WO2021047565A1 - 一种左旋吡喹酮及其手性中间体的制备方法和组合物 - Google Patents

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carboxylic acid
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performance liquid
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钱明心
汤灵娇
居述云
吴坚平
杨立荣
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苏州同力生物医药有限公司
浙江大学
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Definitions

  • the invention belongs to the technical field of biocatalysis, and specifically relates to a preparation method and composition of L-praziquantel and its chiral intermediates.
  • Praziquantel is a synthetic pyrazine isoquinoline derivative, also known as cyclic praziquantel. It is white or off-white crystalline powder with a bitter taste. It is a globally recognized high-efficiency broad-spectrum antiparasitic drug and is widely used in the treatment of Schistosoma japonicum , Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni, Clonorchiasis, Paragonimiasis, Sparganosis monsii, Ginger worm, Hydatid, Tapeworm and Cysticercus and other diseases. It has the advantages of broad anti-insect spectrum, high curative effect, low toxicity, short course of treatment and convenient use.
  • Praziquantel is a racemic compound composed of L-praziquantel and D-praziquantel.
  • Praziquantel is almost ineffective, tastes bitter, and is the main source of drug side effects. The toxicity of L-body to the heart is lower than that of D-body. Therefore, the development of L-praziquantel instead of praziquantel will have the clinical application value of higher curative effect, fewer side effects and better medication compliance.
  • the synthesis of L-praziquantel mainly includes:
  • Chemical enzyme catalysis technology improve the safety and environmental protection shortcomings of traditional chemical methods, and solve the problems of danger and pollution in the use of racemic praziquantel and its intermediates in the production of L-praziquantel by chemical methods.
  • Its advantage lies in avoiding the use of highly toxic raw materials such as sodium cyanide and heavy metals, avoiding dangerous reactions such as high temperature and high pressure, reducing the amount of organic solvents, and reducing and eliminating the environmental pollution caused by the production of praziquantel and its intermediates;
  • THIQ 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline
  • Many clinical drugs use THIQ as the core skeleton. They have various effective Therapeutic activity.
  • Chiral 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline compounds are one of the very important drug intermediates.
  • the purpose of the present invention is to overcome the shortcomings of the prior art and provide an improved method for preparing the (R) or (S) configuration of 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid, which can The progress of the reaction system is monitored in real time from beginning to end to achieve the detection of the four configurations and contents to ensure the quality control of the chiral purity of the target product.
  • the invention also provides a preparation method of L-praziquantel.
  • the present invention also provides a composition comprising the following components: A: (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate; B: (S)- 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate; C:(R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid; D:(S)- 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid.
  • a method for preparing the (R) or (S) configuration of 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid comprising using 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline Preparation of (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid or (S)-1,2,3,4- The step of tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid;
  • the method also includes detecting (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate, (S)-1,2,3,4- in the reaction system by high performance liquid chromatography Tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate, (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid and (S)-1,2,3,4-tetrahydroisoquine
  • the step of morpholin-1-carboxylic acid content
  • the chromatographic column used for the high-performance liquid chromatography detection is an amphoteric ion exchange chiral column covalently bonded to the surface of silica gel-quinidine (8R, 9S)-(1R, 2R)-cyclohexyl sulfamic acid derivative ,
  • the mobile phase used is a mixture containing methanol, acetonitrile, formic acid and diethylamine.
  • the mobile phase is composed of methanol, acetonitrile, formic acid and diethylamine.
  • the volume ratio of the methanol to the acetonitrile is 1-9:1, more preferably 1-6:1, and still more preferably 1-3: 1;
  • the added amount of formic acid is 48-52mM, and the added amount of diethylamine is 23-27mM.
  • the addition amount of the formic acid is 49-51 mM, and the addition amount of the diethylamine is 24-26 mM.
  • the addition amount of the formic acid is 50 mM, and the addition amount of the diethylamine is 25 mM.
  • the detection conditions of the high performance liquid chromatography are: the flow rate of the mobile phase is 0.3-1 mL/min, the column temperature of the chiral chromatography column is 5-45°C, and the detection wavelength is 210-240nm. Further preferably, the flow rate of the mobile phase is 0.4-0.5 mL/min, the column temperature of the chiral chromatography column is 25-30° C., and the detection wavelength is 210-220 nm.
  • the amphoteric ion-exchange chiral column is manufactured by Daicel ZWIX(-) has an inner diameter of 4mm, a length of 150mm, and a filler particle size of 3 ⁇ m.
