CN107750273A - 用于改善精细化学品生产的重组微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组微生物、生产丙氨酸的方法和所述重组微生物用于发酵生产丙氨酸的用途。

Description

用于改善精细化学品生产的重组微生物
发明领域
本发明涉及重组微生物、用于生产丙氨酸的方法和重组微生物用于发酵生产丙氨酸的用途。
发明描述
氨基酸是具有羧基和氨基的有机化合物。最重要的氨基酸是α-氨基酸，其中氨基的位置紧挨着羧基。蛋白质基于α-氨基酸。
丙氨酸因为它已经被用作食品、饲料和制药工业中的添加剂而吸引了相当大的兴趣。而且丙氨酸是用于工业生产N,N-双(羧甲基)-丙氨酸三钠盐(MGDA,商品名Trilon M)的原料，该三钠盐是强的螯合剂,在溶解有机和无机污垢方面显示优良的性能(WO94/29421、WO2012/150155)。根据标准的OECD试验，Trilon M级是可容易地生物降解的。由于极好的生态学和毒理学谱,Trilon M级特别地适于在用于最终用户的产品中使用并且对这样的可生物降解的复杂助剂的需求在不断地增长。
可以通过采用棒杆菌(Hermann,2003:Industrial production of amino acidsby Coryneform bacteria,J.of Biotechnol,104,155-172.)或大肠杆菌(WO2007/120198、WO2008/119009)发酵来生产丙氨酸。
在大肠杆菌中生产丙氨酸是更加有效的并且作为化学工业的原料被广泛地用于丙氨酸的工业生产。由于化学工业对于丙氨酸的需求在增大,需要改善发酵生产丙氨酸的生产力。
本发明的一个目标是提供可以被用于具有高的产率和效率的丙氨酸的发酵生产中的微生物。
发明详述
对实现上述目标的一个贡献是由大肠杆菌(E.coli)家族的重组微生物提供的，其相比于相应的参比微生物,具有gcvTHP操纵子的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
术语“更高的”、“增加的”或“增强的”，例如关于酶的表达和/或活性或产率或生产力,意指显著地更高的、增加的或增强的表达和/或活性或产率或生产力。
术语“酶的减小的、受抑制的或缺失的表达和/或活性”意指各自的酶的显著减小的、受抑制的或缺失的表达和/或活性并且也包括检测不到的表达和/或活性。
令人惊奇地,已经发现具有引入的、增加的或增强的由gcvTHP操纵子编码的蛋白质活性和/或表达的微生物，当相比于不包含引入的、增加的或增强的相应的gcvTHP操纵子活性和/或表达的相同的微生物时，在发酵生产中具有更高的产率和/或生产力。
因此,本发明的一个实施方式是重组微生物，相比于相应的参比微生物，该重组微生物包含引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达，该gcvTHP操纵子为编码甘氨酸切割复合体的硫辛酰蛋白的gcvH基因、编码磷酸吡哆醛依赖性甘氨酸脱羧酶的gcvP基因和编码四氢叶酸依赖性氨甲基转移酶的gcvT基因中的每一个编码，并且相比于相应的参比微生物，该重组微生物在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。
如本文中所用的，术语“参比微生物”意指与重组微生物比较的对照微生物。除了将要分析的差别以外，这种参比微生物基本上具有与重组微生物相同的基因型。优选地，参比微生物是重组微生物所起源的株系。例如,一种基因已经被引入野生型微生物中,因而产生重组微生物,在这种情况下，野生型将会是这种重组微生物的合适的参比微生物。也可能的是:把进一步的突变引入到重组微生物A中，从而产生重组微生物B。重组微生物A于是将会是重组微生物B的合适的参比微生物。如果将要比较重组微生物和相应的参比微生物的性能，则使这两种微生物在基本上相同的条件下生长。
对于技术人员来说显而易见的是:还可以使用具有增加的丙氨酸产率和/或生产力的微生物用于生产与丙氨酸密切相关的其它代谢物,例如作为丙氨酸途径中的中间体的代谢物、与丙氨酸途径共享共同的中间体的代谢物或作为使用丙氨酸作为它们的途径中的中间体代谢物的代谢物。还可以通过增加或引入某些酶活性或通过敲除或降低某些酶活性，容易地改变本发明所述的微生物使其具有这样有关的代谢物增加的产率/或生产力。
这样的代谢物例如是丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和亮氨酸。
例如,为了使用本发明所述的重组微生物来生产琥珀酸,基因ldh、pfl、pta和adhE必须被敲除并且PEP羧化酶基因和/或丙酮酸羧化酶基因必须被引入本发明所述的微生物的基因组中。相应的途径和必需的突变例如被描述在Zhang等人(2009),PNAS(106)pp20180-20185中。
因此,本发明的另一个实施方式是重组微生物，其相比于相应的参比微生物，包含引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达，并且其相比于相应的参比微生物，在发酵生产中具有更高的丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸产率/或生产力。
在一些实施方式中,所述的微生物是原核细胞。合适的原核细胞包括革兰氏阳性的、革兰氏阴性的和革兰氏可变的细菌细胞,优选革兰氏阴性的。
因此,可以被用于本发明中的微生物包括但是不限于氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、浅井氏葡糖杆菌(Gluconobacter asaii)、德尔马瓦无色杆菌(Achromobacter delmarvae)、粘无色杆菌(Achromobacter viscosus)、乳无色杆菌(Achromobacter lacticum)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、肿胀节杆菌(Arthrobacter tumescens)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、烃谷氨酸节杆菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、天牛金杆菌(Aureobacterium saperdae)、印度固氮菌(Azotobacter indicus)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、分叉短杆菌(Brevibacterium divaricatum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、球形短杆菌(Brevibacterium globosum)、暗褐短杆菌(Brevibacterium fuscum)、酮戊二酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、创伤短杆菌(Brevibacterium helcolum)、极小短杆菌(Brevibacterium pusillum)、需土短杆菌(Brevibacterium testaceum)、玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)、Brevibacterium immariophilium、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、原玻璃蝇短杆菌(Brevibacterium protopharmiae)、嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetophilum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、帚石南棒杆菌(Corynebacteriumcallunae)、嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、外来黄杆菌(Flavobacterium peregrinum)、染色黄杆菌(Flavobacterium fucatum)、橙色黄杆菌(Flavobacterium aurantinum)、莱茵黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)、塞沃尼黄杆菌(Flavobacterium sewanense)、短黄杆菌(Flavobacterium breve)、脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、微球菌属物种(Micrococcus sp.)CCM825、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、不透明诺卡氏菌(Nocardia opaca)、粗糙诺卡氏菌(Nocardia rugosa)、Planococcus eucinatus、雷特格氏变形杆菌(Proteus rettgeri)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、成黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)、产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、卵状假单胞菌(Pseudomonas ovalis)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovolans)、霉味假单胞菌(Pseudomonas mucidolens)、睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、红球菌属物种ATCC 15592、红球菌属物种ATCC 19070、脲芽孢八叠球菌(Sporosarcina ureae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、梅氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、干酪弧菌(Vibriotyrogenes)、马杜拉放线菌(Actinomadura madurae)、紫产色链霉菌(Actinomycesviolaceochromogenes)、丘疹性北里孢菌(Kitasatosporia parulosa)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、浅黄链霉菌(Streptomyces flavelus)、浅灰链霉菌(Streptomyces griseolus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄色链霉菌(Streptomyces olivaceus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)、抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)、可可链霉菌(Streptomyces cacaoi)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、解硫胺素芽胞杆菌(Bacillus thiaminolyticus)、弗氏埃希氏菌(Escherichia freundii)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、乙型副伤寒杆菌(Salmonella schottmulleri)、柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citri)等等。
在一些实施方式中,所述的微生物是真核细胞。合适的真核细胞包括酵母细胞,例如酵母菌属物种，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、汉逊酵母菌属物种，例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、裂殖酵母菌属物种，例如粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces spec)，例如乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marisianus)，耶氏酵母属，如解脂耶氏酵母，毕赤酵母属，如甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、树干毕赤酵母(Pichia stipites)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、接合酵母菌属物种，例如鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)和拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、念珠菌属物种，例如博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、产朊念珠菌(Candida utilis)、Candidafreyschussii、光滑念珠菌(Candida glabrata)和发噪声念珠菌(Candida sonorensis)、许旺酵母菌属物种(Schwanniomyces spec)例如许旺酵母菌(Schwanniomycesoccidentalis)、艾瑞克霉属物种(Arxula spec)例如Arxula adeninivorans、欧伽塔酵母菌属物种(Ogataea spec)例如小欧伽塔酵母菌(Ogataea minuta)、克雷伯氏菌属物种，例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)。
许多细菌工业的菌株特别地适用于本文中公开的方法中。在一些实施方式中,所述的微生物是棒杆菌属的物种,例如嗜乙酰棒杆菌(C.acetophilum)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、美棒杆菌(C.callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(C.acetoacidophilum)、乙酰谷氨酸棒杆菌(C.acetoglutamicum)。在一些实施方式中,所述的微生物是芽孢杆菌属的物种,例如苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、扁豆芽孢杆菌(B.lentils)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、短芽孢杆菌(B.brevis)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkaophius)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。在一些实施方式中,所述的微生物是欧文氏菌属的物种,例如嗜夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、点状欧文氏菌(E.punctata)和土欧文氏菌(E.terreus)。在一些实施方式中,所述的微生物是埃希氏菌属的物种,例如大肠杆菌。在其它实施方式中，所述的微生物是泛菌属的物种,例如柠檬泛菌(P.citrea)或成团泛菌(P.agglomerans)。在还有其它实施方式中,所述的微生物是链霉菌属的物种,例如产二素链霉菌(S.ambofaciens)、不产色链霉菌(S.achromogenes)、除虫链霉菌(S.avermitilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、生金色链霉菌(S.aureofaciens)、金色链霉菌(S.aureus)、杀真菌链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)或浅青紫链霉菌(S.lividans)。在进一步的实施方式中,所述的微生物是发酵单胞菌属的物种,例如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)。在进一步的实施方式中,所述的微生物是红球菌属的物种,例如混浊红球菌(R.opacus)。
