CN115044623A - 一种异柠檬酸的酶法合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种异柠檬酸的酶法合成工艺，属于药物中间体酶催化领域。包括以下步骤：步骤一、异柠檬酸的转化，在反应体系中，分别加入柠檬酸、水以及乌头酸酶液组成反应混合液，水浴恒温反应，得到异柠檬酸反应液；反应过程中，乌头酸酶将柠檬酸催化为异柠檬酸；步骤二、异柠檬酸的纯化，将异柠檬酸反应液加热并加入活性炭吸附杂质，抽滤得清液，清液不断冲洗离子交换树脂柱，冲洗完成后对离子交换树脂柱进行水洗，水洗完成后对离子交换树脂柱进行脱洗，洗脱液经冷却结晶，并在固液分离以及干燥后得到异柠檬酸钾成品。本发明是一种便于对异柠檬酸进行制备的，且制备产物纯度高的合成工艺。
Description
技术领域
本发明主要涉及有机化工原料的技术领域，具体为一种异柠檬酸的酶法合成工艺。
背景技术
异柠檬酸是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界，异柠檬酸作为原料在医药和化工领域具有广阔的应用前景。
双四氢呋喃醇的合成以异柠檬酸钾为原料，在多种临床艾滋病毒蛋白酶抑制剂（如：达芦那韦、布瑞那韦、GS-9005和SPI-256）的合成中至关重要，具有预防和治疗HIV/AIDS的作用。
根据申请号为CN201410590425.2的专利文献所提供的柠檬酸制备方法可知，该制备方法所用原料为橘子，经榨汁、盐沉、醇溶、蒸馏、干燥而成；盐沉是将橘子汁加热至75-85℃，加入过量的氯化钙饱和溶液，过滤，沉淀为柠檬酸钙，用热水洗涤3-5次；醇溶是将柠檬酸钙放入带搅拌装置的反应器内，加入柠檬酸钙0.3-0.6倍质量的浓硫酸，搅拌成糊状，再加入乙醇，不断搅拌反应3-5小时；蒸馏温度为80-85℃；干燥温度为60-70℃，干燥时间为1-3小时。该制备方法工艺流程短，设备投资少，容易操作。
上述专利中的制备方法工艺流程短，设备投资少，容易操作，但无法对异柠檬酸进行制备，且制备的产物纯度较低。
发明内容
本发明主要提供了一种异柠檬酸的酶法合成工艺，用以解决上述背景技术中提出的技术问题。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
一种异柠檬酸的酶法合成工艺，包括以下步骤：
步骤1：异柠檬酸的转化，在反应体系中，分别加入柠檬酸、水以及乌头酸酶液组成反应混合液，水浴恒温反应，得到异柠檬酸反应液。
步骤2：异柠檬酸的纯化，将异柠檬酸反应液加热并加入活性炭吸附杂质，抽滤得清液，清液不断冲洗离子交换树脂柱，冲洗完成后对离子交换树脂柱进行水洗，水洗完成后对离子交换树脂柱进行脱洗，洗脱液经冷却结晶，并经固液分离以及干燥后得到异柠檬酸钾成品。
优选的，步骤1所述乌头酸酶液的获得方法是：以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌株，异源表达来源于芽孢杆菌的乌头酸酶编码的Cit基因，获得能够将柠檬酸催化为异柠檬酸的大肠杆菌工程菌株；然后经发酵培养、细胞破碎处理获得乌头酸酶液；所述工程菌株的表达载体核苷酸序列含有如SEQ ID NO.1所述基因序列。
优选的，步骤1中乌头酸酶液的获得方法是：根据GenBank上公开的芽孢杆菌乌头酸酶基因序列设计一对引物；以芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增Cit基因片段，将PCR扩增的基因片段和pET-28载体进行双酶切并纯化，建立连入Cit编码基因的表达载体pET-28-Cit，加入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行转化构成工程菌株，将工程菌株涂布在卡那霉素抗性的平板中进行培养，经发酵培养、细胞破碎处理获得乌头酸酶液。
优选的，步骤1中柠檬酸初始反应浓度为50-150g/L，优选80-120 g/L。
优选的，步骤1中反应过程中用0.5-2.5mol/L（优选1-1.2 mol/L）的氢氧化钾溶液调节PH值恒定于7.0-7.6（优选7.2-7.4）。
优选的，步骤1中乌头酸酶的加入量为反应体系的1-5%，优选2-3%。
优选的，步骤1中催化反应时间为8-14h，优选10-12h；反应温度为30-45℃，优选35-40℃。
优选的，步骤2中加热温度为55-85℃，优选65-75℃；活性炭的添加量为0.5-3%，优选1-2%；保温时间为0.5-1.5h，优选1h。
优选的，步骤2中对离子交换树脂柱进行脱洗时，脱洗剂为氢氧化钾的浓度为10-30%（优选15-25%）。
优选的，步骤2中结晶条件为0-5℃（优选3-4℃），结晶时间为12-18h（优选14-16h）。