  • the high performance liquid chromatograph used in the high performance liquid chromatography detection is Fuli FL2200.
  • the step of high-performance liquid chromatography detection includes:
  • the concentration of the liquid to be detected is 0.001 to 1 g/L.
  • composition prepared by the above method the composition comprising the following components:
  • the content of components A, B and D in the composition is less than 1%, respectively.
  • a preparation method of lev-praziquantel comprising using the above-mentioned preparation of 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid (R ) Configuration method to prepare (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid.
  • the route for preparing L-praziquantel from (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid (compound 1, X is H) is as follows:
  • X is H, and R is the same and represents an amino protecting group.
  • the R group may be tert-butoxycarbonyl (Boc), benzyloxycarbonyl, fluorenylmethoxycarbonyl, allyloxycarbonyl, trichloroethoxycarbonyl, or the like.
  • each step of the reaction included can be achieved by conventional techniques or means in the field of organic synthesis, and there is no particular limitation.
  • compound 4 to compound 5 can be prepared by reacting with phthalimide in the presence of DIAD (diisopropyl azodicarboxylate) and triphenylphosphine in an organic solvent.
  • DIAD diisopropyl azodicarboxylate
  • triphenylphosphine in an organic solvent.
  • compounds from compound 5 to compound 6 can be produced by reacting with hydrazine hydrate.
  • From compound 6 to compound 7 can be produced by the action of cyclohexylformyl chloride.
  • a detection method used in the preparation process of the chiral intermediate of lev-praziquantel including the use of high performance liquid chromatography to detect (R)-1,2, 3,4-Tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate, (S)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylate, (R)-1,2,3, Steps of 4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid and (S)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid content;
  • the chromatographic column used for the high-performance liquid chromatography detection is an amphoteric ion exchange chiral column covalently bonded to the surface of silica gel-quinidine (8R, 9S)-(1R, 2R)-cyclohexyl sulfamic acid derivative ,
  • the mobile phase used is a mixture containing methanol, acetonitrile, formic acid and diethylamine.
  • a pharmaceutical composition for preventing and/or treating parasitic diseases comprising an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier, the active ingredient at least comprising the above-mentioned lev-piraquine Ketone products.
  • the present invention has the following beneficial effects compared with the prior art:
  • the present invention detects and monitors the content of the four configurations in the reaction system by introducing liquid chromatography into the method for preparing two configurations of 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid, and at the same time through specific flow
  • the combination of phase and specific chiral chromatographic column makes the chromatographic peak obtained by liquid chromatography good, and can completely separate the target product and the two enantiomers in the substrate. It has high sensitivity, good reproducibility, simple operation, and easy control. It is suitable for the process optimization and real-time quality monitoring of the key intermediate (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid in the preparation of chiral lev-praziquantel by biocatalysis.
  • optical purity of the intermediate (R)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid in the production process thereby improving the quality and efficacy of the lev-praziquantel prepared therefrom, is obviously unique
  • the practical value and significance can meet the needs of chiral analysis in the large-scale industrialization of products.
  • Figure 1 is the detection spectra of four configurations in the mother liquor of the substrate and the reaction system after the reaction in Example 1;
  • Figure 2 is a standard curve diagram of the substrate prepared in Example 1;
  • Figure 3 is a standard curve diagram of the product prepared in Example 1.
  • Preparation of the substrate mother liquor weigh 0.2g( ⁇ )-1 and fully dissolve it in 10mL 100mM ammonium acetate buffer. Detect the pH change of the solution while dripping the aqueous ammonia solution. When the pH value of the solution reaches 8.0, stop the dripping of ammonia water to obtain the substrate mother liquor with the initial pH value of 8.0. Take 0.5mL of the substrate mother liquor and aliquot to 2mL EP Inside the tube
  • Preparation of the product standard curve Weigh 0.01g of racemic 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic acid (( ⁇ )-1-TIC) and dissolve it in 9.5mL mobile phase. Finally, use a 10mL volumetric flask to make the volume constant to obtain a 1g ⁇ L -1 product acid standard solution. Use a 1mL pipette to dilute step by step, and finally obtain the final concentrations of 1g ⁇ L -1 , 0.5g ⁇ L -1 , 0.25g ⁇ L -1 , 0.125g ⁇ L -1 , 0.0625g ⁇ L -1 , 0.03125g ⁇ L -1 , 0.015625g ⁇ L -1 product acid solution.
  • Example 2 It is basically the same as Example 1, except that the CALB preparation is replaced with Novozyme 435.