优选地，所述的微生物选自肠杆菌科,优选埃希氏菌属,例如大肠杆菌(E.coli),优选菌株大肠杆菌W,其对应于DSMZ 1116,后者对应于ATCC9637。
除了引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达之外,本发明所述的重组微生物还可以进一步包含(a)减小的、受抑制的或缺失的编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的活性和/或表达,其中与相应的参比微生物比较，测定了pflB基因活性和/或表达的减小、受抑制或缺失。
除了引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达之外,本发明所述的重组微生物还可以进一步包含(b)编码双功能性乙醛-辅酶A脱氢酶/铁依赖性醇脱氢酶/丙酮酸-甲酸裂合酶钝化酶(deactivase)的adhE基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达,其中与相应的参比微生物比较，测定了adhE基因活性和/或表达的减小、受抑制或缺失。
除了引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达之外,本发明所述的重组微生物还可以进一步包含(c)编码NAD依赖性的发酵性的D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达,其中与相应的参比微生物比较，测定了ldhA基因活性和/或表达的减小、受抑制或缺失。
除了引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达之外,本发明所述的重组微生物还可以进一步包含(d)编码磷酸乙酰转移酶的pta基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达,其中与相应的参比微生物比较，测定了pta基因活性和/或表达的减小、受抑制或缺失。
除了引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达之外,本发明所述的重组微生物还可以进一步包含(e)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达,其中与相应的参比微生物比较，测定了frdA基因的活性和/或表达的减小、受抑制或缺失。
除了引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达之外,本发明所述的重组微生物还可以进一步包含(f)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达,其中与相应的参比微生物比较，测定了alaD基因活性和/或表达的增加或增强。
优选地,包含引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子活性和/或表达的本发明所述的重组微生物另外具有选自由下列组成的组的特征中的至少两个,更优选地至少三个,甚至更优选地至少四个,甚至更优选地至少五个,最优选地全部特征:
(a)编码丙酮酸甲酸裂合酶I的pflB基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达，和
(b)编码双功能性乙醛辅酶A脱氢酶/铁依赖性醇脱氢酶/丙酮酸-甲酸裂解酶钝化酶)的adhE基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达，和
(c)编码NAD依赖性的发酵性D-乳酸脱氢酶的ldhA基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达，和
(d)编码磷酸乙酰转移酶的pta基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达，和
(e)编码延胡索酸还原酶的frdA基因的减小的、受抑制的或缺失的活性和/或表达，和
(f)编码丙氨酸脱氢酶的alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达,
其中与相应的参比微生物比较，测定了基因活性和/或表达的减小、抑制、缺失、增加或增强。
alaD基因可以来源于任何生物体或可以是由人设计的合成基因,例如为了在本发明所述的重组微生物中表达，对其密码子使用进行了优化或者针对酶活性对其进行了优化,例如其具有改善的Vmax或Km。优选地，alaD基因来源于芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、盐芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属中的一种的微生物。在一种更加优选的实施方式中，alaD基因来源于土芽孢杆菌属的微生物。在一种最优选的实施方式中,alaD基因来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。
在一种优选的实施方式中，为了在本发明所述的重组微生物中表达，已经对alaD基因进行了密码子优化。
本发明所述的微生物可以进一步包含遗传修饰,例如突变、敲除或增强的或引入的酶活性，其进一步改善丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸的产率和/或生产力。例如,本发明所述的微生物可以进一步包含来自大肠杆菌的ygaW基因或其同源物或功能等同物的增强的或增加的表达和/或活性，近来已经描述了当被过度表达时，ygaW基因改善微生物的丙氨酸生产力(WO2012/172822)。
在另一种实例中,本发明所述的微生物可以另外包含编码硫辛酰胺脱氢酶蛋白质的lpd基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
在进一步的实例中,本发明所述的微生物可以另外包含在申请PCT/IB2014/064426和PCT/IB2014/066686中具体说明和详细描述的并且对丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸有益的基因中的任意一种、其任何组合或全部。
在进一步的实施方式中，在本发明所述的重组微生物中具有引入的、增加的或增强的活性和/或表达的为编码甘氨酸切割复合体的硫辛酰蛋白的gcvH基因、编码磷酸吡哆醛依赖性甘氨酸脱羧酶的gcvP基因和编码四氢叶酸依赖性氨甲基转移酶的gcvT基因中的每一个编码的gcvTHP操纵子选自由下列组成的组:
(i)包含SEQ ID NO:51的序列的核酸分子,或
(ii)与SEQ ID NO:51的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子,或
(iii)在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下，与具有SEQ ID NO:51的核酸分子杂交的核酸分子,或
(iv)编码SEQ ID NO:46、48和50的多肽中的每一个的核酸分子或
(v)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:46的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽和与SEQ ID NO:48的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽以及与SEQ ID NO:50的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽中的每一个,
其中由(ii)、(iii)或(v)编码的多肽具有分别具有SEQ ID NO:46、48或50的多肽的活性的至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％。
包含引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子表达和/或活性的本发明所述的重组微生物可以进一步包含lpd基因，该基因例如可以具有SEQ ID NO:1或3的序列、与SEQ IDNO:1或3的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子或在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下与SEQ IDNO:1或3的核酸分子杂交的核酸分子,每一种核酸编码SEQ ID NO:2或4的多肽或编码与SEQID NO:2或4的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽,其中所述的多肽具有至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％的具有SEQ ID NO:2或4的多肽的活性。
包含gcvTHP操纵子的引入的、增加的或增强的表达和/或活性的本发明所述的重组微生物可以进一步包含上面根据(a)至(f)所定义的特征中的任意一个、两个、三个、四个、五个或全部,其中pflB基因选自由下列组成的组:
(A)包含SEQ ID NO:5的序列的核酸分子,或
(B)与SEQ ID NO:5的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子,或
(C)在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下，与具有SEQ ID NO:5的核酸分子杂交的核酸分子，或
(D)编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子,或
(E)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽,
其中由(B)、(C)或(E)编码的多肽具有至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％的具有SEQ ID NO:6的多肽的活性，并且
其中adhE基因选自由下列组成的组:
(F)包含SEQ ID NO:7的序列的核酸分子,或
(G)与SEQ ID NO:7的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子,或
(H)在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下，与具有SEQ ID NO:7的核酸分子杂交的核酸分子,或
(I)编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子,或
(J)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽,
其中由(G)、(H)或(J)编码的多肽具有至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％的具有SEQ ID NO:8的多肽的活性，并且
其中ldhA基因选自由下列组成的组:
(K)包含SEQ ID NO:9的序列的核酸分子,或
(L)与SEQ ID NO:9的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子,或
(M)在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下，与具有SEQ ID NO:9的核酸分子杂交的核酸分子,或
(N)编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子,或
(O)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽,
其中由(L)、(M)或(O)编码的多肽具有至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％的具有SEQ ID NO:10的多肽的活性，并且
其中pta基因选自由下列组成的组:
(P)包含SEQ ID NO:11的序列的核酸分子,或
(Q)与SEQ ID NO:11的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子,或
(R)在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下，与具有SEQ ID NO:11的核酸分子杂交的核酸分子,或
(S)编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子,或
(T)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽,
其中由(Q)、(R)或(T)编码的多肽具有至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％的具有SEQ ID NO:12的多肽的活性，并且
其中frdA基因选自由下列组成的组:
(U)包含SEQ ID NO:13的序列的核酸分子,或
(V)与SEQ ID NO:13的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子,或
(W)在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下，与具有SEQ ID NO:13的核酸分子杂交的核酸分子,或
(X)编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子,或
(Y)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:14的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少96％、至少98％或至少99％同源性的多肽,
其中由(V)、(W)或(Y)编码的多肽具有至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％的具有SEQ ID NO:14的多肽的活性，和
其中alaD基因选自由下列组成的组:
(Z)包含SEQ ID NO:15的序列的核酸分子,或
(AA)与SEQ ID NO:15的核酸分子具有至少80％,优选地至少85％例如至少90％,更优选地至少95％例如至少96％,甚至更优选地至少97％例如至少98％,最优选地至少99％同一性的核酸分子,或
(BB)在中等严格条件下,更优选地在高严格条件下,最优选地在极高的严格条件下，与具有SEQ ID NO:15的核酸分子杂交的核酸分子,或
(CC)编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子,或
(DD)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:16的多肽具有至少60％，优选地至少70％例如至少75％,更优选地至少80％例如至少85％,甚至更优选地至少90％例如至少95％,最优选地至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽,
其中由(AA)、(BB)或(DD)编码的多肽具有至少10％、20％，优选地至少30％或50％,更优选地至少60％或70％,甚至更优选地至少75％、80％、85％或90％,最优选地至少95％的具有SEQ ID NO:16的多肽的活性。
本发明的另外的实施方式是包含上面所定义的本发明的一种或更多种重组微生物的组合物。所述的组合物可以进一步包含允许本发明所述的重组微生物生长的培养基。所述的培养基可以另外包含碳源例如己糖、戊糖或多元醇例如蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、棉子糖、木糖、阿拉伯糖、木酮糖、甘油、甘露糖醇、阿糖醇、木糖醇、淀粉、纤维素、木质纤维素或其组合。优选地，所述的碳源是葡萄糖或蔗糖,更优选地所述的碳源是葡萄糖。
