CN108707617A - 一种l-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种L‑丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法。该方法包括以下步骤：将嗜热脂肪地芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因(alaD)按大肠杆菌密码子偏好进行优化；在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L‑丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入启动子和转录终止子；将优化后的基因进行全基因人工合成，即得。本发明提供的L‑丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法能够提高alaD在大肠杆菌中的基因表达效率，使L‑丙氨酸积累量增加，从而提高L‑丙氨酸的产量。

Description

一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法及其应用。
背景技术
大肠杆菌是表达外源基因用于发酵生产有用基因产物的最常用平台微生物之一，L-丙氨酸的发酵生产以大肠杆菌发酵为主。但是大肠杆菌细胞中L-丙氨酸的生物合成是在谷氨酰胺-丙酮酸氨基转移酶催化下进行的；此酶催化活性较低，不能满足L-丙氨酸生产菌株培育的要求，因此L-丙氨酸生产菌多采用向大肠杆菌导入芽孢杆菌科微生物编码的具有较强丙氨酸合成能力的丙氨酸脱氢酶Alanine Dehydrogenase编码基因alaD的方法获得。芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，基因组中GC含量较革兰氏阴性的大肠杆菌为高，且其基因指导酶蛋白合成时的密码子偏好也与后者不同，如果直接将芽孢杆菌的alaD导入大肠杆菌进行表达，有可能降低其基因表达效率，影响L-丙氨酸积累，进而使得L-丙氨酸的产量变低。
发明内容
针对现有芽孢杆菌的alaD在大肠杆菌中的基因表达效率低，进而影响L-丙氨酸积累量，使L-丙氨酸的产量变低的问题，本发明提供一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法。
以及，本发明还提供上述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法在构建高产L-丙氨酸基因工程菌中的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，包括如下步骤：
步骤a、将嗜热脂肪地芽孢杆菌基因按大肠杆菌密码子偏好进行优化；
步骤b、在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L-丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入启动子和转录终止子；
步骤c、将步骤b所得基因优化的基因进行全基因人工合成，即得。
相对于现有技术，本发明提供的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法能够提高alaD在大肠该菌中的基因表达效率，使L-丙氨酸积累量增加，从而提高L-丙氨酸的产量。
具体地，步骤a中所述L-丙氨酸脱氢酶基因经优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
步骤b中所述启动子选自tac启动子、trc启动子、trp启动子、lac启动子、Pl启动子或Pr启动子；所述转录终止子选自rrnBT1终止子、rrnBT2终止子、rrnBT1结合rrnBT2终止子，或大肠杆菌核糖体RNA操纵子rrnA、rrnC、rrnD、rrnE、rrnG或rrnH的T1、T2终止子。上述启动子和终止子均为大肠杆菌的强启动子和强终止子，具有良好的转录活性。
优选地，所述启动子为tac启动子。该tac启动子是将色氨酸启动子Ptrp-35区域与突变的乳糖启动子PlacUV5的-10区域融合构成的杂合启动子，转录调控活性强于2个亲本启动子，能活化L-丙氨酸脱氢酶基因的RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。
优选地，所述tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述转录终止子为rrnBT1终止子。终止子rrnBT1的序列为大肠杆菌核糖体rRNA操纵子rrnB的强终止子序列，可以对转录终止进行有效的调控。
优选地，所述转录终止子rrnBT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
以及，本发明实施例还提供上述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法在构建高产L-丙氨酸基因工程菌中的应用。所述应用的具体操作为：敲除大肠杆菌染色体的D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、丙氨酸消旋酶基因，在目标基因丙氨酸消旋酶基因同源臂与pKD3的FRT序列之间插入权利要求1所得L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因，通过RED同源重组技术进行基因替换，消除选择标记基因cat(氯霉素抗性基因)的同时将所述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因留在丙氨酸消旋酶基因位点。
相对于现有技术，该方法通过敲除上述基因，首先减少了上述基因可能存在的对L-丙氨酸生物合成所需碳流的影响，再插入L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因后，可以构建出高产L-丙氨酸的基因工程菌。
附图说明