优选的，步骤2中的干燥温度为50-60℃（优选55℃），干燥时间4-8h（优选5-7h）。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本方法提供了一种全新的异柠檬酸制备方法——生物酶催化法，以柠檬酸为底物，利用乌头酸酶生物合成异柠檬酸。
（2）通过采用本发明的乌头酸酶进行酶法催化具有高收率且制备的产物纯度较高，转化率能达到80％以上；在作为多种临床艾滋病毒蛋白酶抑制剂（如：达芦那韦、布瑞那韦、GS-9005和SPI-256）合成的中间体具有重要的作用；
（3）本发明方法操作简单、成本低和三废排放少等，适用于工业化生产，具有良好的市场竞争力。
以下将结合附图与具体的实施例对本发明进行详细的解释说明。
附图说明
图1为本发明所构建的表达质粒pET-28a-Cit；
图2为实施例2制备的异柠檬酸钾的高效液相谱图；
图3为本发明用于制备异柠檬酸钾的实验装置；
图4为本发明用于纯化异柠檬酸钾的实验装置；
图5为本发明合成反应式示意图；
图中：10、合成箱；22、伸缩缸；27、震荡板；25、震动电机；24、震动板；26、连接杆；28、存放盒；32、驱动电机；34、搅拌转盘；33、气缸；13、过滤口；43、连通管；41、淋洗箱；45、卡接板；411、排污管；42、隔板；46、脱洗剂罐；412、出料管。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：乌头酸酶液的制备
1、乌头酸酶克隆菌株的构建
将-80℃的芽孢杆菌进行复苏传代培养后，提取基因组作为DNA模板，按照NCBI上公开的芽孢杆菌乌头酸酶基因(如GenBank：AQR86003.1)序列设计一对引物：正向引物(Cit-F-BamHI)：5’-CGCGGATCCATGGCAAACGAGCAAAAA-3’；反向引物(Cit-R-Xho I)：5’-CCGCTCGAGCAGGACTGCTTCATTTTTTC-3’；PCR扩增，PCR完毕后进行凝胶验证和产物回收。电泳检测并切胶回收目的片段，回收后的目的蛋白进行BamHI-Xho I双酶切，与同样用BamH I-Xho I双酶切的pET-28a质粒于16℃下进行过夜连接，连接后即获得Cit基因编码的表达载体pET-28a-Cit。
2、乌头酸酶表达菌株的构建
将Cit基因编码的表达载体pET-28a-Cit，热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上筛选阳性转化子，进行PCR和双酶切验证，对验证正确的转化子进行发酵培养、细胞破碎处理获得乌头酸酶酶液。
3、乌头酸酶液的制备
将步骤1制备的大肠杆菌工程菌接种至含卡那霉素抗性的斜面上，37℃培养16h后，用接种环从斜面挑取一环转接至含卡那霉素抗性TB培养基，37℃、200rpm摇床培养至OD600=0.6，以体积浓度1％的接种量接种至含卡那霉素抗性的发酵培养基，37℃、200rpm摇床培养至OD600=0.5，然后加入终浓度3mM的IPTG在24℃、200rpm条件下培养16h，发酵液在4℃、5000rpm下离心15min，弃上清收集湿菌体。将湿菌体以300g/L的浓度加入蒸馏水中，采用冰浴，在400w条件下超声破碎，每破碎2s间隔1s，即得到细胞破碎悬液，即为乌头酸酶液。
实施例2：异柠檬酸的制备
向初始750mL水中投加100g柠檬酸（100g/L），用1mol/L的氢氧化钾溶液调节PH值至7.2后，加入实施例1制备所得的乌头酸酶液100mL（湿菌体浓度为300g/L），补加水定容至1L后开始反应，反应过程中用1mol/L的氢氧化钾溶液维持反应液pH值恒定在7.2，37℃恒温缓慢搅拌10h，反应结束，反应液加入1.5%活性炭并加热至70℃，缓慢搅拌保温1h，混合液抽滤得清液，清液不断冲洗离子交换树脂柱，冲洗完成后对离子交换树脂柱进行水洗，水洗完成后用20%的氢氧化钾对离子交换树脂柱进行脱洗，洗脱液经冷却至4℃结晶15h，经固液分离以及55℃干燥6h后得到异柠檬酸钾成品，得83.5g产物，纯度99.1%，产率83.5%。异柠檬酸钾采用高效液相色谱法测定：色谱条件：仪器：Aglient(安捷伦)1200高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：SB-C18，250×4.6mm，5μm；流速：0.8mL/min；检测波长：210nm；流动相：0.1%磷酸水溶液：甲醇=95:5；进样量：10μL；其高效液相色谱图如图2所示。
实施例3
（1）与实施例2比较，调整pH为9，其余条件相同，最终产率仅为43.0％，详见如下：
在反应体系中，分别加入柠檬酸、水以及乌头酸酶液组成反应混合液，在37℃水浴恒温反应10h，反应过程用氢氧化钾溶液控制反应液pH9，经活性炭加热吸附杂质、抽滤、离子交换树脂柱冲洗、结晶和干燥等步骤后得到异柠檬酸钾成品，计算产率为43.0％。
