CN101194020A - L-氨基酸的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是由氨基酸的对映异构体混合物酶促生成L－氨基酸的L－氨基酸的制造方法，其特征是包含使转化体或其产物与氨基酸对映异构体混合物接触步骤，其中所述转化体是将编码转化D－氨基酸为酮酸的酶的碱基序列和编码转化酮酸为L－氨基酸的酶的碱基序列重组到相同或者不同的表达载体中，得到一种或多种重组载体，再将所述重组载体导入同一个宿主而形成的转化体。根据本发明的L－氨基酸制造方法，可以在同一个步骤中进行D－氨基酸转化成酮酸的反应和酮酸转化成L－氨基酸的反应，并且可以高浓度地蓄积得到可以转化出L－氨基酸的转化体，并可以使用前述转化体从廉价的原料高效地生产L－氨基酸。
Description
技术领域
本发明涉及以氨基酸的对映异构体混合物为原料，使用表达转化D-氨基酸为酮酸的酶和转化酮酸为L-氨基酸的酶的转化体制造L-氨基酸的方法。
背景技术
近年来，在医药品、农药、食品、饲料、香料等领域，合成光学活性体变得越来越重要。这是因为对映体之间有时生理活性不同，如何得到纯光学活性体正逐渐成为产业上重要的课题。其中，L-氨基酸特别是天然型的L-氨基酸，作为容易获得的光学活性合成单体，其衍生物合成已经被广泛研究。而且，对于具有非天然型结构的产物也在进行应用开发，获得纯光学活性体的重要性日益提高。
以往，人们所知的非天然型的L-氨基酸的合成方法如下。
(1)以酰化的外消旋体为原料，通过L-氨基酰化酶生产L-氨基酸的方法(Method Enzymol.，3，554，(1957))
(2)用L-乙内酰脲酶将乙内酰脲开环后，通过L-甲氨酰酶等使之脱去氨基甲酰基，生成L-氨基酸的方法(Agric.Biol.Chem.，51，729(1087))
(3)以酰胺化的外消旋体为原料，通过酰胺酶生成L-氨基酸的方法(Method Enzymol.，3，554，(1957))
(4)以外消旋体为原料，选择性地分解D型体，使L-氨基酸残留的方法(Biotechnol.Bioeng.，14，1288(1994))
(5)通过酮酸的还原氨基化合成L-氨基酸的方法(特开平10-23896号公告)
但是，上述任何一种方法都不能满足工业生产的需要，例如，前述的方法(5)就有原料酮酸一般很昂贵、不适合作为工业原料的问题。制造L-氨基酸时，有些时候根据氨基酸的结构，不用酮酸而用外消旋氨基酸则比较廉价。另一方面，采用以外消旋体为原料的单一光学拆分制造方法，L-氨基酸的理论收率不会超过50％。要提高收率就需要另行外消旋化，仅采用光学拆分，不需要的D型体就成为废弃物，理论收率很难接近100％。
作为将不需要的D型体再循环以提高收率的方法，人们尝试了设置立体反转D型体步骤的方法，或将通过利用酶活性转化将不需要的D型体成酮酸的步骤，和将酮酸氨基化转化成L-氨基酸的步骤相组合的方法。例如，有人报道了如下实例，其是以外消旋体为原料，将其全部变成L-氨基酸的方法。
(6)酶促合成法：以外消旋氨基酸为原料，通过酵母细胞或者D-氨基酸氧化酶和过氧化氢酶的作用将D型体转化成酮酸，接着通过L-氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的作用将酮酸转化成L型体(BiomolecularEngineering，17，167(2001))。
(7)酶促和化学方法并用的合成方法：其特征是以外消旋氨基酸为原料，通过D-氨基酸氧化酶的作用氧化D型体，生成中间体亚胺，接着通过应用氢化物还原剂或者使用金属催化剂的接触氢化还原亚胺，再生外消旋氨基酸(外消旋化)，重复上述步骤，得到L型体。(Chem.Comm.，246(2002))。
但是，前述(6)的方法有很多问题，例如：要利用微生物等大量表达各步骤中使用的至少2种酶，并回收、纯化，或者需要另外购入市售酶来制备纯化酶，因而不够经济；由于添加多种酶，反应液的制备方法复杂，等等。而在前述(7)的方法中，则有还原反应使用有害的金属催化剂、需要加压条件、产物的蓄积浓度低等问题。
另外，国际公开第WO2005-090590号小册子中披露了D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸脱氢酶、辅酶NADH再生酶和(根据情况)过氧化氢酶的浓度或者活性有所提高的重组微生物，以及利用它们制造L-氨基酸类的方法。实施例中记载了通过使用导入了两个重组载体的转化体的方法制造L-甲硫氨酸以及L-亮氨酸的实例，其中所述重组载体表达原生节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)来源或者变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)来源的D-氨基酸氧化酶、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)来源的亮氨酸脱氢酶、以及辅酶NADH再生酶中的1种或2种酶。但是，这种方法中底物浓度非常低，为25mM左右，所以有工业化困难的问题。而且没有兼用过氧化氢酶的实施例，没有具体显示兼用过氧化氢酶的效果。
非专利文献1：Method Enzymol.，3，554，(1957)
非专利文献2：Agric.Biol.Chem.，51，729(1087)
非专利文献3：Biotechnol.Bioeng.，14，1288(1994)
非专利文献4：Biomolecular Engineering，17，167(2001)
非专利文献5：Chem.Comm.，246(2002)
专利文献1：特开平10-23896号公告
专利文献2：国际公开第WO2005-090590号小册子
发明内容
发明拟解决的问题
本发明的目的在于提供：能够在同一体系内进行将D-氨基酸转化成酮酸的反应和将酮酸转化成L-氨基酸的反应、并且能够以高蓄积浓度转化出L-氨基酸的转化体，以及利用该转化体从廉价原料高效生成L-氨基酸的L-氨基酸制造方法。
本发明的另一目的在于提供除具有上述特性外，能够利用补偿主反应的酶活性以更高的效率转化出L-氨基酸的转化体，以及利用该转化体从廉价原料高效生成L-氨基酸的L-氨基酸制造方法。
本发明的另一目的在于提供在使用高底物浓度时也能够以高收率得到L-氨基酸的生产性能优越的L-氨基酸制造方法，以及用于该方法的转化体。
解决问题的方法
本发明人等为解决上述课题进行了深入研究，结果发现通过利用同时表达转化D型体成酮酸的酶和转化酮酸成L-氨基酸的酶的转化体，能够在一罐中(同一个体系中)进行两种反应，而且能够用廉价的原料高浓度蓄积L-氨基酸，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供由氨基酸的对映异构体混合物酶促生成L-氨基酸的L-氨基酸制造方法(以下，有些情况下称为“本发明的L-氨基酸制造方法1”或者“方法1”)，其特征是包括下述步骤：其特征在于包括使转化体或其处理物与氨基酸对映异构体混合物接触的步骤，所述转化体是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列和编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列重组到同一或者不同的表达载体中，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。
本发明的方法1中，前述转化体可以是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列和编码辅酶再生酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。前述转化体还可以是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列和编码过氧化氢分解酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。
本发明中，转化D-氨基酸成酮酸的酶可以是D-氨基酸氧化酶及/或D-氨基酸脱氢酶。前述D-氨基酸氧化酶包括例如选自博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、变异三角酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的至少一种微生物来源的D-氨基酸氧化酶。前述D-氨基酸脱氢酶可以是大肠杆菌(Escherichia coli)来源的D-氨基酸脱氢酶。前述将酮酸转化成L-氨基酸的酶可以是L-氨基酸脱氢酶及/或L-氨基酸氨基转移酶。前述L-氨基酸脱氢酶包括中间型高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)来源的苯丙氨酸脱氢酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶、热链形芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)来源的丙氨酸脱氢酶、希瓦氏菌属菌种(Shewanellaspecies)来源的丙氨酸脱氢酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶、以及球形芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶。
本发明中的辅酶再生酶可以是甲酸脱氢酶。该甲酸脱氢酶中包含母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)来源的甲酸脱氢酶。前述过氧化氢分解酶可以是过氧化氢酶。该过氧化氢酶可以是大肠杆菌来源的过氧化氢酶。
本发明方法1中的优选方案例如是这样的方法：其中将D-氨基酸转化成酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶，将酮酸转化成L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶，辅酶再生酶是甲酸脱氢酶且过氧化氢分解酶是过氧化氢酶。更优选的方案例如是这样的方法：其中D-氨基酸氧化酶来源于博伊丁假丝酵母，L-氨基酸脱氢酶是中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌，过氧化氢酶来源于大肠杆菌。
本发明中的L-氨基酸优选使用L-正缬氨酸等。
此外，本发明还提供将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列、编码辅酶再生酶的碱基序列和编码过氧化氢分解酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。
本发明的转化体的优选方案例如是这样的转化体：其中将D-氨基酸转化成酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶，将酮酸转化成L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶，辅酶再生酶是甲酸脱氢酶，且过氧化氢分解酶是过氧化氢酶。更优选的方案例如是这样的转化体：其中D-氨基酸氧化酶来源于博伊丁假丝酵母，L-氨基酸脱氢酶是中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌，过氧化氢酶来源于大肠杆菌。
本发明还提供将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列、编码辅酶再生酶的碱基序列和编码过氧化氢分解酶的碱基序列整合到同一表达载体而得到的重组载体。
本发明的重组载体的优选方案例如是这样的重组载体：其中将D-氨基酸转化成酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶，将酮酸转化成L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶，辅酶再生酶是甲酸脱氢酶，过氧化氢分解酶是过氧化氢酶。更优选的方案例如是这样的重组载体：其中D-氨基酸氧化酶来源于博伊丁假丝酵母、L-氨基酸脱氢酶是中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌、过氧化氢酶来源于大肠杆菌。
本发明还提供从氨基酸的对映异构体混合物酶促生成L-氨基酸的L-氨基酸制造方法(以下，有些情况称为“本发明的L-氨基酸的制造方法2”或者“方法2”)，其特征是至少具有两个不同的反应步骤即氧化步骤和还原步骤，其中，所述氧化步骤使用共表达转化D-氨基酸为酮酸的酶和过氧化氢分解酶的转化体或其处理物，主要氧化D-氨基酸；而所述还原步骤使用共表达从酮酸生成L-氨基酸的酶和可选的辅酶再生酶的转化体或其处理物，主要从酮酸合成L-氨基酸。本发明的方法2中，可以使用上述本发明的转化体。
本发明的方法2可以是在不同的反应条件下进行氧化步骤和还原步骤的方法。例如，本发明的方法2可以在通入含氧气体的条件下进行氧化步骤，而在不通入含氧气体的条件下，或者在以比氧化步骤时低的通气量通入含氧气体的条件下进行还原步骤。
本发明的方法2包括例如：氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟1体积％以上、还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液低于每分钟10体积％的方法；优选氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟2体积％以上、还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液低于每分钟2体积％的方法；更优选氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟5体积％以上、还原步骤中含氧气体的通气量为相对于反应液低于每分钟5体积％的方法。另外，本发明的方法2还可以是氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟1体积％以上、还原步骤中基本上不通入含氧气体的方法。
本发明的方法2可以是氧化步骤中的反应液pH调至7.0～9.5，还原步骤中的反应液pH调至6.0～8.5且低于氧化步骤中的pH的值的方法；尤其可以是氧化步骤中的反应液pH调至7.5～9.0，还原步骤中的反应液pH调至6.5～8.0的方法。
而且，本发明的方法2可以在从氧化步骤转到还原步骤之前或之后，向反应液中额外添加上述本发明的转化体或其产物。
本发明的方法1和方法2可以用甲酸或其盐调整转化D-氨基酸为酮酸的反应的pH。
此外，本发明的方法1和方法2可以使用含有相对于原料氨基酸对映异构体混合物的0.2当量以上的甲酸根离子和/或铵离子的反应液。
并且，本说明书中的“酶”可以是将构成该酶的氨基酸的一部分用缺失、取代和/或添加等基因工程手段使之变异而得到的变体，只要其具有目的酶活性即可。此外，“本发明的方法”的含义是上述本发明的方法1和方法2的统称。
发明的效果
本发明利用表达特定的酶的一个转化体，能够在一罐内(同一体系内)进行利用酶活性的D-氨基酸转化成酮酸的反应和酮酸转化成L-氨基酸的反应，所以能够高效且高浓度地蓄积L-氨基酸。因此，能够使用廉价的氨基酸对映异构体混合物为原料，通过少数步骤以100％的理论收率生产L-氨基酸。
尤其是当包含将D-氨基酸氧化成酮酸的氧化步骤时，因为在同一宿主内表达过氧化氢分解酶，所以可以用温和的反应条件避免酮酸的分解，能够以优异的生产性能获得L-氨基酸。
附图说明
(图1)制造例1中使用的质粒pSE420U的限制性内切酶图谱。
(图2)制造例1中使用的质粒pSUCBDO1的限制性内切酶图谱。
(图3)制造例2中使用的质粒pUCTVDOT的限制性内切酶图谱。
(图4)制造例2中使用的质粒pSUTVDO1的限制性内切酶图谱。
(图5)制造例3中使用的质粒pUCECDD1的限制性内切酶图谱。
(图6)制造例3中使用的质粒pETECDD1的限制性内切酶图谱。
(图7)制造例4中使用的质粒pSU-MF26的限制性内切酶图谱。
(图8)制造例5中使用的质粒pSF-GSA2的限制性内切酶图谱。
(图9)制造例6中使用的质粒pSF-BTA1的限制性内切酶图谱。
(图10)制造例7中使用的质粒pSFBPAD1的限制性内切酶图谱。
(图11)制造例8中使用的质粒pSF-SAD1的限制性内切酶图谱。
(图12)制造例9中使用的质粒pEGSLED2的限制性内切酶图谱。
(图13)制造例9中使用的质粒pFGSLED1的限制性内切酶图谱。
(图14)制造例10中使用的质粒pSFBPLD1的限制性内切酶图谱。
(图15)制造例11中使用的质粒pSU-TIP2的限制性内切酶图谱。
(图16)制造例11中使用的质粒pSF-TIP2的限制性内切酶图谱。
(图17)制造例12中使用的质粒pSE-ECB 1的限制性内切酶图谱。
(图18)制造例13中使用的质粒pSE-BSB 1的限制性内切酶图谱。
(图19)实施例1中构建质粒pSFTPCO1的限制性内切酶图谱。
(图20)实施例2中构建质粒pSFGACO1的限制性内切酶图谱。
实施发明的最优方式
本发明的L-氨基酸制造方法1是由氨基酸的对映异构体混合物酶促生成L-氨基酸的方法，其特征是包含使转化体或其处理物与氨基酸对映异构体混合物接触的步骤，所述转化体是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列和编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体中，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。即，本发明的L-氨基酸制造方法1是以氨基酸的对映异构体混合物为原料，利用一个转化体表达的酶，通过在一罐内(同一体系内)进行将D-氨基酸转化成酮酸的反应和将酮酸转化成L-氨基酸的反应(以下，有些情况将两反应合称为“主反应”)，以100％的理论收率生成L-氨基酸的方法。
本发明的L-氨基酸制造方法1包括下述步骤：对上述构成的转化体进行诱导表达，获得含有目的转化酶的培养物的培养步骤；以及通过利用该培养物的酶促反应将氨基酸对映异构体混合物中含有的D-氨基酸转化成L-氨基酸的反应步骤。
培养步骤即下述步骤：将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列和编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列整合到同一或不同的表达载体中，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主，对形成的转化体进行诱导表达获得含有目的转化酶的培养物。
本发明中使用的转化D-氨基酸为酮酸的酶没有特别限定，只要是作用于D-氨基酸生成对应的酮酸的酶即可，例如D-氨基酸氧化酶和D-氨基酸脱氢酶等。
D-氨基酸氧化酶可以利用例如D-氨基酸氧化酶、由构成前述酶的氨基酸的一部分发生缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成的、且可表现前述D-氨基酸氧化酶活性的多肽等。
前述的D-氨基酸氧化酶分属于EC 1.4.3.1、EC 1.4.3.3、EC 1.4.3.7、EC1.4.3.15、EC 1.4.3.19等，具有以氧为电子受体、在水存在下将D-氨基酸氧化脱氨基化、生成对应的酮酸和过氧化氢的酶活性。此外，还发现了以氧为电子受体，氧化氨基酸形成亚胺但不生成过氧化氢的D-氨基酸氧化酶，本发明的D-氨基酸氧化酶也包含这些酶。
D-氨基酸氧化酶可以是任何生物来源的，例如可以应用假丝酵母属(Candida)、三角酵母属(Trigonopsis)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红酵母属(Rhodotorula)等微生物来源的酶；人、小鼠、猪、兔等哺乳动物的肝脏来源的酶(Biochemistry，26，3612(1987))等。
前述微生物来源的酶的具体实例包括原生节杆菌来源(欧洲专利申请公开第1375649号说明书)、博伊丁假丝酵母来源(Yeast，16，1217(2000))、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源(J.Biotechnol.104，5(2003))、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源(Environ.Microbiol.4，799(2002))、纤细红酵母(Rhodotorula gracilis)来源(J.Bacteriol.，58，115(1997))、变异三角酵母来源(特公平7-108225号公告)、茄病镰孢(Fusarium solani)来源(J.Biochem.，108，1063(1990))、粟酒裂殖酵母来源的酶等。
其中，优选博伊丁假丝酵母DSM 70026菌株等假丝酵母属来源的D-氨基酸氧化酶、变异三角酵母CBS 4095菌株等三角酵母属来源的D-氨基酸氧化酶等。
D-氨基酸脱氢酶可以利用例如D-氨基酸脱氢酶、由构成前述酶的氨基酸的一部分发生缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成的、且可表现前述D-氨基酸脱氢酶活性的多肽等。
前述D-氨基酸脱氢酶分属于EC 1.4.99.1等，具有以2，6-二氯靛酚(DCIP)等为电子受体、将D-氨基酸氧化脱氨基化生成对应的酮酸的酶活性。
D-氨基酸脱氢酶可以是任何生物来源的，例如埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、沙门氏菌属(Salmonella)、黄杆菌属(Flavobacterium)等微生物来源的酶等。
前述微生物来源的酶的具体实例有大肠杆菌来源的酶(J.Bacteriol.，176，1500(1994))、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的酶(Curr.Microbiol.41，290(2000))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)来源的酶(Nature，413，852(2001))、黄杆菌属菌种(Flavobacterium sp)来源的酶(J.Gen.Microbiol.133，745-754(1987))等微生物来源的酶等。
其中，优选使用大肠杆菌K-12菌株等埃希氏菌属(Escherichia)来源的D-氨基酸脱氢酶。
本发明中的转化D-氨基酸成酮酸的酶活性可以用以下方法测定。D-氨基酸氧化酶活性如下测定：反应液含有100mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)、10mM D-氨基酸、0.5mM 4-氨基安替比林、2mM苯酚、5U/mL过氧化物酶，采用在30℃进行反应的方法，将1分钟催化生成0.5μmol的醌亚胺(quinonimine)的酶量定义为1U。D-氨基酸脱氢酶活性如下测定：反应液含有100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、10mM D-氨基酸、0.1mM 2，6-二氯靛酚钠盐(DCIP)，采用在30℃进行反应的方法，将1分钟减少1μmol的DCIP的酶量定义为1U。
本发明中使用的转化酮酸成L-氨基酸的酶，没有特别限定，只要是作用于酮酸生成对应的L-氨基酸的酶即可，例如L-氨基酸脱氢酶和具有L-氨基酸氨基转移酶的多肽等。
前述L-氨基酸脱氢酶具有例如在NAD(P)H和氨存在下将α-酮酸还原氨基化生成对应的L-氨基酸的酶活性。这样的L-氨基酸脱氢酶包括：例如丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.1)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)、L-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.5)、丝氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.7)、缬氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.8)、亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)、甘氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.10)、赖氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.15)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)和苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)等。
