Leu Asn Met Leu Thr Gln Gly Val Asp Pro Gln Leu Asp

325 330 335

Phe Thr Asp Ile Arg Gln Ile Arg Ser Thr Val Glu Tyr Cys Asn Gln

340 345 350

Leu Arg Val Pro Glu Arg His Pro Tyr Gly Gly Asp Leu Val Phe Thr

355 360 365

Ala Phe Ser Gly Ser His Gln Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Asp Ala

370 375 380

Met Ala Ala Lys Val Gln Pro Gly Ala Ser Ser Thr Glu Val Ser Trp

385 390 395 400

Glu Gln Leu Arg Asp Thr Glu Trp Glu Val Pro Tyr Leu Pro Ile Asp

405 410 415

Pro Lys Asp Val Gly Arg Asp Tyr Glu Ala Val Ile Arg Val Asn Ser

420 425 430

Gln Ser Gly Lys Gly Gly Val Ala Tyr Ile Met Lys Thr Asp His Gly

435 440 445

Leu Gln Ile Pro Arg Ser Met Gln Val Glu Phe Ser Thr Val Val Gln

450 455 460

Asn Val Thr Asp Ala Glu Gly Gly Glu Val Asn Ser Lys Ala Met Trp

465 470 475 480

Asp Ile Phe Ala Thr Glu Tyr Leu Glu Arg Thr Ala Pro Val Glu Gln

485 490 495

Ile Ala Leu Arg Val Glu Asn Ala Gln Thr Glu Asn Glu Asp Ala Ser

500 505 510

Ile Thr Ala Glu Leu Ile His Asn Gly Lys Asp Val Thr Val Asp Gly

515 520 525

Arg Gly Asn Gly Pro Leu Ala Ala Tyr Ala Asn Ala Leu Glu Lys Leu

530 535 540

Gly Ile Asp Val Glu Ile Gln Glu Tyr Asn Gln His Ala Arg Thr Ser

545 550 555 560

Gly Asp Asp Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Val Leu Ala Glu Val Asn Gly

565 570 575

Arg Lys Val Trp Gly Val Gly Ile Ala Gly Ser Ile Thr Tyr Ala Ser

580 585 590

Leu Lys Ala Val Thr Ser Ala Val Asn Arg Ala Leu Asp Val Asn His

595 600 605

Glu Ala Val Leu Ala Gly Gly Val

610 615

<210> 4

<211> 1851

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)

<400> 4

atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60

cgcaacgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120

tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180

aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240

ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300

ggcttcaaag aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360

cgtgagatca tcgaaaaggg catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420

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gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactaa tcaagaccat cgctcaggat 600

tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660

gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720

ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780

tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840

ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900

gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960

accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020

cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080

tacggcggtg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140

ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200

gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260

ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320

tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380

accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440

gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500

gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560

ggcaaggacg tcaccgtcga tggccgcggc aacggcccac tggccgctta cgccaacgcg 1620

ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccgcacctcg 1680

ggcgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740

ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800

aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851

<210> 5

<211> 2413

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60

gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120

gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180

tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240

accggctaca cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300

gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360

atcaccggcc aggtcggaag tagcctgctg ggtaccgacg ctttccagga agccgatatc 420

cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480

ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540

gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600

gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660

aagctgatcg gtgagtctag gaagcccgtc ctttacgttg gtggtggcgt aatcaaggct 720

gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagcacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780

ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840

catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900

tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960

attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020

gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080

gagtctgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140

cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200

tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260

gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320

accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380

gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440

gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500

cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560

ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620

gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680

ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740

ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800

gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860

gttgaatcga ccgaggcata aggagagacc caagatggct aattctgacg tcacccgcca 1920

catcctgtcc gtactcgttc aggacgtaga cggaatcatt tcccgcgtat caggtatgtt 1980

cacccgacgc gcattcaacc tcgtgtccct cgtgtctgca aagaccgaaa cactcggcat 2040

caaccgcatc acggttgttg tcgacgccga cgagctcaac attgagcaga tcaccaagca 2100

gctcaacaag ctgatccccg tgctcaaagt cgtgcgactt gatgaagaga ccactatcgc 2160

ccgcgcaatc atgctggtta aggtctctgc ggacagcacc aaccgtccgc agatcgtcga 2220

cgccgcgaac atcttccgcg cccgagtcgt cgacgtggct ccagactctg tggttattga 2280

atccacaggc accccaggca agctccgcgc actgcttgac gtgatggaac cattcggaat 2340

ccgcgaactg atccaatccg gacagattgc actcaaccgc ggtccgaaga ccatggctcc 2400

ggccaagatc taa 2413

<210> 6

<211> 3111

<212> DNA

<213> 大肠杆菌杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

atgtcgaaga attaccatat tgccgtattg ccgggggacg gtattggtcc ggaagtgatg 60

acccaggcgc tgaaagtgct ggatgccgtg cgcaaccgct ttgcgatgcg catcaccacc 120

agccattacg atgtaggcgg cgcagccatt gataaccacg ggcaaccact gccgcctgcg 180

acggttgaag gttgtgagca agccgatgcc gtgctgtttg gctcggtagg cggcccgaag 240

tgggaacatt taccaccaga ccagcaacca gaacgcggcg cgctgctgcc tctgcgtaag 300

cacttcaaat tattcagcaa cctgcgcccg gcaaaactgt atcaggggct ggaagcattc 360

tgtccgctgc gtgcagacat tgccgcaaac ggcttcgaca tcctgtgtgt gcgcgaactg 420

accggcggca tctatttcgg tcagccaaaa ggccgcgaag gtagcggaca atatgaaaaa 480

gcctttgata ccgaggtgta tcaccgtttt gagatcgaac gtatcgcccg catcgcgttt 540

gaatctgctc gcaagcgtcg ccacaaagtg acgtcgatcg ataaagccaa cgtgctgcaa 600

tcctctattt tatggcggga gatcgttaac gagatcgcca cggaataccc ggatgtcgaa 660

ctggcgcata tgtacatcga caacgccacc atgcagctga ttaaagatcc atcacagttt 720

gacgttctgc tgtgctccaa cctgtttggc gacattctgt ctgacgagtg cgcaatgatc 780

actggctcga tggggatgtt gccttccgcc agcctgaacg agcaaggttt tggactgtat 840

gaaccggcgg gcggctcggc accagatatc gcaggcaaaa acatcgccaa cccgattgca 900

caaatccttt cgctggcact gctgctgcgt tacagcctgg atgccgatga tgcggcttgc 960

gccattgaac gcgccattaa ccgcgcatta gaagaaggca ttcgcaccgg ggatttagcc 1020

cgtggcgctg ccgccgttag taccgatgaa atgggcgata tcattgcccg ctatgtagca 1080

gaaggggtgt aatcatggct aagacgttat acgaaaaatt gttcgacgct cacgttgtgt 1140

acgaagccga aaacgaaacc ccactgttat atatcgaccg ccacctggtg catgaagtga 1200

cctcaccgca ggcgttcgat ggtctgcgcg cccacggtcg cccggtacgt cagccgggca 1260

aaaccttcgc taccatggat cacaacgtct ctacccagac caaagacatt aatgcctgcg 1320

gtgaaatggc gcgtatccag atgcaggaac tgatcaaaaa ctgcaaagaa tttggcgtcg 1380

aactgtatga cctgaatcac ccgtatcagg ggatcgtcca cgtaatgggg ccggaacagg 1440

gcgtcacctt gccggggatg accattgtct gcggcgactc gcataccgcc acccacggcg 1500

cgtttggcgc actggccttt ggtatcggca cttccgaagt tgaacacgta ctggcaacgc 1560

aaaccctgaa acagggccgc gcaaaaacca tgaaaattga agtccagggc aaagccgcgc 1620

cgggcattac cgcaaaagat atcgtgctgg caattatcgg taaaaccggt agcgcaggcg 1680

gcaccgggca tgtggtggag ttttgcggcg aagcaatccg tgatttaagc atggaaggtc 1740

gtatgaccct gtgcaatatg gcaatcgaaa tgggcgcaaa agccggtctg gttgcaccgg 1800

acgaaaccac ctttaactat gtcaaaggcc gtctgcatgc gccgaaaggc aaagatttcg 1860

acgacgccgt tgcctactgg aaaaccctgc aaaccgacga aggcgcaact ttcgataccg 1920

ttgtcactct gcaagcagaa gaaatttcac cgcaggtcac ctggggcacc aatcccggcc 1980

aggtgatttc cgtgaacgac aatattcccg atccggcttc gtttgccgat ccggttgaac 2040