在一种优选的实施方式中，所述的组合物包含本发明所述的微生物和NBS培养基、AM1培养基或PPM01培养基。更优选地，所述的组合物进一步包含碳源,优选地糖。这些培养基的成分是技术人员已知的。
优选地，NBS培养基每升包含:
1-5g,优选地3.5g KH2PO4和
1-10g,优选地5.0g和
1-5g,优选地3.5g和
0.1-1g,优选地0.25g和
5-25mg,优选地15mg和
0.1-1mg,优选地0.5mg硫胺素和
0.1-5ml,优选地1ml痕量金属储备液,
其中痕量金属储备液每升包含0.5-5g,优选地1.6g FeCL3–6H2O；0.05-0.5g,优选地0.2g CoCl2–6H2O；0.01-0.5g,优选地0.1g CuCl2-2H2O；0.1-0.5g,优选地0.2g ZnCl2；0.05-0.5g,优选地0.2g NaMoO4–2H2O；0.001-0.1g,优选地0.05g H3BO3；0.01-1M,优选地0.1M HCL。
优选的在NBS培养基中的碳源是葡萄糖或蔗糖,优选地2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。
优选地AM 1培养基每升包含0.1-10mM,优选地1mM甜菜碱(betain)溶液，
1-10g,优选地2.6g和
0.1-5g,优选地0.87g和
0.05-2.5g,优选地0.15g KCl和
0.05-5g,优选地0.37g和
0.1-5ml,优选地1ml痕量金属储备液,
其中痕量金属储备液每升包含0.01-1M,优选地0.12M HCL、1-5g,优选地2.4gFeCL3-6H2O；0.1-1g,优选地0.3g CoCl2-6H2O；0.1-1g,优选地0.21g CuCl2-2H2O；0.1-1g,优选地0.3g ZnCl2；0.1-1g,优选地0.27g NaMoO4–2H2O；0.01-0.5g,优选地0.068g H3BO3和0.1-1g,优选地0.5g MnCl2–4H2O以及任选地1-30g,优选地15g(NH4)2SO4。
优选的在AM 1培养基中的碳源是葡萄糖或蔗糖,优选地2％-18％葡萄糖或2％-16％蔗糖。
优选地，PPM01培养基每升包含:
0.05–5g,优选地0.37g和
0.1-10g,优选地1g和
0.05-5g,优选地0.46g甜菜碱和
0.001-0.5g,优选地0.05g氰钴胺素(B12)和
1-10g,优选地3.74g和
0.1-5ml,优选地1ml痕量金属储备液,
其中痕量金属储备液每升包含10-100mM,优选地60mM硫酸、1-10g,优选地3.48g(NH4)2Fe(II)(SO4)2-7H2O；0.1-1g,优选地0.35g CoSO4-7H2O；0.1-1g,优选地0.31g CuSO4-5H2O；0.1-5g,优选地0.63g ZnSO4-7H2O；0.1-1g,优选地0.27g MnSO4-H2O；0.01-1g,优选地0.07g NaMoO4-2H2O和0.1-5g,优选地0.43g H3BO3。
优选的在PPM01培养基中的碳源是葡萄糖一水合物,优选地每升培养基10-500g,更优选地140g葡萄糖一水合物。
本发明的另外的实施方式是用于生产具有增强的丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸的产率或生产力的重组微生物的方法,其包括下列步骤:
(I)在微生物中引入、增加或增强gcvTHP操纵子或上面根据(i)至(v)所定义的gcvTHP操纵子的一种或更多种活性和/或表达；和
(II)生产、鉴定和分离与没有引入的、增加的或增强的gcvTHP操纵子或上面根据(i)至(v)所定义的gcvTHP操纵子的活性和/或表达的相应微生物比较，具有增强的丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸的产率或生产力的重组微生物。
在一种优选的用于生产本发明的重组微生物的方法的实施方式中，所述的方法进一步包括使例如正如上面根据(A)至(Y)所定义的pflB基因、adhE基因、ldhA基因、pta基因或frdA基因中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部的活性和/或表达减小、受抑制或缺失的步骤，，和/或引入、增加或增强例如如上面根据(Z)至(DD)所定义的alaD基因活性和/或表达的步骤。
一种更加优选的用于生产本发明的重组微生物的方法包括使所有pflB基因、adhE基因、ldhA基因、pta基因和frdA基因的活性和/或表达减小、受抑制或缺失的步骤以及引入、增加或增强alaD基因和gcvTHP操纵子活性和/或表达的步骤。
用于生产本发明的重组微生物的方法可以进一步包括引入、增加或增强lpd基因活性和/或表达的步骤。
此外，用于生产本发明的重组微生物的方法可以进一步包括在申请PCT/IB2014/064426和PCT/IB2014/066686中具体说明和详细描述的减小、抑制或缺失附加基因的步骤并且其中所述的减小、抑制或缺失对丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸的生产是有益的。
此外，用于生产本发明的重组微生物的方法可以进一步包括在申请PCT/IB2014/064426和PCT/IB2014/066686中具体说明和详细描述的引入、增加或增强附加基因的活性和/或表达的步骤并且其中所述活性和/或表达的引入、增加或增强对丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸的生产是有益的。
在用于生产本发明的重组微生物的方法的一个实施方式中，所述的微生物选自由下列组成的组:棒杆菌属的物种例如嗜乙酰棒杆菌(C.acetophilum)、谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、美棒杆菌(C.callunae)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(C.acetoacidophilum)、乙酰谷氨酸棒杆菌(C.acetoglutamicum)；芽孢杆菌属的物种例如苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、扁豆芽孢杆菌(B.lentils)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、短芽孢杆菌(B.brevis)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkaophius)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)；欧文氏菌属物种例如嗜夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、点状欧文氏菌(E.punctate)、土欧文氏菌(E.terreus)；埃希氏菌属物种例如大肠杆菌(E.coli)；泛菌属物种例如柠檬泛菌(柠檬泛菌)、成团泛菌(P.agglomerans)；链霉菌属物种例如产二素链霉菌(S.ambofaciens)、不产色链霉菌(S.achromogenes)、除虫链霉菌(S.avermitilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、生金色链霉菌(S.aureofaciens)、金色链霉菌(S.aureus)、杀真菌链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)、浅青紫链霉菌(S.lividans)；发酵单胞菌属物种例如运动发酵单胞菌(Z.mobilis)或解脂发酵单胞菌(Z.lipolytica)和红球菌属物种例如混浊红球菌(R.opacus)。
优选地，所述的微生物选自肠杆菌科,优选埃希氏菌属,例如大肠杆菌(E.coli),优选菌株大肠杆菌W,其对应于DSMZ 1116,后者对应于ATCC9637。
本发明的另外的实施方式是生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸的方法,其包括在允许生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸的条件下，培养上面所定义的一种或更多种重组微生物。
在一些实施方式中,使本发明所包括的重组微生物在分批或连续发酵条件下生长。经典的分批发酵是封闭系统,其中在发酵开始时设定培养基的组成并且在发酵期间不对培养基的组成进行人工改变。分批系统的变型是补料分批发酵。在这种变型中,随着发酵的进展，以增量方式添加底物。当分解代谢物阻遏很可能抑制细胞的代谢作用时以及当希望在培养基中具有有限数量的底物时，可使用补料分批发酵。分批和补料分批发酵是本领域中常见的和熟知的。也在本发明中获得应用的连续发酵是这样的系统，其中把确定的发酵培养基连续地添加到生物反应器中并且同时除去等量的条件培养基(例如包含所要的最终产物)，用于加工。连续发酵一般地把培养物保持在恒定的高密度，其中细胞主要地处于生长期，当时最终产物的生产被增强。连续发酵系统力求保持稳态生长条件。用于使产物形成速率最大化的用于调节连续发酵工艺以及技术的营养物和生长因子是工业微生物学领域中熟知的。
在一些实施方式中,在从大约10℃至大约60℃、从大约15℃至大约50℃、从大约20℃至大约45℃、从大约25℃至大约45℃、从大约30℃至大约45℃以及从大约25℃至大约40℃范围内的温度下进行发酵。在一种优选的实施方式中，温度大约是34℃、35℃或36℃。在一种最优选的实施方式中，温度大约是37℃或38℃。
在一些其它的实施方式中,进行发酵持续一段在大约8小时至240小时、大约8小时至大约168小时、大约10小时至大约144小时、大约15小时至大约120小时或大约20小时至大约72小时范围内的时间。优选地，进行发酵持续大约20小时至大约40小时。
在一些其它的实施方式中,在大约4至大约9的范围内、在大约4.5至大约8.5范围内、在大约5至大约8的范围内或在大约5.5至大约7.5的范围内的pH时进行发酵。优选地，在pH7时进行发酵。
在所述的生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸的方法的一个实施方式中,在包含在1％和30％(w/v)之间的糖、在5％和25％(w/v)之间的糖、在10％和20％(w/v)之间的糖、在12％和18％(w/v)之间的糖的培养基中培养微生物。优选地，在包含在12％和16％(w/v)之间的糖的培养基中培养微生物。
在用于生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸的方法的另一个实施方式中，丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的产率是至少80％例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％或至少85％。优选地，所述的产率是至少86％、至少87％、至少88％、至少89％或至少90％。更优选地，所述的产率是至少90.5％、至少91％、至少91.5％、至少92％、至少92.5％、至少93％、至少93.5％、至少94％或至少94.5％。在一种甚至更优选的实施方式中，所述的产率是至少95％或至少95.5％。在一种最优选的实施方式中,所述的产率是至少96％。产率百分数是根据由培养基中葡萄糖克数产生的产物克数来计算的。因此,当培养基包含100g葡萄糖并且发酵产生98g丙氨酸时,产率将会是98％。
在用于生产丙氨酸的方法的另一个实施方式中，优选地生产L-丙氨酸,其中L-丙氨酸的手性纯度是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％或至少94％。在一种优选的实施方式中，L-丙氨酸的手性纯度是至少95％或至少95.5％。在一种更加优选的实施方式中,L-丙氨酸的手性纯度是至少96％或至少96.5％或至少97％。在一种甚至更优选的实施方式中，L-丙氨酸的手性纯度是至少97.5％、至少98％或至少98.5％例如至少99％。甚至更优选地，L-丙氨酸的手性纯度是至少99.5％或至少99.6％例如至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％。在一种最优选的实施方式中，生产了手性纯的L-丙氨酸。
本发明的另一个实施方式是培养上面所定义的任意一种遗传修饰微生物或使其生长的方法,所述的方法包括给培养基接种一种或更多种遗传修饰的微生物并且在培养基中在上面所定义的条件下培养或生长所述的遗传修饰微生物。
上面所定义的重组微生物或上面所定义的组合物用于发酵生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸的用途是本发明的另外一个实施方式。
根据本发明所述的重组微生物的特征在于：与相应的参比微生物例如野生型比较,由gcvTHP操纵子编码的酶的表达和/或活性被增加了。
在一个实施方式中，基因表达和/或活性的减小是通过基因的去活化作用、突变或敲除实现的。这可以通过使基因的编码区和/或启动子的一部分或全部缺失、通过使基因突变例如插入或缺失一定数目的核苷酸例如导致基因的编码区移码的一个或两个核苷酸、在编码区中引入终止密码子、灭活基因的启动子例如通过使启动子盒(例如核糖体进入端、TATA盒等等)缺失或突变来完成。所述的减小也可以通过降解基因的转录物(例如借助于引入核糖酶、dsRNA、反义RNA或反义寡核苷酸)而实现。所述的基因活性的减小可以通过在细胞中表达特异性地结合靶酶的抗体或适体而实现。用于减少基因表达和/或活性的其它方法是技术人员已知的。
本文中公开的酶的减小的表达和/或活性,特别是由乳酸脱氢酶(ldhA)、丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)、双功能性乙醛-辅酶A脱氢酶/铁依赖性醇脱氢酶/丙酮酸-甲酸裂合酶钝化酶(adhE)、磷酸乙酰转移酶(pta)和/或延胡索酸还原酶(frdA)编码的酶的减少的表达和/或减少的活性可以是与所述的酶在相应的参比微生物例如野生型的微生物中的表达和/或活性比较，表达和/或酶活性减少至少50％,或表达和/或酶活性减少至少90％,或更优选地表达和/或酶活性减少至少95％,或更优选地表达和/或酶活性减少至少98％,或甚至更优选地表达和/或酶活性减少至少99％或甚至更优选地表达和/或酶活性减少至少99.9％。在一种最优选的实施方式中，在本发明所述的微生物中不能检测到酶的表达和/或活性。
本文中公开的增强的或增加的酶的表达和/或活性,特别是增强的或增加的由gcvTHP操纵子编码的酶的表达和/或活性,可以是与所述的酶在相应的参比微生物例如野生型的微生物中的表达和/或活性比较，所述的表达和/或酶活性增加至少25％,或所述的表达和/或酶活性增加至少50％,或更优选地表达和/或酶活性增加至少100％,或更优选地表达和/或酶活性增加至少3倍,例如至少5倍,或甚至更优选地表达和/或酶活性增加至少10倍或甚至更优选地所述的表达和/或酶活性增加至少20倍。
gcvTHP操纵子的表达和/或活性的增加导致与相应的参比微生物比较，在本发明所述的重组微生物中改善的丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸的产率/或生产力。因此，通过测定与相应的参比微生物比较，本发明所述的重组微生物的丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸的产率或生产力，可以测定gcvTHP操纵子的表达和/或活性的增加。用于发酵生产代谢物例如丙氨酸的方法是技术人员已知的并且也被描述在本文中。与在经由相应的参比微生物的发酵中的丙氨酸产率比较，在经由本发明所述的微生物的发酵中，例如丙氨酸的改善的产率是gcvTHP操纵子的表达和/或活性增加的一种量度。