L-氨基酸脱氢酶可以是任何生物来源的，例如可以使用微生物来源的酶；人、小鼠、猪、牛等哺乳动物来源的酶等。
前述的丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.1)包括例如嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶(Biochemistry，29，1009(1990))、热链形芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶(Biochimie，71，559(1989))、希瓦氏菌属菌种来源的丙氨酸脱氢酶(Appl.Environ.Microbiol.，65，4014(1999))和球形杆菌IFO 3525来源的丙氨酸脱氢酶(Biochemistry，29，1009(1990)；登录号M33298)等生物来源的丙氨酸脱氢酶等。
前述的谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4)包括例如牛肝脏来源的谷氨酸脱氢酶(J.Biochem.Mol.Biol.，36，545(2003))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的谷氨酸脱氢酶(J.Bacteriol.，180，6298(1998))、嗜热硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)来源的谷氨酸脱氢酶(Biochemistry，203，81(1992))、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的谷氨酸脱氢酶(Biochemistry，217，469(1993))等生物来源的谷氨酸脱氢酶。
前述L-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.5)包括例如专性厌氧菌等生物来源的L-氨基酸脱氢酶。
前述丝氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.7)包括例如根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)来源的丝氨酸脱氢酶(登录号AB032242)等微生物来源的酶等。
前述缬氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.8)包括例如噬纤维菌属菌种(Cytophagasp)来源的缬氨酸脱氢酶(登录号AF339150)等生物来源的缬氨酸脱氢酶等。
前述亮氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.9)包括例如嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(Biochemistry，27，9056(1998))、球形杆菌(Bacillus sphaericus)来源的亮氨酸脱氢酶等生物来源的酶等。
前述甘氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.10)包括例如大肠杆菌来源的甘氨酸脱氢酶(Eur.J.Biochem.216，539(1993))等生物来源的甘氨酸脱氢酶等。
前述赖氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.15)包括例如嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的赖氨酸脱氢酶(Appl.Environ.Microbiol.70，937(2004))等生物来源的酶等。
前述苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)包括例如中间型高温放线菌来源(J.Biochem.，109，371(1991))的苯丙氨酸脱氢酶、短杆菌属菌种(Brevibacteriumsp)来源的苯丙氨酸脱氢酶(特开昭63-157986号公告)、尿素芽孢八叠球菌(Sporosarcina urea)来源的苯丙氨酸脱氢酶(特开昭61-239887号公告)、球形杆菌来源的苯丙氨酸脱氢酶(特开昭63-157986号公告)、粟褐芽孢杆菌(Bacillus badius)来源的苯丙氨酸脱氢酶(特开昭63-157986号公告)、红球菌属菌种(Rhodococcussp)来源的苯丙氨酸脱氢酶(特开昭61-146183号公告)、诺卡氏菌属菌种(Nocardia sp)来源的苯丙氨酸脱氢酶(Arch.Microbiol.，153，12(1989))、太平洋盐单胞菌(Halomona pacifica)来源的苯丙氨酸脱氢酶(特开2002-65270号公告)等生物来源的苯丙氨酸脱氢酶等。
其中，优选嗜热杆菌属(Geobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、嗜热放线菌属(Thermoactinomyces)等微生物来源的L-氨基酸脱氢酶。优选的L-氨基酸脱氢酶的具体实例如：中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶、热链形芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶、球形芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶、希瓦氏菌属菌种来源的来源的丙氨酸脱氢酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶和球形杆菌来源的亮氨酸脱氢酶等。
L-氨基酸氨基转移酶具有将氨基从L-谷氨酸、L-天冬氨酸等氨基供体上转移到α-酮酸，生成对应的L-氨基酸的酶活性。这样的L-氨基酸氨基转移酶包括丙氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.2)、半胱氨酸氨基转移酶(EC2.6.1.3)、甘氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.4)、苏氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.5)、亮氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.6)、色氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.27)、组氨酸氨基转移酶(EC 2.6.1.38)、支链氨基酸氨基转移酶(EC 2.6.1.42)、芳香族L-氨基酸氨基转移酶(EC 2.6.1.57)等。
L-氨基酸氨基转移酶可以是任何生物来源的，例如可以使用微生物来源的酶；人、大鼠、小鼠等哺乳动物来源的酶等。
L-氨基酸氨基转移酶的代表实例有：例如稻(Oryza sativa)来源的丙氨酸氨基转移酶(Plant.Mol.Biol.39，149(1999))；大鼠等哺乳动物来源的半胱氨酸氨基转移酶(Physiol.Chem.Phys.，10，483(1978))；人、大鼠等哺乳动物来源的甘氨酸氨基转移酶(J.Biol.Chem.，242，3614(1967))；大鼠等哺乳动物来源的苏氨酸氨基转移酶(Anal.Biochem.，95，188(1979))；大鼠等哺乳动物来源的亮氨酸氨基转移酶(Biochim.Biophys.Acta，445，622(1976))；灰色链霉菌(Streptomyces griseus)来源的色氨酸氨基转移酶(J.Biol.Chem.，250，7819(1975))；睾丸酮假单胞菌(Pseudomonastestosteroni)来源的组氨酸氨基转移酶(Biochem.J.，147，727(1975))等。
支链氨基酸氨基转移酶包括例如大肠杆菌来源的支链氨基酸氨基转移酶(J.Biochem.，97，993(1985))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的支链氨基酸氨基转移酶(J.Bacteriol.，179，496(1997))等生物来源的支链氨基酸氨基转移酶等。芳香族氨基酸氨基转移酶例如大肠杆菌来源的芳香族氨基酸氨基转移酶(Biochem.Biophys.Res.Commun.，133，134(1985))、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)来源的芳香族氨基酸氨基转移酶(特开平01-153084号公告)等生物来源的芳香族氨基酸氨基转移酶。
其中，优选使用支链氨基酸氨基转移酶，尤其是优选使用大肠杆菌K-12菌株等埃希氏菌属(Escherichia)来源的支链氨基酸氨基转移酶；枯草芽孢杆菌等芽孢杆菌属(Bacillus)来源的支链氨基酸氨基转移酶等微生物来源的氨基酸氨基转移酶。
本发明中转化酮酸成L-氨基酸的酶活性可以用如下方法测定。即，L-氨基酸脱氢酶活性可如下测定：反应液含有200mM甘氨酸-KCl-KOH缓冲液(pH10.5)、10mML-氨基酸、2.5mM NAD+，采用在30℃进行反应的方法，将1分钟生成1μmol NADH的酶量定义为1U。L-氨基酸氨基转移酶活性可如下测定：反应液含有100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、50mM氯化铵、10mMα-酮异己酸钠、40mM L-氨基酸(氨基供体)、0.05mM 5’-磷酸吡哆醛、0.2mM NADPH、5U/mL变形杆菌属菌种(Proteus species)来源的谷氨酸脱氢酶(东洋纺公司制造)，采用在30℃进行反应的方法，将1分钟减少1μmol的NADPH的酶量定义为1U。
在本发明中，可以在不阻碍上述酶活性的范围内，将编码其他酶的碱基序列与编码目的转化酶的碱基序列整合到同一表达载体或不同表达载体中。所述其他酶可以使用例如分解抑制主反应进行的物质的酶(例如过氧化氢分解酶等)、再生主反应中被消耗的基质的酶(例如辅酶再生酶等)。
前述过氧化氢分解酶通过分解、除去在利用D-氨基酸氧化酶的反应中附带产生的、抑制主反应进行的过氧化氢的作用，能够使反应有效的进行。前述的过氧化氢分解酶可以利用例如过氧化氢酶，以及由构成该过氧化氢酶的氨基酸的一部分发生缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成的、且表现过氧化氢分解酶活性的多肽(类过氧化氢酶)等。所述过氧化氢酶可以利用微生物等来源的公知的过氧化氢酶，例如大肠杆菌来源的过氧化氢酶等。具体的大肠杆菌来源的过氧化氢酶的例子例如katE(J.Biol.Chem.，254，11664-11668(1979))和katG(J.Biol.Chem.，254，4245-4252(1979))等都是适宜的。
过氧化氢的分解活性(过氧化氢酶活性)可以通过例如如下的方法测定：反应液由50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.035％过氧化氢组成，采用在30℃进行反应的方法，将1分钟分解1μmol的过氧化氢的酶量定义为1U。
前述的辅酶再生酶通过再生伴随L-氨基酸脱氢酶催化的反应进行被消耗的辅酶NAD(P)H的作用，能够使主反应顺利地进行。在本发明中，可以使用的具有再生辅酶NAD(P)H的作用的转化体例如：将整合了目的转化酶的相应碱基序列的一种或多种重组载体导入到保持有再生辅酶NAD(P)H活性的宿主中形成的转化体；将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码L-氨基酸脱氢酶的碱基序列和编码辅酶再生酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。
前述具有NAD(P)H再生作用的宿主可以使用广泛的微生物，通过该微生物具有的糖酵解系统、甲基营养菌的C1化合物同化途径等再生辅酶。
前述的辅酶再生酶可以利用例如辅酶再生酶，以及由构成该辅酶再生酶的氨基酸的一部分发生缺失、取代和/或添加而得到的氨基酸序列组成的、且表现辅酶再生酶活性的多肽等。
前述辅酶再生酶可以列举例如甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶)等。辅酶再生酶可以是任何生物来源的，优选使用分枝杆菌属(Mycobacterium)来源的甲酸脱氢酶，芽孢杆菌属(Bacillus)、热原体属(Thermoplasma)来源的葡萄糖脱氢酶等。具体的辅酶再生酶可以利用例如：NADH再生酶有母牛分枝杆菌来源等的甲酸脱氢酶；NAD(P)H再生酶有枯草芽孢杆菌来源、Thermoplasma acidphilum来源、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源、蜡状芽孢杆菌来源等的葡萄糖脱氢酶等。
前述辅酶再生酶的活性可以用如下的方法测定。例如，甲酸脱氢酶活性如下测定：反应液含有100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、100mM甲酸钠、2.5mM NAD+，采用在30℃进行反应的方法，将1分钟催化生成1μmol的NADH的酶量定义为1U。
本发明中，编码酶的碱基序列只要是编码表现目的酶活性的多肽的碱基序列即可，包括例如：一部分或者全部已在DDBJ公开的已知碱基序列，从纯化的酶测定氨基酸序列、确定该氨基酸序列的相应碱基序列等。这些碱基序列可以利用PCR等扩增方法、化学合成方法等已知的方法制备。
表达载体可以使用质粒载体或者噬菌体载体等。表达载体可以根据宿主的种类、整合基因的种类和数量等适当选择。这些表达载体可以单独或者数个组合使用。与宿主对应的表达载体的具体例子示例地有后述的载体。
在本发明中，重组载体可使用将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体中得到的一种或多种重组载体。其中，优选使用将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列整合到同一表达载体的重组载体。重组载体还可以将其他酶的相应碱基序列整合到与整合了上述碱基序列的表达载体同一或者不同的表达载体中。
本发明中的重组载体的代表例有例如；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列和转化酮酸为L-氨基酸的酶的相应碱基序列整合到同一表达载体而成的双基因表达重组载体；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列、转化酮酸为L-氨基酸的酶的相应碱基序列和任意其他酶的相应碱基序列整合到同一表达载体而成的多基因表达重组载体；整合了转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列的单基因表达重组载体，与将转化酮酸为L-氨基酸的酶的相应碱基序列整合到与前者不同的表达载体而成的单基因表达重组载体的组合；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列、转化酮酸为L-氨基酸的酶的相应碱基序列、以及任意其他酶的相应碱基序列中至少两种碱基序列整合到同一表达载体而成的多基因表达重组载体，与将一种碱基序列整合到与之不同的表达载体而成的单基因表达重组载体的组合；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列整合到表达载体而成的单基因表达重组载体，将转化酮酸为L-氨基酸的酶的相应碱基序列整合到与前者不同的表达载体而成的单基因表达重组载体，和将任意其他酶的相应碱基序列组合到与前两者均不同的表达载体而成的重组载体的组合；等等。
其中，优选使用表达多个基因的单一重组载体，这是因为其可以在没有不相容性问题的条件下得到转化体，且操作性、可控性优越。这样的重组载体例如：将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列和编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列整合到同一表达载体而成的重组载体；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列、转化酮酸为L-氨基酸的酶的相应碱基序列和任意其他酶的相应碱基序列整合到同一表达载体的多基因表达重组载体；等等。
当转化D-氨基酸成酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶时，为了抑制副产物过氧化氢造成的酮酸分解，减少D-氨基酸氧化反应所需的氧量，使主反应顺利进行，优选使用以过氧化氢分解酶，优选过氧化氢酶作为所述“任意其他酶”的重组载体或者其组合。这样的重组载体及其组合的具体例子有：例如，将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列、转化酮酸为L-氨基酸的酶的相应碱基序列、过氧化氢分解酶的相应碱基序列和辅酶再生酶的相应碱基序列整合到同一表达载体中的四基因表达重组载体；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列、L-氨基酸脱氢酶的相应碱基序列和过氧化氢分解酶的相应碱基序列整合到同一表达载体中的三基因表达重组载体；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列和过氧化氢分解酶的相应碱基序列整合到同一表达载体中而成的双基因表达重组载体，与将对应于转化酮酸为L-氨基酸脱氢酶的碱基序列和辅酶再生酶的相应碱基序列整合到与前者不同的表达载体中而成的双基因重组表达载体的组合；等等。
此外，当转化酮酸为L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶时，为了使主反应顺利进行，优选使用以辅酶再生酶作为所述“任意其他酶”的重组载体或者其组合。这样的重组载体及其组合的具体例子有：例如，将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列、L-氨基酸脱氢酶的相应碱基序列和辅酶再生酶的相应碱基序列整合到同一表达载体中的三基因表达重组载体；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列、L-氨基酸脱氢酶的相应碱基序列和辅酶再生酶的相应碱基序列中至少两种碱基序列整合到同一表达载体中的多基因表达重组载体，与将一种碱基序列整合到与之不同的表达载体中的单基因表达重组载体的组合；将转化D-氨基酸为酮酸的酶的相应碱基序列整合到表达载体的单基因表达重组载体、将L-氨基酸脱氢酶的碱基序列整合到与前者不同的表达载体中的单基因表达重组载体、与将辅酶再生酶的相应碱基序列整合到与前两者均不同的表达载体中的重组载体的组合；等等。
通过重组载体导入到宿主内的碱基序列，可以直接从重组载体转录、翻译表达酶活性，也可以以导入的碱基序列整合到宿主染色体上的形式表达。重组载体的构建是通过在表达载体上以可表达的方式整合目的转化酶的相应碱基序列的方法进行的。所述以可表达的方式组合目的转化酶的相应碱基序列的方法通常使用在目的碱基序列近旁整合启动子、终止子等表达调控相关区域(表达调控单元)的方法。例如，将多个编码基因的碱基序列以任意顺序导入同一表达载体时，可以根据宿主生物的种类适当选择利用下述方法：将启动子、终止子等表达调控单元分别连接于各基因的方法，或者作为如乳糖操纵子那样的含有多个顺反子的操纵子进行表达的方法等。
这样的重组载体的优选结构有：例如在目的碱基序列的5’侧上游配置启动子的结构，更优选除前述启动子外，在3’侧下游配置终止子的结构等。关于相应于宿主生物的种类可以利用的载体、启动子和终止子，在《微生物学基础讲座8基因工程学》(共立出版)，特别是关于酵母在Adv.Biochem.Eng.43，75-102(1990)、Yeast 8，423-488(1992)等中有详细叙述。此外，以家蚕等昆虫(Nature 315，592-594(1985))等动物和油菜、玉米、马铃薯等植物植物为宿主，已开发了在相应宿主中大量表达异源蛋白质的系统，可以适宜地加以利用。适合于宿主种类的重组载体的构建可以基于分子生物学、生物工程、基因工程领域中常用的技术进行(例如Sambrook等，MolecularCloning，Cold Spring Harbor Laboratories)。
重组载体的具体组成例有：例如，在对pSE420D(特开2000-189170号公告)进行改造得到的三基因表达载体pSE420U中、依次插入博伊丁假丝酵母来源的D-氨基酸氧化酶基因、母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶、中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶基因而获得的质粒pSFTPCO1；按照不同的顺序插入博伊丁假丝酵母来源的D-氨基酸氧化酶基因、母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶和嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶基因而获得的质粒pSFGACO1、pSFTPCO2、pSFTPCO3等。还可以列举出：共表达博伊丁假丝酵母来源的D-氨基酸氧化酶基因和大肠杆菌来源的过氧化氢酶基因的重组载体pSCCBDO1；共表达编码母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的基因和编码中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶的基因的重组载体pSF-TIP2；共表达博伊丁假丝酵母来源的D-氨基酸氧化酶基因、大肠杆菌来源的过氧化氢酶基因、中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶基因、母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的基因等4个基因的pSFCPCO1，等等。
导入重组载体的宿主没有特别限制，只要是能够导入一个或者数个含有上述酶的相应碱基序列的重组载体，并能够表达目的酶的生物即可，可以从微生物、植物、动物等广泛的生物从适当选择加以应用。
作为可以利用作为宿主的微生物，通常可以使用已开发了可供其作为宿主时利用的表达载体系统的微生物，例如：埃希氏菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、短杆菌属、棒状杆菌属、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)等细菌；红球菌属、链霉菌属等已开发了宿主载体系统的放线菌；酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属等已开发了宿主载体系统的酵母；脉孢菌属(Neurospora)；曲霉(Aspergillus)属、头孢子菌属(Cephalosporium)；等等。
本发明中，视宿主的种类所使用的表达载体与表达调控单元(启动子、终止子等)的组合的具体例子如下所示。
宿主是埃希氏菌属，例如大肠杆菌等时，可以列举出如下组合：pBR、pUC系列质粒载体；lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌体PL、PR等来源的启动子；终止子是由trpA来源、噬菌体来源、rrnB核糖体RNA来源的终止子。其中，可以优选使用将市售的pSE420(Invitrogen制造)的多克隆位点一部分进行改造而得到的载体pSE420D(特开2000-189170号公报)、可共表达3个基因的载体pSE420U、可共表达4个基因的载体pSE420Q。
当宿主是芽孢杆菌属时，可以使用pUB 110系列质粒、pC 194系列质粒等质粒载体，也可以整合到染色体上。而启动子、终止子可以利用apr(碱性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy(α-淀粉酶)等。
当宿主是假单胞菌属时，开发了以恶臭假单胞菌、洋葱假单胞菌(Pseudomona cepacia)等为宿主的载体系统。可以使用以参与甲苯化合物分解的质粒TOL质粒为基础的广宿主范围载体pKT240(含有RSF1010等来源的自主复制必需的基因)等，启动子、终止子则可利用脂肪酶基因(特开平5-284973号公报)等。
当宿主是短杆菌属，例如发酵乳短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)时，可以使用pAJ43(Gene 39，281(1985))等质粒载体。启动子、终止子可以直接使用在大肠杆菌中使用的启动子、终止子。