gcgcgtcggc agaaaaagcg ctggcctata tggggctgaa accgggtatt ccgctgaccg 2100

aagtggctat cgacaaagtg tttatcggtt cctgtaccaa ctcgcgcatt gaagatttac 2160

gcgcggcagc ggagatcgcc aaagggcgaa aagtcgcgcc aggcgtgcag gcactggtgg 2220

ttcccggctc tggcccggta aaagcccagg cggaagcgga aggtctggat aaaatcttta 2280

ttgaagccgg ttttgaatgg cgcttgcctg gctgctcaat gtgtctggcg atgaacaacg 2340

accgtctgaa tccgggcgaa cgttgtgcct ccaccagcaa ccgtaacttt gaaggccgcc 2400

aggggcgcgg cgggcgcacg catctggtca gcccggcaat ggctgccgct gctgctgtga 2460

ccggacattt cgccgacatt cgcaacatta aataaggagc acaccatggc agagaaattt 2520

atcaaacaca caggcctggt ggttccgctg gatgccgcca atgtcgatac cgatgcaatc 2580

atcccgaaac agtttttgca gaaagtgacc cgtacgggtt ttggcgcgca tctgtttaac 2640

gactggcgtt ttctggatga aaaaggccaa cagccaaacc cggacttcgt gctgaacttc 2700

ccgcagtatc agggcgcttc cattttgctg gcacgagaaa acttcggctg tggctcttcg 2760

cgtgagcacg cgccctgggc attgaccgac tacggtttta aagtggtgat tgcgccgagt 2820

tttgctgaca tcttctacgg caatagcttt aacaaccagc tgctgccggt gaaattaagc 2880

gatgcagaag tggacgaact gtttgcgctg gtgaaagcta atccggggat ccatttcgac 2940

gtggatctgg aagcgcaaga ggtgaaagcg ggagagaaaa cctatcgctt taccatcgat 3000

gccttccgcc gccactgcat gatgaacggt ctggacagta ttgggcttac cttgcagcac 3060

gacgacgcca ttgccgctta tgaagcaaaa caacctgcgt ttatgaatta a 3111

<210> 7

<211> 497

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 7

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60

tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120

gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180

tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240

gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300

cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 360

gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 420

actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 480

ttctcccatg aagacgg 497

<210> 8

<211> 535

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 8

gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 60

atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 120

gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 180

ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 240

cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 300

cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 360

cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 420

ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 480

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtga 535

<210> 9

<211> 897

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 9

atgaccatga ttacggattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 60

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 120

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 180

tttgcctggt ttccggcacc agaagcggtg ccggaaagct ggctggagtg cgatcttcct 240

gaggccgata ctgtcgtcgt cccctcaaac tggcagatgc acggttacga tgcgcccatc 300

tacaccaacg tgacctatcc cattacggtc aatccgccgt ttgttcccac ggagaatccg 360

acgggttgtt actcgctcac atttaatgtt gatgaaagct ggctacagga aggccagacg 420

cgaattattt ttgatggcgt taactcggcg tttcatctgt ggtgcaacgg gcgctgggtc 480

ggttacggcc aggacagtcg tttgccgtct gaatttgacc tgagcgcatt tttacgcgcc 540

ggagaaaacc gcctcgcggt gatggtgctg cgctggagtg acggcagtta tctggaagat 600

caggatatgt ggcggatgag cggcattttc cgtgacgtct cgttgctgca taaaccgact 660

acacaaatca gcgatttcca tgttgccact cgctttaatg atgatttcag ccgcgctgta 720

ctggaggctg aagttcagat gtgcggcgag ttgcgtgact acctacgggt aacagtttct 780

ttatggcagg gtgaaacgca ggtcgccagc ggcaccgcgc ctttcggcgg tgaaattatc 840

gatgagcgtg gtggttatgc cgatcgcgtc acactacgtc tgaacgtcga aaacccg 897

<210> 10

<211> 500

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 10

ttgatggtag tggtcaaatg gcgattaccg ttgatgttga agtggcgagc gatacaccgc 60

atccggcgcg gattggcctg aactgccagc tggcgcaggt agcagagcgg gtaaactggc 120

tcggattagg gccgcaagaa aactatcccg accgccttac tgccgcctgt tttgaccgct 180

gggatctgcc attgtcagac atgtataccc cgtacgtctt cccgagcgaa aacggtctgc 240

gctgcgggac gcgcgaattg aattatggcc cacaccagtg gcgcggcgac ttccagttca 300

acatcagccg ctacagtcaa cagcaactga tggaaaccag ccatcgccat ctgctgcacg 360

cggaagaagg cacatggctg aatatcgacg gtttccatat ggggattggt ggcgacgact 420

cctggagccc gtcagtatcg gcggaattcc agctgagcgc cggtcgctac cattaccagt 480

