WO2015055127A1 - 一种左旋吡喹酮的制备方法 - Google Patents

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  • the borane-amine complex may be selected from the group consisting of a borane ammonia complex, a borane dimethylamine complex, a borane-triethylamine complex, a borane t-butylamine complex, A combination of one or more of a borane diethylamine complex and a borane N,N-diisopropylethylamine complex.
  • the invention mainly aims to overcome the defects existing in the preparation of the prior art L-praziquantel and provide a new chemical enzyme catalytic process technology, improve the safety and environmental protection deficiencies of the traditional chemical methods, and reduce the amount of the existing enzyme catalyst. Handle complex puzzles.
  • the invention solves the problems of danger and pollution in the production of praziquantel and its intermediates by chemical method. Compared with the traditional chemical method, the advantage is that the use of the highly toxic raw materials sodium cyanide and heavy metals is avoided, and dangerous reactions such as high temperature and high pressure are avoided.
  • the nuclear magnetic data of the product obtained in this example are as follows: 1 H-NMR (400 MHz, D 2 O, ⁇ ppm): 3.07-3.10 (m, 2H, H-4), 3.45-3.66 (m, 2H, H-3), 4.95 ( s, 1H, H-1), 7.29-7.54 (m, 4H, Ph), confirmed to be 1-(R)-tetrahydroisoquinolinecarboxylic acid ammonium salt.
  • the HPLC test results for about 35 hours showed that the potassium salt of 1-(S)-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate was less than 1%. Stop the reaction, heat to 50-60 ° C, half a hour or more of denaturing enzyme protein, the heated reaction was filtered through diatomaceous earth to remove the enzyme, the filtrate was added to the reaction solution to dilute the volume of acetone, and the precipitated crude solid was collected by filtration and then passed through water. /Acetone (volume ratio of 1/2) was recrystallized to obtain 1.99 g of a white solid, which was a compound 1-(R)-tetrahydroisoquinolinecarboxylic acid potassium salt. The separation yield was 92.3%, and the ee value was 99.1%.
  • the HPLC test results for about 36 hours showed that the sodium 1-(S)-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate was less than 1%. Stop the reaction, heat to 50-60 ° C, half an hour or more of denaturing enzyme protein, the heated reaction was filtered through diatomaceous earth to remove the enzyme, the filtrate was cooled to 3-5 ° C, slowly added concentrated hydrochloric acid to adjust the pH value to about 6.8, A large amount of precipitate was washed out, and the precipitate was collected by filtration. The filtrate was diluted with 2-3 volumes of acetone, and the precipitate was collected by filtration. The collected precipitate was combined and recrystallized from water/acetone to give a white solid. g, which is the intermediate 1-(R)-tetrahydroisoquinolinecarboxylic acid, the separation yield is 93.5%, and the ee value is 99.3%.
  • benzyltriethylammonium chloride (TEBAC, 5.5 g, 0.024 mol) was added and heated to reflux for 2 hr. After the reaction was over, 380 mL of water was added and extracted with dichloromethane. The combined organic phases were washed twice with 5% aqueous hydrochloric acid and then brine and dried over anhydrous sodium sulfate. After evaporating the solvent, the residue was applied tolululululululululululululululululu The total yield is 72%), which is L-praziquantel.
  • the product nuclear magnetic data are as follows: 1 H NMR (300 MHz, DMSO-d6): ⁇ 1.26-1.30 (m, 3H), 1.46-1.63 (m, 3H), 1.72-1.88 (m, 5H), 2.43-2.56 (m) , 1H), 2.77-2.87 (m, 2H), 2.90-3.25 (m, 2H), 3.84-4.10 (m, 1H), 4.35-4.49 (m, 1H), 4.79-4.87 (m, 2H), 5.15 -5.18 (d, 1H), 7.17-7.19 (d, 2H), 7.24-7.28 (d, 2H).
  • the present invention has many advantages through a bioenzyme-catalyzed synthesis route, and is more suitable for large-scale industrial production.