用于测定乳酸脱氢酶(ldhA)表达或活性的方法例如被公开在Bunch等人，“TheldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichiacoli”,Microbiology(1997),第143卷,第187-155页；或在"Methods of EnzymaticAnalysis",第三版,第III卷,第126-133页,Verlag Chemie,Weinheim中的Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer J.and Grassl,M.(1983-1986)；或Enzymes in Industry:Productionand Applications,第二版(2004),Wolfgang Aehle,第23页中。优选的是最后一种方法。
用于测定丙酮酸甲酸裂合酶I(pflB)表达或活性的方法例如被公开在Knappe J,Blaschkowski HP,Grobner P,Schmitt T(1974).“Pyruvate formate-lyase ofEscherichia coli:the acetyl-enzyme intermediate."Eur J Biochem 1974；50(1)；253-63.PMID:4615902中；在KNAPPE,Joachim,等人“Pyruvate Formate‐Lyase ofEscherichia coli:the Acetyl‐Enzyme Intermediate."European Journal ofBiochemistry 50.1(1974):253-263中；在Wong,Kenny K.,等人“Molecular propertiesof pyruvate formate-lyase activating enzyme."Biochemistry 32.51(1993):14102-14110中以及在Nnyepi,Mbako R.,Yi Peng,和Joan B.Broderick.“Inactivation ofE.coli pyruvate formate-lyase:Role of AdhE and small molecules."Archives ofbiochemistry and biophysics 459.1(2007):1-9中。
用于测定双功能性乙醛-辅酶A脱氢酶/铁依赖性醇脱氢酶/丙酮酸-甲酸裂合酶钝化酶(adhE)表达或活性的方法例如被公开在Membrillo-Hernández,Jorge等人“Evolutionof the adhE Gene Product of Escherichia coli from a Functional Reductase to aDehydrogenase GENETIC AND BIOCHEMICAL STUDIES OF THE MUTANT PROTEINS."Journalof Biological Chemistry 275.43(2000):33869-33875中和在Mbako R.Nnyepi,Yi Peng,Joan B.Broderick,Inactivation of E.coli pyruvate formate-lyase:Role of AdhEand small molecules,Archives of Biochemistry and Biophysics,第459卷,发布1,2007年3月1日,第1-9页中。
用于测定磷酸乙酰转移酶(pta)表达或活性的方法例如被公开在Dittrich,Cheryl R.,George N.Bennett,和Ka‐Yiu San.“Characterization of the Acetate‐Producing Pathways in Escherichia coli."Biotechnology progress 21.4(2005):1062-1067中和在Brown,T.D.K.,M.C.Jones-Mortimer,和H.L.Kornberg."The enzymicinterconversion of acetate and acetyl-coenzyme A in Escherichia coli."Journalof general microbiology102.2(1977):327-336中。
用于测定延胡索酸还原酶(frdA)表达或活性的方法例如被公开在Dickie,Peter,和Joel H.Weiner.“Purification and characterization of membrane-bound fumaratereductase from anaerobically grown Escherichia coli."Canadian journal ofbiochemistry 57.6(1979):813-821中；在Cecchini,Gary等人“Reconstitution ofquinone reduction and characterization of Escherichia coli fumarate reductaseactivity."Journal of Biological Chemistry 261.4(1986):1808-1814中或在I.等人“Identification of active site residues of Escherichia colifumarate reductase by site-directed mutagenesis."Journal of BiologicalChemistry266.21(1991):13572-13579中。
用于测定丙氨酸脱氢酶(alaD)表达或活性的方法例如被公开在Sakamoto,Y.,Nagata,S.,Esaki,N.,Tanaka,H.,Soda,K.“Gene cloning,purification andcharacterization of thermostable alanine dehydrogenase of Bacillusstearothermophilus”J Fermen.Bioeng.69(1990):154-158中。
术语“酶的减少的表达”例如包括经由所述的以遗传方式操纵的(例如以遗传方式工程化的)微生物，以比经由相应的参比微生物例如所述微生物的野生型所表达的更低的水平表达酶。用于减少酶的表达的遗传操纵可以包括但是不限于缺失编码所述的酶的基因或其部分、改变或修饰与编码所述酶的基因的表达相关联的调节序列或位点(例如通过除去强启动子或阻抑型启动子)、修饰参与编码所述酶的基因的转录和/或基因产物的翻译的蛋白质(例如调节蛋白、抑制子、增强子、转录激活因子等等)或本领域常规的减少特定基因表达的任何其它常规手段(包括但不限于使用反义核酸分子或其它方法来敲除或阻断靶蛋白的表达)。还有,可以把去稳定化元件引入到mRNA中或引入遗传修饰，导致RNA的核糖体结合位点(RBS)退化。也可以以一种方式改变基因的密码子使用,使得翻译效率和速度降低。
还可以通过引入导致酶活性减少的一种或更多种有害的基因突变来达到酶活性的减少。此外,酶活性的减少也可以包括活化酶的失活(或减少的表达)，所述活化酶是必需的以便活化其活性将要被减少的酶。通过后一种方法，其活性将要被减少的酶优选地被保存在失活状态。
根据本申请的有害突变是在包含启动子和编码区的基因内部的任何突变，其导致由基因的编码区编码的蛋白质的蛋白活性减少或缺失。这样的有害突变包括例如移码、在编码区中引入终止密码子、启动子元件例如TATA盒的阻止转录的突变等等。
具有由gcvTHP操纵子编码的酶的增加的或增强的表达和/或活性的微生物可以天然地发生,即由于自发的突变。可以通过各种技术例如化学处理或放射来修饰微生物，使其具有显著地增加的由一种或更多种所述的基因编码的酶的活性。为此目的,将会通过例如诱变性化学试剂、X-射线或紫外线处理微生物。在随后的步骤中,将会挑选具有由一种或更多种所述的基因编码的酶的增加的表达和/或活性的那些微生物。也能通过同源重组技术获得重组微生物，该同源重组技术旨在把一种或更多种所述的基因替换成编码酶的相应基因,该酶与由野生型基因编码的酶相比，具有增加的表达和/或活性。
按照根据本发明所述的重组微生物的一个实施方式,由gcvTHP操纵子编码的酶的表达和/或活性的增加可以通过修饰gcvTHP操纵子而实现,其中这种/这些遗传修饰优选地是通过扩增所述微生物的基因组中gcvTHP操纵子的拷贝数、通过把自我复制的表达载体上的基因引入到微生物中、通过gcvTHP操纵子的启动子交换为更强的启动子或通过把基因的内源性启动子转变成更强的启动子，例如通过把点突变引入到启动子序列中而实现的。
进一步，可以通过使基因突变来增强gcvTHP操纵子的活性，以便在蛋白质中实现改善基因活性的氨基酸交换。这样的方法是技术人员已知的。
本发明的另一种实施方式一个实施方式是重组微生物，其与相应的参比微生物比较，包含编码四氢叶酸依赖性氨甲基转移酶的gcvT基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，并且与相应的参比微生物比较，在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。
本发明的另一个实施方式是重组微生物，其与相应的参比微生物比较，包含编码甘氨酸切割复合体的硫辛酰蛋白的gcvT基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，并且与相应的参比微生物比较，在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。
本发明的另一个实施方式是重组微生物，其与相应的参比微生物比较，包含编码磷酸吡哆醛依赖性甘氨酸脱羧酶的gcvP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，并且与相应的参比微生物比较，在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。
此外，本发明的另一个实施方式是重组微生物，其与相应的参比微生物比较，包含gcvT基因和gcvH基因或gcvT基因和gcvP基因或gcvH和gcvP基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，并且与相应的参比微生物比较，在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。
此外，本发明的另一个实施方式是重组微生物，其与相应的参比微生物比较，包含gcvTHP操纵子的引入的、增加的或增强的活性和/或表达，在gcvTHP操纵子中可读框gcvT(SEQ ID NO:45)、gcvH(SEQ ID NO:47)、gcvP(SEQ ID NO:49)的顺序被改变了(产生了gcvPHT或gcvHPT或gcvTPH或gcvPTH或gcvHTP操纵子)，其与相应的参比微生物比较，在发酵生产中具有更高的丙氨酸产率和/或生产力。
例如可以通过位点定向的或随机的诱变引入上述基因中的突变,随后通过重组把修饰的基因引入到微生物的基因组中。可以通过PCR使基因序列突变，来产生基因的变体。可以使用“快速改变的位点定向诱变试剂盒”(Stratagene)来进行定向诱变。可以通过“GeneMorph II随机诱变试剂盒”(Stratagene)，在完整编码序列上或仅仅在其部分上进行随机诱变。经由所使用的模板DNA的量，把诱变率设定到所要的突变量。通过单个突变的靶向的组合或通过几个诱变循环的顺序执行，产生了多个突变。
在下面描述了适用于重组,特别是适用于引入突变或缺失序列的技术。
在本文中，这种技术有时也被称为“坎贝尔重组”(Leenhouts等人,Appl EnvMicrobiol.(1989),第55卷,第394-400页)。如本文中所用的,“坎贝尔进”是指原始宿主细胞的转化体，其中全部环状双链DNA分子(例如质粒)已经通过单个同源重组事件整合到染色体中(杂交进事件),并且其有效地导致所述的环状DNA分子的线性化形式插入到与所述的环状DNA分子的第一DNA序列同源的染色体的第一DNA序列中。“坎贝尔进”是指已经被整合到“坎贝尔进”转化体的染色体中的线性化的DNA序列。“坎贝尔进”包含所述的第一同源的DNA序列的复制本，其每一个拷贝包括并且围绕同源重组交叉点的拷贝。
如本文所用的“坎贝尔出”(Campbell out)指“坎贝尔进”转化体的后代细胞，其中在“坎贝尔进”DNA的线性化插入的DNA上所含的第二个DNA序列和与所述线性化插入片段的第二个DNA序列同源的染色体来源的第二个DNA序列之间发生了第二次同源重组事件(杂交出(cross out)事件)，该第二次重组事件导致缺失(投下)一部分整合的DNA序列，但是重要地，还导致一部分(这可以小至单个碱基)整合的被坎贝尔进的DNA保留在染色体中，从而与最初的宿主细胞相比，“坎贝尔出”细胞在染色体中含有一个或多个有意的改变(例如，单个碱基替换、多个碱基替换、插入异源基因或者DNA序列，插入额外一个或多个拷贝的同源基因或者经修饰的同源基因，或者插入包含一个以上的这些上述所列实例的DNA序列)。“坎贝尔出”细胞优选通过对“被坎贝尔进”DNA序列，如枯草芽孢杆菌sacB基因的一部分(希望抛弃该部分)的基因进行反选择得到，所述基因当在存在约5％到10％蔗糖下生长的细胞中表达时是致死的。使用或不使用反选择，通过使用任何可筛选的表型筛选所希望的细胞，可以得到或者鉴定希望的“坎贝尔出”细胞，所述表型为诸如但不限于，菌落形态、菌落颜色、存在或不存在抗生素抗性、(通过聚合酶链式反应)存在或不存在给定的DNA序列、存在或不存在营养缺陷型、存在或不存在酶、菌落核酸杂交、抗体筛选，等等。术语“坎贝尔进”和“坎贝尔出”还可以在多种时态中用作动词来指上述方法。
可以理解导致“坎贝尔进”或“坎贝尔出”的同源重组事件可以在同源DNA序列内的DNA碱基范围内发生，并且因为同源序列将对于该范围的至少部分是相互相同的，所以通常不可能精确地指出哪里发生了交换事件。换句话说，不可能精确地指出哪个序列最初来自插入的DNA，哪个最初来自染色体DNA。此外，第一个同源DNA序列和第二个同源DNA序列通常通过部分非同源区域分开，并且该非同源区域保持放置在“坎贝尔出”细胞的染色体内。
优选地,第一和第二同源的DNA序列长度至少是大约200个碱基对,并且长度可以最高达到几千个碱基对。然而,可以使所述的方法用于更短或更长的序列。例如,第一和第二同源序列的长度范围可以从大约500到2000个碱基,并且通过把第一和第二同源序列排列到大约相同的长度,优选地具有少于200个碱基对的差别以及最优选地，在碱基对中的两个序列中较短的序列至少是较长的序列长度的70％，促进了从“坎贝尔进”中获得“坎贝尔出”。
在一个实施方式中，通过活化gcvTHP操纵子而实现了对由gcvTHP操纵子编码的酶的表达和/或活性的诱导。
正如在本发明的上下文中所使用的那样,必须在它们最广泛的意义上理解术语“丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸”并且它们也包括其盐,例如丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸的碱金属盐,如Na+和K+盐,或碱土金属盐,如Mg2+和Ca2+盐,或铵盐或酸酐。
优选地,在微需氧的条件下生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸。也可以使用需氧或缺氧的条件。
微需氧的意指氧气浓度小于在空气中的氧气浓度。根据一个实施方式，微需氧的意指在5和27mm Hg之间,优选地在10和20Hg之间的氧气压力(Megan Falsetta等人(2011),The composition and metabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms,Frontiers in Microbiology,第2卷,第1至11页)。优选地，采用0.1至1vvm空气流量建立微需氧的条件。
借助于常规技术,例如通过将反应培养基的组分脱气并且通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入二氧化碳或氮气或其混合物以及任选的氢气而保持微需氧的条件，可以建立微需氧的条件。借助于常规技术,例如通过以例如0.1至1或0.2至0.5vvm的流速引入空气或氧气，可以建立需氧条件。如果合适的话,可以在所述的方法中应用稍微超过0.1至1.5巴的压力。
按照根据本发明所述的方法的一个实施方式，可同化的碳源可以是葡萄糖、甘油、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、棉子糖以及其组合。