(2)与实施例2相比，调整反应体系pH，其余条件相同，条件和结果见表1。
| 试验例1 | 试验例2 | 试验例3 | |
| pH值 | 6.0 | 7.0 | 8.0 |
| 异柠檬酸收率（%） | 56.9% | 83.4% | 64.1% |
实施例4
（1）与实施例2比较，调整温度为50℃，其余条件相同，最终产率仅为14％，详见如下：
在反应体系中，分别加入柠檬酸、水以及乌头酸酶液组成反应混合液，在50℃水浴恒温反应10h，反应过程用氢氧化钾溶液控制反应液pH7.2，经活性炭加热吸附杂质、抽滤、离子交换树脂柱冲洗、结晶和干燥等步骤后得到异柠檬酸钾成品，计算产率为14.0％。
(2)与实施例2相比，调整反应体系温度，其余条件相同，条件和结果见表1。
| 试验例1 | 试验例2 | 试验例3 | |
| 温度（℃） | 25℃ | 35℃ | 45℃ |
| 异柠檬酸收率（%） | 56.2% | 80.8% | 73.7% |
实施例5：异柠檬酸的酶法合成实验装置
本发明针对上述记载的异柠檬酸的酶法合成工艺提供了一整套实验装置，如图3、4：
向合成箱10中加入7.5L水、加入1kg柠檬酸，用1mol/L的氢氧化钾溶液调节PH值至7.2后，再向合成箱10内加入按照实施例1方法制备所得的乌头酸酶1L（湿菌体浓度为300g/L），补加水定容至10L后开始反应，反应过程中用1mol/L的氢氧化钾溶液维持反应液pH值恒定在7.2，37℃恒温缓慢震荡10h，反应结束，震荡时开启伸缩缸22以将震荡板27调整至合适高度，开启震动电机25，震动电机25执行端带动震动板24震动，震动板24通过连接杆26带动震荡板27震荡。
对异柠檬酸溶液进行纯化时，开启伸缩缸22以将震荡板27移出异柠檬酸溶液，此时向多个存放盒28内放入活性炭，放入活性炭的总量是反应液的1.5%，通过加热器将温度上升至70℃并以40rpm的速率缓慢保温搅拌1h，以得到异柠檬酸钾溶液，搅拌时，驱动电机32带动搅拌转盘34转动，气缸33可带动搅拌转盘34升降；反应完成后冷却至40℃，并经过滤口13滤出，收集滤液得到异柠檬酸钾溶液。将异柠檬酸钾溶液经连通管43排入淋洗箱41，此时卡接板45上卡接的离子交换树脂柱对异柠檬酸钾进行吸附，废液经排污管411排出，吸附完成后，气动缸44带动卡接板45下移，以使整个离子交换树脂柱位于隔板42下方，脱洗剂罐46内20%的氢氧化钾经管道进入淋洗箱41以对离子交换树脂柱进行脱洗，脱洗液经出料管412排出。
重结晶时，将脱洗液放入低温箱，在4℃的条件下，结晶15h并经固液分离后用干燥箱对晶体进行干燥，干燥条件为55℃，干燥6h，以得到异柠檬酸钾成品，得82.0g产物，纯度99.3%，产率82.0%。
需要说明的是本发明方法的合成反应式如图5所示。
序列表
<110> 长兴制药股份有限公司
<120> 一种异柠檬酸的酶法合成工艺
<130> 20210316
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2730
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atggcaaacg agcaaaaaac tgcagcaaaa gacgttaccc aagcgagaaa aacgtttact 60
acaaatggga aaacatatca ttactactct ttaaaagcgt tagaagattc aggtatagga 120
aaggtttcga agcttcctta ttccatcaaa gttcttttag aatcagtatt gcgtcaagtt 180
gacggcttcg ttatcaaaaa agaacacgtg gaacaattgg caaaatgggg aactgccgaa 240
ttaaaggata tcgacgttcc gttcaaaccg tctcgtgtta ttttacaaga cttcacaggg 300
ctaccggcag tagtagatct ggcttcactg cgtaaagcaa tggcagctgt cggcggagat 360
cctgataaaa tcaaccctga aattcctgtt gatctcgtta tcgatcactc tgtacaggta 420
gataaagcgg gtacagaaga tgcattagca gtaaatatgg acttggaatt cgaaagaaat 480
gcagagcgct acaaattttt aagctgggca aagaaagcgt ttaacaatta tcaggcagta 540