当宿主是棒状杆菌属，例如谷氨酸棒状杆菌时，可以使用pCS11(特开昭57-183799号公告)、pCB101(Mol.Gen.Genet.196，175(1984))等质粒载体。
当宿主是链球菌(Streptococcus)属时，可以利用pHV1301(FEMSMicrobiol.Lett.26，239(1985))、pGK1(Appl.Environ.Microbiol.50，94(1985))等作为质粒载体。
当宿主是乳酸杆菌属(Lactobacillus)时，可以使用供链球菌属(Streptococcus)使用而开发的pAMβ1(J.Bacteriol.137，614(1979))等。启动子可以使用上述芽孢杆菌属中作为启动子使用的示例性启动子。
当宿主是红球菌属时，可以使用从玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)中分离的质粒载体(J.Gen.Microbiol.138，1003(1992))。
当宿主是链霉菌属时，可以根据Hopwood等的Genetic Manipulation ofStreptomyces：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories(1985)中记载的方法构建质粒。特别是在浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)中，可以使用pIJ486(Mol.Gen.Genet.203，468-478(1986))、pKC 1064(Gene 103，97-99(1991))和pUWL-KS(Gene 165，149-150(1995))。此外，在弗吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)中也可以使用同样的质粒(Actinomycetol.11，46-53(1997))。
当宿主是酵母属、例如酿酒酵母时，可以利用YRp系列、YEp系列、YCp系列、YIp系列质粒；利用了与多拷贝存在于染色体内的核糖体DNA的同源重组的整合载体(EP 537456等)能够以多拷贝导入基因，并能够稳定地保持基因，因此非常有用。另外，可以利用ADH(乙醇脱氢酶)、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、PHO(酸性磷酸酶)、GAL(β-半乳糖苷酶)、PGK(磷酸甘油酸酯激酶)、ENO(烯醇酶)等的启动子、终止子。
当宿主是克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)时，可以利用酿酒酵母来源的2μm系列质粒、pKD1系列质粒(J.Bacteriol.145，382-390(1981))、杀伤(killer)活性相关的pGKl1来源质粒、克鲁维酵母属中自主复制基因KARS系列质粒、能够通过与核糖体DNA等的同源重组整合到染色体中的载体质粒(EP 537456等)等。此外，可以利用ADH、PGK等来源的启动子、终止子。
当宿主是裂殖酵母菌属时，可以利用含有粟酒裂殖酵母来源的ARS(自主复制相关基因)以及酿酒酵母来源的补偿营养缺陷的选择标记的质粒载体(Mol.Cell.Biol.6，80(1986))。此外，可以利用粟酒裂殖酵母来源的ADH启动子等(EMBO J.6，79(1987))。特别是pAUR224已由宝酒造实现商品化，可以非常方便地应用。
当宿主是接合酵母属(Zygosaccharomyces)时，可以利用鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)来源的pSB3(Nucleic Acids Res.13，4267(1985))等来源的质粒载体，可以利用酿酒酵母来源的PHO5启动子、鲁氏接合酵母来源的GAP-Zr(3-磷酸甘油醛脱氢酶)的启动子(Agri.Biol.Chem.54，2521(1990))等。
当宿主是毕赤酵母属时，在狭窄毕赤酵母(Pichia angusta)(旧名多形汉森酵母(Hansenula polymorpha))中开发了宿主载体系统。作为载体，也可以利用狭窄毕赤酵母来源的自主复制相关基因(HARS1、HARS2)，但其较不稳定，因此向染色体进行多拷贝整合是有效的(Yeast 7，431-443(1991))。此外，可以利用可用甲醇等诱导的AOX(乙醇氧化酶)、FDH(甲酸脱氢酶)的启动子等。另外，正在开发巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)等中的利用了毕赤酵母来源的自主复制相关基因(PARS1、PARS2)等的宿主载体系统(Mol.Cell.Biol.5，3376(1985))，可以利用高浓度培养和甲醇诱导的AOX等强启动子(Nucleic Acids Res.15，3859(1987))。
当宿主是假丝酵母属时，在麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、白色假丝酵母(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产蛋白假丝酵母(Candida utilis)等中开发了宿主载体系统。在麦芽糖假丝酵母中克隆了麦芽糖假丝酵母来源的ARS(Agri.Biol.Chem.51，1587(1987))，开发了利用它的载体。而在产蛋白念珠菌中，开发了染色体整合型载体的强启动子(特开平8-173170号公告)。
当宿主是曲霉属时，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等在霉菌中最经常被研究，可以利用质粒和向染色体的整合，可以利用胞外蛋白酶、淀粉酶来源的启动子(Trends in Biote chnology 7，283-287(1989))。
当宿主是木霉属(Trichoderma)时，开发了利用里氏木霉(Trichodermareesei)的宿主载体系统，能够利用胞外纤维素酶基因来源的启动子等(Biotechnology 7，569-603(1989))。
宿主除了上述微生物以外，还可以利用植物、动物等生物。已开发出可对应于相应宿主使用的载体、启动子等。例如已经以家蚕等昆虫(Nature315，592-594(1985))、油菜、玉米、马铃薯等植物为宿主，开发了在相应宿主中大量表达异源蛋白质体系统，可以适当使用。
至于向宿主中导入重组载体的方法，可以根据宿主的种类等利用公知或常用的手段和方法。
通过上述方法，形成了一种或多种能够表达目的酶的重组载体被导入同一宿主的转化体。
本发明的转化体是将上述示例的重组载体导入同一宿主而形成的。本发明的转化体的代表性例子有：含有将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列和编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列整合到同一表达载体中得到的单一重组载体的转化体，和将前述两种碱基序列整合到不同表达载体、再将得到的数个重组载体导入到同一宿主而形成的单一转化体；将一个或多个通过将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列、编码辅酶再生酶的碱基序列、和/或编码过氧化氢分解酶的碱基序列整合到同一表达载体而得到的重组载体，和多个通过将前述3种或4种碱基序列重组到2种以上的不同表达载体而得到的多种重组载体导入同一宿主而形成的单一转化体。其中，优选使用导入单一重组载体的转化体，因为其不易产生多载体间的不相容性等问题。
优选转化体是上述构成中的转化D-氨基酸为酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶，转化酮酸为L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶，辅酶再生酶是甲酸脱氢酶，过氧化氢分解酶是过氧化氢酶的转化体；更优选例如D-氨基酸氧化酶来源于博伊丁假丝酵母、L-氨基酸脱氢酶是中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌、过氧化氢酶来源于大肠杆菌的转化体。
本发明优选的转化体的具体例子是：至少共表达转化D-氨基酸为酮酸的酶、过氧化氢分解酶和转化酮酸为L-氨基酸的酶的转化体。该转化体能够抑制D-氨基酸的氧化反应的副产物过氧化氢造成的酮酸分解，进一步提高酮酸的收率。前述的优选转化体必要时可以进一步共表达辅酶再生酶。这时，由于辅酶再生酶的活性，酮酸的还原氨基酸反应可高效地进行，从而能够以高收率获得L-氨基酸。
本发明中，通过单独培养上述构成的转化体，可以共表达转化D-氨基酸为酮酸的酶和转化酮酸为L-氨基酸的酶。因此，由于可以在一罐内(同一体系中)进行转化D-氨基酸为酮酸的反应和转化酮酸为L-氨基酸的反应(主反应)，可以减少制造步骤。另外，本发明中利用依赖载体的强制表达体系，因而能够通过高浓度蓄积的酶使主反应高效进行。所以，具有能够以廉价的氨基酸的对映异构体混合物为原料，以100％的理论收率制造L-氨基酸的优点。
转化体的培养中使用的培养基可以使用至少含有宿主生长必需的蛋白质、脂类、糖类、维生素、矿物质等有用成分的液体培养基或者固体培养基。其中，从将培养物直接用于酶促反应的角度来看，优选使用液体培养基。培养基可以含有各种添加物等。
通过培养步骤，产生高浓度蓄积有转化D-氨基酸为酮酸的酶、转化酮酸为L-氨基酸的酶和可选的其他酶的培养物。
在反应步骤中，使用在培养步骤中获得的培养物或其产物，通过酶促反应，进行将氨基酸对映异构体混合物中所含D-氨基酸转化成L-氨基酸的反应。即，所述反应步骤是在同一体系内，以氨基酸的对映异构体混合物为原料，进行转化D-氨基酸成为酮酸的酶反应和转化所生成的酮酸成为L-氨基酸的酶反应，从而生成L-氨基酸的高浓度蓄积物的步骤。
反应步骤中的反应液至少含有培养步骤中得到的培养物或其处理物，以及用作原料的氨基酸对映异构体混合物。
培养步骤中得到的培养物至少由被诱导表达的转化体和培养基构成。前述培养物直接用于反应步骤也是可能的，但是从易于制备适合酶反应的反应液的角度，优选使用作为培养物的处理物，从培养物除去培养基而得到的转化体。并且，作为培养物的处理物，在可保持培养物中诱导表达的目的酶活性的范围内，可以使用对培养物实施破碎、浓缩、稀释、过滤、离心分离、提取、固定化等适当处理后的处理物。作为培养物的产物，具体地可以利用通过表面活性剂和有机溶剂提高了膜透过性的菌体或固定化菌体，用匀浆器或超声波等实施破碎处理制备的无细胞提取液等。
用作原料的氨基酸对映异构体混合物是D-氨基酸和L-氨基酸的混合物，D型体和L型体的比例可以是例如D型体∶L型体＝10∶90～90∶10，优选25∶75～75∶25，更优选50∶50(外消旋体)的混合物。
构成对映异构体混合物的氨基酸是例如用下式(1)表示的化合物。
[化1]
(式中，R表示可以有取代基的烃基)
R所表示的烃基有甲基、乙基、丙基、丙烯基、丁基、异丁基、丁烯基等直链或支链烃基；环戊烷、环己烷等脂环烃基；苯基等芳香族烃基等。烃基可具有的取代基有：例如，卤素原子、氨基、硝基、烷基、烷氧基等。
本发明中使用的氨基酸的代表例有：例如正缬氨酸、正亮氨酸、高苯丙氨酸、邻硝基苯丙氨酸、间硝基苯丙氨酸、对硝基苯丙氨酸、2-氨基丁酸、β-萘基丙氨酸等。其中，优选使用正缬氨酸的对映异构体混合物。
氨基酸的对映异构体的使用量可以根据转化体表达的酶的种类和量适当选择，但是相对于全部反应液，例如是0.1～50重量％，优选1～30重量％，更优选2～20重量％左右。
反应液除了培养物或其处理物以及氨基酸的对映异构体混合物以外，还可以含有其他成分。作为其他成分，例如可以使用反应溶剂、相应于酶活性的底物和辅酶、消泡剂等。反应溶剂可以使用水，烃、酯、醇等适当有机溶剂，pH调节剂、缓冲液等液体性质调节剂等。这些反应溶剂可以单独或者2种以上组合使用。相应于酶活性的底物和辅酶可根据转化体表达的酶适当选择使用。
作为添加到反应液中的辅酶，例如对于表达氨基酸脱氢酶的转化体而言可以使用NAD(P)H，对于表达甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶等辅酶再生酶的转化体而言可以使用NAD(P)+。将这些辅酶添加到反应液中时，可以增强并稳定化各酶，从而促进主反应的进行。可以添加前述辅酶(NAD(P)H、NAD(P)+)，使其相对整个反应液的量为0.001～100mM，优选为0.01～10mM，更优选为0.1～1mM左右的浓度。
转化体共表达氨基酸脱氢酶和辅酶再生酶时，有必要让体系中同时存在前述辅酶再生酶活性的相应底物。前述辅酶再生酶与其底物的组合的具体例子例如：可以向体系中添加甲酸脱氢酶和甲酸或其盐、葡萄糖脱氢酶和葡萄糖、醇脱氢酶和乙醇或者2-丙醇、苹果酸脱氢酶和苹果酸或其盐、甘油脱氢酶和甘油等。前述底物相对于用作原料的对映异构体混合物中含有的D-氨基酸，可以添加例如0.1～20当量左右，优选1～5当量左右。
而当转化体表达L-氨基酸氨基转移酶时，可以添加氨基供体。氨基供体可以使用例如谷氨酸、天冬氨酸等各种氨基酸及其盐。氨基供体相对于原料对映异构体混合物中含有的D-氨基酸，可以添加例如0.1～100当量左右，优选1～20当量左右。
当转化体表达L-氨基酸脱氢酶时，优选使体系中存在铵离子等氨基供体。向反应液中添加铵离子的形式，没有特别限制，例如可以作为铵缓冲液添加；也可以添加甲酸铵，其可同时提供辅酶再生酶即甲酸脱氢酶的底物甲酸；或者可以分别添加甲酸和。铵离子的添加量相对于反应开始时体系中存在的D-氨基酸为例如0.1～20当量左右，优选0.2～10当量左右，更优选0.5～4当量左右。
消泡剂对于改善液体性质是有效的，例如可以利用ADEKA PluronicL-61、ADEKA Pluronic L-71、ADEKA Pluronic 25R-1、ADEKA Pluronic25R-2、ADEKAnol LG-294、COLORIN、硅酮等。消泡剂的添加量相对于全部反应液量为0.001～0.5重量％左右，优选为0.005～0.1重量％左右，更优选为0.01～0.05重量％左右。
为了维持反应液的pH值，可以添加各种缓冲液和具有缓冲能力的化合物。特别是使用L-氨基酸脱氢酶作为转化酮酸成L-氨基酸的酶时，可适当使用氨缓冲液、甲酸铵等。它们相对于全部培养基的量可以按10mM～3M左右，优选50mM～1.5M左右的浓度添加。
此外，根据转化体表达的酶的种类，在氧存在下进行酶反应。表达D-氨基酸氧化酶的转化体可以在例如向反应液中通入纯氧或提高了氧分压的空气、空气等的同时进行反应。这时通气量是例如0.01～10vvm左右，优选0.05～2vvm左右。通气方法可以是通过搅拌、振荡等手段使氧等与反应液接触的方法，或者通过加压的方法中的任何一种。这些条件可以根据溶氧量来控制。
反应步骤中的反应是将培养物或其处理物以及其他成分与原料氨基酸对映异构体混合物混合而进行的。原料等可以一次添加到反应溶剂等中，也可以逐次地、连续地或间隔地添加。反应在静置或搅拌下进行。
反应条件可以在不抑制酶反应进行的范围内适当选择。反应开始时反应液的pH可从能够维持目的酶活性的范围选择，通常为pH5～11左右，优选pH6～10左右，更优选pH7～9左右。反应中以及反应结束时的pH可以控制在适当范围内，也可以任其伴随反应进行而变化。反应温度可以从能够维持目的酶活性的范围适当选择，如5～70℃左右、优选10～55℃左右、更优选20～40℃左右。
反应步骤的优选实施方案例如将从培养步骤获得的培养物中回收的转化体、氨基酸对映异构体混合物、对应于酶的底物及其它适当的添加剂混合得到反应液，并在通气条件下搅拌反应液的方法。
反应步骤通过使培养步骤中表达的酶作用于氨基酸对映异构体混合物，在同一体系内进行D-氨基酸转化为酮酸的酶反应和酮酸转化为L-氨基酸的酶反应，生成L-氨基酸。
反应结束可以在反应液中D-氨基酸浓度降低、L-氨基酸高浓度蓄积的时刻确认。即，在本发明中的反应结束时刻，培养体系中的L-氨基酸蓄积浓度是例如90％e.e以上，优选95％e.e以上，更优选99％e.e以上。这里的“％e.e”是指用下式表示的值。
e.e(％)＝{(L-氨基酸的浓度)-(D-氨基酸的浓度)}×100/{(L-氨基酸浓度)+(D-氨基酸浓度)}
通过上述反应，生成高浓度蓄积L-氨基酸的反应液。对于含有高浓度L-氨基酸的反应液，可以将反应液中蓄积至溶解度以上的L-氨基酸可溶化，然后，用适当的分离方法实施除菌、除蛋白等处理，所得处理液视需要经纯化，从而回收L-氨基酸。
前述L-氨基酸的可溶化处理，例如，当进行液体培养时的培养液中蓄积了其溶解度以上的目的产物L-氨基酸时，例如可以通过对培养体系酸性化、碱性化或者稀释等方法实施。酸性化通过向体系内添加盐酸、硫酸等酸进行；碱性化通过添加氢氧化钠、氢氧化钾等碱进行。可溶化处理后的处理液可以是酸性、碱性、中性的任何一种。前述的分离方法可以使用例如过滤、离心分离等常用方法。
前述除菌、除蛋白后的处理液通过添加添加剂使不需要的无机盐析出，通过实施过滤等分离方法可以制备成除去无机酸的L-氨基酸溶液。这样的添加剂没有特别限制，只要能够保持L-氨基酸的溶解度并降低不需要的无机酸的溶解度即可，优选可以使用甲醇、乙醇、2-丙醇、丙酮、乙腈等水溶性有机溶剂。这些添加剂可以通过蒸馏等操作从体系中除去，也可以不除去直接进行以后的纯化。
纯化可以通过例如下述公知的纯化方法及其组合进行：通过浓缩、等电点沉淀、冷却或添加具有降低目的产物的溶解度的作用的添加物等的结晶处理，离子交换树脂处理，膜分离，有机溶剂抽提，离子交换色谱等各种色谱，吸附剂吸附，使用絮凝剂、脱水剂的脱水或者絮凝，蒸馏等。上述纯化方法可以根据氨基酸的种类适当选择。
从反应液中分离、纯化L-氨基酸的优选方法例如：将含有L-氨基酸的反应液浓缩后，将pH值调到等电点附近，添加上述示例的水溶性有机溶剂实施结晶处理，并分离、回收析出的纯化L-氨基酸的方法。
分离、纯化的氨基酸为L-正缬氨酸时，可以利用例如以下的方法。即，通过向含有L-正缬氨酸的反应液中添加硫酸进行酸性化使反应液中蓄积的L-正缬氨酸可溶化，然后通过离心分离实施除菌处理。向得到的含有L-正缬氨酸的溶液中添加甲醇使不要的无机盐析出，通过过滤去除之。向回收的滤液中添加氨、氢氧化钠等碱进行中和，接着添加丙酮，实施结晶处理，通过上述操作可以得到纯化的正缬氨酸。
根据本发明的方法1，D-氨基酸转化为酮酸的酶反应和生成的酮酸转化为L-氨基酸的酶反应在一罐中(同一体系内)进行，因此由D-氨基酸生成酮酸的酶反应和由酮酸生成L-氨基酸的酶反应可以作为单一转化体的培养步骤进行，并且能够以高蓄积量得到L-氨基酸。因此，即使使用外消旋体等D型体和L型体混合的廉价氨基酸混合物为原料，也能够以100％的理论收率制造L-氨基酸。
本发明的L-氨基酸制造方法是为从氨基酸的对映异构体混合物酶促生成L-氨基酸的L-氨基酸制造方法，其特征是：至少具有氧化步骤和还原步骤这两个不同的反应步骤；其中，所述氧化步骤使用共表达转化D-氨基酸为酮酸的酶和过氧化氢分解酶的转化体或其产物，主要氧化D-氨基酸，而所述还原步骤使用共表达从酮酸生成L-氨基酸的酶和可选的辅酶再生酶的转化体或其产物，主要从酮酸合成L-氨基酸。
所述“氧化步骤”是指主要包含将D-氨基酸氧化成酮酸的氧化反应的步骤。也可以进行氧化反应以外的其他反应。前述氧化步骤中的其它反应有，例如，促进氧化反应的反应(依赖过氧化氢分解酶的作用的反应等)、后述的还原反应等。
所述“还原步骤”是指主要包含通过酮酸的还原氨基化合成L-氨基酸的还原反应的步骤。也可以进行还原反应以外的其它反应。前述还原步骤中的其它反应有，例如，促进还原反应的反应(依赖辅酶再生酶的作用的反应)、上述氧化反应等。还原步骤中的“共表达从酮酸生成L-氨基酸的酶和可选的辅酶再生酶的转化体”，是指表达从酮酸生成L-氨基酸的酶的转化体，以及共表达从酮酸生成L-氨基酸的酶和辅酶再生酶的转化体。
另外，本发明的L-氨基酸制造方法2还可以包含纯化步骤等其它步骤，只要具有上述氧化步骤和还原步骤这两个不同的反应步骤即可。
根据本发明者的研究，对于使用氧化D-氨基酸为酮酸的酶的氧化反应，如果反应液中的底物浓度高，则反应生成物(酮酸)的收率(相对于原料氨基酸对映异构体混合物(DL-氨基酸)的L-氨基酸的比例)有降低的倾向。例如，在底物浓度超过5重量％的反应条件下，前述收率就停滞在70％左右，从而就有不能经受工业化生产的问题。收率降低的原因推断是由于通过D-氨基酸氧化酶的作用生成的酮酸与同一反应的副产物过氧化氢接触而脱羧，生成的醛进一步经过酶促氧化或者空气氧化生成有机酸的一系列反应而被分解，结果导致主反应的进行被抑制。
针对上述问题，本发明者等发现：如果使用共表达D-氨基酸氧化酶和过氧化氢分解酶(特别是过氧化氢酶)的转化体，则L-氨基酸的收率可得到显著提高。但是，向含有表达D-氨基酸氧化酶的转化体的反应液中另外添加过氧化氢酶时，却基本未显示出效果。这暗示在菌体内生成的α-酮酸被同时生成的副产物过氧化氢在菌体内迅速分解，而不是渗漏到菌体外的α-酮酸被同样渗漏到菌体外的过氧化氢酶慢慢分解。也就是说，为了高效抑制α-酮酸的分解，与其向反应混合液中添加过氧化氢分解酶，不如通过在同一菌体内表达D-氨基酸氧化酶和过氧化氢分解酶(特别是过氧化氢酶)有价值。
另外，依赖于D-氨基酸氧化酶的作用的D-氨基酸氧化反应，通常氧通气是限速因素，因此，大多要求高通气量、高搅拌条件。这些条件在工业规模的发酵罐中有加大设备上的负担、引起溶菌和反应液发泡、容易造成收率下降的问题。本发明者等发现通过联合使用过氧化氢分解酶(过氧化氢酶等)，能够获得使上述问题得以解决的附加效果。以下详细叙述。
在氧化D-氨基酸生成酮酸的氧化步骤中，单独使用D-氨基酸氧化酶时进行例如下述反应式(1)。如式(1)所示，氧化1分子的D-氨基酸需要1分子氧，同时副生成1分子的过氧化氢。与此相对，当联合使用D-氨基酸氧化酶和过氧化氢分解酶时，进行如下反应式(2)。正如式(2)所示，从被过氧化氢分解酶分解的1分子过氧化氢生成1/2分子的氧供给反应体系，所以整体上从反应体系外导入的氧的量可以减半。因此，氧化步骤中的通气、搅拌可以在更加温和的条件下进行，还能获得可以缩短反应时间的有利效果。
(1)D-氨基酸+O2+H2O→酮酸+过氧化氢+氨
(2)D-氨基酸+1/2O2→酮酸+氨
使用过氧化氢分解酶(过氧化氢酶等)时，本来预想过氧化氢酶具有的过氧化物酶活性会促进中间产物酮酸的分解，但实际上联合使用过氧化氢酶时，可获得L-氨基酸的收率显著提高的效果。这样，本发明的方法2通过联合使用过氧化氢酶，基本没有过氧化物酶引起的弊端(促进酮酸分解)问题，对于抑制过氧化氢分解所引起的酮酸分解可发挥极高的效力，所以对于高收率极为有利。
本发明的方法2具有上述构成，因此可以使用温和的反应条件高收率地获得酮酸。本发明的方法2可以使用与上述方法1中相同的酶、重组载体、转化体以及培养条件等。另外，本发明的方法2还可以使用方法1中记载的反应条件。
本发明的方法2中，优选氧化步骤和还原步骤在不同的反应条件下进行。前述氧化步骤主要由需氧的D-氨基酸的氧化反应构成，而还原反应主要由不需要氧的酮酸的还原氨基化反应构成，所以，通过设定适合各个步骤的反应条件，能够促进L-氨基酸的生成反应，提高收率。
本发明者等进一步研究发现：在促进氧化步骤中的D-氨基酸氧化反应的高通气条件下，还原步骤中的酮酸还原反应所必需的底物、辅酶被氧化，结果会抑制还原反应的进行。而且，证实其主要原因在于：(1)本来应该在还原步骤中被还原氨基化反应有效利用的还原型辅酶(NADH等)在高通气条件下容易被氧化而白白消耗掉，(2)还原型辅酶的氧化产物(NAD等)在反应体系内存在的辅酶再生酶的活性作用下再生(生成NADH等)，进行该反应的结果是辅酶再生酶的底物(例如甲酸脱氢酶的底物甲酸等)容易被无谓地消耗。这意味着对于还原步骤中的酮酸的还原氨基化反应而言，倒是优选无氧的条件。本发明中，通过使在一罐内(同一体系内)进行的还原反应和氧化反应在不同的反应条件下进行，能够促进α-酮酸的还原氨基反应，获得进一步提高最终目的产物L-氨基酸的收率的效果。至于对于氧化步骤和还原步骤需区别设定的反应条件，可以列举例如氧的通气条件，搅拌条件，pH，催化剂(包括酶)、转化体等的补加等。
本发明的方法2优选实施方案例如：在通入含氧气体的条件下进行氧化步骤，在不通入含氧气体或者以比氧化步骤低的通气量通入含氧气体的条件下进行还原步骤的方法。采用该方法，能够在还原步骤中，避免由于还原型辅酶被氧化浪费或经氧化的辅酶在辅酶再生酶的作用下再还原等原因造成该酶的底物被浪费，从而抑制还原氨基化反应的问题，因此尤其能够进一步提高从酮酸到L-氨基酸的生成效率。
前述含氧气体只要是至少含有氧气的气体即可，包括氧气，以及空气等氧气和其他气体的混合气体。其他气体包括二氧化碳、氮气等不活泼气体等。含氧气体优选使用空气等。含氧气体中的含氧量在例如，0.1体积％以上(0.1～100％)，优选1体积％以上，更优选5体积％以上。