tggtctggtg tcaaaaataa 500

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

gtgaaaccag taacgttata cg 22

<210> 12

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

ccacacatta tacgagccgg atgattaatt gtcaaccgtc ttcatgggag aa 52

<210> 13

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacaag gagatatacc 60

atgtctccta acgatgcatt 80

<210> 14

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgctt 60

aaacgccgcc agc 73

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat gctgttagcg 60

ggc 63

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

tcactgcccg ctttccag 18

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

atgtctccta acgatgcatt 20

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ttaaacgccg ccagc 15

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

atgaccatga ttacggattc ac 22

<210> 20

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

ccacacatta tacgagccgg atgattaatt gtcaacgggt tttcgacgtt cagacgta 58

<210> 21

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacaag gagatatacc 60

atgaatgtgg cagcttctc 79

<210> 22

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

caaacaacag ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttgtta 60

gatcttggcc ggagccatgg tc 82

<210> 23

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 60

ttgatggtag tggtcaaatg g 81

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

ttatttttga caccagacca a 21

<210> 25

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgca tgtctcctaa cgatgcatt 49

<210> 26

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

tgatgatgtt agctagcgct gaattctgct taaacgccgc cagc 44

<210> 27

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

gaccatggaa ttcgagctcg gtacccggat gtcgaagaat taccatattg cc 52

<210> 28

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagaata attcataaac gcaggttgtt ttg 53

<210> 29

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

agtcctaggt ataatactag tttctcccat gaagacgggt tttagagcta gaa 53

<210> 30

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

ttctagctct aaaacccgtc ttcatgggag aaactagtat tatacctagg act 53

<210> 31

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

agtcctaggt ataatactag taaactgtgg agcgccgaaa tccgttttag agctagaa 58

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

ttctagctct aaaacggatt tcggcgctcc acagtttact agtattatac ctaggact 58

<210> 33

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgca tgaccatgat tacggattca c 51

<210> 34

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

tgatgatgtt agctagcgct gaattctgct tagatcttgg ccggagccat gg 52

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

atgaccatga ttacggattc ac 22

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

ttagatcttg gccggagcca tgg 23

Claims

1.一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过在宿主细胞中过表达解除L-亮氨酸反馈抑制异丙基苹果酸合成酶编码基因leuA^M、解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBN^M、3-异丙基苹果酸脱氢酶编码基因leuB、3-异丙基苹果酸脱水酶编码基因leuCD获得的；

所述leuA^M核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

3.如权利要求1所述的一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述ilvBN^M基因编码的乙酰羟酸合成酶解除了L-异亮氨酸的反馈抑制，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

4.如权利要求1所述的一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述leuB基因是Genbank编号为b0073、JW5807、NCgl1237、BSU28270或BAMF_2634的leuB基因。

5.如权利要求1所述的一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述leuCD基因是Genbank编号为b0071、b0072、JW0070、JW0071、NCgl1262、NCgl1263、BSU28250、BSU28260、BAMF_2632或BAMF_2633的leuCD基因。

6.如权利要求1所述的一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌杆菌(Escherichia coli)W3110为宿主细胞，过表达SEQ ID NO.2所示的leuA^M基因，SEQ ID NO.5所示的ilvBN^M基因，SEQ ID NO.6所示的leuBCD基因获得的。

7.如权利要求1所述的一种生产L-亮氨酸的基因工程菌，其特征在于，构建方法如下：

(1)分别扩增基因leuA^M、leuB、leuCD以及ilvBN^M，并分别构建基因组整合片段；

(2)采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将上述基因组整合片段和重组质粒依次在宿主细胞内表达。

8.权利要求1-6任意一项所述基因工程菌在生产L-亮氨酸中的应用。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，利用上述基因工程菌发酵合成L-亮氨酸的方法具体如下：

以5％-10％接种量将种子培养物接至发酵培养基中进行发酵培养，溶氧维持在20-40％，pH维持在6.5-7.5，培养温度30-35℃，发酵周期40-45h，发酵过程中维持残糖浓度为0-0.4％。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基成分为：葡萄糖25g/L，蛋白胨12g/L，酵母粉4g/L，KH₂PO₄ 3.5g/L，MgSO₄ 1.5g/L，FeSO₄15mg/L，MnSO₄15mg/L，VB10.01mg/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。