ccgcctgcaa caggtattgt gcaccaggtc aaccttgagt tcttggcaag tgttgtccat 600
gccattgaag aagacggcga gcttgtagcu tatcctgata cgcttgtcgg aacagactca 660
cacacaacaa tgattaacgg tatcggtgtt ctcggctggg gtgtcggtgg aattgaagct 720
gaagcgggaa tgcttggaca gccttcttac ttcccagttc cagaggtaat cggcgcgaaa 780
cttgtcggca agcttccaaa cggaacaaca gctactgact tggcgttaaa agtaacacaa 840
gtgctgcgtg aaaaaggcgt tgtcggtaaa tttgttgaat tcttcggaga aggaattgct 900
gaactgccgc ttgcagatcg cgcaacaatt gcgaatatgg ctccggaata cggtgctaca 960
tgcggattct tcccagtaga tgaagaagcg cttaactacc tgcgcctgac tggccgtgat 1020
cctgaacata ttgatgttgt tgaagcatac tgcagaagca atggcttgtt ctacactcca 1080
gatgcggaag accctcaatt tactgatgtg gttgaaattg acctgtctca aattgaagca 1140
aacttatcgg gtccaaagcg tcctcaggat cgaatcccgc tatctgctat gcaggaaacg 1200
tttaaaaagc aattagtcag ccctgcaggt aaccaaggat tcggtttaaa tgctgaggaa 1260
gaaaataaag aaattaagtt taaactcctt aacggcgaag aaacagttat gaaaacgggt 1320
gcgatcgcca ttgctgcgat tacaagctgt acaaatacat caaacccata cgtgctgatc 1380
ggcgccggac tggtagcgcg taaagcggtt gagttagggc ttaaggtgcc taattacgtg 1440
aaaacgtcac ttgcaccggg ttctaaagtt gttacaggat atcttgtgaa ttcaggcctt 1500
cttccataca tgaaagagct tggctttaac ctcgttgggt acggctgtac aacatgtatc 1560
gggaactcag gtccgctttc accggaaatc gaagaagcgg ttgcgaaaaa tgatcttctg 1620
attacgtctg tcctttccgg aaaccgtaac tttgaaggac gtattcaccc gcttgttaaa 1680
ggcaactatc ttgcttcacc gccgcttgtt gtggcatatg cgctggctgg aacggtaaac 1740
attaacttaa aaaccgatcc aatcggtgtg ggcaaggatg gtcaaaacgt atactttaat 1800
gatatttggc cgtcaatgga cgaaatcaat gcacttgtta agcaaactgt tacgccagag 1860
ctattccgca aagagtatga aacagtattt gatgacaaca agcgctggaa cgaaattgaa 1920
acaacagatg aagctttata taaatgggat aacgattcaa cttacatcca aaacccacca 1980
ttctttgaag agatgtctgt tgagccaggc aaggttgagc cattaaaagg actgcgtgtt 2040
ctuggtaaat tcggcgattc agtcacaact gaccatattt ctcctgcgaa tgcaatcgga 2100
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cgcatcaaaa accaaatcgc accgggtaca gaaggcggat ttacgacgta ctggccgact 2280
ggtgaagtaa catccatcta tgatgcatgc atgaaataca uggaagataa aaccggtctt 2340