具体的含氧气体的通气条件为例如：氧化步骤中含氧气体的通气量相对于反应液为每分钟1体积％以上，还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液低于每分钟10体积％；优选氧化步骤中含氧气体的通气量相对于反应液为每分钟2体积％以上，还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液低于每分钟2体积％；更优选氧化步骤中含氧气体的通气量相对于反应液为每分钟5体积％以上，还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液低于每分钟5体积％；特别优选氧化步骤中含氧气体的通气量相对于反应液为每分钟1体积％以上，而还原步骤中基本上不通入含氧气体的条件。通过这样的条件，可获得进一步提高L-氨基酸的收率的效果。
除了上述方法之外，本发明的方法2优选的实施方案还有将氧化步骤中的反应液和还原步骤中的反应液调整到不同pH值的方法，例如将还原步骤中的反应液的pH调整到比氧化步骤中的反应液的pH低的值的方法。具体的pH条件有，例如，将氧化步骤中反应液的pH值调整到7.0～9.5，还原步骤中反应液的pH值调整到6.0～8.5且低于氧化步骤中的值的条件；优选氧化步骤中反应液的pH值调整到7.5～9.0，还原步骤中反应液的pH值调整到6.5～8.0且低于氧化步骤的值的条件。
氧化步骤和还原步骤的pH调整只要不抑制主反应的进行即可，没有特别限制，可根据种类适当量地使用公知的酸或碱。本发明的方法1和方法2中，优选使用甲酸或其盐(例如甲酸铵等)来调整D-氨基酸转化成酮酸的反应的pH，因为它能够有效地补充如上文所述在氧化步骤中被浪费的甲酸。
本发明的方法优选使用含有相对于原料氨基酸对映异构体混合物为0.2当量以上的甲酸根离子和/或铵离子的反应液。作为前述甲酸根离子，可以添加能够在反应体系内生成甲酸根离子的化合物，这样的化合物可以使用例如甲酸，甲酸铵、甲酸钠等甲酸盐等。作为前述的铵离子，可以添加能在反应体系内生成铵离子的化合物，这样的化合物可以例如使用氨，氯化铵、甲酸铵、乙酸铵等铵盐等。
根据上述方法，在由D-氨基酸生成酮酸的反应中，甲酸根离子作为pH调节剂发挥作用，能够以高收率获得酮酸。特别是当包含用甲酸脱氢酶作为辅酶再生酶将酮酸转化成L-氨基酸的反应时，甲酸根离子作为甲酸脱氢酶的底物的供给源有效地再生辅酶，促进酮酸的还原氨基化反应，从而能够以高收率得到L-氨基酸。这样就可以使反应结束后的反应液中酮酸的残留量更低。而且，当包含使用D-氨基酸氧化酶的反应时，上述方法能获得更好的效果。
另外通过上述方法，在酮酸转化成L-氨基酸的反应中，铵离子作为pH调节剂发挥作用的同时，铵离子成为氨基供应源，促进酮酸的还原氨基化反应，能够有效生成L-氨基酸。而且，当使用L-氨基酸脱氢酶时，上述方法能获得更好的效果。
本发明者等发现：以相对原料氨基酸对映异构体混合物(D，L-氨基酸)0.2当量以上的量添加本来认为对D-氨基酸转化成酮酸的反应(特别是氧化反应)没有影响的甲酸铵，可促进酮酸的生成。即，本发明的方法如果采用同时含有相对于原料氨基酸对映异构体混合物为0.2当量以上的甲酸根离子和0.2当量以上的铵离子的反应液，则会进一步提高上述效果。特别是在包含使用甲酸脱氢酶将酮酸转化成L-氨基酸的反应的方法中，甲酸根离子和铵离子除了共同作为pH调节剂发挥作用之外，前者还成为甲酸脱氢酶的底物，有效再生辅酶，而后者即铵离子则成为氨基供应源，由此显著提高由酮酸转化成L-氨基酸的反应的效率。
为了提高反应收率，在本发明的方法2中，优选在从氧化步骤转到还原步骤之前或者之后向反应液中额外添加上述本发明的转化体或其产物。通过该方法，可以补偿氧化步骤中消耗的氧，使还原步骤中的还原氨基化反应顺利进行，因此能够防止中间体酮酸在反应结束后残存，从而以高收率获得L-氨基酸。
根据本发明的方法2，使用与过氧化氢分解酶共表达的D-氨基酸氧化酶来转化酮酸的酶反应与生成的酮酸转化成L-氨基酸的酶反应在一罐内(同一体系内)进行，因而能够在温和的条件下进行D-氨基酸的氧化步骤，并能够防止生成后的酮酸分解，以高浓度蓄积酮酸，在接下来的还原步骤中以高收率有效地获得L-氨基酸。尤其是通过在与氧化步骤不同的条件下进行还原步骤，促进了从酮酸到L-氨基酸的转化反应，反应结束后反应液中不易残存中间生成物酮酸，从而可以进一步提高L-氨基酸的收率。因此，即使以外消旋体等D型体和L型体混合的廉价氨基酸混合物为原料，也能够以100％的理论收率制造L-氨基酸。
实施例
以下通过实施例对本发明做更为具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。其中“LB培养基”使用成分为1％细菌用蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、1％氯化钠、pH7.2的培养基。而“含有氨苄青霉素的LB培养基”使用在上述组成的LB培养基中添加了50μg/mL浓度的氨苄青霉素的培养基。表1～表5中，“Nva”表示“正缬氨酸的基质浓度”；“Nva残留率[％]”表示“反应液中正缬氨酸的摩尔浓度/反应液配制时的正缬氨酸浓度×100”，“Nva产率[％]”表示“反应液中正缬氨酸的摩尔浓度/反应液配制时的2-氧戊酸的摩尔浓度×100％”。
酶活性的测定
用制造例或者实施例中制备的质粒转化大肠杆菌HB 101菌株，将得到的转化体在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的液体LB培养基中30℃过夜培养，添加0.1mM IPTG诱导基因表达，继续在30℃培养4小时。收集得到的菌体后，悬浮到含有0.02％2-巯基乙醇的50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，用密闭式超声破碎装置UCD-200TM(COSMOBIO制造)破碎，离心回收上清液(无细胞提取液)。
用得到的无细胞提取液分别以下述各种方法测定酶活性。
(D-丙氨酸氧化酶活性的测定)
将由无细胞提取液、100mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)、10mM D-丙氨酸、0.5mM 4-氨基安替匹林、2mM苯酚、5U/mL过氧化物酶组成的反应液保持在30℃进行反应来测定D-丙氨酸氧化活性。1U定义为1分钟内催化0.5μmol的醌亚胺生成的酶量。
(D-氨基酸脱氢酶活性的测定)
将由无细胞提取液、100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、10mM D-丙氨酸、0.1mM 2，6-二氯靛酚钠盐(DICP)组成的反应液保持在30℃进行反应，来测定D-丙氨酸氧化活性。1U定义为1分钟内催化1μmol的DCIP减少的酶量。
(L-氨基酸脱氢酶活性的测定)
将由无细胞提取液、200mM甘氨酸-KCl-KOH缓冲液(pH 10.5)、10mM L-氨基酸、2.5mM NAD+组成的反应液保持在30℃温育进行反应，来测定L-氨基酸脱氢酶活性。1U定义为1分钟内催化1μmol的NADH生成的酶量。作为L-氨基酸，分别在L-丙氨酸脱氢酶活性的测定中使用L-丙氨酸，在L-亮氨酸脱氢酶活性的测定中使用L-亮氨酸，在L-苯丙氨酸脱氢酶活性的测定中使用L-苯丙氨酸。
(甲酸脱氢酶活性的测定)
将由无细胞提取液、100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、100mM甲酸钠、2.5mM NAD+组成的反应液保持在30℃进行反应，来测定甲酸氧化活性。1U定义为1分钟内催化1μmol的NADH生成的酶量。
(L-氨基酸氨基转移酶活性测定)
将由无细胞提取液、100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、50mM氯化铵、10mM α-酮异己酸钠、40mM L-谷氨酸钠、0.05mM 5-磷酸吡哆醛、0.2mM NADPH、5U/mL变形杆菌来源的谷氨酸脱氢酶(东洋纺制造)组成的反应液保持在30℃进行反应，来测定L-氨基酸氨基转移酶活性。1U定义为1分钟内催化1μmol的NADPH减少的酶量。
(过氧化氢酶活性的测定)
将由无细胞提取液、50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、0.035％过氧化氢组成的反应液保持在30℃进行反应，来测定过氧化氢酶活性。1U定义为1分钟内催化1μmol的过氧化氢分解的酶量。
制造例1
含有D-氨基酸氧化酶基因的质粒pSUCBDO1的构建
将pSE420D(特开2000-189170号公告)用NdeI酶切，经Klenow片段进行平端化处理，通过自身连接构建NdeI限制性内切酶位点被破坏的载体pSE420-N。通过定点突变将pSE420-N的260-263位CTAG变成AGCT，构建了在该位置重组有SacI位点的pSE420S。将pSE420S用ClaI、NcoI双酶切，将合成DNA(序列编号：1、序列编号：2)退火后连接到该位置中，构建了质粒pSE420U(图1)。
序列编号1：CGATTAACTTTATTATTAAAAATTAAAGAGGTATATACATATGAAATATTTAATTAAGGAGGAATAATC
序列编号2：CATGGATTATTCCTCCTTAATTAAATATTTCATATGTATATACCTCTTTAATTTTTAATAATAAAGTTAAT
将Candida boidinii DSM 70026菌株用YEPD培养基(2％细菌用蛋白胨、1％细菌用酵母提取物、2％半乳糖、pH 6.0)培养，制备菌体。根据Meth.CellBiol.，29，39(1975)所记载的方法，从菌体分离、纯化染色体DNA。
以Yeast，16，1217(2000)所记载的博伊丁假丝酵母TK 62菌株来源的D-氨基酸氧化酶基因的碱基序列(登录号AB042032)为基础，合成克隆用的正向引物CbDAO-A1(序列编号：3)和反向引物CbDAO-T1(序列编号：4)。
序列编号3：CACCATATGGGTGATCAAATTGTTGTTCTTGGTTC
序列编号4：CGACTTAAGTCTAGATTAAAGTTTAGCTTTAACTTTTTGGTTATCAACTAAAAG
使用GeneAmp PCR System 2400(PerkinElmer制造)进行PCR反应，50μl反应液由前述从博伊丁假丝酵母DSM 70026菌株纯化的染色体DNA50ng、3.75U PfuUltra DNA聚合酶、PfuUltra用缓冲液、0.2mM dNTP、以及正向引物CbDAO-A1和反向引物CbDAO-T1各20pmol组成，进行30个变性(95℃、30秒)、退火(52℃、30秒)及延伸(72℃、70秒)的循环。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化，回收DNA片段。
将获得的DNA片段用限制性内切酶NdeI、AflII双酶切，经苯酚-氯仿处理后，进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，回收目的DNA片段。将质粒pSE420U用限制性内切酶NdeI、AflII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用获得的质粒转化大肠杆菌JM109菌株。将转化体在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，用正向引物CbDAO-A1和反向引物CbDAO-T1进行菌落PCR，确认插入片段的大小。将认为插入了1.1kb的DNA片段的菌落在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，用FlexiPrep Kit(Pharmacia制造)纯化，获得质粒pSUCBDO1(图2)。
对于纯化的质粒pSUCBDO1，用BigDye Terminator Cycle Sequencing FSReady Reaction Kit(PerkinElmer制造)和ABI PRISMTM 310(PerkinElmer制造)，通过引物步移(primer walking)法分析插入DNA的碱基序列。将插入质粒的博伊丁假丝酵母DSM 70026菌株来源的D-氨基酸氧化酶的碱基序列与Yeast，16，1217(2000)所记载的博伊丁假丝酵母TK 62菌株来源的D-氨基酸氧化酶基因的碱基序列(登录号AB042032)相比较，确认了包含3个氨基酸置换的6个碱基置换，即77G→T(Cys27→Phe)、83C→A(Ala28→Asp)、198A→C、243C→A(His81→Gln)、510A→G、525A→G，其中以ORF的起始位置作为第1位。这样，确认了质粒pSUCBDO1中重组了博伊丁假丝酵母DSM 70026菌株来源的D-氨基酸氧化酶基因。
按照上述酶活性测定方法测定了质粒pSUCBDO1的D-丙氨酸氧化活性，其比活性为4.68U/mg-蛋白质。
制造例2
含有D-氨基酸氧化酶基因的质粒pSUTVDO1的构建
使用与制造例1中记载的方法同样的方法，培养变异三角酵母CBS4095菌株，制备菌体，并从菌体分离、纯化染色体DNA。
特表2001-506868号公告(编号Z50019)所记载的变异三角酵母CBS4095菌株来源的D-氨基氧化酶基因在其ORF内部含有内含子，所以先进行第2外显子部分的克隆。根据该基因的第2外显子上游的内含子部分的5’-和3’-末端翻译区合成克隆用的正向引物TvDAO-e2A1(序列编号：5)和反向引物TvDAO-T2(序列编号：6)。
序列编号5：GACGCCGGCGTTGCAGGTTTAACTAC
序列编号6：CTCAAGCTTCTAGATTAAAGATTTGGACGAGTAAGAGCTC
以从前述变异三角酵母CBS 4095菌株纯化的染色体DNA为模板，用引物TvDAO-e2A1和TvDAO-T2以与制造例1同样的条件进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purifcation Kit(Pharmacia制造)纯化，回收含有第2外显子的DNA片段。
将得到的DNA片段用限制性内切酶HindIII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的片段，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化。将质粒载体pUC119用限制性内切酶HindIII、HincII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接含有第2外显子的DNA片段形成质粒，转化大肠杆菌JM109菌株。
用含有氨苄青霉素的LB培养基培养转化体，用FlexiPrep Kit(Pharmacia制造)纯化质粒，得到质粒pUCTVDOT(图3)。
对于纯化的质粒pUCTVDOT，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，并与特表2001-506868号公告(编号Z50019)所记载的变异三角酵母CBS 4095菌株来源的D-氨基氧化酶基因的碱基序列相比较，结果发现了1个碱基置换，即1002G→A，其中以引物ORF的起始位置为第1位。这样，确认了质粒pUCTVDOT中重组了变异三角酵母CBS 4095菌株来源的D-氨基酸氧化酶基因的第2外显子部分。
将变异三角酵母CBS 4095菌株染色体DNA中含有的D-氨基酸氧化酶基因的第1外显子部分作为TvDAO-e5(序列编号：7)和TvDAO-e3(序列编号：8)合成：
序列编号7：CAGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGTG
序列编号8：CCGGCACCAATAACAACGATTTTAGCCATGGCTG
将由TvDAO-e3和TvDAO-e5各1.25μmol、0.1mM EDTA、10mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)组成的50μl反应液，在94℃变性1分钟，接着在61℃退火1分钟后，用限制性内切酶Nco I酶切，经苯酚-氯仿处理后，进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，获得含有第2外显子的DNA片段。将pUCTVDOT用限制性内切酶NgoMIV、HindIII双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，获得含有第1外显子的DNA片段。
将制造例1中记载的pSE420U用限制性内切酶Nco I、HindIII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)将其与含有第1外显子和第2外显子的各DNA片段连接起来，构建重组了变异三角酵母CBS 4095菌株来源的D-氨基酸氧化酶基因的质粒pSUTVDO1(图4)。
按照上述酶活性的测定方法，测定质粒pSUTVDO1的D-氨基酸氧化活性，比活性为5.26U/mg-蛋白质。
制造例3
含有D-氨基酸脱氢酶基因的质粒pETECDD1的构建
用LB培养基培养大肠杆菌JM109菌株，制备菌体。按照Nucleic AcidsRes.，8，4321(1980)所记载的方法从菌体分离、纯化染色体DNA。
以J.Bacteriol.，176，1500(1994)所记载的大肠杆菌K-12菌株来源的D-氨基酸脱氢酶基因(登录号L02948)为基础，合成克隆用正向引物EcDadA-A1(序列编号：9)、反向引物EcDadA-T1(序列编号：10)。
序列编号9：TGGCCATGGCTCGTGTTGTAATTCTGGGAAGTGGTGTG
序列编号10：CAGTCTAGATTAAGAATGTGCAC CATGTAAATGGC CC
以前述从大肠杆菌K-12菌株纯化的染色体DNA为模板，用引物EcDadA-A1和EcDadA-T1在与制造例1同样的条件下进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.3kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化，回收目标DNA片段。
将质粒载体pUC118用限制性内切酶Hinc II酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化得到质粒pUCECDD1(图5)。
对于纯化的质粒pUCECDD1，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，与J.Bacteriol.，176，1500(1994)所记载的大肠杆菌K-12菌株来源的D-氨基酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号L02948)完全一致。这样，确认了质粒pUCECDD1中重组了大肠杆菌K-12菌株来源的D-氨基酸脱氢酶基因。
得到的pUCECDD1用限制性内切酶Nco I、EcoR I双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将质粒载体pET-21d用限制性内切酶Nco I、EcoR I双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段，用所得质粒转化大肠杆菌BL21(DB3)pLysS菌株。用与制造例1同样的操作从转化体纯化质粒，得到重组了大肠杆菌K-12菌株来源的D-氨基酸脱氢酶基因的质粒pETECDD1(图6)。
将经纯化的质粒pETECDD1转化的转化大肠杆菌BL21(DB3)pLysS菌株在含有氨苄青霉素和氯霉素(25μg/mL)的LB培养基中28℃过夜培养后，添加0.1mM IPTG诱导基因表达，再在30℃培养4小时。收集得到的菌体后，悬浮到含有0.02％2-巯基乙醇的50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，用密闭式超声波破碎装置UCD-200TM(COSMOBIO制造)破碎，离心回收上清液(无细胞提取液)。用得到的无细胞提取液，按照上述酶活性的测定方法，测定D-丙氨酸氧化活性，其比活性为49.2mU/mg-蛋白质。
制造例4
含有甲酸脱氢酶变异体基因的质粒pSU-MF26的构建
将含有母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶基因的变异体基因的表达质粒pSE-MF26(特开2003-199595号公告)用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化。用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)将得到DNA片段与同样用Nco I与XbaI消化的质粒pSE420U(制造例1)连接，得到质粒。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用含有氨苄青霉素的LB培养基培养，从筛选出的转化体纯化质粒，得到重组了母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的变异体基因的质粒pSU-MF26(图7)。
制造例5
含有两种基因的质粒pSF-GSA2的构建(L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶)
根据Biochemistry，29，1009(1990)所记载的嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO12550菌株来源的L-丙氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号M33299)，合成克隆用正向引物BstAlaDH-A1(序列编号：11)、反向引物BstAlaDH-T1(序列编号：12)。
序列编号11：GAGGAATTCTGTCATGAAAATTGGTATTCCAAAAGAAATCAAAAACAATG
序列编号12：CTGAAGCTTCTAGATTATCCATGTAACAACGAATGAACATCTG
以Biochemistry，29，1009(1990)所记载的嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO12550菌株来源的亮氨酸脱氢酶表达质粒pICD301为模板，用正向引物BstAlaDH-A1和反向引物BstAlaDH-T1按照制造例1所记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel BandPurification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将制造例4中得到pSU-MF26用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSF-GSA2(图8)。
对于纯化的质粒pSF-GSA2，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，与Biochemistry，29，1009(1990)所记载的嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株的碱基序列相比较，发现了20个碱基置换、3个碱基缺失、3个碱基插入。随之有16个氨基酸的置换、1个氨基酸的缺失及1个氨基酸的插入发生。得到的碱基序列如序列编号：13所示。这样，就确认了质粒pSF-GSA2中重组了嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株来源的L-丙氨酸脱氢酶基因和母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的变异体基因。
按照上述酶活性的测定方法，测定质粒pSF-GSA2的L-丙氨酸氧化活性和甲酸氧化活性，比活性分别为2.40U/mg-蛋白质和0.74U/mg-蛋白质。
制造例6
含有两种基因的质粒pSF-BTA1的构建(L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶)
根据Biochimie，71，559(1989)所记载的热链形芽孢杆菌DSM 730菌株来源的丙氨酸脱氢酶基因的碱基序列，合成克隆用正向引物BthAlaDH-A1(序列编号：14)、反向引物BthAlaDH-T1(序列编号：15)。
序列编号14：GAGGAATTCTATTCATGATTATTGGTGTGCCAAAGCAA
序列编号15：CAGAAGCTTCTAGATTAATTAGCAGCCAACGTTTTCC
以质粒pKUAD103为模板，用正向引物BthAlaDH-A1和反向引物BthAlaDH-T1按照制造例1记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.2kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将制造例4中得到pSU-MF26用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSF-BTA1(图9)。