  • D-amino acid oxidase By the high stereoselectivity of recombinant D-amino acid oxidase, one of the enantiomers in the catalytically synthesized racemate is oxidized to an imine intermediate and in situ chemically reduced to a racemate via a borane amine complex.
  • the invention adopts a new enzyme catalytic method to reduce the amount of enzyme, and is safe and environmentally friendly.
  • the invention improves the deficiencies of the conventional method, and has the advantages of simple enzymatic catalysis process, easy post-treatment, and the like, and the reaction condition is relatively mild, the reaction of each step is simple, easy to control, and can be applied.
  • process equipment reduce equipment investment, reduce energy consumption and organic solvent, reduce environmental pollution and achieve green production.

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Abstract

本发明涉及左旋吡喹酮的制备方法，其包括以(R,S)-四氢异喹啉-1-甲酸或其盐，或1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸或其盐为原料来制备1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐的步骤以及由该盐来制备左旋吡喹酮的步骤，制备1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸或其盐的方法如下：首先使所述原料与氧气在重组D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的存在下发生氧化反应，然后使氧化反应所得产物在硼烷-胺基络合物的作用下发生还原反应，实现1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸或其盐连续转化为1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸或其盐异构体。本发明不仅可以获得更高光学纯度的左旋吡喹酮产品，而且成本更低，生产更绿色环保。

Description

一种左旋吡喹酮的制备方法 技术领域
本发明涉及一种左旋吡喹酮((R)-praziquantel)的制备方法。
背景技术
吡喹酮是人工合成的吡嗪异喹啉衍生物，又名环吡喹酮，通常为白色或类白色结晶粉末，味苦，是世界公认的高效广谱抗寄生虫药物，广泛用于治疗日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、华支睾吸虫病、肺吸虫病、孟氏裂头蚴、姜片虫、包虫、绦虫和囊虫等疾病。它具有抗虫谱广、疗效高、毒性低、疗程短及使用方便等优点。除用于人体外，它也广泛用于动物、家禽等的抗寄生虫治疗。吡喹酮的问世是寄生虫病化疗史上的一项重大突破，吡喹酮是目前市场上治疗多种寄生虫病的首选药物。
吡喹酮是由左旋和右旋吡喹酮共同组成的外消旋化合物，科研人员从合成吡喹酮中拆分获得左旋吡喹酮和右旋吡喹酮光学异构体，并通过临床前和初期临床试验发现：左旋吡喹酮是吡喹酮的有效杀虫成分，而右旋吡喹酮是无效甚至有害成分；相同剂量下，左旋吡喹酮临床疗效比吡喹酮更好，右旋吡喹酮则几乎无疗效，味苦，而且是药物副作用的主要产生来源。对心脏的毒性左旋体比右旋体低，因此开发左旋吡喹酮代替吡喹酮，将具有疗效更高，毒副作用更少，医学依从性更好的临床应用价值。尽管世界卫生组织期望用左旋吡喹酮取代吡喹酮，但多年来左旋吡喹酮化学合成收率低的工艺难题一直悬而未解。
吡喹酮于1975年由Seubert等人首先合成，德国E.Merck和Bayer AG两药厂成功开发出该种药品，于1980年以商品名Cesol率先上市，现已在世界范围内广泛应用。吡喹酮在生产过程中要使用一些有毒、有害的化学物质，如氰化钾、重金属等，而且它的工艺路线较长，反应条件也比较苛刻(高温，高压)，见如下反应路线1。而这类反应过程控制难度较大，污染严重。
