CN103589696A - 大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体及其应用，所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因如SEQ ID No.2所示。本发明通过易错PCR的方法对野生型大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶（GlmS）进行突变。过表达突变后的GlmS，40h发酵产量可达6g/L，72h氨基葡萄糖的产量可以达到17g/L。

Description

大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程及微生物发酵领域，具体地说，涉及一种大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体及其应用。

背景技术

氨基葡萄糖（Glucosamine,GlcN）又称氨基葡糖或葡萄糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖，在医药、食品和保健领域具有广泛应用。氨基葡萄糖在体内具有重要的生理作用，如参与肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；作为抗菌消炎药物，治疗风湿性关节炎和胃溃疡等。由于GlcN对人体没有毒性，日本和美国均将其作为食品配料广泛使用。氨基葡萄糖也是一种新型生化药品、药物中间体和高档化妆品的添加剂。目前主要的生产方法为甲壳素水解法。水解法消耗大量的酸碱，腐蚀设备，环境污染严重，纯化工艺复杂，产品有鱼腥味，存在过敏效应。相对于甲壳素水解法，微生物发酵法生产不受资源限制，对环境污染小，产品无鱼腥味，不存在过敏效应。

对GlcN的生物合成研究表明：在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖合成酶（GlmS）的催化作用下，生成GlcN，该步是GlcN合成途径中的第一个限速反应。过表达氨基葡萄糖合成酶（GlmS）和降解基因的失活都会增加约15倍的氨基葡萄糖产量，达到60mg/L。

发明内容

本发明的目的是提供一种大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

与野生型的氨基葡萄糖合成酶相比，本发明的氨基葡萄糖合成酶突变体发生改变的氨基酸序列为：M43K（第43位甲硫氨酸变为赖氨酸），P151T（第151位脯氨酸变为苏氨酸），Y258S（第258位酪氨酸变为丝氨酸），I434T（第434位异亮氨酸变为苏氨酸），A552G（第552为丙氨酸变为甘氨酸）。

本发明还提供编码所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的基因，其核苷酸序列为：

i）Seq ID No.2所示的核苷酸序列；或

ii）Seq ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii）在严格条件下与Seq ID No.2所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明还提供含有编码所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体基因的载体、工程菌及转基因细胞系。优选地，所述工程菌的出发菌株为大肠杆菌。

本发明还提供所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体在氨基葡萄糖合成中的应用。

本发明进一步提供一种利用大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，通过在大肠杆菌中过表达编码所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的基因，从而提高氨基葡萄糖的发酵产量。

所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的筛选方法，包括以下步骤：

（1）从大肠杆菌（Escherichia coli）基因组DNA中，扩增GlmS的编码基因glms；

（2）采用易错PCR技术，以GlmS的编码基因glms为模板，扩增获得GlmS突变体基因；

（3）将步骤（2）所得易错PCR产物用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后，与BamHⅠ和XhoⅠ酶切的pET-24d(+)载体连接，连接产物转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布至LB（Kan）平板，将平板置37℃恒温培养箱培养，即得构建好的重组GlmS基因突变库；

（4）LB（Kan）平板上长出菌落，挑取其中的100个单克隆，转接到LB（Kan）液体培养基中，37℃摇床培养，待菌液OD600值达0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，放回37℃摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定GlmS野生型和突变体酶活，挑选酶活力最强的一株，并测定其基因序列，结果如SEQ ID NO.2所示。

其中，所述野生型氨基葡萄糖合成酶具有SEQ ID NO.3所示的基因序列和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供所述氨基葡萄糖合成酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

1）PCR扩增编码所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的基因；

2）将步骤1）所得PCR产物连接表达载体pET-24d（+）；

3）连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物；

其中，步骤1）中PCR扩增所用引物为：

正向引物：5′-CGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3′

反向引物：5′-CCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTGCCA-3′

其中，过表达的大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体C-端含有6个组氨酸标签。

通过诱导表达，获得GlmS（野生型）及GlmSM（突变体）的诱导上清液，并进行SDS-PAGE分析。

本发明的大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体及其编码基因还可以通过人工合成序列的方法获得。

由于GlmS受6-磷酸氨基葡萄糖的强烈抑制，本发明通过易错PCR的方法对GlmS进行突变。过表达突变后的GlmS，40h发酵产量可达6g/L，72h氨基葡萄糖的产量可以达到17g/L。

附图说明

图1为PCR扩增野生型大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶基因的凝胶电泳检测结果。

图2为PCR扩增大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体基因的凝胶电泳检测结果。

图3为野生型和突变体大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶的SDS-PAGE检测结果；其中，I为野生型，II为突变体，1为未诱导的菌体上清，2为经过诱导的菌体上清。

图4为大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的SDS-PAGE检测结果；其中，M为蛋白Marker，1为经过诱导的菌体上清，2为经过纯化的GlmSM蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶基因的获得