对于纯化的质粒pSF-BTA1，使用引物步移法分析插入DNA的碱基序列，与Biochimie，71，559(1989)所记载的热链形芽孢杆菌DSM 730菌株来源的L-丙氨酸脱氢酶基因的碱基序列完全一致。这样，确认了质粒pSF-BTA1中重组了热链形芽孢杆菌DSM 730菌株来源的L-丙氨酸脱氢酶基因和母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的变异体基因。
除了以25℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSF-BTA1制备无细胞提取液，测定L-丙氨酸氧化活性和甲酸氧化活性，比活性分别为3.38U/mg-蛋白质和1.24U/mg-蛋白质。
制造例7
含有两种基因的质粒pSFBPAD1的构建(L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶)
用LB培养基培养球形芽孢杆菌IFO 3525菌株，制备菌体。用Genometip 100(Qiagen制造)从菌体分离纯化染色体DNA。
根据Biochemistry，29，1009(1990)所记载的球形芽孢杆菌IFO 3525菌株来源的丙氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号M33298)，合成正向引物BspAlaDH-A1(序列编号：16)和反向引物BspAlaDH-T1(序列编号：17)。
序列编号16：GTGGAATTCTATCATGAAAATTGGTATTCCAAAGGAAATTAAAAACAACG
序列编号17：CTGAAGCTTCTAGATTATTGGATTAATTCATCCACATTCACATATGG
以从前述球形芽孢杆菌IFO 3525菌株纯化的染色体DNA为模板，用引物BspAlaDH-A1和BspAlaDH-T1以与制造例1同样的条件进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas BandPrep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将制造例4中得到pSU-MF26用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，再用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSFBPAD1(图10)。
对于纯化的质粒pSFBPAD1，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，与Biochemistry，29，1009(1990)所记载的球形芽孢杆菌IFO 3525菌株的碱基序列(Accession No.M33298)相比较，发现了99GT→TG、119G→C、150G→T、537G→C、888T→C的6个碱基置换，96G、103G、104C、169G、297C、505C的6个碱基缺失，及186CA→CAA、302CT→CGT、499CA→CAA的3个碱基插入，其中以ORF的起始位置为第1位。其碱基序列如序列编号：18所示。这样，确认了质粒pSFBPAD1中重组了球形芽孢杆菌IFO 3525菌株来源的L-丙氨酸脱氢酶基因和母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的变异体基因。
除了以25℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSFBPAD1制备无细胞提取液，测定L-丙氨酸氧化活性和甲酸氧化活性，比活性分别为8.44U/mg-蛋白质及0.83U/mg-蛋白质。
制造例8
含有两种基因的质粒pSF-SAD1的构建(L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶)
以具有Appl.Environ.Mictobiol.，65，4014(1999)所记载的希瓦氏菌属菌种Ac 10菌株来源的L-丙氨酸脱氢酶基因的质粒pSheAlaDH2的碱基序列为基础，合成正向引物SheAlaDH-A2(序列编号：19)和反向引物SheAlaDH-T2(序列编号：20)。
序列编号19：AGAGAATTCTATCATGATTATTGGTGTTCCAACAGAAATC
序列编号20：GACAAGCTTCTAGATTAAGCAAGTAGGCTTTTTGGTTCAG
以质粒pSheAlaDH2为模板，用正向引物SheAlaDH-A2和反向引物SheAlaDH-T2按照制造例1记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将制造例4中得到pSE-MF26用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSF-SAD1(图11)。
对于纯化的质粒pSF-SAD1，使用引物步移法分析插入DNA的碱基序列，结果与Appl.Environ.Mictobiol.，65，4014(1999)所记载的碱基序列完全一致。这样，确认了质粒pSF-SAD1中重组了希瓦氏菌属菌种Ac 10菌株来源的L-丙氨酸脱氢酶基因和母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的变异体基因。
除了以25℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSF-SAD1制备无细胞提取液，测定L-丙氨酸氧化活性和甲酸氧化活性，比活性分别为3.50U/mg-蛋白质、1.02U/mg-蛋白质。
制造例9
含有两种基因的质粒pFGSLED1的构建(L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶)
用LB培养基培养嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株，制备菌体。用Genome tip 100(Qiagen制造)从菌体分离纯化染色体DNA
根据Biochemistry，27，9056(1988)所记载的嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO12550菌株来源的L-亮氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号M22977)，合成正向引物GSTLEUDH-A2(序列编号：21)和反向引物GSTLEUDH-T2(序列编号：22)。
序列编号21：GTCTCTAGAGGAATTCTACCATGGAATTGTTCAAATATATGGAAACTTACGATTATGAGC
序列编号22：CTGAAGCTTCTAGATTATATTGCCGAAGCACCTGCC
以前述嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株来源的染色体为模板，用正向引物GSTLEUDH-A2和反向引物GSTLEUDH-T2按照制造例1记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.3kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel BandPurification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶Xba I、Not I双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。另外将剩余PCR反应液的一部分用限制性内切酶Not I、HindIII双酶切，用与上述同样的方法纯化制备DNA片段。
将pSE420D(特开2000-189170号公告)用限制性内切酶Xba I和HindIII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接上述两种DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pFGSLED2(图12)。
对于纯化的质粒，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，与Biochemistry，27，9056(1988)所记载的登录序列(M22977)相比较，发现在该登录序列的3’末端插入了186bp的非翻译序列。其碱基序列如序列编号：23所示。这样，确认了质粒pFGSLED2中重组了嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株来源的L-亮氨酸脱氢酶基因。
根据嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株来源的L-亮氨酸脱氢酶基因中间部分以及3’-末端序列，合成克隆用的正向引物GstLeuDH-SalI(序列编号：24)和反向引物GstLeuDH-TAA1(序列编号：25)。
序列编号24：GCGGTCGACCCGAACGAC
序列编号25：CTGAAGCTTCTAGATTAACGTGCACGACGGCGGCTTAA
以前述pFGSLED2质粒为模板，用正向引物GstLeuDH-SalI和反向引物GstLeuDH-TAA1按照制造例1记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约0.7kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶Sal I、HindIII双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。另外将前述质粒pFGSLED2用限制性内切酶Xba I和SalI双酶切，用与上述同样的方法纯化制备DNA片段。
将制造例4中得到pSU-MF26用限制性内切酶Xba I和HindIII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接上述2种DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pFGSLED1(图13)。
对于纯化的质粒pFGSLED1，使用引物步移法以制造例1所述条件分析插入DNA的碱基序列，确认了质粒pFGSLED1中重组了如序列编号：23所示的碱基序列组成的嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株来源的L-亮氨酸脱氢酶基因和母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的变异体基因。
除了以24℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pFGSLED1制备无细胞提取液，测定质粒L-亮氨酸氧化活性和甲酸氧化活性，比活性分别为4.03U/mg-蛋白质和0.63U/mg-蛋白质。
制造例10
含有两种基因的质粒pSFBPLD1的构建(L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶)
根据DDBJ/EMBL/GenBank数据库所记载的球形芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号AB103119)，合成正向引物BspLeuDH-A1(序列编号：26)和反向引物BspLeuDH-T1(序列编号：27)。
序列编号26：GTGGAATTCTACCATGGAAATCTTCAAGTATATGGAAAAGTATG
序列编号27：CTCCTTAAGTCTAGATTAACGACCGTTCAAAATGTTTTTTTCATTTTTTAAGAACTG
用制造例7中制备的球形芽孢杆菌IFO 3525菌株来源的染色体DNA为模板，用正向引物BspLeuDH-A1和反向引物BspLeuDH-T1用制造例1所述的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA andGel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶EcoRI、Afl II双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将制造例4中得到pSU-MF26用限制性内切酶双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSFBPLD1(图14)。
对于纯化的质粒，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，结果与DDBJ/EMBL/GenBank数据库所记载的球形芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号AB103119)完全一致。这样，确认了质粒pSFBPLD1中重组了球形芽孢杆菌IFO 3525菌株来源的L-亮氨酸脱氢酶基因。
除了以24℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSFBPLD1制备无细胞提取液，测定质粒L-亮氨酸氧化活性和甲酸氧化活性，结果比活性分别为5.76U/mg-蛋白质和0.54U/mg-蛋白质。
制造例11
含有两种基因的质粒pSF-TIP2的构建(苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶)
将中间型高温放线菌IFO 14230菌株用M-64培养基(1％蛋白胨、0.25％酵母提取物、0.2％肉浸膏、0.2％甘油、0.2％氯化钠、0.2％磷酸氢二钾、0.2％磷酸二氢钾、0.01％七水合硫酸镁、痕量的生物素(20mg/100mL溶液，每1L培养基中添加2μL)pH 7.2)在55℃培养，制备菌体。按照MethodsEnzymol.，152，116(1987)所记载的方法从菌体制备染色体DNA。
根据J.Biochem.，109，371(1991)所记载的中间型高温放线菌IFO 14230菌株来源的苯丙氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号D00631)，合成正向引物TIP-ATG1(序列编号：28)和反向引物TIP-TAA1(序列编号：29)。
序列编号28：CAGGAATTCTATAATGCGTGATGTATTTGAAATGATGGAC
序列编号29：CTGAAGCTTCTAGATTAACGACGTGCACTATTACGGGGATCCTCCAA
以从前述中间型高温放线菌IFO 14230菌株来源的染色体DNA为模板，用正向引物TIP-ATG1和反向引物TIP-TAA1按照制造例1记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的特异性条带。切出该条带，经苯酚-氯仿沉淀、乙醇沉淀回收DNA片段后，用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将制造例1中得到pSE420U用限制性内切酶EcoR I、HindIII双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSU-TIP2(图15)。
对于纯化的质粒pSU-TIP2，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，与J.Biochem.，109，371(1991)所记载的中间型高温放线菌IFO 14230菌株来源的L-苯丙氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号D00631)相比较，发现了包含两个氨基酸置换的碱基置换，即431AG→GC(Lys144→Ser)和846T→G(Cys282→Trp)，其中以ORF的起始位置作为第1位。这样，确认了质粒pSU-TIP2中重组了中间型高温放线菌IFO14230菌株来源的L-苯丙氨酸脱氢酶基因。
将制造例4中得到的pSE-MF26用限制性内切酶Nco I、EcoR I双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。将质粒pSU-TIP2用限制性内切酶Nco I、EcoR I双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到重组了中间型高温放线菌IFO14230菌株来源的L-苯丙氨酸脱氢酶和母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的基因的质粒pSF-TIP2(图16)。
除了以24℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSF-TIP2制备无细胞提取液，测定L-苯丙氨酸氧化活性和甲酸氧化活性，比活性分别为9.56U/mg-蛋白质和0.76U/mg-蛋白质。
制造例12
含有支链氨基酸氨基转移酶基因的质粒pSE-ECB1的构建
根据J.Biochem.，97，993(1985)所记载的大肠杆菌K-12菌株来源的支链氨基酸氨基转移酶基因的碱基序列(登录号X02413)，合成正向引物EcBCA-A1(序列编号：30)及反向引物EcBCA-T1(序列编号：31)。
序列编号30：CTGTCATGACTAATAAGAAAGCGTATTACATTTGGTTCAATGG
序列编号31：GTCTCTAGATTATTGATTAACTTGATCTAACCAGCCCCA
以制造例3中大肠杆菌JM109菌株来源的染色体DNA为模板，用正向引物EcBCA-A1和反向引物EcBCA-T1在与制造例1同样的条件下进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶BspH I、Xba I双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas BandPrep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将pSE420D(特开2000-189170)用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSE-ECB1(图17)。
对于纯化的质粒pSFBPAD1，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，结果与J.Biochem.，97，993(1985)所记载的大肠杆菌K-12菌株来源的支链氨基酸氨基转移酶基因的碱基序列(登录号X02413)完全一致。这样，就确认了质粒pSE-ECB1中重组了大肠杆菌K-12菌株来源的支链氨基酸氨基转移酶基因。
除了以24℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSE-ECB1制备无细胞提取液，按照上述酶活性测定方法测定氨基转移酶活性，比活性为1.44U/mg-蛋白质。
制造例13
含有支链氨基酸氨基转移酶基因的质粒pSE-BSB1的构建
用LB培养基培养枯草芽孢杆菌DB 104菌株，制备菌体。用NucleicAcids Res.，8，4321(1980)所记载的方法从菌体分离纯化染色体DNA。
根据J.Bacteriol.，179，496(1997)所记载的枯草芽孢杆菌来源的支链氨基酸氨基转移酶的碱基序列(Z49992)，合成引物BsBCA-A1(序列编号：32)及反向引物BsBCA-T1(序列编号：33)。
序列编号32：TGATCATGACTAAACAAACAATTCGCGTTGA
序列编号33：GCTTCTAGATTATTTACTTTCAGTCAGCGCTGCGA
以前述枯草芽孢杆菌DB 104来源的染色体DNA为模板，用正向引物BsBCA-A1和反向引物BsBCA-T1按照与制造例1记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了高特异性条带。切出该条带，用GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶BspH I、Xba I双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将pSE420D(特开2000-189170号公告)用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSE-BSB 1(图18)。
对于纯化的质粒，使用引物步移法用制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，与J.Bacteriol.，179，496(1997)所记载的枯草芽孢杆菌来源的支链氨基酸氨基转移酶的碱基序列(Z49992)相比较，发现有包含1个氨基酸置换的两个碱基置换，即177A→G和178A→G(Thr60→Ala)，其中以ORF的起始位置为第1位。这样，确认了质粒pSE-BSB 1中重组了枯草芽孢杆菌来源的支链氨基酸氨基转移酶基因。
除了以24℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSEBSB 1制备无细胞提取液，按照上述酶活性的测定方法，测定质粒氨基转移酶活性，比活性为0.30U/mg-蛋白质。
制造例14
从DL-正缬氨酸制造2-氧戊酸
用制造例1中得到的质粒pSUCBDO1转化大肠杆菌HB101菌株，将得到的转化体用2×YT培养基(2％细菌用胰蛋白胨、1％细菌用酵母提取物、1％氯化钠、pH 7.2)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG，诱导D-氨基酸氧化酶基因的表达后，收集菌体，得到表达D-氨基酸氧化酶的大肠杆菌。
向加入了DL-正缬氨酸(正缬氨酸的对映异构体混合物)至底物终浓度分别为1重量％(85mM)、4重量％(341mM)和10重量％(850mM)的3个反应容器中，分别加入400mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)和从10g量的培养液制备的菌体，配制成总重量10g的反应液，在30℃振荡反应过夜。从反应液中每份采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表1所示。
制造例15
除了将制造例14中使用的质粒由制造例1得到的pSUCBDO1换为制造例2中得到的pSUTVDO1之外，进行与制造例14同样的操作来制备表达D-氨基酸氧化酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例14同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表1所示。
制造例16
用制造例3中得到的质粒pETECDD1转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株，得到的转化体用2×YT培养基(2％细菌用胰蛋白胨、1％细菌用酵母提取物、1％氯化钠、pH 7.2)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mMIPTG，诱导D-氨基酸氧化酶基因的表达后，收集菌体，得到表达D-氨基酸氧化酶的大肠杆菌。
向加入了DL-正缬氨酸(正缬氨酸的对映异构体混合物)至底物终浓度分别为1重量％(85mM)和4重量％(341mM)的两个反应容器中，分别加入400mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)和从10g量的培养液制备的菌体，配制成总重量10g的反应液，在30℃振荡反应过夜。从反应液中每份采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表1所示。
制造例17
从2-氧戊酸制造L-正缬氨酸(利用L-氨基酸脱氢酶)
用制造例5中得到的质粒pSF-GAS2转化大肠杆菌HB101菌株，得到的转化体用2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG，诱导L-丙氨酸脱氢酶基因的表达后，收集菌体，得到共表达L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。
向加入了2-氧戊酸钠至终浓度分别为2重量％(145mM)、4重量％(290mM)及10％(724mM)，和甲酸钠至终浓度分别为174mM、348mM和869mM的3个反应容器中，分别加入400mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)和从10g量的培养液制备的菌体，配制成总重量10g的反应液，在30℃振荡反应过夜。从反应液中每份采取0.1g样品，按照正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸光学纯度的分析和定量。其结果如表2所示。