Figure PCTCN2014088713-appb-000001
左旋吡喹酮的合成目前主要有两种方法：
1、化学拆分法：采用消旋中间体或消旋吡喹酮为原料，通过化学拆分合成左旋吡喹酮(Resolution of Praziquantel，Matthew H.Todd1，Australia，PLOS，Neglected Troplcal Diseases，September 2011，Volume 5，Issue 9，e 1260)，参见如下反应路线2：
Figure PCTCN2014088713-appb-000002
该方法除了涉及到合成吡喹酮的潜在环保弊病外，其所得到左旋吡喹酮的收率和光学纯度还有待提高，并且拆分后的右旋吡喹酮胺需要回收消旋化后才能得以再利用，比较耗费耗时。
2、酶法拆分法：需要将右旋消旋化，过程繁琐，总收率有待提高。(中国专利公开号CN 102911979 A，一种制备左旋吡喹酮的方法)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的左旋吡喹酮的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种左旋吡喹酮的制备方法，其包括以式2a表示的化合物(例如(R，S)-四氢异喹啉-1-甲酸或其盐)或式2b表示的化合物(例如1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸或其盐)来制备式1表示的中间体的步骤以及由式1表示的中间体(1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐)来制备左旋吡喹酮的步骤：
Figure PCTCN2014088713-appb-000003
其中，式1、2a和2b中，X+相同，且代表与羧酸根离子相抗衡的阳离子部分；
制备式1表示的中间体的方法如下：首先使式2a或2b表示的化合物与氧气在重组D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的存在下发生氧化反应，然后使氧化反应所得产物在硼烷-胺基络合物的作用下发生还原反应生成式1表示的中间体。
优选地，式1、2a和2b中，X+表示H+、K+、Na+或NH4 +。此时，式1表示的中间体具体为1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸钾盐、1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸钠盐、1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸铵盐或1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸。
根据本发明，所述重组D-氨基酸氧化酶的制备方法为：将含有D-氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于37±1℃下过夜活化12～16小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于37±1℃下振荡培养，至OD600值达到0.6～0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.8mmol/L～1.0mmol/L，于30±1℃下继续培养8～10小时，离心，收集沉淀物，加入pH 7～9的磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎，再离心，将上清液预冻至温度降至-20℃～-30℃，然后冷冻干燥34～40小时，即得冻干的粉状重组D-氨基酸氧化酶。
根据本发明，所述硼烷-胺基络合物可以选自硼烷氨络合物、硼烷二甲胺络合物、硼烷-三乙胺络合物、硼烷叔丁胺络合物、硼烷二乙胺络合物以及硼烷N，N-二异丙基乙胺络合物中的一种或多种的组合。
根据本发明，式2a或2b表示的化合物与硼烷-胺基络合物的投料摩尔比优选为1∶1.1～5。重组D-氨基酸氧化酶和过氧化氢的投料量占底物式2a或2b表示的化合物的质量百分比分别优选为4％～6％(例如5％)和0.5％～1.5％(例如1％)。
进一步地，使氧化反应和还原反应在pH 7.5～9.0的水相缓冲溶液中、温度15℃～40℃下进行。优选的pH范围是8.0～8.5。优选的温度范围是20℃～40℃。
进一步地，水相缓冲溶液优选选自磷酸钠盐、磷酸钾盐、氨水中的一种或多种的组合。
优选地，制备式1表示的中间体的具体过程如下：将式2a或2b表示的化合物溶于缓冲溶液中，加入硼烷-胺基络合物，通入氧气或空气，加入重组D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶，搅拌下，于所述温度下开始反应，HPLC监测反应进程，至式2a或2b表示的化合物的含量低于1wt％时，停止反应。