在一种优选的实施方式中，可同化的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘油或其组合。优选的碳源是葡萄糖、蔗糖、葡萄糖以及蔗糖、葡萄糖和木糖和/或葡萄糖、阿拉伯糖和木糖。按照按照本发明所述的方法的一个实施方式，可同化的碳源可以是蔗糖、甘油和/或葡萄糖。
可同化的碳源的起始浓度,优选地所述的起始浓度，优选地调节到5至250g/l,优选地50至200g/l以及更优选地125至150g/l,最优选地大约140g/l范围的值，并且在培养期间可以保持在所述的范围内。通过添加合适的碱例如气态氨、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N和/或其混合物，可以控制反应培养基的pH。
本发明的另外的实施方式是用于发酵生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,最优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸的方法,其包括下列步骤:
I)使上面所定义的根据本发明所述的微生物在发酵罐中生长和
II)从在I)中得到的发酵液中回收丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸。
根据本发明所述的发酵步骤I)例如可以在搅拌的发酵罐、泡罩塔和环式反应器中进行。关于包括搅拌器类型和几何设计在内的可能的方法类型的综合概述可以在Chmiel:“Bioprozesstechnik:Einführung in die Bioverfahrenstechnik”,第1卷中找到。在根据本发明所述的方法中,可利用的典型的变型是本领域技术人员已知的或例如在Chmiel,Hammes和Bailey:“Biochemical Engineering”中阐明的下列变型:例如分批、补料分批、重复补料分批或连续发酵，有和没有生物量的再循环。取决于生产菌株、可以采用空气、氧气、二氧化碳、氢气、氮气或合适的气体混合物进行鼓泡，以便实现良好的产率(YP/S)。
在方法步骤I)中，特别优选的用于生产丙氨酸、丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸和/或亮氨酸,优选地琥珀酸或丙氨酸,更优选地丙氨酸,最优选地L-丙氨酸的条件是:
可同化的碳源:葡萄糖
温度: 30至45℃
pH: 6.0至7.0
微需氧条件
在方法步骤II)中，从在方法步骤I)中得到的发酵液中回收产物。
通常,回收方法包括把作为所谓的"生物量"的重组微生物从发酵液中分离出来的步骤。用于取出生物量的方法是本领域技术人员已知的,并且包括过滤、沉降、浮选或其组合。因此,例如可以采用离心机、分离器、滗析器、过滤器或在浮选装置中除去生物量。为了达到对有价值的产物的最大回收,洗涤生物量常常是可建议的,例如以渗滤的形式。对方法的挑选取决于在发酵液中的生物量含量和生物量的性质以及还有生物量与有机化合物(即有价值的产物)的相互作用。在一个实施方式中,可以将发酵液灭菌或巴氏灭菌。在进一步的实施方式中,把发酵液浓缩。取决于需要,可以以分批方式或连续地进行这种浓缩。应该这样选择压力和温度范围，使得首先不发生产物损害,其次最小量地使用装置和能量是必需的。特别是针对多级蒸发，熟练地选择压力和温度水平确保能量节约。
回收方法可以进一步包括另外的纯化步骤，其中发酵产品被进一步纯化。然而,如果通过化学反应把发酵产品转变为次级有机产物,则取决于反应类型和反应条件，对发酵产品的进一步纯化可能未必是必需的。为了纯化在方法步骤II)中得到的发酵产品，可以使用本领域技术人员已知的方法,例如结晶、过滤、电渗析和层析。可以借助于离子交换层析进一步纯化所得到的溶液，以便除去不想要的残留离子。
本发明的另外的实施方式是重组表达构建体，其包含在与上面在(i)至(v)中所定义的核酸有效连接的微生物中有功能的启动子。优选地，所述的启动子对于上面在(i)至(v)中所定义的核酸来说是异源的。
本发明的另外的实施方式是重组载体，其包含上面在(i)至(v)中所定义的核酸分子或上面所定义的重组表达构建体。
定义
应该理解:本发明不局限于特定的方法或实验方案。也应该理解:在本文中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式的目的,并且不意欲限定本发明的保护范围，本发明的保护范围将会仅仅由所附的权利要求书限定。必须指出:正如本文中和在所附的权利要求书中所用的那样,除非上下文清楚地以其它方式指令，单数形式“一个”、“和”以及“所述的”包括复数指称在内。因此,例如指称“一个载体”是指一个或更多个载体并且包括本领域技术人员已知的其等同物等等在内。在本文中使用术语“大约”意指大致地、粗略地、在周围或在...区域内。当把术语“大约”和数字范围一起使用时,它通过把边界延长到所提出的数值的上面和下面来修饰那个范围。一般而言,在本文中使用术语“大约”来将所述数值修饰到高于或低于所述数值20％的差异,优选地10％上下(更高或更低)。如本文中所用的,词“或”意指特定的列表中的任意一个成员并且也包括该列表中成员的任何组合在内。当在本说明书中以及在下面的权利要求书中使用词“含有”、“包含”、“包括”、“包括...在内”和“包含...在内”时，意图要它们规定一种或更多种声明的特征、整数、组分或步骤的存在,但是它们不排除一种或更多种其它特征、整数、组分、步骤或其组的存在或添加。为了清楚起见，按照下列定义和使用在说明书中使用的某些术语:
编码区:如本文中所用的，当参照结构基因使用术语“编码区”时，该术语是指核苷酸序列，其编码在作为mRNA分子的翻译结果的新生多肽中发现的氨基酸。在真核生物中,在5'-一侧上编码区的边界是编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”,原核生物也使用三联体“GTG”和“TTG”作为起始密码子。在3'-一侧上，它的边界是指定终止密码子的三种三联体(即TAA、TAG、TGA)中的一种。另外，基因可以包含位于存在于RNA转录物上的序列的5'-端和3'-端上的序列。这些序列被称为“侧翼”序列或区(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5'或3'端)。5'-侧翼区可以包含控制或影响基因转录的调节序列例如启动子和增强子。3'-侧翼区可以包含指导转录终止、转录后的切割和聚腺苷酸化的序列。
互补的:“互补的”或“互补性”是指两个核苷酸序列，其包含在反平行的核苷酸序列中在互补的碱基残基之间形成氢键时，能够彼此配对(通过碱基配对法则)的反平行的核苷酸序列。例如,序列5'-AGT-3'与序列5'-ACT-3'是互补的。互补性可以是“部分的”或“全部的”。“部分的”互补性是根据碱基配对法则，其中一个或更多个核酸碱基是不匹配的。在核酸分子之间“全部的”或“完全的”互补性是根据碱基配对法则，其中每一个核酸碱基都与另一个碱基匹配。在核酸分子链之间的互补度对于核酸分子链之间杂交的效率和强度具有显著的影响。如本文中所用的，核酸序列的“互补序列”是指核苷酸序列，其核酸分子显示与核酸序列的核酸分子完全的互补性。
内源的:“内源的”核苷酸序列是指存在于野生型微生物的基因组中的核苷酸序列。
增强的表达:"增强"或"增加"微生物中核酸分子的表达在本文中被等同地使用并且意指与参比微生物例如野生型比较，在一种微生物中核酸分子的表达水平是更高的。如本文中所用的,术语“增强的”或“增加的”在本文中意指将要被表达的核酸分子的更高的,优选地显著地更高的表达。正如在本文中使用的那样,一种作用剂例如蛋白质、mRNA或RNA的水平的“增强”或“增加”意指相对于在基本上相同的条件下生长的基本上相同的微生物，所述的水平增加了。如本文中所用的,由靶基因表达的一种作用剂,比如例如前RNA、mRNA、rRNA、tRNA和/或由它编码的蛋白产物的水平的"增强"或"增加"，意指相对于合适的参比微生物，所述的水平增加50％或更多,例如100％或更多,优选地200％或更多,更优选地5倍或更多,甚至更优选地10倍或更多,最优选地20倍或更多，例如50倍。可以通过技术工人熟悉的方法测定所述的增强或增加。因此,例如可以通过对蛋白质的免疫学检测来测定核酸或蛋白质数量的增强或增加。此外,可以利用技术例如蛋白质测定、荧光、Northern杂交、核酸酶保护测定、反转录(定量RT-PCR)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)或其它免疫测定和荧光活化细胞分析(FACS)来测定微生物中的特定蛋白质或RNA。取决于诱导的蛋白产物的类型,也可以测定它的活性或对微生物的表型的影响。用于测定蛋白质量的方法是熟练工人已知的。可以提到的实例是:微缩二脲方法(Goa J(1953)Scand JClin Lab Invest 5:218-222)、Folin-Ciocalteau方法(Lowry OH等人(1951)J Biol Chem193:265-275)或测定CBB G-250的吸收(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72:248-254)。
表达:“表达”是指基因产物的生物合成,优选地是指核苷酸序列例如内源性基因或异源基因在细胞中的转录和/或翻译。例如,在结构基因的情形中,表达涉及把结构基因转录成mRNA以及任选地，随后把mRNA翻译成一种或更多种多肽。在其它情况下,表达可以仅仅是指包含RNA分子的DNA的转录。
外来的:术语“外来的”是指通过实验操作被引入到细胞中的任何核酸分子(例如基因序列)，并且它可以包括在该细胞中发现的序列，只要所引入的序列包含某些修饰(例如点突变、存在选择性标记基因等等)并且因此相对于天然存在的序列是不同的。
功能性连接:术语“功能性连接”或“功能性地连接的”等同于术语“有效连接”或“有效连接的”并且应该被理解为意指例如调控元件(例如启动子)与将要被表达的核酸序列以及如果合适的的话，另外的调控元件(比如例如终止子)以如下方式顺序排列，使得每一个调控元件能够完成它的预期功能以允许、修饰、促进或其它方式影响所述的核酸序列的表达。作为同义词，可以使用词语“有效连接”或“有效连接的”。取决于核酸序列相对于有义或反义RNA的排列，表达可能发生。为此目的,不必要求化学意义上的直接连接。遗传控制序列比如例如增强子序列还可以在位置远离它们或实际上来自其它DNA分子的靶序列上发挥它们的功能。优选的排列是其中将要被以重组方式表达的核酸序列位于充当启动子的序列后面的那些排列,使得所述的两个序列彼此共价连接。在一种优选的实施方式中,将要被转录的核酸序列以这样一种方式位于启动子的后面，使得转录起始和本发明嵌合RNA的所要的起始相同。可以借助于惯常的重组和克隆技术产生功能性连接和表达构建体，正如所描述的那样(例如在Maniatis T,Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy等人(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人(1987)Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience；Gelvin等人(编辑)(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,荷兰)中。然而,例如充当具有限制性内切酶的特异性切割位点的接头或充当信号肽的另外的序列也可以位于所述的两个序列之间。插入所述的序列也可以导致融合蛋白的表达。优选地,由调节区例如启动子和将要表达的核酸序列的连接组成的表达构建体可以以载体整合的形式存在或可以被插入基因组中,例如通过转化。
基因:术语“基因”是指与能够以某种方式调节基因表达产物(例如多肽或功能性RNA)的合适的调节序列有效连接的区。基因包括编码区(可读框,ORF)前面(上游)和后面(下游)的DNA的未翻译的调节区(例如启动子、增强子、阻遏子等等)。如本文中所用的，术语“结构基因”意图是意指被转录成mRNA的DNA序列，mRNA然后被翻译成具有特定多肽的特征的氨基酸序列。
基因组和基因组DNA:术语“基因组”或“基因组DNA”是指宿主生物体的可遗传的遗传信息。所述的基因组DNA包括拟核的DNA，而且也包括自我复制的质粒的DNA。
异源的:术语相对于核酸分子或DNA“异源的”是指与第二核酸分子有效连接的或被操纵而变成与第二核酸分子有效连接的核酸分子，在自然界中所述核酸分子不与第二核酸分子有效连接或在自然界中在不同的位置处与第二核酸分子有效连接。包含核酸分子和与其相连的一种或更多种调节性核酸分子(例如启动子或转录终止信号)的异源表达构建体例如是通实验操作而起源的构建体，其中a)所述的核酸分子,或b)所述的调节性核酸分子，或c)这两者(即(a)和(b))没有处于它的自然的(天然的)遗传环境中或者已经通过实验操作而被修饰,修饰的实例是取代、添加、缺失、倒置或插入一个或更多个核苷酸残基。自然的遗传环境是指在原始的生物体中天然的基因组基因座,或是指在基因组文库中的存在。在基因组文库的情形中,核酸分子序列的自然的遗传环境优选地被至少部分地保留了。所述的环境位于核酸序列的侧翼，至少位于一侧并且具有长度至少为50bp,优选地至少为500bp,特别优选地至少为1,000bp,非常特别优选地至少为5,000bp的序列。天然存在的表达构建体-例如天然存在的启动子与相应的基因的组合-当它经由非天然的、合成的“人工”方法比如例如诱变作用而被修饰时，变成了转基因的表达构建体。这样的方法已经被描述了(US 5,565,350；WO00/15815)。例如，与不是这种分子的天然启动子的启动子有效连接的编码蛋白质的核酸分子被认为相对于所述的启动子是异源的。优选地,异源的DNA对于它所被引入其中的细胞不是内源性的或没有天然地结合,但是已经从另一个细胞中获得或已经被合成出来。异源的DNA也包括包含某种修饰的内源性DNA序列，内源性DNA序列的非天然存在的多个拷贝，或DNA序列，其没有和与其物理连接的另一种DNA序列天然结合。一般地,尽管不是必要地,但是异源的DNA编码RNA或蛋白质，所述RNA或蛋白质通常不是由表达它的细胞产生的。
杂交:正如本文中所用的那样如本文中所用的，术语“杂交”包括“核酸分子链与互补链通过碱基配对结合的任何方法”。(J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology,Stockton Press,纽约)。杂交和杂交强度(即在核酸分子之间缔合的强度)受诸如所述的核酸分子之间的互补度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和在核酸分子内部的G:C比率这样的因素影响。正如本文中所用的那样如本文中所用的,参照“熔解温度”使用术语“Tm”。熔解温度是在其下双链的核酸分子群变成半数解离成单链的温度。用于计算核酸分子的Tm的方程是本领域中熟知的。正如由标准的参照所指示的那样,当核酸分子在水溶液中处于1M NaCl下时，可以通过下列方程:Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算Tm值的简单估测值[参见例如Anderson和Young,Quantitative Filter Hybridization,在Nucleic AcidHybridization(1985)中]。其它参照包含更加复杂的计算,为了计算Tm，其考虑了结构以及序列特征。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以在Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,纽约(1989),6.3.1-6.3.6中找到。
合适的杂交条件例如是在这样的条件下杂交，所述条件等同于在50℃下在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4、1mM EDTA中与包含序列的互补序列的至少50个,优选地至少100个,更优选地至少150个,甚至更优选地至少200个,最优选地至少250个连续的核苷酸的核酸分子杂交，在50℃(低严格性)下在2X SSC、0.1％SDS中洗涤。其它合适的杂交条件是在50℃下，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4、1mM EDTA中与包含序列的互补序列的至少50个，优选地至少100个，更优选地至少150个,甚至更优选地至少200个,最优选地至少250个连续的核苷酸的核酸分子杂交，采用在50℃(中等严格性)或65℃(高严格性)下在1X SSC、0.1％SDS中洗涤。其它合适的杂交条件是在50℃下，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4、1mM EDTA中与包含序列的互补序列的至少50个,优选地至少100个,更优选地至少150个,甚至更优选地至少200个,最优选地至少250个连续的核苷酸的核酸分子杂交，采用在65℃(极高的严格性)下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤。