制造例18
除了将制造例17中使用的质粒由制造例5中得到的pSF-GSA2换为制造例6中得到的pSF-BTA1之外，进行与制造例17同样的操作来制备共表达L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例17同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表2所示。
制造例19
除了将制造例17中使用的质粒由制造例5中得到的pSF-GSA2换为制造例7中得到的pSFBPAD1之外，进行与制造例17同样的操作来制备共表达L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例17同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表2所示。
制造例20
除了将制造例17中使用的质粒由制造例5中得到的pSF-GSA2换为制造例8中得到的pSF-SAD1之外，进行与制造例17同样的操作来制备共表达L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例17同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表2所示。
制造例21
除了将制造例17中使用的质粒由制造例5中得到的pSF-GSA2换为制造例9中得到的pFGSLED1之外，进行与制造例17同样的操作来制备共表达L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例17同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表2所示。
制造例22
除了将制造例17中使用的质粒由制造例5中得到的pSF-GSA2换为制造例10中得到的pSFBPLD1之外，进行与制造例17同样的操作来制备共表达L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例17同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表2所示。
制造例23
除了将制造例17中使用的质粒由制造例5中得到的pSF-GSA2换为制造例11中得到的pSF-TIP2之外，进行与制造例17同样的操作来制备共表达L-氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例17同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表2所示。
制造例24
从2-氧戊酸制造L-正缬氨酸(利用L-氨基酸氨基转移酶)
除了将制造例17中使用的质粒由制造例5中得到的pSF-GSA2换为制造例12中得到的pSE-ECB1之外，进行与制造例17同样的操作制备表达支链氨基酸氨基转移酶的大肠杆菌。
向加入2-氧戊酸钠至终浓度分别为2重量％(145mM)和4重量％(290mM)，以及作为氨基供体的L-谷氨酸钠至终浓度分别为290mM和580mM的2个反应容器中，分别加入400mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)，用5M氢氧化钠水溶液调至pH 8.0后，加入从10g量的培养液制备的菌体，配制成总重量10g的反应液，在30℃振荡反应过夜。从反应液中每份采取0.1g样品，按照后文所述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表3所示。
制造例25
将制造例24中制备的表达支链氨基酸氨基转移酶的大肠杆菌用于以下反应。除了将制造例24中用作氨基供体的L-谷氨酸钠换成L-天冬氨酸之外，使用与制造例24同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表3所示。
制造例26
除了将制造例17中使用的质粒由制造例中5得到的pSF-GSA2换成制造例13中得到的pSE-BSB 1之外，进行与制造例17同样的操作来制备表达支链氨基酸氨基转移酶的大肠杆菌。使用得到的大肠杆菌通过与制造例24同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表3所示。
制造例27
将制造例26中制备的表达支链氨基酸氨基转移酶的大肠杆菌用于以下反应。除了将制造例26中用作氨基供体的L-谷氨酸钠换成L-天冬氨酸之外，使用与制造例26同样的方法进行反应，并进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表3所示。
制造例28
用混合菌体制造L-正缬氨酸
用制造例1中得到的质粒pSUCBDO1转化大肠杆菌HB101菌株，将得到的转化体用50ml2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达D-氨基酸氧化酶的大肠杆菌。
用制造例11中得到的质粒pSF-TIP2转化大肠杆菌HB101菌株，将得到的转化体用50ml 2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到共表达L-苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。
将从各5g量的上述2种培养液制备的菌体加入含4重量％的DL-正缬氨酸、0.20M甲酸钠和0.75M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液中，使总重量为10g，在通气条件下振荡，30℃反应过夜。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表4所示。
制造例29
除了使用含10重量％的DL-正缬氨酸、0.51M甲酸钠和0.75M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液作为制造例28中的反应液之外，使用与制造例28同样的方法进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表4所示。
制造例30
用混合菌体制造L-正缬氨酸
用制造例1中得到的质粒pSUCBDO1转化大肠杆菌HB101菌株，将得到的转化体用50ml 2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达D-氨基酸氧化酶的大肠杆菌。
用制造例5中得到的质粒pSF-GSA2转化大肠杆菌HB101菌株，将得到的转化体用50ml 2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到共表达L-丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌。
将从各5g量的上述2种培养液制备的菌体加入含4重量％的DL-正缬氨酸、0.20M甲酸钠和0.75M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液中，使总重量为10g，在通气条件下振荡，30℃反应过夜。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表4所示。
制造例31
除了使用含10重量％的DL-正缬氨酸、0.51M甲酸钠和0.75M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液作为制造例30中的反应液之外，使用与制造例30同样的方法进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表4所示。
制造例32
能够表达四种基因的载体pSE420Q的构建
将制造例1中得到的质粒pSE420U用SpeI、双酶切，将合成DNA(序列编号：35、序列编号：36)退火后连接于所述位点，构建质粒pSE420Q。
序列编号35：CTAGTAGAGGTACCTATATATGCATGTGCACGC
序列编号36：TTAAGCGTGCACATGCATATATAGGTACCTCTA
制造例33
含有大肠杆菌来源的过氧化氢酶基因katE的质粒pSQECKE1的构建
根据大肠杆菌K12菌株来源的过氧化氢酶基因katE的碱基序列(登录号NC_000913REGION：1811891..1814152)，合成克隆用正向引物EckatE-A1(序列编号：37)和反向引物EckatE-T1(序列编号：38)。
序列编号37：gacggtacctatacATGTCTCAACATAACGAAAAGAACCCACA
序列编号38：tcgaagcttaagaTTATGCAGGAATTTTGTCAATCTTAGGAATGC
以前述大肠杆菌K12菌株生成的染色体DNA为模板，用上述正向引物EckatE-A1(序列编号：37)和反向引物EckatE-T1(序列编号：38)按照制造例1所记载的方法进行PCR，扩增由序列编号39的碱基序列组成的DNA片段。将所得DNA片段用限制性内切酶Kpn I、HindIII双酶切，与经相同限制性内切酶双酶切的制造例32中得到的pSE420Q连接，构建pSQECKE1。
按照上述酶活性测定方法，测定质粒pSQECKE1的过氧化氢酶活性，其比活性为260U/mg-蛋白质。
另外据报道，质粒pSQECKE1所含的大肠杆菌来源的过氧化氢酶EckatE，与制造例34中得到的质粒pSQECKG1所含的大肠杆菌来源的过氧化氢酶EckatG相比，过氧化氢酶活性以及稳定性均较高，且过氧化物酶活性较低。这些特性也符合本发明的目的，因此将表达EckatE的质粒pSQECKE1用于以后的实验。
制造例34
含有大肠杆菌来源的过氧化氢酶基因katG的质粒pSQECKG1的构建
根据大肠杆菌K12菌株来源的过氧化氢酶基因katG的碱基序列(登录号NC_000913REGION：4131858..4134038)合成克隆用正向引物EckatG-Al(序列编号：40)和反向引物EckatG-T1(序列编号：41)。
序列编号40：gacggtaccatatcATGAGTACTTCAGACGATATCCATAACAC
序列编号41：gacaagcttaagaTTAAAGCAGATCAAAACGGTCGAGG
以从前述大肠杆菌K12菌株生成的染色体DNA为模板，用上述正向引物EckatG-A1(序列编号：40)和反向引物EckatG-T1(序列编号：41)按照制造例1所记载的方法同样的方法进行PCR，扩增由序列编号42的碱基序列组成的DNA片段。将所得DNA片段用限制性内切酶Kpn I和HindIII双酶切，与经相同限制性内切酶双酶切的制造例32中所得的pSE420Q相连接，构建pSQECKG1。
按照上述酶活性测定方法，测定质粒pSQECKG1的过氧化氢酶活性，其比活性为108U/mg-蛋白质。
制造例35
含有两种基因的质粒pSQTIP2的构建(苯丙氨酸脱氢酶和过氧化氢酶)
根据J.Biochem.，109，371(1991)所记载的中间型高温放线菌IFO 14230菌株来源的苯丙氨酸脱氢酶基因的碱基序列(登录号D00631)合成正向引物TIP-ATG4(序列编号：43)和反向引物TIP-TAA4(序列编号44)。
序列编号43：CAGGAATTCTATAATGCGTGATGTATTTGAAATGATGGAC
序列编号44：gtcaggtacctcTTAACGACGTGCACTATTACGG
以制造例11中得到的苯丙氨酸脱氢酶表达质粒pSU-TIP2为模板，用正向引物TIP-ATG4和反向引物TIP-TAA4按照与制造例1所记载的方法相同的方法进行PCR，扩增DNA片段。将所得DNA片段用限制性内切酶KbaI和Kpn I双酶切，与经相同限制性内切酶双酶切的制造例33中得到的pSQECKE1连接，得到重组了中间型高温放线菌IFO 14230菌株来源的L-苯丙氨酸脱氢酶和大肠杆菌K12菌株来源的过氧化氢酶基因katE的质粒pSQTIP4。
实施例1
含有三种基因的质粒pSFTPCO1的构建
合成了博伊丁假丝酵母DSM 70026菌株来源的D-氨基酸氧化酶基因的反向引物CbDAO-T2(序列编号：34)。
序列编号34：GTCTTAATTAAAGTTTAGCTTTAACTTTTTGGTTATCAACTAA
以制造例11中得到的质粒pSUCBDO1为模板，用制造例11中记载使用的正向引物CbDAO-A1(序列编号：3)和反向引物CbDAO-T1(序列编号：4)按照制造例11记载的方法进行PCR。将PCR反应液的一部分用琼脂糖凝胶电泳分析，结果检测出了约1.1kbp的特异性条带。切出该条带，用GFXPCR DNA and Gel Band Purification Kit(Pharmacia制造)纯化后，用限制性内切酶Nde I和Pac I双酶切，经苯酚-氯仿处理后进行琼脂糖凝胶电泳，切出目的条带部分，用Sephaglas Band Prep Kit(Pharmacia制造)纯化，得到目的DNA片段。
将制造例11所得的质粒pSF-TIP2用限制性内切酶Nde I和Pac I双酶切，用磷酸酶处理，接着用苯酚-氯仿处理后，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接目的DNA片段。用得到的质粒转化大肠杆菌JM109菌株，用与制造例1同样的方法纯化，得到质粒pSFTPCO1(图19)。
对于纯化的质粒，使用引物步移法以制造例1中记载的条件分析插入DNA的碱基序列，确认重组了博伊丁假丝酵母来源的D-丙氨酸氧化酶、中间型高温放线菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶及母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶。
除了以26℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSFTPCO1制备无细胞提取液，测定各个酶的活性。结果比活性分别为：D-丙氨酸氧化活性为2.93U/mg-蛋白质，L-苯丙氨酸氧化活性为7.03U/mg-蛋白质，甲酸氧化活性为0.71U/mg-蛋白质。
实施例2
含有三种基因的质粒pSFGACO1的构建
将制造例1中通过PCR获得的、含博伊丁假丝酵母来源的D-氨基酸氧化酶基因的DNA片段，和制造例5中获得的质粒pSF-GSA2分别用限制性内切酶Nde I和Pac I双酶切，磷酸酶处理，接着用苯酚-氯仿处理后，用T4DNA连接酶(TakaraBio制造)连接，转化大肠杆菌JM109菌株。将插入了目的DNA片段的转化体用含有氨苄青霉素的LB液体培养基培养，用FlexiPrep Kit(Pharmacia制造)纯化质粒，得到含有3个基因的质粒pSFGACO1(图20)，它共表达博伊丁假丝酵母来源的D-丙氨酸氧化酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶和母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶的基因。用引物步移法确认了插入DNA的碱基序列。
除了以26℃过夜培养以外，按照上述酶活性的测定方法，用质粒pSFGACO1制备无细胞提取液，测定各个酶的活性，结果比活性分别为：D-丙氨酸氧化活性为2.42U/mg-蛋白质，L-丙氨酸氧化活性为2.63U/mg-蛋白质，甲酸氧化活性为0.79U/mg-蛋白质。
实施例3
用含有三种基因的质粒pSFTPCO1制造L-正缬氨酸
用实施例1中构建的含有3种基因的质粒pSFTPCO1转化大肠杆菌HB 101菌株，将得到的转化体用50ml 2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达三种基因的大肠杆菌。
将从10g量的培养液制备的菌体，加入含有4重量％的DL-正缬氨酸、0.20M甲酸钠和0.17M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液中，使总重量为10g，在通气条件下振荡，30℃进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表5所示。
实施例4
除了使用含有10重量％的DL-正缬氨酸、0.51M甲酸钠和0.43M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液作为实施例3中的反应液之外，使用与实施例3同样的方法进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表5所示。
实施例5
除了使用含有12重量％的DL-正缬氨酸、0.61M甲酸钠和0.51M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液作为实施例3中的反应液之外，用与实施例3同样的方法进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表5所示。
实施例6
除了使用实施例2中构建的含有三种基因的质粒pSFGACO1代替实施例3中的pSFTPCO1来作为含有三种基因的质粒以外，使用与实施例3同样的方法进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表5所示。
实施例7
除了使用含有10重量％的DL-正缬氨酸、0.51M甲酸钠和0.21M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液作为实施例6中的反应液之外，使用与实施例6同样的方法进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表5所示。
实施例8
除了使用含有12重量％的DL-正缬氨酸、0.61M甲酸钠和0.26M氨缓冲液(pH 8.0)的反应液作为实施例6中的反应液之外，使用与实施例6同样的方法进行反应。从反应开始起20个小时后和45个小时后分别从反应液中采取每份0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。其结果如表5所示。
实施例9
用含有三种基因的质粒pSFTPCO1制造L-正缬氨酸
用实施例1中构建的含有三种基因的质粒pSFTPCO1转化大肠杆菌HB 101菌株，将所得的转化体用400ml 2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达三种基因的大肠杆菌。
将得到的大肠杆菌加入含有12重量％(1.02M)的DL-正缬氨酸、2.8％(0.61M)甲酸钠、1.1％(0.62M)氨缓冲液(pH 8.0)的反应液中，使总重量为40g，在通气条件搅拌下，30℃反应24小时。从反应液中采取0.1g的样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量。L-正缬氨酸的浓度是9.1重量％(0.779M)，检测不到D-正缬氨酸，光学纯度为100％。
实施例10
将实施例9中得到的反应液的一部分用如下方法纯化。
向实施例9中得到的反应液30.5g中添加浓硫酸1.7g，调整至pH2.5，在30℃加热搅拌17个小时。得到的酸性悬浊液通过离心分离除菌后，向上清中添加50ml甲醇后过滤除去生成的固体来去除蛋白质。向得到的滤液中添加氨水调整至pH 6，再添加60ml丙酮。过滤获取析出的固体，干燥，得到含有纯化正缬氨酸的白色固体2.42g。得到的固体以顺丁烯二酸为内部标准测定1H-NMR，测得其化学纯度为95％。基于后述正缬氨酸的分析条件2的光学纯度为100％(L型)。
实施例11
将实施例9中得到的反应液的一部分用如下方法纯化。
向实施例9中得到的反应液9.1g中添加4.5ml水，在60℃加热搅拌2.5小时。将得到的悬浊液通过离心分离除菌后，用分级分子量10000的超滤膜(CentriCon YM 10、Millipore制造)以30℃、2000×g离心去除蛋白。接着对滤液进行减压浓缩至可见固体析出。向浓缩液中添加0.1g甲酸，调整至pH 6.2，再添加14.8ml丙酮。过滤获取析出的固体，干燥，得到含有纯化正缬氨酸的白色固体0.433g。得到的固体以顺丁烯二酸为内部标准测定1H-NMR，测得其化学纯度为95％。基于后述正缬氨酸的分析条件2的光学纯度为100％(L型)。
实施例12
含有四种基因的质粒pSFCPCO1的构建(D-氨基酸氧化酶、甲酸脱氢酶、苯丙氨酸脱氢酶、过氧化氢酶)
将实施例1中得到的表达三种基因的质粒pSFTPO1用限制性内切酶Nde I、Xba I双酶切，制备含有D-丙氨酸氧化酶和甲酸脱氢酶基因的DNA片段。将制造例35中得到的表达两种基因的质粒pSQTIP4用同样的限制性内切酶双酶切，与前述含有D-丙氨酸氧化酶和甲酸脱氢酶基因的DNA片段连接，获得了共表达由博伊丁假丝酵母来源的D-丙氨酸氧化酶、母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶、中间型高温放线菌IFO14230菌株来源的L-苯丙氨酸脱氢酶和大肠杆菌K12菌株来源的过氧化氢酶基因katE组成的四种基因的质粒pSFCPCO1。
用得到的表达四种基因的质粒pSFCPCO1，按照上述“酶活性的测定”中记载的方法制备无细胞提取液，按照上述各种酶的相应方法测定活性，其结果是：D-丙氨酸氧化酶活性2.40U/mg-蛋白质、甲酸脱氢酶活性0.63U/mg-蛋白质、L-苯丙氨酸脱氢酶活性5.30U/mg-蛋白质，过氧化氢酶活性399U/mg-蛋白质，可以确认任何一种酶都以充分的活性表达。
实施例13
用含有三种基因的质粒pSFTPCO1制造L-正缬氨酸
用实施例12中构建的含有三种基因的质粒pSFTPCO1转化大肠杆菌HB 101菌株，将得到的转化体用2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达三种基因的大肠杆菌。
将从5g量的培养液制备的菌体加入含有8重量％的DL-正缬氨酸、相对于正缬氨酸0.6当量的甲酸铵的反应液(pH 8.0)中，使总重量为10g，在通气条件下振荡，30℃振荡反应44小时。从反应液中采取0.1g，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果L-正缬氨酸的光学纯度为100％ee，收率为65.9％。
另外，对反应结束后的反应液进行高效液相色谱分析，结果没有检测到α-酮戊酸。
实施例14
用含有四种基因的质粒pSFCPCO1制造L-正缬氨酸
除了用实施例12中得到的含有四种基因的质粒pSFCPCO1代替实施例13中含有三种基因的质粒pSFTPCO1之外，用与实施例13同样的方法进行反应，并进行正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果L-正缬氨酸的光学纯度为100％ee，收率为76.6％。
另外，按照与实施例13同样的方法测定反应结束后残存的α-酮戊酸的浓度，结果检出相对于原料DL-正缬氨酸为21.3mol％。该结果表明，在由D-氨基酸生成酮酸的氧化步骤之后的还原步骤中，从酮酸生成L-氨基酸的酮酸还原氨基化反应没有进行完全，α-酮酸有所蓄积。
实施例15
氧化步骤和还原步骤中使用不同条件的方法
用实施例12中得到的含有四种基因的质粒pSFCPCO1转化大肠杆菌HB101菌株，将得到的转化体用2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达四种基因的大肠杆菌。
将从132g培养液制备的菌体与8重量％的DL-正缬氨酸、相对于正缬氨酸0.6当量的甲酸铵、0.02％的ADEKAnol(消泡剂，旭电化工业公司制造)混合，用硫酸调至pH 8.0，将该反应液400ml加入1L的微型罐，在空气通气量0.5vvm、搅拌速度500rpm、30℃反应条件下进行43小时反应作为氧化步骤。从氧化步骤结束后的反应液中采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果L-正缬氨酸光学纯度为98.3％ee，收率为64.4％。
接着，作为还原步骤，停止含氧气体的通气，在搅拌速度300rpm、补加相对于原料DL-正缬氨酸(从132g培养液制备的菌体)0.37当量的甲酸铵、反应液pH 8.0、30℃的条件下进行62小时反应。从反应结束后的反应液中采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果L-正缬氨酸光学纯度为100％ee，收率为86.6％。
另外，对反应结束后的反应液进行高效液相色谱分析，结果只有少量α-酮戊酸残存(以原料DL-正缬氨酸为基准约4重量％左右)。
实施例16
用甲酸进行氧化步骤的pH调整，还原步骤补加甲酸铵的方法
除了在实施例15中氧化步骤调整反应液pH值时用甲酸代替硫酸之外，通过与实施例15同样的方法进行氧化步骤和还原步骤，结果L-正缬氨酸光学纯度为100％ee，收率为92.8％。