  • Example 2 It is basically the same as in Example 1, except that the CALB preparation is replaced with Immo 8285.
  • X is H and R is the amino protecting group Boc.
  • benzyltriethylammonium chloride (TEBAC, 5.5g, 0.024mol) was added and heated to reflux for 2 hours. After the reaction, 380 ml of water was added and extracted with dichloromethane. The combined organic phase was washed twice with water, washed with 5% hydrochloric acid solution, then washed with saturated brine, and dried with anhydrous sodium sulfate.
  • the nuclear magnetic data of the product L-praziquantel are as follows: 1 HNMR (300MHz, DMSO-d6): ⁇ 1.26-1.30 (m, 3H), 1.46-1.63 (m, 3H), 1.72-1.88 (m, 5H), 2.43 -2.56(m,1H),2.77-2.87(m,2H),2.90-3.25(m,2H),3.84-4.10(m,1H),4.35-4.49(m,1H),4.79-4.87(m, 2H), 5.15-5.18 (d, 1H), 7.17-7.19 (d, 2H), 7.24-7.28 (d, 2H).

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Abstract

一种制备和检测1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型及其组合物的方法并用于制备左旋吡喹酮及其关键中间体。其中以1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯的外消旋体为底物制备(R)或(S)酸，并通过高效液相色谱检测反应体系中(R)或(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(R)或(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的含量；由上述方法制备的包括四种构型的组合物、左旋吡喹酮的关键中间体和左旋吡喹酮；上述方法能够从始至终实时监测反应体系进行的程度，以达到四种构型及含量的检测，确保目的产物手性纯度的质量控制，能够满足产品大规模产业化中手性分析的需求。

Description

一种左旋吡喹酮及其手性中间体的制备方法和组合物 技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种左旋吡喹酮及其手性中间体的制备方法和组合物。
背景技术
吡喹酮是人工合成的吡嗪异喹啉衍生物，又名环吡喹酮，白色或类白色结晶粉末，味苦，是世界公认的高效广谱抗寄生虫药物，广泛用于治疗日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫、华支睾吸虫病、肺吸虫病、孟氏裂头蚴、姜片虫、包虫、绦虫和囊虫等疾病。它具有抗虫谱广、疗效高、毒性低、疗程短及使用方便等优点。除用于人体外，它也广泛用于动物、家禽等的抗寄生虫治疗。吡喹酮的问世是寄生虫病化疗史上的一项重大突破，30余年来仍然是市场上治疗多种寄生虫病的首选药物。
吡喹酮是由左旋和右旋吡喹酮共同组成的外消旋化合物，科研人员从合成吡喹酮中拆分获得左旋吡喹酮和右旋吡喹酮光学异构体，并通过临床前和初期临床试验发现：左旋吡喹酮是吡喹酮的有效杀虫成分，而右旋吡喹酮是无效甚至有害成分；相同剂量下，左旋吡喹酮临床疗效比吡喹酮更好，右旋吡喹酮则几乎无疗效，味苦，而且是药物副作用的主要产生来源。对心脏的毒性左旋体比右旋体低，因此开发左旋吡喹酮代替吡喹酮，将具有疗效更高，毒副作用更少，服药依从性更好的临床应用价值。
目前左旋吡喹酮的合成主要有：
1、化学拆分：采用消旋中间体或消旋吡喹酮为原料，通过化学拆分合成左旋吡喹酮，操作繁琐，收率低，剧毒原料及重金属以及高温高压、环境污染严重(Resolution of Praziquantel，Matthew H.Todd1，Australia,PLOS，Neglected Troplcal Diseases,September 2011|Volume 5|Issue 9|e1260；
2、化学酶催化工艺技术：改进传统化学方法安全环保的不足之处，解决化学法生产左旋吡喹酮时采用消旋吡喹酮及其中间体中危险和污染的问题，相对于化学法，其优势在于避免了剧毒原料氰化钠及重金属使用，避免高温高压等危险反应，减少有机溶剂用量，降低消除了吡喹酮及其中间体生产对于环境的污染；
1,2,3,4-四氢异喹啉(THIQ)作为一种特殊的杂环骨架，存在于许多天然的生物碱中，许多临床药物都以THIQ为核心骨架，它们具备各种有效的治疗活性。手性1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物是其中一类非常重要的药物中间体，近年也被广泛应用于多种手性药物的合成，例如(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸是合成广谱型抗寄生虫药物左旋吡喹酮的重要手性中间体(中国专利201310487924.4)，而由(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸为起始化合物合成的右旋吡喹酮无相关治疗作用。对于左旋吡喹酮合成工 艺及有关物质和含量的检测，目前未见公开报道。因而在工艺研发和产业化的过程中，建立相关检测方法，对于左旋吡喹酮合成的过程中引入的手性关键中间体进行纯度检测和质量控制显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种改进的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其能够从始至终实时监测反应体系进行的程度，以达到四种构型以及含量的检测，确保目的产物手性纯度的质量控制。