图1是本发明实施例1中L-丙氨酸脱氢酶人工合成步骤。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，包括如下步骤：
步骤a、将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因中的228个密码子按大肠杆菌密码子偏好进行优化，使优化后alaD基因中G+C数量的百分含量从59.52％降至56.54％；优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
步骤b、在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L-丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入tac启动子和rrnBT1终止子，tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，rrnBT1终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
步骤c、将步骤b所得基因优化的基因进行全基因人工合成，即得。
实施例2
本实施例提供了一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因在构建高产L-丙氨酸基因工程菌中的应用，具体方法为：
1、D-乳酸脱氢酶基因(ldhA基因)的敲除
1.1电转感受态细胞的制备
甘油管保藏的大肠杆菌MG1655菌株用LB培养基培养至菌体浓度生长到OD600为0.4左右，置于冰上20分钟，使其充分冷却，在3600rpm的转速下4℃离心5分钟，弃去上清，加入少量预冷的无菌超纯水，使菌体重悬，重复离心一次，弃去上清，加入预冷的10％的无菌甘油，相同条件离心，结束后加入10％的无菌甘油，重新悬浮菌体沉淀，-80℃保存，备用。
1.2 pKD46质粒的转化
40μL MG1655感受态细胞与1μL kD46质粒混合，加入到2mm电击杯中，轻弹底部使其混匀。电转电压设置为2.5kV，电击5.7ms左右后，在电击杯中迅速加入1mL LB液体培养基，转移到1.5mL的离心管中，30℃震荡培养2小时，培养完成后，取100μL菌液，涂布于LB+100μg/mL氨苄青霉素(以下简称Amp100)平板上，30℃倒置培养36小时。
1.3 MG1655/pKD46的诱导及电转感受态细胞的制备
上步实验中Amp100抗性平板上长出的单菌落命名为MG1655/pKD46，挑取其单菌落接种到5mL LB+Amp100液体培养基中，30℃震荡培养过夜。
过夜培养的菌液按1:100的比例加入到100mL LB+Amp100液体培养基中，加入终浓度10-60mM的L-阿拉伯糖，培养至OD600约0.4，冰上冷却20min后制成MG1655/pKD46电转感受态细胞，制备方法如1.1所述。
1.4线性DNA(打靶分子)的扩增
以pKD3为模板，针对不同的基因设计不同的正反向引物，扩增含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测无误后，用试剂盒进行回收，最后用无菌超纯水进行洗脱保存。PCR反应体系及反应程序如表1、2所示，表1为用于ldhA基因敲除的线性DNA打靶分子PCR组分，表2为用于ldhA基因敲除的线性DNA打靶分子PCR条件。
表1
其中引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
表2
1.5线性DNA(打靶分子)的转化
取诱导好的MG1655/pKD46电转感受态细胞40μL和4μL(约400ng)线性DNA，加入到2mm电击杯中，电击电压设置为2.5kV，Tc为5.7ms。
电击完成后，加入1mL LB液体培养基，转移至无菌的1.5mL离心管中，37℃振荡培养2小时，培养完成后，5300g常温离心2分钟，剩余约50μL培养基，重悬菌体，全部涂布于LB+氯霉素25μg/mL(Cam25)平板上，30℃倒置培养24小时。
1.6抗性重组子的鉴定及pKD46质粒的消除
上步中氯霉素平板上长出来的抗性单菌落可以进行初步鉴定：挑取平板上单菌落在LB+Cam25过夜培养，取100μL菌液于100℃煮沸裂解5min，3000g离心1min，保留上清作为PCR模板。分别设计靶基因上游的正向引物ldhAupFrw和氯霉素抗性基因内部的反向引物catintRev，以及氯霉素抗性基因内部的正向引物CATintFrw和靶基因下游的反向引物ldhAdwnRev，进行PCR扩增反应，阳性重组子可获得分子量确定的扩增产物。PCR反应体系及反应程序如表3、4所示，表3为ΔldhA::cat重组子的PCR组分，表4为ΔldhA::cat重组子的PCR鉴定条件，以相应野生型菌落的过培养菌液的PCR反应作为空白对照。
鉴定得到的阳性重组子接种到5mL含氯霉素的LB液体培养基中，43℃培养过夜，LB，LB+Amp100，LB+Cam25平板分别划线，挑取LB+Cam25平板单菌落重复液体培养，再划线培养，以消除助手质粒pKD46。
表3
其中引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
表4
1.7抗性基因的消除
将检测为阳性重组子的单菌落接种到5mL LB+Cam25液体培养基中，37℃过夜培养。然后按照1:100的比例接种到100mL LB+Cam25液体培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.4，按1.3的方法方法制备电转感受态细胞，电击转化pCP20质粒，30℃震荡培养2小时后，取100μL菌液涂布于含氨苄和氯霉素的LB平板上，30℃培养36小时。
生长出来的单菌落用前面的方法进行PCR验证，以菌液为模板，用靶基因上下游的正反向引物进行PCR反应，同时以相应野生型为对照组。
鉴定出来的基因敲除菌，利用相同的温敏培养方式(即pKD46质粒消除方法)消除pCP20质粒，之后甘油管保藏。
2、其他基因的敲除