另外，对反应结束后的反应液进行高效液相色谱分析，没有检测到α-酮戊酸。
实施例17
用甲酸进行氧化步骤的pH调整，还原步骤中不补加甲酸铵的方法
除了在实施例15中调整氧化步骤反应液pH值时用甲酸代替硫酸，且还原步骤中不补加甲酸铵之外，通过与实施例15同样的方法进行氧化步骤和还原步骤，结果L-正缬氨酸的光学纯度为100％ee，收率为93.3％。
另外，按照实施例13的方法测定反应结束后残存的α-酮戊酸浓度，没有检测到α-酮戊酸。
由以上结果可见，氧化步骤的pH调整使用硫酸时，反应结束后残存有α-酮酸，还原反应中的还原氨基化反应没有充分进行(实施例15)。而与之相对，氧化步骤的pH调整使用甲酸时，还原步骤进行完全，反应结束后没有也发现α-酮酸残存(实施例16、17)。这时，还原步骤中补加甲酸铵(实施例16)或者不补加(实施例17)都不影响收率。这说明氧化步骤中甲酸被浪费时，通过使用甲酸调整氧化步骤的pH，可以有效地补充甲酸。
参考例1
用实施例12中得到的含有四种基因的质粒pSFCPCO1转化大肠杆菌HB 101菌株，将得到的转化体用2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达四种基因的大肠杆菌。
将从132g培养液制备的菌体与8重量％的DL-正缬氨酸、0.02％的ADEKAnol(消泡剂，旭电化工业公司制造)、甲酸铵在相对于原料DL-正缬氨酸0(不添加)、0.2当量、0.4当量、0.6当量的各条件下混合，用甲酸调至pH 8.0，将所得反应液400ml加入1L的微型罐，在空气通气量0.5vvm、搅拌速度500rpm、30℃反应条件下进行氧化反应作为氧化步骤。对于各条件，氧化步骤结束所需的时间分别为28小时以上、28小时、24小时、28小时。从氧化步骤结束后的反应液中采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果如表6所示。根据其结果可知，在氧化步骤中反应开始时不添加甲酸铵的情况下，即使进行超过28小时的反应光学纯度仍停留在49.3％ee，与相对于原料DL-正缬氨酸添加0.2当量以上的甲酸铵时光学纯度为99％ee以上相对照，反应的进行非常缓慢。而当甲酸铵的添加量在0.2当量以上时，L-正缬氨酸光学纯度充分高，没有发现差别。
参考例2
除了参考例1中的pH调整用甲酸代替甲酸铵，且反应液的pH分别调整到7.0、7.5、8.0、8.5的值之外，通过与参考例1同样的方法进行氧化步骤。从氧化步骤结束后的反应液中采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果如表7所示。
实施例18(贵公司案：补加实施例13，上次的参考例3)
用实施例12中得到的含有四种基因的质粒pSFCPCO1转化大肠杆菌HB 101菌株，将得到的转化体用2×YT培养基(与制造例14相同)在33℃过夜培养。向培养基中添加0.1mM IPTG诱导基因的表达后，收集菌体，得到表达四种基因的大肠杆菌。
将从132g培养液制备的菌体，与8重量％的DL-正缬氨酸、相对于正缬氨酸0.6当量的甲酸铵、0.02％的ADEKAnol(消泡剂，旭电化工业公司制造)混合，用硫酸调至pH 8.0，将所得反应液400ml加入1L的微型罐，在空气通气量0.5vvm、搅拌速度500rpm、30℃反应条件下进行43小时反应作为氧化步骤。从氧化步骤结束后的反应液中采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果L-正缬氨酸光学纯度为98.3％ee，收率为64.4％。
接着，作为还原步骤，停止含氧气体的通气，在搅拌速度300rpm、温度30℃的条件下，用甲酸将反应液的pH调整到6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0各值，进行62小时的反应。从反应结束后的反应液中吸取0.1g样品，从氧化步骤结束后的反应液中采取0.1g样品，按照后述的正缬氨酸的分析条件1进行反应液中所含正缬氨酸的光学纯度分析和定量，结果L-正缬氨酸光学纯度为100％ee，收率为86.6％。
另外，对于反应结束后的反应液进行高效液相色谱分析，只有少量α-酮戊酸残存(以原料DL-正缬氨酸为基准为4重量％左右)。
(评价试验)
正缬氨酸的分析条件1
向含有正缬氨酸的反应液样品0.1g中加入0.1M盐酸悬浮，将离心分离得到的上清用含有0.4％三乙胺的50％乙腈水溶液稀释。将该稀释液100μL与2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)100μL混合，在40℃反应90分钟。得到的反应液通过高效液相色谱在如下条件下分析。
柱：Inertsil ODS-3(φ4.6mm×250mm)(GL SCIENCE制造)
温度：25℃
检测：UV 250nm
洗脱液：10mM磷酸钾缓冲液(pH 2.5)/甲醇＝45/55
流速：1mL/分
在以上条件下检出GITC化的L-正缬氨酸保留时间为8.8分钟，GITC化的D-正缬氨酸为11.8分钟。
正缬氨酸的分析条件2
将含有正缬氨酸的固体5mg溶于1mL水中，在如下条件下分析。
柱：CROWNPAK CR(+)(φ4mm×150mm)(Daicel化学工业(株)制造)
温度：40℃
检测：UV 210nm
洗脱液：高氯酸水溶液(pH 2.0)
流速：0.8mL/分
在如上条件下检出L-正缬氨酸保留时间为2.5分钟，D-正缬氨酸保留时间为3.3分钟。
2-氧戊酸的分析条件
向反应液配制时的反应液样品0.1g中加入0.1M盐酸悬浮，将离心分离得到的上清液在以下条件下分析。
柱：Wakosil-II 5C18HG(φ4.6mm×250mm)(和光纯药(株)制造)
温度：40℃
检测：UV 230nm
洗脱液：0.1体积％三氟乙酸水溶液/乙腈＝95/5
流速：1mL/分
在如上条件下检出2-氧戊酸的保留时间为8.6分钟。
表1
| 制造例 | D-氨基酸氧化酶或者脱氢酶 | Nva[wt％] | 光学纯度[％e.e.(L)] | Nva残留率[％] |
| 14 | 博伊丁假丝酵母DSM 70026菌株来源的D- | 1 | 100 | 57 |
| 氨基酸氧化酶 | 410 | 10039 | 6082 | |
| 15 | 变异三角酵母CBS 4095菌株来源的D-氨基酸氧化酶 | 1410 | 10010024 | 594991 |
| 16 | 大肠杆菌K-12菌株来源的D-氨基酸脱氢酶 | 14 | 10057 | 5468 |
表2
| 制造例 | L-氨基酸脱氢酶 | 底物[wt％] | 光学纯度[％e.e.(L)] | Nva产率[％] |
| 17 | 嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株来源的丙氨酸脱氢酶 | 2410 | 100100100 | 798174 |
| 18 | 热链形芽孢杆菌DSM 730菌株来源的丙氨酸脱氢酶 | 2410 | 100100100 | 687376 |
| 19 | 球形芽孢杆菌IFO 3525菌株来源的丙氨酸脱氢酶 | 2410 | 100100100 | 767677 |
| 20 | 希瓦氏菌属菌种Ac 10菌株来源的丙氨酸脱氢酶 | 2410 | 100100100 | 798262 |
| 21 | 嗜热脂肪地芽孢杆菌IFO 12550菌株来源的亮氨酸脱氢酶 | 2410 | 100100100 | 908932 |
| 22 | 球形芽孢杆菌IFO 3525菌株来源的亮氨酸脱氢酶 | 2410 | 100100100 | 929239 |
| 23 | 中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶 | 24 | 100100 | 10088 |
| 10 | 100 | 73 |
表3
表4
表5
表6
| 甲酸钠[当量] | 氧化步骤所用时间 | 光学纯度[％] |
| 0 | ＞28小时 | 49.3 |
| 0.2 | 28小时 | ＞99 |
| 0.4 | 24小时 | ＞99 |
| 0.6 | 28小时 | ＞99 |
表7
| pH[-] | 光学纯度[％] |
| 7.0 | 16.5 |
| 7.5 | 55.8 |
| 8.0 | 99.5 |
| 8.5 | 92.3 |
工业实用性
本发明的L-氨基酸制造方法作为利用酶反应、在同一体系内高效生成L-氨基酸的方法等是有用的。通过该方法，能够从廉价的氨基酸对映异构体混合物获得光学收率高的L-氨基酸。特别是使过氧化氢分解酶在同一宿主内表达的方法，由于用稳定温和的反应条件避免中间产物酮酸的分解，能够提高L-氨基酸的产率。
序列表
<110>大赛璐化学工业株式会社
<120>L-氨基酸的制造方法
<130>FP06DC09PC
<150>JP 2005-169919
<151>2005-06-09
<160>42
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>1
cgattaactt tattattaaa aattaaagag gtatatacat atgaaatatt taattaagga 60
ggaataatc 69
<210>2
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>2
catggattat tcctccttaa ttaaatattt catatgtata tacctcttta atttttaata 60
ataaagttaa t 71
<210>3
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>3
caccatatgg gtgatcaaat tgttgttctt ggttc 35
<210>4
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>4
cgacttaagt ctagattaaa gtttagcttt aactttttgg ttatcaacta aaag 54
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>5
gacgccggcg ttgcaggttt aactac 26
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>6
ctcaagcttc tagattaaag atttggacga gtaagagctc 40
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>7
cagccatggc taaaatcgtt gttattggtg 30
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>8
ccggcaccaa taacaacgat tttagccatg gctg 34
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>9
tggccatggc tcgtgttgta attctgggaa gtggtgtg 38
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>10
cagtctagat taagaatgtg caccatgtaa atggccc 37
<210>11
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>11
gaggaattct gtcatgaaaa ttggtattcc aaaagaaatc aaaaacaatg 50
<210>12
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>12
ctgaagcttc tagattatcc atgtaacaac gaatgaacat ctg 43
<210>13
<211>1119
<212>DNA
<213>嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)
<400>13
atgaaaattg gtattccaaa agaaatcaaa aacaatgaaa accgcgtcgc catcactccg 60
gcaggcgtga tgacgctcgt caaagcgggg catgacgtgt atgtggagac ggaagccggc 120
gctgggtcgg ggttttccga ttccgagtat gaaaaagccg gggcagtgat cgtgccgaac 180
gcggaagatg cttggacggc ggagatggtg ttgaaagtga aagagccgct ggctgaggag 240
ttccgctatt ttcgccccgg attgattttg tttacgtatt tgcatttagc cgcggccgaa 300
gcgctcacga aagcgctcgt cgagcaaaaa gtggtcggca tcgcttacga gacggtgcag 360
ctggcgaacg gctcgctgcc actgttgacg ccgatgagtg aagtcgccgg ccgcatgtcg 420
gtgcaagtcg gcgcccagtt tctcgagaag ccgcacggcg ggaaaggcat tttgcttggc 480
ggcgtgcccg gagtgcggcg cggcaaagtg acgatcatcg gcggcggaac ggcggggacg 540
aacgcggcga aaatcgcggt cggtctcggg tcagacgtga cgattttgga cattaacgcc 600
gagcggctgc gcgagctcga tgatttgttc ggcgaccacg tgacgacgct catgtccaac 660
tcgtaccata tcgccgagtg cgtgcgcgaa tcggatttgg tcgtcggtgc cgtcttgatc 720
ccgggggcga aagcgccgaa gctggtgacg gaagagatgg tgcgctcgat gacgccggga 780
tcggtgttgg tcgacatcgc cattgaccaa ggcggcattt tcgaaacgac cgaccgcgtc 840
acgacgcacg acgatccgac atacgtcaag cacggcgtcg tccattacgc cgtcgccaac 900
atgccgggcg cggtgccgcg cacgtcgaca ttcgcgctta cgaacgtcac gatcccatac 960
gccttgcaaa tcgccaacaa aggctaccgc gccgcgtgct tggataaccc ggcgctgtta 1020
aaagggatca acacgctcga cgggcacatc gtgtacgaag cggtcgcggc ggcgcacaac 1080
atgccgtata cagatgttca ttcgttgtta catggataa 1119
<210>14
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>14
gaggaattct attcatgatt attggtgtgc caaaggaa 38
<210>15
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>15
cagaagcttc tagattaatt agcagccaac gttttcc 37
<210>16
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>16
gtggaattct atcatgaaaa ttggtattcc aaaggaaatt aaaaacaacg 50
<210>17
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>17
ctgaagcttc tagattattg gattaattca tccacattca catatgg 47
<210>18
<211>1116
<212>DNA
<213>球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)
<400>18
atgaaaattg gtattccaaa ggaaattaaa aacaacgaaa atcgcgtagc aatgacacca 60
gcaggagttg tatccttaac gcatgctggg cacgaagtgt atattgaaac aggagctggt 120
atcggttcaa gttttacaga tgcagattac gtagcagcag gtgcacatat cgttgcatcg 180
gcaaaagaag cgtgggctca agaaatgatt ttaaaagtaa aagaacccgt agcatcggaa 240
tacgattact tttatgaggg acaaatctta tttacctact tgcacttagc gccagagcgt 300
gaattaacgc aggcattaat agataaaaaa gttgtaggta ttgcctatga aacggttcaa 360
cttgcaaatg gttcactacc tttattaaca ccaatgagtg aagtagctgg taaaatggca 420
acacaaattg gtgcgcaata tttagagaaa aatcacggtg gtaaagggat tttactaggc 480
ggtgtatcag gtgtacaacg cggtaaagta acagtaattg gtggcggaat cgccggaaca 540
aacgctgcga aaattgcagt tggtatggga gcagacgtaa cagttattga tttaagtcca 600
gaacgtctac gtcaattaga agatatgttt ggtcgcgatg ttcaaacatt aatgtctaac 660
ccgtataata ttgcagaatc tgtgaaacac tcagatttag ttgtcggtgc tgttctaatt 720
cctggtgcaa aggctccaaa gttagtttcg gaagaaatga ttcaatcgat gcaaccaggt 780
tctgttgttg tggatattgc gattgaccaa ggtggaattt ttgcgacatc tgatcgtgtt 840
acaacacatg atgatccaac gtatgttaaa catggggtag tccactatgc tgttgcaaat 900
atgccagggg ctgtgccacg tacttcaacg attgctttaa caaataatac aattccttat 960
gcgttgcaaa ttgccaataa aggctataag caagcatgta ttgacaatcc tgcattgaaa 1020
aaaggtgtga atgcattaga ggggcatatt acttataaag cggtagcaga agcacaaggc 1080
ttgccatatg tgaatgtgga tgaattaatc caataa 1116
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>19
agagaattct atcatgatta ttggtgttcc aacagaaatc 40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>20
gacaagcttc tagattaagc aagtaggctt tttggttcag 40
<210>21
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>21
gtctctagag gaattctacc atggaattgt tcaaatatat ggaaacttac gattatgagc 60
<210>22
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>22
ctgaagcttc tagattatat tgccgaagca cctgcc 36
<210>23
<211>1104
<212>DNA
<213>嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearohtermophi lus)
<400>23
atggaattgt tcaaatatat ggaaacttac gattatgagc aagtgctgtt ttgccaagat 60
aaagaatcgg gtttgaaagc gatcattgcc attcatgaca caacgctcgg cccggcgctc 120
ggcgggacgc gcatgtggat gtacaattcg gaagaagaag cgcttgaaga cgccttgcgc 180
ctcgcccgcg gcatgacgta caaaaacgcg gccgccggcc tcaacttggg cgggggcaaa 240
acggtcatca tcggcgaccc gcgcaaagat aaaaacgaag cgatgttccg ggcgttcggc 300
cgcttcattc aagggctgaa cggccgctac atcacggcgg aagacgtcgg cacgaccgtc 360
gccgatatgg atatcatcta tcaagaaacc gactatgtca ccggcatttc gcccgaattc 420
ggctcatccg gcaacccatc gccggcgacc gcctacggcg tataccgcgg catgaaggcg 480
gcggcaaaag aggcattcgg cagcgattcg ctcgaaggaa aagtcgtcgc cgtccaagga 540
gtcggcaatg tcgcgtatca tttgtgccgc catttgcacg aagaaggagc gaaactcatc 600
gtgactgaca tcaacaagga agcggtggcg cgcgcagtcg aggaattcgg agcgaaagcg 660
gtcgacccga acgacattta cggcgtggag tgcgacattt ttgctccatg cgcgctcggc 720
ggcatcatca acgatcaaac gattccgcaa ctgaaagcga aagtgatcgc cggatcggcg 780
aacaaccagc tgaaagagcc gcgccatggc gacatcatcc atgaaatggg catcgtctat 840
gccccggatt atgtgatcaa cgccggcggc gtcatcaatg tcgcggacga actgtacggc 900
tacaatcggg aacgggcgat gaaaaaaatc gagcaaattt atgacaacat cgaaaaagtg 960
tttgccatcg ccaagcgcga caacattcca acgtatgtgg ccgccgaccg gatggcggaa 1020
gaacggattg aaacgatgcg caaagcgcgc agtcaatttt tgcaaaatgg tcaccatatt 1080
ttaagccgcc gtcgcgcccg ctaa 1104
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>24
gcggtcgacc cgaacgac 18
<210>25
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>25
ctgaagcttc tagattaacg tgcacgacgg cggcttaa 38
<210>26
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>26
gtggaattct accatggaaa tcttcaagta tatggaaaag tatg 44
<210>27
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>27
ctccttaagt ctagattaac gaccgttcaa aatgtttttt tcatttttta agaactg 57
<210>28
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>28
caggaattct ataatgcgtg atgtatttga aatgatggac 40
<210>29