进一步地：停止反应后，加热(50℃～60℃)使体系中的酶发生变性，过滤除酶(可以使用硅藻土来过滤)，滤液中加入丙酮，过滤收集析出的粗品固体，再用水和丙酮的混合溶剂进行重结晶，即得到式1表示的中间体。其中，所述水和丙酮的混合溶剂中，水与丙酮的体积比优选为1∶1～3。
根据本发明的一个优选方面，从式I表示的中间体制备左旋吡喹酮的路线如下：
Figure PCTCN2014088713-appb-000004
上述式3至式7中，R相同，且表示氨基保护基。
更具体地，R可以为叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基、芴甲氧羰酰基、烯丙氧羰基或三氯乙氧羰基等。
上述路线中，所包含的各步反应均可以通过有机合成领域的常规技术或手段来实现，没有特别限制。例如，从式1化合物到式3化合物可采用常规的氨基保护方法。从式3化合物到式4化合物可采用常规的还原方法，例如可采用还原剂BH3。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明提供了一种以1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐为关键中间体合成左旋吡喹酮的新路线，其中1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐的制备采用化学-酶法相结合的技术，充分利用重组D-氨基酸氧化酶的高度立体选择性，使1-(S)-四氢异 喹啉-1-甲酸盐转化成1-四氢异喹啉亚胺甲酸盐，同时利用水溶性的硼烷-胺基络合物原位高效还原1-四氢异喹啉亚胺甲酸盐生成消旋1-(R，S)-四氢异喹啉-1-甲酸盐，实现了1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸盐原位高效、快速、彻底的去消旋化生成对映异构体1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐，以超过90％的获得率获得光学纯度大于99.0％的1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐。此外，1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐的制备还具有过程简单、后处理容易等优点。
在高效获得1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐后，从1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐到最终的左旋吡喹酮的制备则可以采用有机合成领域常规且成熟的化学合成反应来实现。
与现有技术相比，本发明左旋吡喹酮的制备方法不仅可以获得更高光学纯度的左旋吡喹酮产品，而且成本更低，生产更绿色环保，为进一步进行临床前和临床成药性评价，大规模产业化生产左旋吡喹酮并进入国际市场铺平了道路。
具体实施方式
本发明主要在于为了克服现有技术左旋吡喹酮制备所存在的缺陷而提供一种新的化学酶催化工艺技术，改进传统化学方法安全环保的不足之处，降低现有酶催化剂用量大，后处理复杂的难题。通过本发明解决化学法生产吡喹酮及其中间体中危险和污染的问题，相对于传统化学法，其优势在于避免了剧毒原料氰化钠及重金属使用，避免了高温高压等危险反应，减少了有机溶剂用量，降低了吡喹酮及其中间体生产对环境的污染；通过本发明还解决了传统生物法生产吡喹酮及其中间体酶用量大、底物浓度低、后处理复杂、能耗大、效率低、难以控制等问题。
本发明提供一种利用重组D-氨基酸氧化酶和水溶性的硼烷-胺基络合物原位高效去消旋化制备1-(R)-四氢异喹啉-1-甲酸盐的方法。反应所用的物质除重组D-氨基酸氧化酶外，均可通过商购获得。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1 重组D-氨基酸氧化酶的制备
从甘油管或转化平板将含有D-氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含(100ug/mL)氨苄青霉素抗性的4mL液体LB培养基中，于37℃下活化过夜12～16小时，将活化后得到的培养物以2％接种量转接含(100ug/mL)氨苄青霉素抗性的100mL液体LB培养基，于37℃、220rpm振荡 培养至OD600值达到约0.6，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.8mmol/L，于30℃继续培养过夜。离心(4℃，5000rpm，15min)收集细胞，用10mL磷酸缓冲液(100mM，pH 7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，再离心(4℃，12000rpm，15min)，上清液于-20℃预冻过夜，然后冷冻干燥34～40小时，即得冻干的粉状重组D-氨基酸氧化酶。
实施例2 中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸铵盐的制备