“同一性”:当关于两种或更多种核酸或氨基酸分子的比较而被使用时，"同一性"意指所述的分子序列共享某种程度的序列相似度,所述的序列是部分地相同的。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸分子的同一性百分比(如果涉及核酸序列，在本文中可互换地使用同源性),把所述的序列中的一个写在另一个的下面，用于最佳的比较(例如可以把空位插入到一个蛋白质或一个核酸的序列中，以便产生与另一个蛋白质或另一个核酸的最佳比对)。
然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核酸分子。如果在一个序列中的一个位置与在另一个序列中相应的位置被相同的氨基酸残基或相同的核酸分子占据,则所述的分子在这个位置处是相同的。在两个序列之间的同一性百分比是由所述的序列共享的相同位置数目的函数(即同一性％＝相同的位置数目/位置总数x 100)。因此，当涉及核酸序列时，术语“同源性”和“同一性”被认为是同义词。当涉及氨基酸序列时，术语同一性是指在一种序列中在特定位置处相同的氨基酸,术语同源性是指在一个序列中在特定位置处同源的氨基酸。同源的氨基酸是具有相似的侧链的氨基酸。在本领域中已经定义了具有相似的侧链的氨基酸残基家族。
通过把一个或更多个核苷酸取代、添加或缺失引入到核苷酸序列中，使得一个或更多个氨基酸取代、添加或缺失被引入到所编码的蛋白质中，可以产生编码与本发明的蛋白质同源的蛋白质的核酸分子。可以通过标准技术比如定点诱变和PCR介导的诱变，可以把突变引入到本发明所述的序列之一中。优选地,在一个或更多个预测的非必需氨基酸处进行保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的一种取代。在本领域中已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此,在本发明的蛋白质中的预测的非必需氨基酸残基优选地被来自相同的侧链家族的另一种氨基酸残基取代。
备选地,在另一个实施方式中,可以沿着所有或部分编码序列随机地引入突变,例如通过饱和诱变,并且可以针对本文中描述的相应活性来筛选所得的突变体，以鉴定保留它们活性的突变体。在诱变本发明所述的一种序列以后,可以重组表达编码的蛋白质并且可以使用例如本文中描述的测定法测定蛋白质的活性。
为了确定两个或更多个氨基酸或两个或更多个核苷酸序列的同一性百分比，已经开发了几种计算机软件程序。可以采用例如软件fasta计算两个或更多个序列的同一性，目前以版本fasta 3使用该软件(W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS 85,2444(1988)；W.R.Pearson,Methods in Enzymology 183,63(1990)；W.R.Pearson和D.J.Lipman,PNAS85,2444(1988)；W.R.Pearson,Enzymology 183,63(1990))。另一种用于计算不同序列的同一性的有用的程序是标准的blast程序,其被包括在Biomax pedant软件(Biomax,Munich,德意志联邦共和国)。这个有时不幸地导致次优的结果，因为blast不总是包括主题和查询的完全序列。尽管如此，由于这个程序是非常有效的，可以使用它来比较巨大量的序列。下列设置被典型地用于这样的序列比较:
-p程序名[字符串]；-d数据库[字符串]；默认值＝nr；-i查询文件[文件录入]；默认值＝stdin；-e期望值(E)[真实的]；默认值＝10.0；-m比对观察选项:0＝成对地；1＝查询-锚定的显示同一性；2＝查询-锚定的无同一性；3＝扁平查询-锚定的,显示同一性；4＝扁平查询-锚定的,无同一性；5＝查询-锚定的无同一性和平端；6＝扁平查询-锚定的,无同一性和平端；7＝XML Blast输出；8＝表格式的；9表格式的，带有注释行[整数]；默认值＝0；-o BLAST报告输出文件[文件输出]任选的；默认值＝stdout；-F过滤器查询序列(具有blastn的DUST、具有其它的SEG)[字符串]；默认值＝T；-G打开空位的代价(零引起默认的行为)[整数]；默认值＝0；-E延长空位的代价(零引起默认的行为)[整数]；默认值＝0；-X关于带空位的比对的X降低值(以比特表示)(零引起默认行为)；blastn 30、megablast 20、tblastx 0、所有其它的15[整数]；默认值＝0；-I显示在deflines中GI的[T/F]；默认值＝F；-q对于核苷酸错配的罚分(仅仅blastn)[整数]；默认值＝-3；-r对于核苷酸匹配的奖励(仅仅blastn)[整数]；默认值＝1；-v用来显示(V)的单线描述的数据库序列的数目[整数]；默认值＝500；-b用来显示(B)的比对的数据库序列的数目[整数]；默认值＝250；-f用于扩大命中数的阈值,如果是零，则是默认值；blastp11、blastn 0、blastx 12、tblastn 13；tblastx 13、megablast 0[整数]；默认值＝0；-g执行带空位的比对(对于tblastx是不可用的)[T/F]；默认值＝T；-Q查询要使用的遗传密码[整数]；默认值＝1；-D DB遗传密码(仅仅用于tblast[nx])[整数]；默认值＝1；-要使用的处理器的数目[整数]；默认值＝1；-OSeqAlign文件[文件输出]任选的；-J相信查询defline[T/F]；默认值＝F；-M矩阵[字符串]；默认值＝BLOSUM62；-W词大小,如果是零，则是默认值(blastn 11、megablast 28、所有其它的3)[整数]；默认值＝0；-z数据库的有效长度(对于真实的尺寸，使用零)[真实的]；默认值＝0；-K来自要保留的区的最好的命中数目(默认脱靶,如果推荐使用100的值的话)[整数]；默认值＝0；-P对于多次命中为0,对于单次命中为1[整数]；默认值＝0；-Y检索空间的有效长度(对于真实的尺寸，使用零)[真实的]；默认值＝0；-S查询链以针对数据库进行检索(关于blast[nx]和tblastx)；3是两者,1是顶部,2是底部[整数]；默认值＝3；-T产生HTML输出[T/F]；默认值＝F；-l把数据库检索限制到GI的名单[字符串]任选的；-U使用小写体过滤FASTA序列[T/F]任选的；默认值＝F；-y X以比特表示的无空位延伸的下降值(0.0引起默认行为)；blastn 20、megablast 10、所有其它的7[真实的]；默认值＝0.0；-Z X以比特表示的最后带空位的比对的降低值(0.0引起默认行为)；blastn/megablast50、tblastx、所有其它的25[整数]；默认值＝0；-R PSI-TBLASTN限制点文件[文件录入]任选的；-n MegaBlast检索[T/F]；默认值＝F；-L在查询序列上的位置[字符串]任选的；多次命中的窗口尺寸,如果是零，则是默认值(blastn/megablast 0,所有其它的40[整数]；默认值＝0；-w移码罚分(用于blastx的OOF算法)[整数]；默认值＝0；-t在tblastn中允许的用于连接HSPs的最大的内含子长度(0禁止连接)[整数]；默认值＝0。
通过使用Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法，达到了高质量的结果。因此基于所述的算法的程序是优选的。有利地，可以采用程序PileUp(J.Mol.Evolution.,25,351(1987),Higgins等人,CABIOS 5,151(1989))或优选地采用程序“Gap”和“Needle”(这两者都基于Needleman和Wunsch的算法)(J.Mol.Biol.48；443(1970))以及“BestFit”(其基于Smith和Waterman的算法)(Adv.Appl.Math.2；482(1981))，进行序列的比较。“Gap”和“BestFit”是GCG软件包(Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711(1991)；Altschul等人,(Nucleic Acids Res.25,3389(1997))的一部分,“Needle”是European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)的一部分(Trends in Genetics 16(6),276(2000))。因此优选地，在序列的整个范围上，采用程序“Gap”或“Needle”进行用来测定序列同一性百分比的计算。对于“Needle”，使用下列标准调整用于核酸序列的比较:矩阵:EDNAFULL,空位罚分:10.0,延伸罚分:0.5。对于“Gap”，使用下列标准调整用于核酸序列的比较:空位权重:50,长度权重:3,平均匹配:10.000,平均错配:0.000。
例如一种序列,其被说成与序列SEQ ID NO:1在核酸水平上具有80％同一性，被理解为意指在通过上述程序“Needle”采用上述参数设置与由SEQ ID NO:1代表的序列比较时，具有80％同一性的序列。优选地，在查询序列例如SEQ ID NO:1的全部长度上计算同一性。
分离的:如本文中所用的，术语“分离的”意指经人的手取出并且离开它的原始的天然的环境存在的物质，因此本质上不是自然的产物。分离的物质或分子(例如DNA分子或酶)可以以纯化形式存在或可以存在于非天然环境中，比如例如存在于转基因的宿主细胞中。例如,存在于活细胞中的天然存在的核酸分子或多肽不是分离的,但是与在自然系统中共存的物质中的一些或全部分离的相同的核酸分子或多肽则是分离的。这样的核酸分子可以是载体的一部分和/或这样的核酸分子或多肽可以是组合物的一部分,并且将会是分离的，因为这样的载体或组合物不是它的原始环境的部分。优选地,当相对于核酸分子使用的术语“分离的”，正如在“分离的核酸序列”中那样，是指核酸序列，其被鉴定并且与在它的天然来源中通常与它缔合的至少一种杂质核酸分子分离。分离的核酸分子是以不同于在自然界中发现它时的形式或设置存在的核酸分子。相比之下,非分离的核酸分子是发现处于它们在自然界中存在的状态的核酸分子例如DNA和RNA。例如,在临近的基因附近的宿主细胞染色体上发现了给定的DNA序列(例如基因)；在细胞中发现了RNA序列,例如编码特定的蛋白质的特定的mRNA序列，其呈与编码许多蛋白质的许多其它mRNA的混合物形式。然而,包含例如SEQ ID NO:1的分离的核酸序列例如包括在通常包含SEQ ID NO:1的细胞中的这样的核酸序列，其中所述的核酸序列处在与天然细胞不同的基因组或质粒位置中,或者以其它方式在两侧为与在自然界中发现的不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链或双链形式存在。当将要利用分离的核酸序列来表达蛋白质时,核酸序列将会至少包含有义链或编码链的至少一部分(即核酸序列可以是单链的)。备选地,它可以包含有义和反义链这两者(即核酸序列可以是双链的)。
非编码的:术语“非编码的”是指不编码被表达的蛋白质的部分或全部的核酸分子的序列。非编码序列包括但是不限于增强子、启动子区、3'非翻译区和5'非翻译区。
核酸和核苷酸:术语“核酸”和“核苷酸”是指天然存在的或合成的或人工的核酸或核苷酸。术语“核酸”和“核苷酸”包括呈要么单链要么或双链的、有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸类似物和聚合物或杂交杂合体。除非另有指示,特定的核酸序列也含蓄地包括其保守性地修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确地指示的序列。在本文中，可以把术语“核酸”与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“核酸分子”互换地使用。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸的化学结构中具有修饰的核苷酸,该修饰包括但不限于5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在胞嘧啶环外的胺处的修饰、5-溴-尿嘧啶的取代等等；和2'-位糖修饰,其包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代。短的发夹RNA(shRNA)也可以包含非天然的元件比如非天然的碱基例如ionosin和黄嘌呤,非天然的糖例如2'-甲氧基核糖,或非天然的磷酸二酯键,例如膦酸甲酯、硫代磷酸酯和肽。
核酸序列:短语“核酸序列”是指从5'端到3'端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物。它包括染色体DNA、自我复制的质粒、DNA或RNA的感染性聚合物以及主要地发挥结构作用的DNA或RNA。“核酸序列”也指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词语的连续的列表。在一个实施方式中,核酸可以是“探针”，其是相对地短的核酸,通常长度小于100个核苷酸。常常核酸探针从大约50个核苷酸长到大约10个核苷酸长。核酸的“靶区”是被鉴定为感兴趣的核酸部分。核酸的“编码区”是当被置于合适的调节序列的控制下时，以序列特异性方式被转录和翻译而生成特定的多肽或蛋白质的核酸部分。编码区被说成编码这样的多肽或蛋白质。
寡核苷酸:术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的低聚物或聚合物或其模拟物以及具有非天然地存在的部分的功能相似的寡核苷酸。由于所希望的性质例如增强的细胞摄取、对于核酸靶标的增强的亲和性以及在核酸酶存在时增加的稳定性，相比于天然的形式，这样的修饰或取代的寡核苷酸常常是优选的。寡核苷酸优选地包括通过键(例如磷酸二酯)或取代键相互之间共价偶联的两个或更多个核酸单体。
突出端:“突出端”是在双链寡核苷酸分子的5'-或3'-羟基端上的相对短的单链核苷酸序列(也被称为“延伸”、“突出末端”或“粘性末端”)。
多肽:在本文中术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因产物”、“表达产物”以及“蛋白质”可被互换地使用，是指连续的氨基酸残基的多聚体或寡聚体。
启动子:术语“启动子”或“启动子序列”是等同物的并且如本文中所用的,是指DNA序列，当将其与目的核苷酸序列有效连接的时，能够控制将目的核苷酸序列转录成RNA。启动子位于5'(即上游),邻近于目的核苷酸序列的转录起始位点，它所控制所述目的核苷酸序列的转录成mRNA的目的核苷酸序列的转录起始位点,并且提供用于被RNA聚合酶以及其它用于启动转录的转录因子特异性结合的部位。启动子不包含编码区或5’非未翻译区。启动子例如可以异源于或同源于相应的细胞。如果核酸分子序列来源于外来的物种,或者,如果来自相同的物种,但是从它的原始形态修饰而来，则所述核酸分子序列它“异源于”生物体或第二核酸分子序列。例如,与异源的编码序列有效连接的启动子是指来自与衍生启动子的物种不同的物种的编码序列,或者如果来自相同的物种,不天然地与所述的启动子相关联的编码序列(例如以遗传方式工程化的编码序列或来自不同的生态型或种类物种的等位基因)。合适的启动子可以源自于其中将会发生表达的宿主细胞的基因或源自于这种宿主的病原体。
纯化的:如本文中所用的,术语“纯化的”是指从它们的自然环境中移出的分离的或分开的分子,其是核酸或氨基酸序列。“基本上纯化的”分子至少是60％不含,优选地至少75％不含,以及更优选地至少90％不含天然地与其缔合的其它组分。纯化的核酸序列可以是分离的核酸序列。
重组的:针对核酸分子，术语“重组的”是指通过重组DNA技术产生的核酸分子。该术语也包括像这样不存在于自然界中但是被人修饰、改变、突变或以其它方式操纵的核酸分子。优选地,“重组核酸分子”是在序列方面与天然存在的核酸分子相差至少一个核酸的非天然存在的核酸分子。“重组核酸分子”也可以包括“重组构建体”，其优选地包含有效连接的不天然地按照那个次序存在的核酸分子序列。优选的用于生产所述的重组核酸分子的方法可以包括克隆技术、定向或非定向诱变、合成或重组技术。