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>29
ctgaagcttc tagattaacg acgtgcacta ttacggggat cctccaa 47
<210>30
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>30
ctgtcatgac tactaagaaa gctgattaca tttggttcaa tgg 43
<210>31
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>31
gtctctagat tattgattaa cttgatctaa ccagcccca 39
<210>32
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>32
tgatcatgac taaacaaaca attcgcgttg a 31
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>33
ttctagatta tttactttca gtcagcgctg cga 33
<210>34
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>34
gtcttaatta aagtttagct ttaacttttt ggttatcaac taa 43
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>35
ctagtagagg tacctatata tgcatgtgca cgc 33
<210>36
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>36
ttaagcgtgc acatgcatat ataggtacct cta 33
<210>37
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>37
gacggtacct atacatgtct caacataacg aaaagaaccc aca 43
<210>38
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>38
tcgaagctta agattatgca ggaattttgt caatcttagg aatgc 45
<210>39
<211>2289
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia col i)
<220>
<221>EckatE过氧化氢酶
<222>(15)..(2276)
<223>EcatE的过氧化物酶活性低于EcatG
<400>39
gacggtacct atacatgtct caacataacg aaaagaaccc acatcagcac cagtcaccac 60
tacacgattc cagcgaagcg aaaccgggga tggactcact ggcacctgag gacggctctc 120
atcgtccagc ggctgaacca acaccgccag gtgcacaacc taccgcccca gggagcctga 180
aagcccctga tacgcgtaac gaaaaactta attctctgga agacgtacgc aaaggcagtg 240
aaaattatgc gctgaccact aatcagggcg tgcgcatcgc cgacgatcaa aactcactgc 300
gtgccggtag ccgtggtcca acgctgctgg aagattttat tctgcgcgag aaaatcaccc 360
actttgacca tgagcgcatt ccggaacgta ttgttcatgc acgcggatca gccgctcacg 420
gttatttcca gccatataaa agcttaagcg atattaccaa agcggatttc ctctcagatc 480
cgaacaaaat caccccagta tttgtacgtt tctctaccgt tcagggtggt gctggctctg 540
ctgataccgt gcgtgatatc cgtggctttg ccaccaagtt ctataccgaa gagggtattt 600
ttgacctcgt tggcaataac acgccaatct tctttatcca ggatgcgcat aaattccccg 660
attttgttca tgcggtaaaa ccagaaccgc actgggcaat tccacaaggg caaagtgccc 720
acgatacttt ctgggattat gtttctctgc aacctgaaac tctgcacaac gtgatgtggg 780
cgatgtcgga tcgcggcatc ccccgcagtt accgcaccat ggaaggcttc ggtattcaca 840
ccttccgcct gattaatgcc gaagggaagg caacgtttgt acgtttccac tggaaaccac 900
tggcaggtaa agcctcactc gtttgggatg aagcacaaaa actcaccgga cgtgacccgg 960
acttccaccg ccgcgagttg tgggaagcca ttgaagcagg cgattttccg gaatacgaac 1020
tgggcttcca gttgattcct gaagaagatg aattcaagtt cgacttcgat cttctcgatc 1080
caaccaaact tatcccggaa gaactggtgc ccgttcagcg tgtcggcaaa atggtgctca 1140
atcgcaaccc ggataacttc tttgctgaaa acgaacaggc ggctttccat cctgggcata 1200
tcgtgccggg actggacttc accaacgatc cgctgttgca gggacgtttg ttctcctata 1260
ccgatacaca aatcagtcgt cttggtgggc cgaatttcca tgagattccg attaaccgtc 1320
cgacctgccc ttaccataat ttccagcgtg acggcatgca tcgcatgggg atcgacacta 1380
acccggcgaa ttacgaaccg aactcgatta acgataactg gccgcgcgaa acaccgccgg 1440
ggccgaaacg cggcggtttt gaatcatacc aggagcgcgt ggaaggcaat aaagttcgcg 1500
agcgcagccc atcgtttggc gaatattatt cccatccgcg tctgttctgg ctaagtcaga 1560
cgccatttga gcagcgccat attgtcgatg gtttcagttt tgagttaagc aaagtcgttc 1620
gtccgtatat tcgtgagcgc gttgttgacc agctggcgca tattgatctc actctggccc 1680
aggcggtggc gaaaaatctc ggtatcgaac tgactgacga ccagctgaat atcaccccac 1740
ctccggacgt caacggtctg aaaaaggatc catccttaag tttgtacgcc attcctgacg 1800
gtgatgtgaa aggtcgcgtg gtagcgattt tacttaatga tgaagtgaga tcggcagacc 1860
ttctggccat tctcaaggcg ctgaaggcca aaggcgttca tgccaaactg ctctactccc 1920
gaatgggtga agtgactgcg gatgacggta cggtgttgcc tatagccgct acctttgccg 1980
gtgcaccttc gctgacggtc gatgcggtca ttgtcccttg cggcaatatc gcggatatcg 2040
ctgacaacgg cgatgccaac tactacctga tggaagccta caaacacctt aaaccgattg 2100
cgctggcggg tgacgcgcgc aagtttaaag caacaatcaa gatcgctgac cagggtgaag 2160
aagggattgt ggaagctgac agcgctgacg gtagttttat ggatgaactg ctaacgctga 2220
tggcagcaca ccgcgtgtgg tcacgcattc ctaagattga caaaattcct gcataatctt 2280
aagcttcga 2289
<210>40
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>40
gacggtacca tatcatgagt acttcagacg atatccataa cac 43
<210>41
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工合成的引物序列
<400>41
gacaagctta agattaaagc agatcaaaac ggtcgagg 38
<210>42
<211>2208
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>EckatG过氧化氢酶
<222>(15)..(2195)
<223>EcatG的过氧化物酶活性高于EcatE
<400>42
gacggtacca tatcatgagt acttcagacg atatccataa caccacagcc actggcaaat 60
gcccgttcca tcagggcggt cacgaccaga gtgcgggggc gggcacaacc actcgcgact 120
ggtggccaaa tcaacttcgt gttgacctgt taaaccaaca ttctaatcgt tctaacccac 180
tgggtgagga ctttgactac cgcaaagaat tcagcaaatt agattactac ggcctgaaaa 240
aagatctgaa agccctgttg acagaatctc aaccgtggtg gccagccgac tggggcagtt 300
acgccggtct gtttattcgt atggcctggc acggcgcggg gacttaccgt tcaatcgatg 360
gacgcggtgg cgcgggtcgt ggtcagcaac gttttgcacc gctgaactcc tggccggata 420
acgtaagcct cgataaagcg cgtcgcctgt tgtggccaat caaacagaaa tatggtcaga 480
aaatctcctg ggccgacctg tttatcctcg cgggtaacgt ggcgctagaa aactccggct 540
tccgtacctt cggttttggt gccggtcgtg aagacgtctg ggaaccggat ctggatgtta 600
actggggtga tgaaaaagcc tggctgactc accgtcatcc ggaagcgctg gcgaaagcac 660
cgctgggtgc aaccgagatg ggtctgattt acgttaaccc ggaaggcccg gatcacagcg 720
gcgaaccgct ttctgcggca gcagctatcc gcgcgacctt cggcaacatg ggcatgaacg 780
acgaagaaac cgtggcgctg attgcgggtg gtcatacgct gggtaaaacc cacggtgccg 840
gtccgacatc aaatgtaggt cctgatccag aagctgcacc gattgaagaa caaggtttag 900
gttgggcgag cacttacggc agcggcgttg gcgcagatgc cattacctct ggtctggaag 960
tagtctggac ccagacgccg acccagtgga gcaactattt cttcgagaac ctgttcaagt 1020
atgagtgggt acagacccgc agcccggctg gcgcaatcca gttcgaagcg gtagacgcac 1080
cggaaattat cccggatccg tttgatccgt cgaagaaacg taaaccgaca atgctggtga 1140
ccgacctgac gctgcgtttt gatcctgagt tcgagaagat ctctcgtcgt ttcctcaacg 1200
atccgcaggc gttcaacgaa gcctttgccc gtgcctggtt caaactgacg cacagggata 1260
tggggccgaa atctcgctac atcgggccgg aagtgccgaa agaagatctg atctggcaag 1320
atccgctgcc gcagccgatc tacaacccga ccgagcagga cattatcgat ctgaaattcg 1380
cgattgcgga ttctggtctg tctgttagtg agctggtatc ggtggcctgg gcatctgctt 1440
ctaccttccg tggtggcgac aaacgcggtg gtgccaacgg tgcgcgtctg gcattaatgc 1500
cgcagcgcga ctgggatgtg aacgccgcag ccgttcgtgc tctgcctgtt ctggagaaaa 1560
tccagaaaga gtctggtaaa gcctcgctgg cggatatcat agtgctggct ggtgtggttg 1620
gtgttgagaa agccgcaagc gccgcaggtt tgagcattca tgtaccgttt gcgccgggtc 1680
gcgttgatgc gcgtcaggat cagactgaca ttgagatgtt tgagctgctg gagccaattg 1740
ctgacggttt ccgtaactat cgcgctcgtc tggacgtttc caccaccgag tcactgctga 1800
tcgacaaagc acagcaactg acgctgaccg cgccggaaat gactgcgctg gtgggcggca 1860
tgcgtgtact gggtgccaac ttcgatggca gcaaaaacgg cgtcttcact gaccgcgttg 1920
gcgtattgag caatgacttc ttcgtgaact tgctggatat gcgttacgag tggaaagcga 1980
ccgacgaatc gaaagagctg ttcgaaggcc gtgaccgtga aaccggcgaa gtgaaattta 2040
cggccagccg tgcggatctg gtgtttggtt ctaactccgt cctgcgtgcg gtggcggaag 2100
tttacgccag tagcgatgcc cacgagaagt ttgttaaaga cttcgtggcg gcatgggtga 2160
aagtgatgaa cctcgaccgt tttgatctgc tttaatctta agcttgtc 2208
Claims (35)
1.一种从氨基酸的对映异构体混合物酶促生成L-氨基酸的L-氨基酸制造方法，其特征在于包括使转化体或其处理物与氨基酸对映异构体混合物接触的步骤，所述转化体是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列和编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体中，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。
2.根据权利要求1所述的L-氨基酸制造方法，其中所述转化体是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列和编码辅酶再生酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体中，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。
3.根据权利要求1或2所述的L-氨基酸制造方法，其中所述转化体是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列和编码过氧化氢分解酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体中，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的转化体。
4.根据权利要求1～3任一项所述的L-氨基酸制造方法，其中所述转化D-氨基酸为酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶和/或D-氨基酸脱氢酶。
5.根据权利要求4所述的L-氨基酸制造方法，其中，所述D-氨基酸氧化酶是选自博伊丁假丝酵母、变异三角酵母和粟酒裂殖酵母的至少一种微生物来源的D-氨基酸氧化酶。
6.根据权利要求4所述的L-氨基酸制造方法，其中，所述D-氨基酸脱氢酶是大肠杆菌来源的D-氨基酸脱氢酶。
7.根据权利要求1～3任一项所述的L-氨基酸制造方法，其中，转化酮酸为L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶和/或L-氨基酸氨基转移酶。
8.根据权利要求7所述的L-氨基酸制造方法，其中所述L-氨基酸脱氢酶是选自下组的至少一种微生物来源的L-氨基酸脱氢酶：中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶、热链形芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶、球形芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶、希瓦氏菌属菌种来源的丙氨酸脱氢酶、嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶及球形芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶。
9.根据权利要求2所述的L-氨基酸制造方法，其中所述辅酶再生酶是甲酸脱氢酶。
10.根据权利要求9所述的L-氨基酸制造方法，其中所述甲酸脱氢酶是母牛分枝杆菌来源的甲酸脱氢酶。
11.根据权利要求3所述的L-氨基酸制造方法，其特征是所述过氧化氢分解酶是过氧化氢酶。
12.根据权利要求11所述的L-氨基酸制造方法，其特征是所述过氧化氢酶是大肠杆菌来源的过氧化氢酶。
13.根据权利要求2或3所述的L-氨基酸制造方法，其中所述转化D-氨基酸为酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶，转化酮酸为L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶，辅酶再生酶是甲酸脱氢酶，过氧化氢分解酶是过氧化氢酶。
14.根据权利要求13所述的L-氨基酸制造方法，其中所述D-氨基酸氧化酶来源于博伊丁假丝酵母，L-氨基酸脱氢酶是中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌，过氧化氢酶来源于大肠杆菌。
15.根据权利要求1～14任一项所述的L-氨基酸制造方法，其中所述L-氨基酸是L-正缬氨酸。
16.一种转化体，它是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列、编码辅酶再生酶的碱基序列和编码过氧化氢分解酶的碱基序列整合到同一或者不同的表达载体中，再将得到的一种或多种重组载体导入同一宿主而形成的。
17.根据权利要求16所述的转化体，其中所述转化D-氨基酸为酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶，转化酮酸为L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶，辅酶再生酶是甲酸脱氢酶，过氧化氢分解酶是过氧化氢酶。
18.根据权利要求17所述的转化体，其中所述D-氨基酸氧化酶来源于博伊丁假丝酵母，L-氨基酸脱氢酶是中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌，过氧化氢酶来源于大肠杆菌。
19.一种重组载体，它是将编码转化D-氨基酸为酮酸的酶的碱基序列、编码转化酮酸为L-氨基酸的酶的碱基序列、编码辅酶再生酶的碱基序列和编码过氧化氢分解酶的碱基序列整合到同一表达载体而得到的。
20.根据权利要求19所述的重组载体，其中所述转化D-氨基酸为酮酸的酶是D-氨基酸氧化酶，转化酮酸为L-氨基酸的酶是L-氨基酸脱氢酶，辅酶再生酶是甲酸脱氢酶，过氧化氢分解酶是过氧化氢酶。
21.根据权利要求20所述的重组载体，其中所述D-氨基酸氧化酶来源于博伊丁假丝酵母，L-氨基酸脱氢酶是中间型高温放线菌来源的苯丙氨酸脱氢酶，甲酸脱氢酶来源于母牛分枝杆菌，过氧化氢酶来源于大肠杆菌。
22.一种从氨基酸的对映异构体混合物酶促生成L-氨基酸的L-氨基酸制造方法，其特征在于至少具有两个不同的反应步骤即氧化步骤和还原步骤，其中，氧化步骤使用至少共表达转化D-氨基酸为酮酸的酶和过氧化氢分解酶的转化体或其处理物，主要氧化D-氨基酸；还原步骤使用共表达从酮酸生成L-氨基酸的酶以及任选的辅酶再生酶的转化体或其处理物，主要从酮酸合成L-氨基酸。
23.根据权利要求22所述的L-氨基酸制造方法，其中使用权利要求16～18的任一项所述的转化体。
24.根据权利要求22或23所述的L-氨基酸制造方法，其中所述氧化步骤和还原步骤在不同的反应条件下进行。
25.根据权利要求24所述的L-氨基酸制造方法，其中氧化步骤在通入含氧气体的条件下进行，还原步骤在不通入含氧气体或者以低于氧化步骤的通气量通入含氧气体的条件下进行。
26.根据权利要求25所述的L-氨基酸制造方法，其中氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟1体积％以上，还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液少于每分钟10体积％。
27.根据权利要求25所述的L-氨基酸制造方法，其中氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟2体积％以上，还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液为少于每分钟2体积％。
28.根据权利要求25所述的L-氨基酸制造方法，其中氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟5体积％以上，还原步骤中含氧气体的通气量相对于反应液少于每分钟5体积％。
29.根据权利要求25所述的L-氨基酸制造方法，其中氧化步骤中的含氧气体通气量相对于反应液为每分钟1体积％以上，还原步骤中基本上不通入含氧气体。
30.根据权利要求24所述的L-氨基酸制造方法，其中将还原步骤中的反应液pH调至比氧化步骤中的反应液pH低的值。
31.根据权利要求30所述的L-氨基酸制造方法，其中将氧化步骤中的反应液pH调至7.0～9.5，将还原步骤中的反应液pH调至6.0～8.5且低于氧化步骤中的pH的值。
32.根据权利要求30所述的L-氨基酸制造方法，其中将氧化步骤中的反应液pH调至7.5～9.0，将还原步骤中的反应液pH调至6.5～8.0且低于氧化步骤中的pH的值。
33.根据权利要求9、10、13～15和22～32中任一项所述的L-氨基酸制造方法，其中使用甲酸或其盐来调整转化D-氨基酸为酮酸的反应的pH。
34.根据权利要求24所述的L-氨基酸制造方法，其中在从氧化步骤转到还原步骤之前或之后，向反应液中额外添加权利要求16～18任一项所述的转化体或其处理物。
35.根据权利要求1～15和权利要求22～34任一项所述的L-氨基酸制造方法，其中使用含有甲酸根离子和/或铵离子的反应液，所述甲酸根离子和/或铵离子相对于原料氨基酸对映异构体混合物为0.2当量以上。
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