本发明同时还提供了一种左旋吡喹酮的制备方法。
本发明同时还提供了一种组合物，其包括包含如下组分：A:(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；B:(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；C:(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；D:(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸。
为实现上述目的，本发明采取的一种技术方案如下：
一种制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，所述方法包括以1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯的外消旋体为底物制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤；
所述方法还包括通过高效液相色谱检测反应体系中(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8R,9S)-(1R,2R)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述流动相由甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺构成。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述流动相中，所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-9:1，更优选为1-6:1，进一步优选为1-3:1；所述甲酸的添加量为48-52mM，所述二乙胺的添加量为23-27mM。进一步优选地，所述流动相中，所述甲酸的添加量为49-51mM，所述二乙胺的添加量为24-26mM。根据本发明的一个优选且具体的方面，所述流动相中，所述甲酸的添加量为50mM，所述二乙胺的添加量为25mM。
根据本发明的一些优选方面，所述高效液相色谱检测的条件为：所述流动相的流速为0.3-1mL/min，所述手性色谱柱的柱温为5-45℃，检测波长为210-240nm。进一步优选地，所述流动相的流速为0.4-0.5mL/min，所述手性色谱柱的柱温为25-30℃，检测波长为210-220nm。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述方法包括建立外消旋底物标准曲线以及产物标准曲线的步骤；其中，底物标准曲线为：y＝4×10 9x-42910，R 2＝0.9999， 0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示底物的摩尔浓度；产物标准曲线为：y＝6×10 9x+52538，R 2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示产物的摩尔浓度。
根据本发明的一个优选且具体的方面，所述两性离子交换型手性柱为大赛璐公司的
Figure PCTCN2020114335-appb-000001
ZWIX(-)，内径为4mm，长度为150mm，填料粒径为3μm。
根据本发明的一个具体方面，所述高效液相色谱检测采用的高效液相色谱仪为Fuli FL2200。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述高效液相色谱检测的步骤包括：
配制流动相；
取样，将所取的样品溶液溶解在流动相中制得待检测液，或，将所取的样品溶液溶解在水中，再利用流动相进行稀释制得待检测液；
进行高效液相色谱检测。
根据本发明的一些优选且具体的方面，在采用所述高效液相色谱进行检测的步骤中，所述待检测液的浓度为0.001-1g/L。
本发明提供的又一技术方案：一种组合物，所述组合物由上述方法制备而得，所述组合物包含如下组分：
A:(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
B:(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
C:(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
D:(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
上述组分的化学结构分别为：
Figure PCTCN2020114335-appb-000002
根据本发明的一些优选方面，所述组合物中，组分A、B和D的含量分别小于 1％。
本发明提供的又一技术方案：一种左旋吡喹酮的制备方法，所述制备方法包括采用上述所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)构型的方法来制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤。
根据本发明的一个优选方面，由(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸(化合物1，X为H)制备左旋吡喹酮的路线如下：
Figure PCTCN2020114335-appb-000003
式中，X为H，R相同且表示氨基保护基。
更具体地，R基团可以为叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基、芴甲氧羰酰基、烯丙氧羰基或三氯乙氧羰基等。
上述路线中，所包含的各步反应均可以通过有机合成领域的常规技术或手段来实现，没有特别限制。
例如，从化合物1到化合物3可采用常规的氨基保护方法。从化合物3到化合物4可采用常规的还原方法，例如可采用还原剂BH 3。
例如，从化合物4到化合物5可采用在DIAD(偶氮二甲酸二异丙酯)和三苯基膦存在下、在有机溶剂中与邻苯二甲酰亚胺反应制成。