显著的增加:例如在酶活性、基因表达、某种产物的生产力或产率方面的增加,所述增加大于测量技术固有的误差界限,优选地在对照细胞中对照酶或表达的活性、表达、生产力或产率、对照细胞的生产力或产率增加大约10％或25％，优选地增加50％或75％,更优选地增加2倍或5倍或更大,甚至更优选地增加大约10倍或更大。
显著的减少:例如在酶活性、基因表达、某种产物的生产力或产率的减少,所述减少大于测量技术所固有的误差界限,优选地减少至少大约5％或10％,优选地减少至少大约20％或25％,更优选地减少至少大约50％或75％,甚至更优选地减少至少大约80％或85％,最优选地减少至少大约90％、95％、97％、98％或99％。
基本上互补的:在它的最广泛的意义上,当在本文中针对核苷酸序列相对于参比或靶核苷酸序列被使用时，“基本上互补的”意指在所述的参比或靶核苷酸序列的基本上互补的核苷酸序列和精确互补序列之间具有一定同一性百分比的核苷酸序列，所述同一性百分比为至少60％,更加理想地至少70％,更加理想地至少80％或85％,优选地至少90％,更优选地至少93％,还更优选地至少95％或96％,仍然还更优选地至少97％或98％,仍然还更优选地至少99％或最优选地100％(在该上下文中，后者等同于术语“相同的”)。优选地在至少19个核苷酸,优选地至少50个核苷酸的长度上,更优选地在核酸序列的全部长度上评估与参比序列的同一性(如果下面没有以其它方式指定的话)。使用默认的GAP分析，采用威斯康星大学的GCG、GAP的SEQWEB应用，基于Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch(1970)J Mol.Biol.48:443-453；正如上面定义的的那样)，进行序列比较。与参比核苷酸序列“基本上互补的”核苷酸序列在低严格性条件，优选地中等严格性条件,最优选地高严格性条件下(正如上面定义的的那样),与所述的参比核苷酸序列杂交。
转基因:如本文中所用的，术语“转基因”是指通过实验操作被引入细胞的基因组中的任何核酸序列。转基因可以是“内源性DNA序列”或“异源的DNA序列”(即“外源DNA”)。术语“内源性DNA序列”是指在被引入的细胞中天然地发现的核苷酸序列，只要相对于天然地存在的序列，它不包含某种修饰(例如点突变、存在选择性标记基因等等)。
转基因的:当涉及生物体时，术语转基因的意指被重组DNA分子转化的,优选地稳定地转化的，该重组DNA分子优选地包含与目的DNA序列有效连接的合适的启动子。
载体:如本文中所用的,术语“载体”是指能够输送与其相连的另一种核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体或“整合载体”,其可以变得被整合到宿主细胞的基因组DNA中。另一种类型的载体是附加型载体,即能够在染色体外复制的质粒或核酸分子。能够指导与其有效连接的基因表达的载体在本文中被称为“表达载体”。在本说明书中，除非以其它方式从上下文中澄清，“质粒”和“载体”可互换地使用。
野生型:针对一种生物体，术语“野生型”、“天然的”或“天然的来源”意指所述的生物体没有被人改变、突变或以其它方式被人操纵。针对多肽或核酸序列,所述的多肽或核酸序列是天然存在的或在至少一种没有被人改变、突变或以其它方式操纵的天然存在的生物体中是可利用的。
野生型的微生物是指微生物，其基因组以与在引入某种基因的遗传修饰以前的状态存在。遗传修饰可以是例如基因或其部分的缺失或点突变或基因的引入。
术语“生产”或“生产力”是本领域公认的并且包括在给定的时间和给定的发酵体积之内形成的发酵产品(例如，丙氨酸)的浓度(例如kg产物/小时/升)。术语“生产效率”包括将要达到特定的生产水平所需要的时间(例如细胞要达到精细化学品的特定输出速率需要花费多长时间)。
术语“产率”或“产物/碳产率”是本领域公认的并且包括碳源转化成产物(即精细化学品)的效率。这一般地被写成例如kg产物/kg碳源。通过增加所述的化合物的产率或生产,增加了在给定量的时间上在给定量的培养物中该化合物的回收的分子或有用的回收分子的数量。
术语“重组微生物”包括这样的微生物，其已经被以遗传方式修饰，使得它与从中衍生它的野生型微生物相比，展示改变的或不同的基因型和/或表型(例如当遗传修饰影响微生物的编码核酸序列时)。重组微生物包含至少一个重组DNA分子。
关于DNA，术语“重组的”是指由人使用重组DNA技术产生的DNA分子。该术语包括不存在于自然界中或不存在于从中衍生DNA的生物体中，但是被人修饰、改变、突变或以其它方式操纵的DNA分子。优选地,“重组DNA分子”是在序列方面与天然存在的核酸分子相差至少一个核苷酸的非天然存在的核酸分子。“重组DNA分子”也可以包括“重组构建体”，其优选地包含有效连接的不天然地按照那个次序存在的核酸分子序列。优选的用于生产所述的重组DNA分子的方法可以包括克隆技术、定向或非定向诱变、基因合成或重组技术。
这样的重组DNA的一种实例是其中已经插入了异源的DNA序列的质粒或与从中衍生重组DNA的基因或启动子比较，已经被突变的基因或启动子已经被突变的质粒。可以借助于本领域中已知的定向诱变技术或通过随机诱变技术比如化学的、紫外线或X射线诱变或适应性进化技术来引入突变。
术语“适应性进化”与术语“代谢性进化”在本文中以同义方式使用并且涉及应用有利于具有目的性状的突变体生长的选择压力。选择压力可以基于不同的培养条件、ATP和生长偶联的选择以及与氧化还原作用有关的选择。可以采用具有系列转移接种的分批发酵或具有相同压力的连续培养来执行选择压力(Dragosits,,M.&Mattanovich,D.Adaptivelaboratory evolution--principles and applications for biotechnology.Microbialcell factories 12,64,doi:10.1186/1475-2859-12-64(2013)；Zhang,X.等人Metabolicevolution of energy-conserving pathways for succinate production inEscherichia coli.Proceedings of the National Academy of Sciences 106,20180-20185,doi:10.1073/pnas.0905396106(2009))。
术语“表达”或“基因表达”意指特定基因或特定的基因载体构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别地意指基因或基因载体构建体转录成mRNA。过程包括DNA的转录并且可以包括所产生的RNA产物的加工。术语“表达”或“基因表达”也可以包括mRNA的翻译以及随即编码蛋白质的合成，即蛋白质表达。
实施例
化学试剂和常用方法
除非以其它方式指示,为了本发明目的所进行的克隆步骤包括按照所描述的那样(Sambrook等人,1989)进行限制性酶切消化、琼脂糖凝胶电泳、核酸的纯化、核酸的连接、细菌细胞的转化、选择和培养。采用激光荧光DNA测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,美国)，使用Sanger技术(Sanger等人,1977)进行重组DNA的序列分析。除非以其它方式描述,化学试剂和试剂是从Sigma Aldrich(Sigma Aldrich,圣路易斯,美国)、Promega(Madison,WI,美国)、Duchefa(Haarlem,荷兰)或Invitrogen(Carlsbad,CA,美国)获得的。限制性内切核酸酶来自New England Biolabs(Ipswich,MA,美国)或Roche DiagnosticsGmbH(Penzberg,德国)。通过Eurofins MWG操纵子(Ebersberg,德国)合成寡核苷酸。
实施例1:
通过失活ackA-pta、adhE、frdABCD和pflB ORF并且通过用alaD基因的密码子优化的变体(alaD-gstear)置换ldhA ORF，把大肠杆菌W(LU17032)工程化，用于L-丙氨酸生产。
通过插入FRT侧翼的卡那霉素抗性盒,随后通过FLP重组除去抗生素抗性盒，使ackA-pta、adhE、frdABCD和pflB ORF失活。
把ldhA基因用alaD-gstear和下游FRT侧翼的zeocin抗性盒代替,最后通过FLP重组除去该zeocin抗性盒。
材料和方法
细菌培养
在Luria-Bertani(LB)液体培养基中或在Luria-Bertani固体培养基中培养大肠杆菌W(LU17032)。偶然地,使克隆在包含10mM蔗糖的M9极限琼脂上传代，以证实W菌株的身份。把抗生素酌情添加到液体和固体培养基中,达到15μg/ml(卡那霉素、氯霉素)、25μg/ml(zeocin)或3μg/ml(四环素)的最终浓度。
Red/ET重组
使用Gene Bridges GmbH的标准方案(www.genebridges.com)进行Red/ET重组。简单来说,使Red/ET-熟练的E.coli大肠杆菌W在30℃有氧地生长到～0.3的OD600nm。通过添加50μl的10％(w/v)L-阿拉伯糖,随后使温度升高到37℃，来诱导红色red基因的表达。从没有被诱发的对照培养物中排除掉阿拉伯糖。在37℃培养35分钟之后，采用冰冷的10％(v/v)甘油洗涤细胞两次并且采用500ng的PCR产品以1.35kV、10μF、600Ω将细胞电穿孔。然后把细胞再悬浮在1ml冰冷的LB培养基中并且使其在37℃有氧生长持续大约1.5小时。然后把培养物铺板在包含15μg/ml卡那霉素(敲除)或25μg/ml zeocin(敲入)的LB琼脂上。
FLP重组
侧翼FRT位点允许在修饰大肠杆菌染色体以后，通过FLP重组除去抗生素抗性标记。FLP重组留下单个FRT位点(34bp)以及短的侧翼序列(每一个大约20bp)，它们在盒的扩增中被用作引物结合位点。
为了进行FLP重组,通过电穿孔把编码FLP重组酶的质粒708-FLPe(表1)引入Red/ET重组体中。使用KanR CmR或ZeoR CmR转化体来接种0.2ml LB培养物,在30℃培育该培养物3小时。然后通过把温度变化到37℃,随后在37℃培养3小时来诱导FLP活性。随后针对CmS和KanS或ZeoS表型筛选从这些培养物中获得的单个菌落。
DNA制备和分析
采用Gentra Puregene酵母/细菌试剂盒B(Qiagen,Hilden,德国)把大肠杆菌基因组DNA(gDNA)从过夜的培养物中分离出来。采用PRECISOR高保真度DNA聚合酶(BioCat,Heidelberg)从模板质粒扩增含有敲除或敲入盒的PCR产物并且采用PCR Extender系统(5PRIME GmbH,Hamburg,德国),按照生产商的推荐，进行分析性PCR反应。使用GeneJET PCR纯化试剂盒或GeneJET凝胶提取试剂盒(Fermentas,St.Leon-Rot,德国)纯化PCR扩增子并且通过GATC BioTech(Konstanz,德国)或BioSpring(Frankfurt am Main,德国)进行测序。
表1.质粒和引物
1.1.ackA-pta基因座-ackA-pta的靶向
把大约500ng的ΔackA-pta PCR构建体(1737bp)电穿孔到Red/ET-proficient的大肠杆菌W细胞中。通过PCR采用基因组特异性的引物，分析了八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。三个克隆进行了FLP重组，其按照在材料和方法中所描述的进行(没有显示数据)。
克隆验证。通过PCR跨越剩余的FRT瘢痕证实了ackA-pta基因座的失活和卡那霉素抗性盒的除去。也通过测序证实了产生正确的PCR信号的一个克隆。
1.2 adhE基因座-adhE的靶向
把大约500ng的ΔadhE PCR构建体(1093bp)电穿孔到Red/ET-proficient的含有ΔackA-pta::FRT修饰的大肠杆菌W细胞中。通过PCR采用基因组特异性的引物，分析了八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。两个克隆进行了FLP重组，其按照在材料和方法中所描述的进行(没有显示数据)。
克隆验证。通过PCR跨越剩余的FRT瘢痕证实了adhE基因座的失活和卡那霉素抗性盒的除去。也通过测序证实了产生正确的PCR信号的一个克隆。
1.3 frd基因座-frdABCD的靶向
把大约500ng的ΔfrdABCD PCR构建体(1093bp)电穿孔到Red/ET proficient含有ΔackA-pta::FRT和ΔadhE::FRT修饰的大肠杆菌W细胞中。通过PCR采用基因组特异性的引物，分析了八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行了FLP重组，其按照在材料和方法中所描述的进行(没有显示数据)。
克隆验证。通过PCR跨越剩余的FRT瘢痕证实了frd基因座的失活和卡那霉素抗性盒的除去。也通过测序证实了产生正确的PCR信号的一个克隆。
1.4 pflB基因座-pflB的靶向
把大约500ng的ΔpflB PCR构建体(1093bp)电穿孔到Red/ET-proficient包含ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT和ΔfrdABCD::FRT修饰的大肠杆菌W细胞中。通过PCR采用基因组特异性的引物，分析了八个KanR转化体的抗性标记盒的正确整合。四个克隆进行了按照在材料和方法中描述的FLP重组(没有显示数据)。
克隆验证。通过PCR跨越剩余的FRT瘢痕证实了pflB基因座的失活和卡那霉素抗性盒的除去。也通过测序证实了产生正确的PCR信号的一个克隆。
1.5 ldhA基因座-alaD-gstear的敲入
把大约500ng的ΔldhA::alaD-gstear PCR构建体(1783bp)电穿孔到Red/ET-proficient包含ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT、ΔfrdABCD::FRT和ΔpflB::FRT修饰的大肠杆菌W细胞中。通过PCR采用基因组特异性的引物，分析了四个ZeoR转化体的抗性标记盒的正确整合。一个克隆进行了如在材料和方法中描述的FLP重组(没有显示数据)。
克隆验证。通过PCR跨越剩余的FRT瘢痕证实了alaD-gstear的整合和zeocin抗性盒的除去。也通过测序证实了产生正确的PCR信号的一个克隆。
实施例2丙氨酸的HPLC检测和定量
使用了下列HPLC方法，用于在细胞培养基中的丙氨酸检测:
柱子:Aminex HPX-87C柱子(Bio-Rad),300×7.8mm,内径，颗粒尺寸9μm
流动相:0.1mol/L的Ca(NO3)2 90％、乙腈10％
流速：0.6mL/分钟
柱温:60℃
检测:折光率检测器
根据上面的方法,可以把在细胞培养物样品基质中主要的估计组分与丙氨酸很好地分离，不干扰丙氨酸的定量。
通过外标校准方法测定了在所述的样品中丙氨酸的数量。注射了包含0.5至10.0g/L丙氨酸的标准样品并且使用峰面积进行校准。校准曲线的线性回归系数是0.9995。
以20μL一次性注射样品。通过Waters LC Millenium软件，使用峰面积计算存在于样品中的数量。
实施例3葡萄糖、琥珀酸、乳酸、甲酸、乙酸和乙醇的HPLC检测和定量
使用的HPLC方法
柱子:Aminex HPX-87H柱子(Bio-Rad),300×7.8mm,内径，颗粒尺寸9μm
流动相:H2SO4 4mM
流速：0.4mL/分钟
柱温:45℃
检测:折光率检测器
通过外标校准方法测定了分析物的量。注射包含0.1至38.0g/L葡萄糖、0.05至10.0g/L的琥珀酸盐、乳酸盐、甲酸盐、乙酸盐和乙醇的标准样品并且使用峰面积进行校准。所有的六个校准曲线的线性回归系数都好于0.999。
以20μL一次性注射样品。通过Waters LC Millenium软件，使用峰面积计算存在于样品中的数量。
实施例4:来源于实施例1的大肠杆菌W茎(stem)的代谢性进化，用于改善的丙氨酸生产
使用被称为大肠杆菌Ex1的包含在实施例1中所描述的所有突变的大肠杆菌茎进行代谢性进化程序，以便改善大肠杆菌Ex1茎的丙氨酸产率。
如下所述进行代谢性进化:在第一和第二轮进化中，在包含5％葡萄糖的NBS培养基中进行连续进化，分别地持续500小时和750小时。