按与ldhA基因的敲除步骤一致的方法，对丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB基因)和丙氨酸消旋酶基因(dadX基因)进行敲除。其中所用到的引物pflBH1P1Frw的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，pflBH2P2Rev的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，dadXH1P1Frw的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，dadXH2P2Rev的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，pflBupFrw的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，pflBdwnRev的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，dadXupFrw的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，dadXdwnRev的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
3、alaD基因的敲入
以pKD3为模板，alaDP1Frw(核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示)和dadXH2P2Rev为引物扩增含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段a，然后再以添加了tac启动子的tacalaDFrw(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和添加了转录终止子的rrnBT1的rrnBT1alaDRev(核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示)为引物，从插入有人工合成的L-丙氨酸脱氢酶基因alaD的重组质粒pUC57-alaD上扩增alaD基因。以alaD基因为模板，以dadXH1P1Frw和alaDP1Rev(核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示)为引物进行PCR，为alaD片段添加dadX基因同源臂H1和cat片段(含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段)同源臂P1，记为片段b；最后以片段a、b为模板，以dadXH1P1Frw和dadXH2P2Rev为引物扩增基因敲入所需的新cat片段(含有FRT位点的氯霉素抗性基因片段，dadX基因同源臂及alaD基因)。按照上述敲除的策略进行实验，最终消除cat片段，而alaD基因留在了染色体的dadX基因位点。得到高产L-丙氨酸基因工程菌。
4、发酵
种子培养基组成为：甘油5g/L，酵母粉24g/L，大豆蛋白胨12g/L，三水磷酸氢二钾16.43g/L，磷酸二氢钾2.31g/L。250mL三角瓶中种子培养基装量为40mL，121℃消毒20min，接种量0.1％，培养温度为35-37℃，摇床转速为220rpm，生长周期7-16h，OD值为16-18即可，用于发酵培养基接种。
发酵培养基组成为：A组分：酵母浸提物2-10g/L，甜菜碱1-3g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，七水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁10-30ppm，氯化钙2-4ppm，七水硫酸锌3-6ppm，四水硫酸锰0.5-2ppm，五水硫酸铜1-4ppm，四水钼酸铵0.1-0.5ppm，硼砂0.1-0.5ppm，六水氯化钴0.5-2ppm；B组分：葡萄糖50g/L，用开水分别溶解A组分与B组分，115℃消毒10min，A液先添加24％氨水35mL/L,然后用10％磷酸调节A液的pH到7.5后与B液混合，再用氨水调节pH到7.2，无菌水定容到终体积的50％。
250mL三角瓶中培养成熟的种子为40mL，接入40ml发酵培养基后，共80ml，用封口膜密封瓶口，继续发酵培养，发酵温度为35℃-37℃，旋转摇床转速为100rpm。发酵时间为16h。将得到的高产L-丙氨酸基因工程菌(编号为2#菌株)与原始菌株(编号为1#菌株)进行对比，结果见表5。
表5
由以上结果可见，经过敲入人工合成的AlaD之后，菌株的Ala含量明显增加，pH值明显下降。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北大学，精晶药业股份有限公司
<120> 一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法
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tttcgccttt ttccagattg cttaagtttt gcagcgtagt ctgagaaata gaattagcca 60
tggtccatat 70
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atgtttaacc gttcagttga aggttg 26
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tcattactta cacatcccgc ca 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
aggtacattg agcaactgac tgaa 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ttcagtcagt tgctcaatgt acct 24
<210> 10
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