例如，从化合物5到化合物6可与水合肼作用生成。从化合物6到化合物7可采用环己基甲酰氯作用生成。
例如，从化合物7到化合物8，使化合物7和HCl/EA(1.9L)的溶液在室温下搅拌，并用LC-MS检测，反应结束后，蒸去溶剂，蒸后的残余物溶解到二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗、饱和食盐水洗，浓缩后得到。
例如，从化合物8到左旋吡喹酮，可采用先加入氯乙酰氯，随后加入选自氢氧化钠、氢氧化鉀、叔丁醇钾及有机胺中的一种或多种，搅拌，加入苄基三乙基氯化铵，加热回流反应至反应完成，制成。
本发明提供的又一技术方案：一种用于左旋吡喹酮手性中间体制备过程中的检测方法，所述检测方法包括采用高效液相色谱检测反应体系中(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8R,9S)-(1R,2R)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物。
本发明提供的又一技术方案：一种左旋吡喹酮产品，所述左旋吡喹酮产品通过上述方法制备而成。
本发明提供的又一技术方案：一种用于防治和/或治疗寄生虫病的药物组合物，包括活性成分和药学上可接受的载体，所述活性成分至少包含上述所述的左旋吡喹酮产品。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
本发明通过在制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的方法中引入液相色谱检测并监测反应体系中四种构型的含量，同时通过特定流动相与特定手性色谱柱的配合使得液相色谱所得色谱峰好，能够完全分离目的产物以及底物中的两种对映体，灵敏度高，重现性好，操作简单，易于掌控，进而能够适用于生物催化制备手性左旋吡喹酮关键中间体(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸时的工艺优化和实时质量监控，对于保证左旋吡喹酮中间体(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸生产过程中的光学纯度，从而提高由其所制备的左旋吡喹酮的质量和药效具有明显独特的实用价值和重要意义，能够满足产品大规模产业化中手性分析的需求。
附图说明
图1为实施例1中底物母液以及反应结束后反应体系中四种构型的检测谱图；
图2为实施例1中制备出的底物标准曲线图；
图3为实施例1中制备出的产物标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明；应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
下述中，如无特殊说明，所有的原料基本来自于商购或者通过本领域的常规方法 制备而得；下述中，(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸简称(R)-1-TIC，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸简称(S)-1-TIC，外消旋底物1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯(简称(±)-1)，均购自苏州同力生物医药有限公司，QLlip-9购自苏州同力生物医药有限公司，Novozyme 435购自苏州同力生物医药有限公司，Immo 8285、Immo plus分别购于Purolite公司；下述实施例中使用的甲醇或乙腈均为购自Sigma公司的HPLC级甲醇或乙腈，二乙胺和甲酸购自阿拉丁公司，手性色谱柱
Figure PCTCN2020114335-appb-000004
ZWIX(-)(0.40cmφ×15cm×3μm)购自大赛璐公司，高效液相色谱仪采用Fuli FL2200。
实施例1 (R)-1-TIC的制备
(1)底物母液的制备：称量0.2g(±)-1，充分溶解于10mL 100mM醋酸铵缓冲液。边滴加氨水溶液边检测溶液pH值的变化，当溶液pH值达到8.0时，停止滴加氨水，即获得初始pH值为8.0的底物母液，分别取0.5mL底物母液分装至2mL EP管内；
(2)催化过程：选择CALB制剂：QLlip-9，称量0.01g，加入装有0.5mL底物母液的EP管内，并加入搅拌磁子，将反应EP管做好标记并置于泡沫板中，于3℃低温槽中搅拌反应24h，反应结束后获得反应液。
反应液的处理：(a)反应终止：反应结束后，取出反应EP管，向反应液中加入0.5mL 1M盐酸溶液，混合均匀，作为样品溶液；(b)样品稀释：将包含0.5mL反应液的样品溶液全部转移至25mL容量瓶，用流动相(甲醇：乙腈＝6:4(含50mM甲酸和25mM二乙胺))定容、稀释至1g/L。充分摇匀后取20μL稀释液，经微孔有机滤膜过滤后进样，利用高效液相色谱进行检测(流速为0.4mL·min -1；检测波长为220nm；柱温为30℃，手性色谱柱为
Figure PCTCN2020114335-appb-000005
ZWIX(-)(0.40cmφ×15cm×3μm))。
反应结束后反应体系中四种构型的检测结果参见图1，其中，1.(R)-1((R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯)；2.(R)-1-TIC；3.(S)-1((S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯)；4.(S)-1-TIC，(±)-1的两个构型(R)-1和(S)-1分别在8.3min和13.5min左右出峰，产物酸的两个构型(R)-1-TIC和(S)-1-TIC分别在10.5min和16.5min左右出峰。
反应结果的定量计算：
底物标准曲线的制作：称量0.01g(±)-1，充分溶解于9.5mL流动相(甲醇：乙腈＝6:4(含50mM甲酸和25mM二乙胺))中，最后用10mL容量瓶定容，得到1g·L -1的底物酯标准溶液。利用1mL移液管进行逐级稀释，最终获得终浓度分别为1g·L -1、0.5g·L -1、0.25g·L -1、0.125g·L -1、0.0625g·L -1、0.03125g·L -1、0.015625g·L -1的底物酯溶液。将这7个浓度梯度的底物酯溶液进样，分别获得对应的HPLC谱图。然后以消旋酯的摩尔浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到一条线性相关曲线，即为底物标准曲线。如图2所示，利用外标法得到的底物标准曲线为：y＝4×10 9x-42910，R 2＝0.9999(线性范围为0≤x≤0.005mol·L -1，其中x为(±)-1的摩尔浓度，y为峰面积)；