NBS培养基:
3.5g KH2PO4
5.0g K2HPO4
3.5g(NH4)2HPO4
0.25g MgSO4-7H2O
15mg CaCL2-2H2O
0.5mg硫胺素
1ml痕量金属储备液
在0.1M HCL,1.6g FeCL3-6H2O；0.2g CoCl2-6H2O；0.1g CuCl2-2H2O；0.2g ZnCl2；0.2g NaMoO4-2H2O；0.05g H3BO3中配制痕量金属储备液。
将细胞在LB板上划线培养并且测试其丙氨酸产率。在37℃]在采用包含5％葡萄糖的NBS培养基持续24和48小时的发酵中，与起始茎大肠杆菌Ex1产生80％-83％的丙氨酸产率相比，最好的大肠杆菌茎(大肠杆菌Ev1)产生了在84％–86％之间的丙氨酸产率。
使用大肠杆菌Ev1进行进一步适应性进化步骤，以分批进化方式进行所述步骤20天。每24小时、48h、72小时等等，在37℃把5％的细胞再接种在新鲜的包含14％葡萄糖的AM1培养基中。
AM1培养基:
19.92mM(NH4)2HPO4＝2.6g/L MW:132.07
7.56mM NH4H2PO4＝0.87g/L MW:115
2.0mM KCl＝0.15g/L MW:74.55
1.5mM MgSO4-7H2O＝0.37g/L MW:246.5
在最后的步骤中添加15g/L硫酸铵
1mM甜菜碱
1ml痕量金属储备液
为制作1L痕量金属储备液:
在0.12M HCL,2.4g FeCL3-6H2O；0.3g CoCl2-6H2O；0.21g CuCl2-2H2O；0.3gZnCl2；0.27g NaMoO4-2H2O；0.068g H3BO3；0.5g MnCl2-4H2O中配制痕量金属储备液
从这种适应性进化中分离了茎大肠杆菌Ev2。在具有包含14％葡萄糖的AM1培养基的发酵罐中进行的发酵中测试这种茎。茎大肠杆菌Ev2具有在92％-94％之间的丙氨酸产率，相比于大肠杆菌Ev1在相同条件下具有91％-92％的丙氨酸产率。
在包含12％葡萄糖的AM1培养基中300小时的进一步的分批适应性进化步骤以及随后的在包含12％葡萄糖的AM1中的10个分批适应性进化步骤之后,分离了茎大肠杆菌Ev3。
对丙氨酸产率的测试揭示了:在包含12％葡萄糖的AM1培养基中，茎大肠杆菌Ev3具有在94％-96％之间的丙氨酸产率，相比，大肠杆菌Ev2在相同条件下具有92％-93％的丙氨酸产率。
实施例5:gcvTHP操纵子增加的表达对于L-丙氨酸生产力的影响
在可诱导IPTG的Ptrc启动子控制下，把额外一个拷贝的由gcvT(SEQ ID NO:45)、gcvH(SEQ ID NO:47)和gcvP(SEQ ID NO:49)的ORF组成的gcvTHP操纵子(SEQ ID NO:51)引入pACYC184质粒中处于IPTG可诱导的Ptrc启动子控制下。经由商用的InFusion克隆技术(Clontech,Mountain View,CA,美国)，构建了被命名为pACYC-gcvTHP(SEQ ID NO:52)的载体。采用HindIII和SalI限制性核酸内切酶内切核酸酶(NEB)将pACYC184载体(NEB)线性化。通过琼脂糖凝胶萃取提取纯化所产生的载体主链。采用引物gcvTHP-pACYC_F(SEQ ID NO:53)和gcvTHP-pACYC_R(SEQ ID NO:54)，从野生型大肠杆菌W基因组DNA中PCR扩增，对gcvTHP操纵子进行PCR扩增。所述的引物包含与所述的载体主链同源的另外的15bp突出端以及通过IDT(Integrated DNA Technologies,Inc.)合成的具有Ptrc启动子(SEQ ID NO:55)的双链DNA片段。按照InFusion克隆手册，把扩增的gcvTHP操纵子、上游Ptrc启动子和线性化的pACYC184载体主链克隆在一起。按照在PCT/IB2014/064426和PCT/IB2014/066686中描述的那样，经由电穿孔把所产生的pACYC-gcvTHP质粒转化到大肠杆菌菌株Ev3中，并且在LB氯霉素板上进行筛选。通过DNA测序证实了阳性的构建体。
通过比较性培养驻留了含有空的对照质粒(SEQ ID NO:56)的大肠杆菌Ev3和驻留了含有gcvTHP超量过表达质粒pACYC-gcvTHP(SEQ ID NO:52)的大肠杆菌Ev3，测试了gcvTHP超量表达过表达对于L-丙氨酸生产力的影响。使预培养物在37℃和200rpm下，在具有补充有用于保持质粒的补充有25μg/mL氯霉素的LB培养基、20％装满填充体积的摇瓶中生长过夜。在DASGIP 1.5L并行平行生物反应器系统(Eppendorf)中在500mL AM 1培养基(2.6g/L(NH4)2HPO4、0.87g/L NH4H2PO4、0.15g/L KCl、0.37g/L MgSO4·7H2O、15g/L(NH4)2SO4、1mM甜菜碱、1ml/L痕量金属储备液)中进行发酵。痕量金属储备液包含1.6g/LFeCL3·6H2O；0.2g/L CoCl2·6H2O；0.1g/L CuCl2·2H2O；0.2g/L ZnCl2；0.2g/LNaMoO4·2H2O；0.05g/L H3BO3,0.1M HCL。使用140g/L葡萄糖作为碳源并且把25μg/mL氯霉素添加到发酵培养基中以稳定地保持所述的质粒。在细胞的指数生长期间，采用200μM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导从Ptrc启动子表达gcvTHP操纵子。在37℃和400rpm搅拌器速度下，以一式两份运行每一种菌株。在整个发酵中，使用5N NH4OH将pH控制在6.8并且以铵作为丙氨酸前体提供给培养物。在发酵期间没有用空气鼓泡，并且没有给容器加压，使得在培养基中溶解的氧气最初被细胞消耗之后，发酵在微需氧的条件下运行。在所述的发酵期间采集样品，并且通过HPLC分析L-丙氨酸和葡萄糖浓度。
在60小时的发酵时间之后，与含有空的对照质粒的菌株(37.23±0.01g/L)比较，大肠杆菌Ev3实现了53.37±1.45g/L的显著更高的L-丙氨酸滴度，在大肠杆菌Ev3中从pACYC-gcvTHP质粒(SEQ ID NO:52)中过表达gcvTHP操纵子(SEQ ID NO:51)。

Claims (30)

1.重组微生物，其包含gcvTHP操纵子或其同源物或功能变体的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
2.权利要求1所述的重组微生物，其进一步包含alaD基因的引入的、增加的或增强的活性和/或表达。
3.权利要求1或2所述的重组微生物，其进一步包含pflB基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
4.权利要求1至3中任意一项所述的重组微生物，其进一步包含adhE基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
5.权利要求1至4中任意一项所述的重组微生物，其进一步包含ldhA基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
6.权利要求1至5中任意一项所述的重组微生物，其进一步包含pta基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
7.权利要求1至6中任意一项所述的重组微生物，其进一步包含frdA的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
8.权利要求1至7中任意一项所述的重组微生物,其中gcvTHP操纵子选自由下列组成的组:
(i)包含SEQ ID NO:51的序列的核酸分子,或
(ii)与SEQ ID NO:51的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或
(iii)核酸分子，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:51的核酸分子的互补序列杂交,或
(iv)编码SEQ ID NO:46、48和50的多肽中的每一个的核酸分子,或
(v)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:46的多肽具有至少60％同源性的多肽和与SEQ IDNO:48的多肽具有至少60％同源性的多肽以及与SEQ ID NO:50的多肽具有至少60％同源性的多肽。
9.权利要求2至8中任意一项所述的重组微生物，其中所述alaD基因选自由下列组成的组:
(AA)包含SEQ ID NO:15的序列的核酸分子,或
(BB)与SEQ ID NO:15的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或
(CC)核酸分子，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:15的核酸分子的互补序列杂交,或
(DD)编码SEQ ID NO:16的多肽的核酸分子,或
(EE)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:16的多肽具有至少60％同源性的多肽。
10.权利要求3至9中任意一项所述的重组微生物,其中所述pflB基因选自由下列组成的组:
(A)包含SEQ ID NO:5的序列的核酸分子,或
(B)与SEQ ID NO:5的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或
(C)核酸分子，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:5的核酸分子的互补序列杂交,或
(D)编码SEQ ID NO:6的多肽的核酸分子,或
(E)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:6的多肽具有至少60％同源性的多肽。
11.权利要求4至10中任意一项所述的重组微生物,其中所述adhE基因选自由下列组成的组:
(F)包含SEQ ID NO:7的序列的核酸分子,或
(G)与SEQ ID NO:7的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或
(H)核酸分子，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:7的核酸分子的互补序列杂交,或
(I)编码SEQ ID NO:8的多肽的核酸分子,或
(J)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:8的多肽具有至少60％同源性的多肽。
12.权利要求5至11中任意一项所述的重组微生物，其中ldhA基因选自由下列组成的组:
(K)包含SEQ ID NO:9的序列的核酸分子,或
(L)与SEQ ID NO:9的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或
(M)核酸分子，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:9的核酸分子的互补序列杂交,或
(N)编码SEQ ID NO:10的多肽的核酸分子,或
(O)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:10的多肽具有至少60％同源性的多肽。
13.权利要求6至12中任意一项所述的重组微生物,其中所述pta基因选自由下列组成的组:
(P)包含SEQ ID NO:11的序列的核酸分子,或
(Q)与SEQ ID NO:11的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或
(R)核酸分子，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:11的核酸分子的互补序列杂交,或
(S)编码SEQ ID NO:12的多肽的核酸分子,或
(T)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:12的多肽具有至少60％同源性的多肽。
14.权利要求7至13中任意一项所述的重组微生物,其中所述frdA基因选自由下列组成的组:
(U)包含SEQ ID NO:13的序列的核酸分子,或
(V)与SEQ ID NO:13的核酸分子具有至少80％同一性的核酸分子,或
(W)核酸分子，其在严格条件下与具有SEQ ID NO:13的核酸分子的互补序列杂交,或
(X)编码SEQ ID NO:14的多肽的核酸分子,或
(Y)核酸分子，其编码与SEQ ID NO:14的多肽具有至少60％同源性的多肽。
15.权利要求1至14中任意一项所述的重组微生物,其中所述的微生物选自由棒杆菌属、芽孢杆菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、泛菌属、链霉菌属、发酵单胞菌属和红球菌属以及酵母菌属组成的组的属。
16.包含根据权利要求1至15中任意一项所述的一种或更多种重组微生物的组合物。
17.权利要求16所述的组合物，其进一步包含培养基和碳源。
18.用于生产具有增强的丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸产率/或生产力的重组微生物的方法,其包括下列步骤：
(I)在微生物中引入、增加或增强权利要求1或8中所定义的基因的活性和/或表达；和
(II)产生与没有权利要求1或8中所定义的基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达的参比微生物相比，具有增强的丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸产率/或生产力的重组微生物。
19.权利要求18所述的方法,其中在所述的方法中使用的重组微生物包含权利要求2或9中所定义的基因的增加的或增强的活性和/或表达和/或权利要求3至8或10至14中任意一项中所定义的至少一种基因的减少的、抑制的或缺失的活性和/或表达。
20.权利要求18或19中任意一项所述的方法,其中所述的微生物选自由棒杆菌属、芽孢杆菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、泛菌属、链霉菌属、发酵单胞菌属和红球菌属以及酵母菌属组成的组的属。
21.生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的方法，包括在允许生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的条件下，培养根据权利要求1至15中任意一项所述的一种或更多种重组微生物。
22.根据权利要求21所述的方法,其中在包含0.5％到30％(w/v)的糖的培养基中培养所述的微生物。
23.根据权利要求21或22所述的方法,其中丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的产率是至少80％。
24.根据权利要求21至23中任意一项所述的方法,其中L-丙氨酸的手性纯度是至少95％。
25.根据权利要求21至23中任意一项所述的方法,其中产生了手性纯的L-丙氨酸。
26.培养或生长遗传修饰的微生物的方法，包括对培养基接种根据权利要求1至15中任意一项所述的一种或更多种遗传修饰的微生物，并且在培养基中培养或生长所述的遗传修饰的微生物。
27.根据权利要求1至15中任意一项所述的重组微生物或根据权利要求16或17中任意一项所述的组合物用于发酵生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的用途。
28.用于发酵生产丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸的方法，包括下列步骤:
I)在发酵罐中生长根据权利要求1至15中任意一项所述的微生物和
II)从在I)中得到的发酵液中回收丙酮酸、琥珀酸、天冬氨酸、苹果酸、乳酸、缬氨酸、亮氨酸和/或丙氨酸。
29.重组表达构建体，其包含与权利要求1或8中定义的核酸有效连接的在微生物中发挥功能的启动子。
30.重组载体，其包含权利要求1或8中所定义的核酸或权利要求29中所定义的重组表达构建体。
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