1.77g(0.01mol)DL-四氢异喹啉-1-甲酸溶解于5mL氨水中(调节pH至8.0)，加入1.5g(0.05mol)硼烷-氨络合物，匀速通入氧气，加入88.5mg重组D-氨基酸氧化酶和18mg过氧化氢酶，搅拌下，于28℃开始反应，HPLC检测反应进程。约28小时HPLC检测结果显示1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸铵盐小于1％。停止反应，加热至50-60℃，半小时以上变性酶蛋白，加热过的反应经硅藻土过滤除酶，滤液中加入反应液2倍体积的丙酮稀释，过滤收集析出的粗品固体，再经水/丙酮(体积比1/2)重结晶得到纯白色固体1.8g，即为中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸铵盐，分离获得率92.5％，e.e.值99.3％。
本例所得产物核磁数据如下：1H-NMR(400MHz，D2O，δppm)：3.07-3.10(m，2H，H-4)，3.45-3.66(m，2H，H-3)，4.95(s，1H，H-1)，7.29-7.54(m，4H，Ph)，确证为1-(R)-四氢异喹啉甲酸铵盐。
实施例3 中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸钾盐的制备
1.77g(0.01mol)DL-四氢异喹啉-1-甲酸溶解于5mL K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中(调节pH至8.2)，加入2.61g(0.03mol)硼烷-叔丁基胺络合物，匀速通入氧气，加入35.5mg重组D-氨基酸氧化酶，9mg过氧化氢酶，搅拌下，于35℃开始反应，HPLC检测反应进程。约30小时HPLC检测结果显示1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸钾盐小于1％。停止反应，加热至50-60℃，半小时以上变性酶蛋白，加热过的反应经硅藻土过滤除酶，滤液经甲苯(3×5mL)萃取，甲苯相回收叔丁基胺(2.1g)。萃取后的水相中加入反应液2倍体积的丙酮稀释，过滤收集析出的粗品固体，再经水/丙酮(体积比1/2)重结晶得到纯白色固体1.98g，即为中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸钾盐，分离获得率91.8％，e.e.值99.2％。
实施例4 中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸钠盐的制备
1.77g(0.01mol)DL-四氢异喹啉-1-甲酸溶解于5mL Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲溶液中(调节pH至8.0)，加入1.77g(0.03mol)硼烷-二甲基胺络合物，匀速通入空气，加入53.5mg重组D-氨基酸氧化酶和9mg过氧化氢酶，搅拌下，于37℃开始反应，HPLC检测反应进程。约32小时HPLC检测结果显示1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸钠盐小于1％。停止反应，加热至50-60℃，半小时以上变性酶蛋白，加热过的反应经硅藻土过滤除酶，滤液中加入反应液2倍体积的丙酮稀释，过滤收集析出的粗品固体，再经水/丙酮(体积比1/2)重结晶得到纯白色固体1.86g，即为化合物1-(R)-四氢异喹啉甲酸钠盐，分离获得率93.1％，e.e.值99.3％。
实施例5 中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸铵盐的制备
1.77g(0.01mol)DL-四氢异喹啉-1-甲酸溶解于5mL氨水溶液中(调节pH至8.5)，加入3.45g(0.03mol)硼烷-三乙基胺络合物，缓慢通入空气，加入70.8mg重组D-氨基酸氧化酶，12mg过氧化氢酶，搅拌下，于40℃开始反应，HPLC检测反应进程。约28小时HPLC检测结果显示1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸铵盐小于1％。停止反应，加热至50-60℃，半小时以上变性酶蛋白，加热过的反应经硅藻土过滤除酶，滤液中加入反应液2倍体积的丙酮稀释，过滤收集析出的粗品固体，再经水/丙酮(体积比1/2)重结晶得到纯白色固体1.81g，即为化合物1-(R)-四氢异喹啉甲酸氨盐，分离获得率93.3％，e.e.值99.3％。
实施例6 中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸钾盐的制备
1.77g(0.01mol)(S)-四氢异喹啉-1-甲酸溶解于5mL K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中(调节pH至8.2)，加入3.48g(0.04mol)硼烷-叔丁基胺络合物，匀速通入氧气，加入47.5mg重组D-氨基酸氧化酶，12mg过氧化氢酶，搅拌下，于35℃开始反应，HPLC检测反应进程。约35小时HPLC检测结果显示1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸钾盐小于1％。停止反应，加热至50-60℃，半小时以上变性酶蛋白，加热过的反应经硅藻土过滤除酶，滤液加入反应液2倍体积的丙酮稀释，过滤收集析出的粗品固体，再经水/丙酮(体积比1/2)重结晶得到白色固体1.99g，即为化合物1-(R)-四氢异喹啉甲酸钾盐，分离获得率92.3％，e.e.值99.1％。