产物标准曲线的制作：称量0.01g外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸((±)-1-TIC)，充分溶解于9.5mL流动相中，最后用10mL容量瓶定容，得到1g·L -1的产物酸标准溶液。利用1mL移液管进行逐级稀释，最终获得终浓度分别为1g·L -1、0.5g·L -1、0.25g·L -1、0.125g·L -1、0.0625g·L -1、0.03125g·L -1、0.015625g·L -1的产物酸溶液。将这7个浓度梯度的产物酸溶液进样，分别获得对应的HPLC谱图。然后以消旋酸的摩尔浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到一条线性相关曲线，即为产物标准曲线。如图3所示，利用外标法得到的产物标准曲线为：y＝6×10 9x+52538，R 2＝0.9999(线性范围为0≤x≤0.005mol·L -1，其中x为(±)-1-TIC的摩尔浓度，y为峰面积)；
然后根据HPLC谱图所获得的峰面积计算出目的产物中两种构型的浓度，进而获得转化率和e.e. p(enantiomeric excess of product)；其中转化率(conversion，％)＝(1-S 1/S 0)×100％，其中S 0为底物母液(0h)含有的底物量，S 1为反应结束时剩余未被转化的底物量；e.e. p(％)＝[((R)-1-TIC)-((S)-1-TIC)]/[((R)-1-TIC)+((S)-1-TIC)]×100％，其中(R)-1-TIC为反应结束时溶液含有的(R)-酸的量，(S)-1-TIC为反应结束时溶液含有的(S)-酸的量。
实施例2 (R)-1-TIC的制备
基本同实施例1，区别仅在于将CALB制剂替换为Novozyme 435。
实施例3 (R)-1-TIC的制备
基本同实施例1，区别仅在于将CALB制剂替换为Immo 8285。
实施例4 (R)-1-TIC的制备
基本同实施例1，区别仅在于将CALB制剂替换为Immo Plus。
结果：反应结束后测得上述四种固定化酶制剂(CALB制剂)的催化结果如下表1所示。
表1
Figure PCTCN2020114335-appb-000006
实施例5 左旋吡喹酮的制备
制备左旋吡喹酮的合成路线如下：
Figure PCTCN2020114335-appb-000007
式中，X为H，R为氨基保护基Boc。
将溶解在845ml四氢呋喃中的1-(R)-四氢异喹啉甲酸(80g,0.45mol，化合物1，X为H)和溶解在845mL水中的碳酸钠溶液(191.5g,1.8mol)混合后，冷却到0℃，然后将溶解于280mL四氢呋喃的(Boc) 2O(108g,0.5mol)在0℃下逐滴滴加到该溶液中，搅拌过夜。反应结束后，用乙酸乙酯萃取，萃取出的有机层经合并后用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥后，真空蒸干。蒸干后的残余物用PE/EA＝1:1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后得到白色固体即为化合物3(106g,产率85％)。
在N 2保护下，往溶解有化合物3(70.2g,0.25mol)的0℃的975ml四氢呋喃里逐滴加入溶解在四氢呋喃中的BH 3溶液(2.0M,377mL,754mmol)。滴加完毕后，再搅拌3小时，然后滴加NaHCO 3溶液。反应结束后，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用饱和食盐水清洗，无水硫酸钠干燥，然后真空蒸干。蒸干后的残余物用PE/EA＝10:1～5:1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后得到淡黄色油状的产物，即为化合物4(53.3g,产率80％)。
往溶解有化合物4(85g,0.32mol)的1L的二氯甲烷中加入DIAD(131g,0.65mol，偶氮二甲酸二异丙酯)和三苯基膦(170g,0.65mol)，室温搅拌30min后，将该混合物降至0℃。然后分批加入邻苯二甲酰亚胺(52.6g,0.36mol)，升至室温后搅拌过夜。反应结束后，加入1L的水，用乙酸乙酯萃取，合并的有机相经过水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥，然后真空蒸干。蒸干后的残余物用PE/EA＝200:1～20:1的洗脱剂进行 硅胶柱层析，浓缩后得到白色固体，即为化合物5(90.0g,产率71％)。
往溶解有化合物5(61g,0.15mol)的360mL乙醇中滴加60ml的水合肼，回流40min后冷至室温，浓缩后加入360mL的乙酸乙酯，搅拌30min，过滤掉生成的固体，将滤液浓缩得到黄色油状物化合物6(41.4g)直接用于下一步反应。
化合物6(41.4g,0.15mol)溶解于450ml的四氢呋喃中，将2mol/L的NaOH溶液(300mL,600mmol)加入并冷却到0℃。然后逐滴加入溶解在150mL THF中的环己基甲酰氯(27g,0.18mol)，搅拌2小时后加热到室温，搅拌过夜。反应结束后，加入600mL的水，用乙酸乙酯萃取。合并的有机相经水洗、饱和食盐水洗，然后无水硫酸钠干燥、真空干燥。干燥后用PE/EA＝20:1～10:1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后得到白色固体，即为化合物7(40.5g,两步总产率70％)。
