CN110157692A - 一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体 - Google Patents

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堵国成
宋阳
顾洋
李江华
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    • C12Y—ENZYMES
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Abstract

本发明公开了一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明采用定点饱和突变氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶的方法提供了来源于E.coli的氨基葡萄糖‑6‑磷酸合成酶突变体。相比野生型氨基葡萄糖‑6‑磷酸转移酶，突变体对6‑磷酸果糖的催化活力明显提高，乙酰氨基葡萄糖的产量更高，更适合工业化生产。

Description

一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体
技术领域
本发明涉及一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
对GlcN的生物合成研究表明在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GlmS)的催化作用下，生成GlcN，该步是GlcN合成途径中的第一个限速反应。而氨基葡萄糖-6磷酸合成酶是一种双底物结合酶，属于氨基转移酶类，催化活力较低。
发明内容
本发明的目的首先是提供一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生GlmS的第38位的丙氨酸突变为谷氨酸，或者第249位的精氨酸突变为色氨酸，或者第471位的甘氨酸突变为丝氨酸。
本发明还提供获得所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的方法，以pET28a-glmS-gna1为模版，通过定点突变将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型GlmS的基因进行突变的，将携带编码突变体的基因的载体转入E.coli BL21(DE3)，培养重组菌得到氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体。
编码所述野生型GlmS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。
本发明还提供提高乙酰氨基葡萄糖产量的方法，是以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主，重组表达编码所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因，得到重组菌；将重组大肠杆菌以种子培养基活化后以5～8％的接种量转入发酵培养基，于35～37℃、200～220rpm条件下培养，OD600达到0.6左右时加入0.4mM的IPTG诱导氨基葡萄糖-6磷酸合成酶的表达，使重组菌能以葡萄糖为底物生产乙酰氨基葡萄糖。
种子培养基(g/L)：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖30。
本发明的有益效果：构建了3个有意义的突变体G471S、R249W、A38E，均实现了提高GlmS催化活力的作用，比野生型GlmS更有利乙酰氨基葡萄糖的合成。相比野生型GlmS酶，突变体G471S、R249W、A38T在发酵16h后，以葡萄糖为底物，G471S乙酰氨基葡萄糖产量36.975mg/L，与出发菌相比提高22.62％，R249W产量达到148.23mg/L，是出发菌种产量的4.66倍。A38E产量达到127.56mg/L，是出发菌株产量的4.01倍。
具体实施方式
乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相：5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积10μL。
种子培养基(g/L)：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖30。
实施例1突变位点的确定
GlmS的催化机制遵从有序反应机制，6-磷酸果糖先与谷氨酰胺结合，随着谷氨酰胺的水解，氨基转移且氨基糖的异构化，GlmS依次释放谷氨酸和GlcN-6-P。大肠杆菌的GlmS为同源二聚体，两个不同单体上的异构酶结构域在二聚体内侧，二聚体的外侧是两个谷氨酰胺结合的结构域。通过来源于E.coli的GlmS的PDB晶体结构分析(PDB编码为1JXA)确定G471、R249、A38为可能的提高酶活力位点。
实施例2突变体G471S、R249W、A38E的制备
(1)定点突变
利用快速PCR技术，以表达有野生型GlmS的基因的质粒pET28a-glmS-gna1(pET28a-glmS-gna1的构建方法参见CN103589696A)为模板，进行定点突变。
引入G471S突变的引物：
正向引物：5’-GCTGTTCCTGGCCGTGGCGATC-3’
反向引物：5’-GATCGCCACGGCCAGGAACAGC-3’
引入R249W突变的引物
正向引物：5’-CGGGCGATAAAGGCATTTACTGGCACTACATGCAGA-3’
反向引物：5’-TCTGCATGTAGTGCCAGTAAATGCCTTTATCGCCCG-3’
引入A38E突变的引物
正向引物：5’-CCGTTGTTGATGAAGAAGGTCATATGACCCGCC-3’
反向引物：5’-GGCGGGTCATATGACCTTCTTCATCAACAACGG-3’
PCR反应体系均为：5﹡PrimerStar Buffer 10μL，dNTPs(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，PrimerStar HS DNA Ploymerase(2.5U/μL)0.5μL，加入双蒸水32.5μL。
PCR反应扩增条件均为：98℃预变性4min；随后98℃10s，55℃15s，72℃8min进行30个循环，最后72℃保温10min。
将PCR产物经过Dpn I消化2h后，分别转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，涂布到含有琼脂的LB固体培养基中培养过夜，挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。
(2)突变体的表达及产量测定
挑取测序正确的突变体与LB培养基中，在37℃，200rpm下培养过夜，以2％(v/v)接种量接种到TB培养基中，在37℃、200rpm培养到OD600为0.6，加入0.4mM IPTG诱导，诱导后发酵12h。
表达G471S、R249W、A38E的重组菌的发酵上清中，乙酰氨基葡萄糖产量分别是36.975mg/L、148.23mg/L、127.56mg/L，相比野生型提高22.6％、366.4％、301.7％。重组大肠杆菌种子培养及发酵培养基：
种子培养基(g/L)：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖30。
实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖
用LB斜面培养基培养重组大肠杆菌，培养12h后，用接种环取1环介入装有20mL种子培养基的250mL的三角瓶中培养，种子培养基中按照50μg/mL加入卡那霉素，在37℃、200rpm下培养12h。种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养，OD600等于0.6时加入0.4mM的IPTG诱导，诱导后培养16h。测定最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的产量，结果表明表达G471S的重组菌的发酵上清中乙酰氨基葡萄糖产量36.975mg/L，与出发菌相比提高22.62％；表达R249W的重组菌的发酵上清中产量达到148.23mg/L，是出发菌种产量的4.66倍；表达A38E的重组菌的发酵上清中产量达到127.56mg/L，是出发菌株产量的4.01倍。通过提高GlmS催化活力，实现了提高乙酰氨基葡萄糖在重组大肠杆菌中的积累。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1830
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60
ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcggaa 120
ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggctca ggcagcggaa 180
gaacatcctc tgcatggcgg caccggtatt gctcatactc gctgggcgac acacggtgaa 240
ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300
atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360
tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420
actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480
atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540
attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600
acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660
aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720
tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780
ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840
gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900
tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960
attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020
aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080
cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140
tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200
gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260
tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca ttgtgcatgg tctgcaggcg 1320
ttgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc tctggcagaa 1380
gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440
ctggaaggcg cattgaagct gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgca 1500
ggtgaactga aacacggtcc gctggcgctg attgatgccg atatgccggt tatcgtcgtt 1560
gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaacta aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620
ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680
cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac caatcttcta caccgttccg 1740
ctgcagctac tggcttatca cgtcgcgctg atcaaaggta ccgacgttga ccagccgcgt 1800
aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830
<210> 2
<211> 609
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 2
Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
35 40 45
Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
50 55 60
His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu
65 70 75 80
Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
85 90 95
Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
100 105 110
Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
115 120 125
Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130 135 140
Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val
145 150 155 160
Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
165 170 175
Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
195 200 205
Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210 215 220
Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln
225 230 235 240
Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
245 250 255
Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
275 280 285
Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290 295 300
Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly
305 310 315 320
Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
325 330 335
Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
340 345 350
Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370 375 380
Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val
385 390 395 400
Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
405 410 415
Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
420 425 430
Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
435 440 445
Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460
Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala
465 470 475 480
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
485 490 495
Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
500 505 510
Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
515 520 525
Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530 535 540
Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met
545 550 555 560
His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
565 570 575
Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
580 585 590
Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
595 600 605
Glu
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgttcctg gccgtggcga tc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatcgccacg gccaggaaca gc 22
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgggcgataa aggcatttac tggcactaca tgcaga 36
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctgcatgta gtgccagtaa atgcctttat cgcccg 36
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccgttgttga tgaagaaggt catatgaccc gcc 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggcgggtcat atgaccttct tcatcaacaa cgg 33

Claims (9)

1.一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生GlmS的第249位的精氨酸突变为色氨酸。
2.编码权利要求1所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.一种获得权利要求1所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的方法，其特征在于，以pET28a-glmS-gna1为模版，通过定点突变将编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型GlmS的基因进行突变的，将携带编码突变体的基因的载体转入E.coli BL21(DE3)，培养重组菌得到氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体。
5.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，是以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主，重组表达编码权利要求1所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因，得到重组菌；将重组大肠杆菌以种子培养基活化后以5～8％的接种量转入发酵培养基，于35～37℃、200～220rpm条件下培养，OD600达到0.6左右时加入0.4mM的IPTG诱导氨基葡萄糖-6磷酸合成酶的表达，使重组菌能以葡萄糖为底物生产乙酰氨基葡萄糖。
6.根据权利要求5所述的一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，种子培养基按g/L计含有：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl10。
7.根据权利要求5所述的一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖30。
8.应用权利要求1所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体生产乙酰氨基葡萄糖的方法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体为催化剂，催化葡萄糖生产乙酰氨基葡萄糖。
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