以1μg大肠杆菌（Escherichia coli）基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID NO.3所示的序列设计正向引物GlmS-F：5′-CGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3′，反向引物GlmS–R：5'-CCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTGCCA-3′；其中，斜体字母部分分别为酶切位点BamHⅠ和Xho I。PCR反应在50μl总体系中进行，反应条件为：94℃变性5min；94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。取3μl PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。取100μl PCR产物做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的说明回收目的片段。

实施例2野生型氨基葡萄糖合成酶基因表达载体的构建

将实施例1中的PCR产物经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切消化后，与用BamHⅠ和XhoⅠ内切酶消化的pET-24d（+）质粒（购自Novagen公司）进行连接反应，构建的载体被命名为pET-GlmS，然后用连接产物pET-GlmS混合物转化大肠杆菌DH5-α（购自promega公司），并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株（购自promega公司）。

实施例3易错PCR扩增大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶基因

利用Taq DNA聚合酶不具有3′-5′校对功能的性质，在高镁离子浓度（8mmol/L）和不同浓度dNTP的浓度下（其中dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L，dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L），来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库。模板浓度A260值为1000ng/mL，酶浓度为5U/μL，引物浓度为100μM。实验中最优突变率约为0.6%。

易错PCR反应体系（100μl）：

PCR程序为：96℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸2min，45个循环；最后75℃延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5μl产物1%琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。

实施例4突变体GlmSM表达载体的构建

将实施例3中的PCR产物（DNA改组后的混合物）经限制性内切酶BamHⅠ和Xho I双酶切消化后，与用BamHⅠ和Xho I内切酶消化的pET-24d（+）质粒进行连接反应，构建的载体被称为pET-GlmSM，然后用连接产物pET-GlmSM混合物转化大肠杆菌DH5α，构建转化菌体突变库。

实施例5构建表达突变库及高酶活突变体的筛选

提取转化菌体库的质粒，分别转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株，获得转化子约100株，构建表达突变体库。随机挑取突变菌株至含50μg/mL kan的LB培养基的96孔板中，37℃、150rpm培养，待OD值达0.6-0.8，加入IPTG（终浓度0.2mmol/L），继续培养12h，收集菌体。超声破菌得上清，并进行酶活测定。检测酶活性最高的菌株，并挑选其克隆，并提取质粒，进行电泳检测（图2），测定与野生型氨基葡萄糖合成酶对应的突变体基因序列。测定的大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体基因序列如SEQ ID NO.2所示，对应的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

氨基葡萄糖合成酶的酶活检测：

取不同突变株诱导表达后的菌液3ml在10000r/min离心，弃上清后在4℃下重悬于1ml PBS（pH值7.5，10mmol/L）溶液中，在冰浴条件下选取300V电压，超声3s间歇6s对其进行超声破碎10min，离心取上清作为粗提液。以5ml反应体系为酶活测定体系，其中包括5mmol/L葡萄糖，5mmol/L NAD+，100mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）及25μl粗酶液。酶活反应在37℃水浴中进行，保温2h，然后沸水浴灭活酶5min，用紫外分光光度计检测340nm处吸光度来确定反应体系中NADH的生成，酶活的定义为：37℃条件下该反应体系中每分钟生成2μmol NADH为1U。蛋白的浓度采用Brandford方法测定。经过计算，野生型蛋白的酶活为42.3U/L，突变体蛋白的最高酶活为106.7U/L，结果表明，通过易错PCR对GlmS进行改造，获得了酶活力提高了2.52倍的突变株。

实施例6野生型GlmS和突变体GlmSM的诱导表达及纯化

以测序验证的pET-GlmS和pET-GlmSM表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞；挑取阳性克隆，分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至约为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，37℃诱导12h。接种上述转化后的大肠杆菌BL21于1000mL LB培养基，待OD600值约达2.0时，诱导与上述相同。离心收集菌体，以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl（含1mmol/L咪唑）缓冲液悬浮（湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5mL缓冲液），在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后收集上清，再加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，100℃沸水浴15min后，进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。

NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，然后加NiSO₄溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-0缓冲液（20mMTris-HCl pH7.9，0.5M NaCl）洗柱。将上述收集破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni²⁺-NTA树脂柱中，反复加入2-3次后，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液（即NAT-0缓冲液含有80mmol/L咪唑）洗涤介质以去除杂蛋白,最后用含有300mmol/L咪唑的上述缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体GlmSM，并进行SDS-PAGE分析。纯化分析结果如图4所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，出发菌株为大肠杆菌。

8.权利要求1所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体在氨基葡萄糖合成中的应用。

9.一种利用大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，在大肠杆菌中过表达权利要求2或3所述基因，从而提高氨基葡萄糖的发酵产量。

10.权利要求1所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）PCR扩增编码所述大肠杆菌氨基葡萄糖合成酶突变体的基因；

2）将步骤1）所得PCR产物连接表达载体pET-24d（+）；

3）连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物；

其中，步骤1）中PCR扩增所用引物为：

正向引物：5′-CGGATCCATGTGTGGAATTGTTGGCGC-3′；

反向引物：5′-CCTCGAGTTACTCAACCGTAACCGATTTTGCCA-3′。

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