实施例7 1-(R)-四氢异喹啉甲酸的制备
可分别以实施例1～6制备的1-(R)-四氢异喹啉甲酸盐为原料来制备1-(R)-四氢异喹啉甲酸。一个具体的实例如下：
将实施例6所得中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸钾盐白色固体1.99g溶于5mL纯水中，通入氯化氢气体至pH值2-3，加入10mL丙酮，过滤收集析出的固体，经干燥得1-(R)-四氢异喹啉甲酸1.59g，收率97％，e.e.值99.1％。
本例所得产物的核磁数据如下：1H NMR(DMSO-d6，400MHz，δppm)：2.87-3.11(m，2H，CH2CH2N)，3.35-3.76(m，2H，CH2CH2N)，5.3(d，1H，CHCOOH)，7.24-7.35(m，4H，ArH)，9.45(s，1H，COOH)，确证产物为1-(R)-四氢异喹啉甲酸。
实施例8 中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸的制备
1.77g(0.01mol)(S)-四氢异喹啉-1-甲酸溶解于5mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中(调节pH至8.5)，加入5.72g(0.04mol)硼烷-二异丙基乙胺络合物，匀速通入空气，加入70.8mg重组D-氨基酸氧化酶和12mg过氧化氢酶，搅拌下，于37℃开始反应，HPLC检测反应进程。约36小时HPLC检测结果显示1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸钠盐小于1％。停止反应，加热至50-60℃，半小时以上变性酶蛋白，加热过的反应经硅藻土过滤除酶，滤液降温至3-5℃，缓慢滴加浓盐酸调节pH值至6.8左右，有大量沉淀洗出，过滤收集沉淀，过滤后的滤液中加入滴加滤液2-3倍体积的丙酮稀释，再过滤收集析出的沉淀，合并收集的沉淀，再经水/丙酮重结晶得到白色固体1.66g，即为中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸，分离获得率93.5％，e.e.值99.3％。
实施例9 中间体1-(R)-四氢异喹啉甲酸的制备
5.31g(0.03mol)(R，S)-四氢异喹啉-1-甲酸溶解于15mL K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中(调节pH至8.3)，加入5.22g(0.06mol)硼烷-叔丁基胺络合物，匀速通入空气，加入106.5mg重组D-氨基酸氧化酶，27mg过氧化氢酶，搅拌下，于35℃开始反应，HPLC检测反应进程。约30小时HPLC检测结果显示1-(S)-四氢异喹啉-1-甲酸钾盐小于1％。停止反应，加热至50-60℃，半小时以上变性酶蛋白，加热过的反应经硅藻土过滤除酶，滤液经甲苯(3×10mL)萃取，甲苯相回收叔丁基胺(4.0g)。萃取后的水相降温至3-5℃，缓慢滴加浓盐酸调节pH值至6.8左右，有大量沉淀洗出，过滤收集沉淀，过滤后的滤液中加入滴加滤液2-3倍体积的丙酮稀释，再过滤收集析出的沉淀，合并收集的沉淀，再经水/丙酮重结晶得到白色固体5g，即为化合物1-(R)-四氢异喹啉甲酸，分离获得率93.7％，e.e.值99.3％。
实施例10 (1R)-1-甲羧基-2-叔丁氧羰基-1，2，3，4-四氢异喹啉(化合物4A) 的的制备
Figure PCTCN2014088713-appb-000005
将溶解在845mL四氢呋喃中的1-(R)-四氢异喹啉甲酸(80g，0.45mol)和溶解在845mL水中的碳酸钠溶液(191.5g，1.8mol)混合后，冷却到0℃，然后将溶解于280mL四氢呋喃的(Boc)2O(108g，0.5mol)在0℃下逐滴滴加到该溶液中，搅拌过夜。反应结束后，用乙酸乙酯萃取，萃取出的有机层经合并后用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，真空蒸干。蒸干后的残余物用PE/EA＝1∶1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后得到白色固体即为化合物4A(106g，产率85％)。
实施例11 (1R)-1-羟甲基-2-叔丁氧羰基-1，2，3，4-四氢异喹啉(化合物 4B)的制备
Figure PCTCN2014088713-appb-000006