gtcattttag caggaaaaga ctatggtatg ggatcttcac gtgactgggc tgcaaaagga 2400
acaaaccttc tcggcatcag aacggtcatt gcagagagct tcgaaagaat tcacagaagc 2460
aatcttgtag gaatgggtgt gctgccgctt cagtttaaac aaggtgaaaa tcgtgataca 2520
ctcggcttaa cgggtaaaga agtcatcgag gtagatgttg atgaaacagt tcgtcctcgt 2580
gaccttgtga ctgtaagagc aatcaatgaa gacggcaatg taacaacttt tgaagcagtc 2640
gtccgctttg atagtgaagt tgaaattgat tactaccgcc atggcggcat ccttcaacgc 2700
gtgcttcgtg aaaaaatgaa gcagtcctga 2730
Claims (10)
1.一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于,包括以下步骤：
步骤1：异柠檬酸的转化，在反应体系中，分别加入柠檬酸、水以及乌头酸酶液组成反应混合液，水浴恒温反应，得到异柠檬酸反应液；反应过程中，乌头酸酶将柠檬酸催化为异柠檬酸；
步骤2：异柠檬酸的纯化，将异柠檬酸反应液加热并加入活性炭吸附杂质，抽滤得清液，清液不断冲洗离子交换树脂柱，冲洗完成后对离子交换树脂柱进行水经固液分离以及干燥后得到异柠檬酸钾成品。
2.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，所述乌头酸酶酶液的获得方法是：以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌株，异源表达来源于芽孢杆菌的乌头酸酶编码的Cit基因，获得能够将柠檬酸催化为异柠檬酸的大肠杆菌工程菌株；然后经发酵培养、细胞破碎处理获得乌头酸酶酶液；所述工程菌株的表达载体核苷酸序列含有如SEQ IDNO.1所述基因序列。
3.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，步骤1中柠檬酸初始反应浓度为50-150g/L。
4.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，步骤1反应过程中用0.5-2.5mol/L的氢氧化钾溶液调节PH值恒定于7.0-7.6。
5.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，步骤1中乌头酸酶液的加入量为反应体系的1-5%。
6.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，步骤1中催化反应时间为8-14h，反应温度为30-45℃。
7.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，步骤2中加热温度为55-85℃，活性炭的添加量为0.5-3%，保温时间为0.5-1.5h。
8.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，步骤2中对离子交换树脂柱进行脱洗时，脱洗剂是浓度为10-30%氢氧化钾溶液。
9.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，步骤2中结晶条件为0-5℃，结晶时间为12-18h。
10.根据权利要求1所述的一种异柠檬酸的酶法合成工艺，其特征在于，其特征在于，步骤2中的干燥条件为50-60℃，干燥4-8h。
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| CN104087570A (zh) * | 2014-06-04 | 2014-10-08 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 乌头酸酶突变体、其编码基因及应用 |
| CN113755536A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-12-07 | 微恒科技(天津)有限公司 | 一种发酵生产异柠檬酸的方法 |
-
2022
- 2022-05-24 CN CN202210567633.5A patent/CN115044623A/zh active Pending
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