agaatgaagt aaacgtccgt gacttcattc agaaaaacta cactccgtac ttgagcgatt 60
gtgtaggctg 70
<210> 11
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
catagattga gtgaaggtac gagtaataac gtcctgctgc tgttctttag gaattagcca 60
tggtccatat 70
<210> 12
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
atggctttgc attgcttaac ctggaagagg caataacgtt acgtgagcgc ttgagcgatt 60
gtgtaggctg 70
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
atgatttttt tgcacccaga agacgttgcc tccgatccgg cttacaacaa gaattagcca 60
tggtccatat 70
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
tccgagctta atgaaaagtt agcca 25
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gcagtcacct taaagtatag atagctgac 29
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
cagcgatccc atatgaggat ctaag 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
tatcatgggc aatggctctg t 21
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ttgagcgatt gtgtaggctg 60
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
gagctgttga caattaatca tcggctcgta taatgtgtgg aggaggaaat gtaatgaa 58
<210> 20
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt ttatttagcc atgcagcagg 60
ctatg 65
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
cagcctacac aatcgctcaa ataaaacgaa aggcccagtc tttcgactga gcctttcgtt 60

Claims (9)

1.一种L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤a、将嗜热脂肪地芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因按大肠杆菌密码子偏好进行优化；
步骤b、在优化后的所述嗜热脂肪地芽孢杆菌L-丙氨酸脱氢酶基因的5'和3'端分别加入启动子和转录终止子；
步骤c、将步骤b所得基因优化的基因进行全基因人工合成，即得。
2.根据权利要求1所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，步骤a中所述L-丙氨酸脱氢酶基因经优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，步骤b中所述启动子选自tac启动子、trc启动子、trp启动子、lac启动子、Pl启动子或Pr启动子；和/或
步骤b中所述转录终止子选自rrnBT1终止子、rrnBT2终止子、rrnBT1结合rrnBT2终止子，或大肠杆菌核糖体RNA操纵子rrnA、rrnC、rrnD、rrnE、rrnG或rrnH的T1、T2终止子。
4.根据权利要求3所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，步骤b中所述启动子为tac启动子。
5.根据权利要求4所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，所述tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求3所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，所述转录终止子为rrnBT1终止子。
7.根据权利要求6所述的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法，其特征在于，所述rrnBT1终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种权利要求1所述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因的获得方法在构建高产L-丙氨酸基因工程菌中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的具体操作为：敲除大肠杆菌染色体的D-乳酸脱氢酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶基因、丙氨酸消旋酶基因，在目标基因丙氨酸消旋酶基因同源臂与pKD3的FRT序列之间插入按权利要求1的方法制得的L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因，通过RED同源重组技术进行基因替换，消除选择标记基因、并同时将所述L-丙氨酸脱氢酶人工合成基因留在丙氨酸消旋酶基因位点；其中所述标记基因为氯霉素抗性基因。
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