在N2保护下，往溶解有化合物4A(70.2g，0.25mol)的0℃的975mL四氢呋喃里逐滴加入溶解在四氢呋喃中的BH3溶液(2.0M，377mL，754mmol)。滴加完毕后，再搅拌3小时，然后滴加NaHCO3溶液。反应结束后，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用饱和食盐水清洗，无水硫酸钠干燥，然后真空蒸干。蒸干后的残余物用(石油醚/乙酸乙酯)PE/EA＝10∶1～5∶1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后得到淡黄色油状的产物，即为化合物4B(53.3g，产率80％)。
实施例12 (1R)-1-(N-邻苯二甲酰胺基甲基)-2-叔丁氧羰基-1，2，3，4-四氢 异喹啉(4C)的制备
Figure PCTCN2014088713-appb-000007
向溶解有化合物4B(85g，0.32mol)的1L的二氯甲烷中加入DIAD(131g，0.65mol)和三苯基膦(170g，0.65mol)，室温搅拌30min后，将该混合物降至0℃。然后分批加入邻苯二甲酰亚胺(52.6g，0.36mol)，升至室温后搅拌过夜。反应结束后，加入1L的水，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相经过水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥，然后真空蒸干。蒸干后的残余物用PE/EA＝200∶1～20∶1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后得到白色固体，即为化合物4C(90.0g，产率71％)。
实施例13 (1R)-1-(N-环己基甲酰胺基甲基)-2-叔丁氧羰基-1，2，3，4-四氢异 喹啉(化合物4F)的制备
Figure PCTCN2014088713-appb-000008
向溶解有化合物4C(61g，0.15mol)的360mL乙醇中滴加60mL的水合肼，回流40min后冷至室温，浓缩后加入360mL的乙酸乙酯，搅拌30min，过滤掉生成的固体，将滤液浓缩得到黄色油状物化合物4D(41.4g)直接用于下一步反应。
化合物4D(41.4g，0.15mol)溶解于450mL的四氢呋喃中，将2mol/L的NaOH溶液(300mL，600mmol)加入并冷却到0℃。然后逐滴加入溶解在150mL THF中的化合物4E(27g，0.18mol)，搅拌2小时后加热到室温，搅拌过夜。反应结束后，加入600mL的水，用乙酸乙酯萃取。合并的有机相经水洗、饱和食盐水洗，然后无水硫酸钠干燥、真空干燥。干燥后用PE/EA＝20∶1～10∶1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后得到白色固体，即为化合物4F(40.5g，两步总产率70％)。
实施例14 左旋吡喹酮的制备
Figure PCTCN2014088713-appb-000009
化合物4F(90g，0.24mol)和HCl/EA(1.9L)的溶液在室温下搅 拌2小时，并用LC-MS检测。反应结束后，蒸去溶剂。蒸后的残余物溶解到二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗、饱和食盐水洗，浓缩后得到白色固体4G(66.9g)。将这个白色固体4G(66.9g，0.24mol)溶解到250mL的二氯甲烷并加入溶解在130mL二氯甲烷的乙酰氯(30.3g，0.26mol)，随后加入50％的NaOH溶液(77mL)。搅拌30分钟后，加入苄基三乙基氯化铵(TEBAC，5.5g，0.024mol)并加热回流2小时。反应结束后，加入380mL的水，并用二氯甲烷萃取。合并的有机相用水洗两次、5％的盐酸溶液清洗，然后用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。蒸去溶剂后，残余物用PE/EA＝20∶1～5∶1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后的产品在乙酸乙酯中进行重结晶得到白色固体(54.3g，三步总产率72％)，即为左旋吡喹酮。
产物核磁数据如下：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ1.26-1.30(m，3H)，1.46-1.63(m，3H)，1.72-1.88(m，5H)，2.43-2.56(m，1H)，2.77-2.87(m，2H)，2.90-3.25(m，2H)，3.84-4.10(m，1H)，4.35-4.49(m，1H)，4.79-4.87(m，2H)，5.15-5.18(d，1H)，7.17-7.19(d，2H)，7.24-7.28(d，2H)。