化合物7(90g,0.24mol)和HCl/EA(1.9L)的溶液在室温下搅拌2小时，并用LC-MS检测。反应结束后，蒸去溶剂。蒸后的残余物溶解到二氯甲烷中，用饱和碳酸氢钠清洗、饱和食盐水洗，浓缩后得到白色固体化合物8(66.9g)。将这个白色固体化合物8(66.9g,0.24mol)溶解到250mL的二氯甲烷并加入溶解在130mL二氯甲烷的氯乙酰氯(30.3g,0.26mol)，随后加入50％的NaOH溶液(77mL)。搅拌30分钟后，加入苄基三乙基氯化铵(TEBAC,5.5g,0.024mol)并加热回流2小时。反应结束后，加入380ml的水，并用二氯甲烷萃取。合并的有机相用水洗两次、5％的盐酸溶液清洗，然后用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。蒸去溶剂后，残余物用PE/EA＝20:1～5:1的洗脱剂进行硅胶柱层析，浓缩后的产品在乙酸乙酯中进行重结晶得到白色固体(54.3g,三步总产率72％)，即为左旋吡喹酮。纯度99.3％,光学纯度99.7％。
产物左旋吡喹酮的核磁数据如下： 1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ1.26-1.30(m,3H),1.46-1.63(m,3H),1.72-1.88(m,5H),2.43-2.56(m,1H),2.77-2.87(m,2H),2.90-3.25(m,2H),3.84-4.10(m,1H),4.35-4.49(m,1H),4.79-4.87(m,2H),5.15-5.18(d,1H),7.17-7.19(d,2H),7.24-7.28(d,2H)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

  1. 一种制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，所述方法包括以1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯的外消旋体为底物制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤，其特征在于：
    所述方法还包括通过高效液相色谱检测反应体系中(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
    所述高效液相色谱检测的步骤包括：
    配制流动相；取样，将所取的样品溶液溶解在流动相中制得待检测液，或，将所取的样品溶液溶解在水中，再利用流动相进行稀释制得待检测液；所述待检测液的浓度为0.001-1g/L；进行高效液相色谱检测；
    所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8R,9S)-(1R,2R)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物；其中所述流动相中，所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-9∶1，所述甲酸的添加量为48-52mM，所述二乙胺的添加量为23-27mM；
    所述高效液相色谱检测的条件为：所述流动相的流速为0.3-1mL/min，所述手性色谱柱的柱温为5-45℃，检测波长为210-240nm；
    所述方法包括建立底物标准曲线以及产物标准曲线的步骤；其中，底物标准曲线为：y＝4×10 9x-42910，R 2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示底物的摩尔浓度；产物标准曲线为：y＝6×10 9x+52538，R 2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示产物的摩尔浓度。
  2. 一种制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，所述方法包括以1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯的外消旋体为底物制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤，其特征在于：
    所述方法还包括通过高效液相色谱检测反应体系中(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
    所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8R,9S)-(1R,2R)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物。
  3. 根据权利要求2所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述流动相由甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺构成，其中所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-9∶1。
  4. 根据权利要求1或3所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-6:1。
  5. 根据权利要求4所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-3:1。
  6. 根据权利要求1或3所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述甲酸的添加量为48-52mM，所述二乙胺的添加量为23-27mM。
  7. 根据权利要求2所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件为：所述流动相的流速为0.3-1mL/min，所述手性色谱柱的柱温为5-45℃，检测波长为210-240nm。
  8. 根据权利要求1或7所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.4-0.5mL/min，所述手性色谱柱的柱温为25-30℃，检测波长为210-220nm。
  9. 根据权利要求2所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述方法包括建立底物标准曲线以及产物标准曲线的步骤；其中，底物标准曲线为：y＝4×10 9x-42910，R 2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示底物的摩尔浓度；产物标准曲线为：y＝6×10 9x+52538，R 2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示产物的摩尔浓度。
