CN104087570B - 乌头酸酶突变体、其编码基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码该突变体的基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了73％，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。

Description

乌头酸酶突变体、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应用。

背景技术

柠檬酸，又名枸橼酸，化学名称是2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸。因其具有令人愉悦的酸味，人口爽快，无后酸味，安全无毒，已成为当前世界上生产量和消费量最大的食用有机酸。世界上柠檬酸行业的集约化程度非常高，生产重心已转移至中国，我国柠檬酸产量和出口量已连续多年居世界第一。2008年，我国柠檬酸产能达到10万吨，占世界总量的70％左右，其中70-80％用于生产饮料、食品，其余用于医药、化工、环保、化妆品、纺织、印染、建筑等各个领域。

黑曲霉(Aspergillus niger)是生产柠檬酸最常见的菌株，已有报道称黑曲霉在发酵生产柠檬酸过程中存在三羧酸循环的酶系，其中由柠檬酸到异柠檬酸，即柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸，两步反应均由乌头酸酶(aconitase，ACO)催化。因此阻断柠檬酸向下的代谢是柠檬酸的积累关键，即阻断乌头酸酶的催化反应。通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。

发明内容

本发明的目的是提供一种乌头酸酶突变体、其编码基因及应用。

为了实现本发明目的，本发明的乌头酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

与野生型的乌头酸酶(野生型乌头酸酶的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ IDNo.3和4所示)相比，本发明的乌头酸酶突变体具体的氨基酸序列的改变是：M226V(第226位甲硫氨酸变为缬氨酸)，N227Y(第227位天冬酰胺变为酪氨酸)，T376N(第376位苏氨酸变为天冬酰胺)，A377T(第377位丙氨酸变为苏氨酸)，S529P(第529位丝氨酸变为脯氨酸)，I530M(第530位异亮氨酸变为甲硫氨酸)，H580R(第580位组氨酸变为精氨酸)。

本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因的载体、。

本发明还提供含有编码所述乌头酸酶突变体基因、或上述载体的转基因细胞系及工程菌。

本发明还提供编码所述乌头酸酶突变体的基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的应用。

本发明还提供用于PCR特异性扩增编码所述乌头酸酶突变体的基因的引物对，所述引物对为：

正向引物：5′-GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3′

反向引物：5′-GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3′。

本发明进一步提供所述乌头酸酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

(1)从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组DNA中，扩增ACO的编码基因aco；

(2)采用易错PCR技术，以ACO的编码基因aco为模板，扩增获得ACO突变体基因；

(3)将步骤(2)所得易错PCR产物及表达质粒pET28a(+)用Sac I和Not I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至含Kan的LB平板，将平板置37℃恒温培养箱培养，即得构建得到重组ACO基因突变库；

(4)含Kan的LB平板上长出菌落，挑取其中的100个单克隆，转接到含Kan的LB液体培养基中，37℃摇床培养，待菌液OD₆₀₀长至0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导，放回37℃摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定ACO野生型和突变体酶活，挑选酶活力最低的一株，并测定其基因序列(SEQ ID NO.2)。

本发明通过基因工程方法使黑曲霉中乌头酸酶编码基因突变，降低其酶活力，经计算，乌头酸酶突变体的酶活力与野生型蛋白的酶活相比，降低了73％，理论上可提高柠檬酸的产量和/或产率。

附图说明

图1为本发明实施例1中野生型乌头酸酶基因的PCR扩增结果。

图2为本发明实施例5中乌头酸酶突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结果；其中，1为未诱导的菌体经超声破碎后，离心所得上清，2为乌头酸酶野生型蛋白，3为乌头酸酶突变体蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1 乌头酸酶基因的获得

以1μg黑曲霉(Aspergillus niger)基因组DNA为PCR反应模板，按SEQ ID NO.4的序列设计正向引物ACO-F为5′-GATCGAGCTCATGGGGTGACGCCAGCGA-3′，反向引物ACO-R为5′-GATCGCGGCCGCCATGCATAACGAATATCA-3′。其中，斜体字母部分分别为酶切位点Sac I和NotI。PCR反应在50μl总体积中进行，反应条件为在94℃变性5min后开始循环；94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；再于72℃延伸10min。取3μl PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。取100μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。

实施例2 野生型乌头酸酶基因表达载体的构建

实施例1中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后，与同样用Sac I和Not I内切酶消化的pET-28a(+)质粒(Novagen公司)进行连接反应，构建的载体被称为pET-ACO，然后用连接产物pET-ACO混合物转化大肠杆菌DH5-α(购自promega公司)，并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(Promega公司)。

实施例3 易错PCR扩增黑曲霉乌头酸酶基因

利用Taq DNA聚合酶不具有3′-5′校对功能的性质，在高镁离子浓度(5-9mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(1.5-3.5mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库。实验中最优的突变率约为0.6％。

易错PCR反应体系(100μl)：

PCR反应程序为：96℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，75℃延伸2min，共45个循环；最后75℃延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5μl产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检验，-20℃保存备用。

实施例4 pET-ACOM表达载体的构建

实施例3中PCR产物经限制性内切酶Sac I和Not I双酶切消化后，与用Sac I和NotI内切酶消化的pET-28a(+)质粒进行连接反应，构建的载体被命名为pET-ACOM，然后用连接产物pET-ACOM混合物转化大肠杆菌DH5α，构建转化菌体突变库。

实施例5 构建表达突变库及高产量突变体的筛选

提取转化菌体库的质粒，分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得转化子约100株，构建表达突变体库。挑取突变菌株至含kan的LB培养基(150μl/孔)的96孔板中，37℃、150rpm培养，待OD值达0.6-0.8，加入IPTG(终浓度0.2mmol/L)，继续培养12h，收集菌体。超声破碎菌体，离心收集上清，并进行酶活测定。检测酶活性最低的菌株，并挑选其克隆，并提取质粒，测定与野生型乌头酸酶对应的基因序列。测定的基因序列为SEQ ID NO.2所示，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。乌头酸酶突变体蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图2所示。

乌头酸酶的酶活检测：按照乌头酸酶活性检测试剂盒(Biovision公司)进行。经计算，野生型蛋白的酶活为6.3u/L，突变体蛋白的最低酶活为1.7u/L，结果表明，通过易错PCR对ACO进行改造，获得了酶活力降低了73％的突变株。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.乌头酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在提高发酵生产柠檬酸产量中的应用。