综上，本发明通过生物酶催化的合成途径具有很多优点，更适合大规模工业化生产。通过重组D-氨基酸氧化酶的高度立体选择性，催化化学合成的外消旋体中的某一对映体氧化成亚胺中间体并经硼烷胺络合物原位化学还原成消旋体，实现消旋体连续转化为单一手性异构体的方法。本发明采用新的酶催化手段，降低酶用量，安全环保。与现有技术相比，本发明改进了传统方法的不足之处，而且具有酶催化过程简单，后处理容易等优点，并且反应条件相对温和，各步反应操作简便，易于控制，并且可以套用现有工艺设备，减少设备投资，降低能耗和有机溶剂量，减少了环境污染，实现绿色生产。解决了近30年来悬而未解的高纯度左旋吡喹酮分离纯化的工业难题，为进一步进行临床前和临床成药性评价，大规模产业化生产左旋吡喹酮并进入国际市场铺平了道路。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

  1. 一种左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以式2a或2b表示的化合物来制备式1表示的中间体的步骤以及由式1表示的中间体来制备左旋吡喹酮的步骤：
    Figure PCTCN2014088713-appb-100001
    其中，式1、2a和2b中，X+相同，且代表与羧酸根离子相抗衡的阳离子部分；
    制备式1表示的中间体的方法如下：首先使式2a或2b表示的化合物与氧气或空气在重组D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的存在下发生氧化反应，然后使所述氧化反应所得产物在硼烷-胺基络合物的作用下发生还原反应生成所述式1表示的中间体。
  2. 根据权利要求1所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：式1、2a和2b中，X+表示H+、K+、Na+或NH4 +。
  3. 根据权利要求1所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：所述重组D-氨基酸氧化酶的制备方法为：将含有D-氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于37+1℃下过夜活化12～16小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于37±1℃下振荡培养，至OD600值达到0.6～0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.8mmol/L～1.0mmol/L，于30±1℃下继续培养8～10小时，离心，收集沉淀物，加入pH 7～9的磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎，再离心，将上清液预冻至温度降至-20℃～-30℃，然后冷冻干燥34～40小时，即得冻干的粉状重组D-氨基酸氧化酶。
  4. 根据权利要求1所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：所述硼烷-胺基络合物选自硼烷氨络合物、硼烷二甲胺络合物、硼烷-三乙胺络合物、硼烷叔丁胺络合物、硼烷二乙胺络合物以及硼烷N，N-二异丙基乙胺络合物中的一种或多种的组合。
  5. 根据权利要求1所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：使所述氧化反应和还原反应在pH 7.5～9.0的水相缓冲溶液中、温度15℃～40℃下进行。
  6. 根据权利要求5所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：所述水相缓冲溶液选自磷酸钠盐、磷酸钾盐、氨水中的一种或多种的组合。
  7. 根据权利要求5所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：使所述氧化反应和还原反应在20℃～40℃的温度下进行。
  8. 根据权利要求5或6或7所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：制备式1表示的中间体的步骤包括：将式2a或2b表示的化合物溶于所述水相缓冲溶液中，加入硼烷-胺基络合物，通入氧气或空气，加入重组D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶，搅拌下，于所述温度下开始反应，HPLC监测反应进程，至式2a或2b表示的化合物的含量低于1wt％时，停止反应。
  9. 根据权利要求8所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：停止反应后，加热使体系中的酶发生变性，过滤除酶，滤液中加入丙酮，过滤收集析出的粗品固体，再用水和丙酮的混合溶剂进行重结晶，即得到所述式1表示的中间体。
  10. 根据权利要求1所述的左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于：从式1表示的中间体制备左旋吡喹酮的路线如下：
    Figure PCTCN2014088713-appb-100002
    上述式3至式7中，R相同，且表示氨基保护基。
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