  10. 根据权利要求2所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述两性离子交换型手性柱为大赛璐公司的
    Figure PCTCN2020114335-appb-100001
    内径为4mm，长度为150mm，填料粒径为3μm。
  11. 根据权利要求2所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的步骤包括：
    配制流动相；
    取样，将所取的样品溶液溶解在流动相中制得待检测液，或，将所取的样品溶液溶解在水中，再利用流动相进行稀释制得待检测液；
    进行高效液相色谱检测。
  12. 根据权利要求11所述的制备1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的(R)或(S)构型的方法，其特征在于，在采用所述高效液相色谱进行检测的步骤中，所述待检测液的浓度为0.001-1g/L。
  13. 一种组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求1-12中任一项所述的方法制备而得，所述组合物包含如下组分：
    A:(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
    B:(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯；
    C:(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
    D:(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸。
  14. 根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，组分A、B和D的含量分别小于1％。
  15. 一种用于左旋吡喹酮手性中间体制备过程中的检测方法，所述左旋吡喹酮手性中间体制备过程包括以1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯的外消旋体为底物制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的步骤，其特征在于，所述检测方法包括采用高效液相色谱检测反应体系中(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸酯、(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸和(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量的步骤；
    所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为硅胶表面共价键合-奎宁定(8R,9S)-(1R,2R)-环己基氨基磺酸衍生物的两性离子交换型手性柱，采用的流动相为包含甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺的混合物。
  16. 根据权利要求15所述的用于左旋吡喹酮手性中间体制备过程中的检测方法，其特征在于，所述流动相由甲醇、乙腈、甲酸和二乙胺构成，其中所述甲醇与所述乙腈的体积比为1-9:1，更优选为1-6:1，进一步优选为1-3:1；所述甲酸的添加量为48-52mM，所述二乙胺的添加量为23-27mM。
  17. 根据权利要求15所述的用于左旋吡喹酮手性中间体制备过程中的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件为：所述流动相的流速为0.3-1mL/min，所述手性色谱柱的柱温为5-45℃，检测波长为210-240nm；优选地，所述流动相的流速为0.4-0.5mL/min，所述手性色谱柱的柱温为25-30℃，检测波长为210-220nm。
  18. 根据权利要求15所述的用于左旋吡喹酮手性中间体制备过程中的检测方法，其特征在于，所述方法包括建立底物标准曲线以及产物标准曲线的步骤；其中，底物标准曲线为：y＝4×10 9x-42910，R 2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示底物的摩尔浓度；产物标准曲线为：y＝6×10 9x+52538，R 2＝0.9999，0≤x≤0.005mol·L -1，y表示高效液相色谱检测所获得谱图的峰面积，x表示产物的摩尔浓度；和/或，
    所述两性离子交换型手性柱为大赛璐公司的
    Figure PCTCN2020114335-appb-100002
    内径为4mm，长度为150mm，填料粒径为3μm；和/或，
    所述高效液相色谱检测的步骤包括：
    配制流动相；
    取样，将所取的样品溶液溶解在流动相中制得待检测液，或，将所取的样品溶液溶解在水中，再利用流动相进行稀释制得待检测液；所述待检测液的浓度为0.001-1g/L；
    进行高效液相色谱检测。
  19. 一种左旋吡喹酮的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：采用权利要求1-18中任一项所述的方法来制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
    以及以(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸为原料制备左旋吡喹酮，制备过程如下：
    Figure PCTCN2020114335-appb-100003
    R为氨基保护基。
  20. 一种左旋吡喹酮产品，其特征在于，所述左旋吡喹酮产品通过权利要求19所述的方法制备而得。
  21. 一种用于防治和/或治疗寄生虫病的药物组合物，包括活性成分和药学上可接受的载体，其特征在于：所述活性成分至少包含权利要求20所述的左旋吡喹酮产品。
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