CN112899248B - 氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用 - Google Patents
氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112899248B CN112899248B CN202110077091.9A CN202110077091A CN112899248B CN 112899248 B CN112899248 B CN 112899248B CN 202110077091 A CN202110077091 A CN 202110077091A CN 112899248 B CN112899248 B CN 112899248B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- leu
- ala
- glu
- gly
- glucosamine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
- C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
- C12Y206/01016—Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase (isomerizing) (2.6.1.16), i.e. glucosamine-6-phosphate-synthase
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体及其应用，本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生glmS的第39位和149位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第250位的精氨酸突变为半胱酰胺以及第472位的甘氨酸突变为丝氨酸得到氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体。本发明通过定点突变glmS基因，提高了N‑乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量，其浓度最高可达140g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用。
背景技术
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。
现如今微生物发酵法是国内外生产GlcNAc的主要方法。所使用的基因工程菌主要为大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)。通过在这些菌株中引入氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glmS)和氨基葡萄糖6-磷酸N-乙酰转移酶(gna1)编码基因，以葡萄糖为原料，进行乙酰氨基葡萄糖的微生物合成。
对乙酰氨糖的生物合成研究表明在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glmS)的催化作用下，生成六磷酸氨糖，该步是乙酰氨糖合成途径中的第一个限速反应。而氨基葡萄糖-6磷酸合成酶是一种双底物结合酶，属于氨基转移酶类，催化活力较低，且会受到负反馈抑制，限制了乙酰氨糖产量和原料的转化率。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过对6-磷酸果糖在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(glmS)进行定点突变，得到其突变体，从而提高了此酶的催化活力，提高了大肠杆菌生产乙酰氨基葡萄糖的能力。具有重要的经济价值和社会意义。
本发明的第一个目的是提供一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生glmS的第39位和149位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第250位的精氨酸突变为半胱酰胺以及第472位的甘氨酸突变为丝氨酸。
本发明的第二个目的是提供编码所述氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因。
进一步地，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供一种携带所述的基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述的氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的细胞。
本发明的第五个目的是提供一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，所述的方法是以氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体为催化剂，催化葡萄糖生产乙酰氨基葡萄糖。
进一步地，所述的方法具体是以大肠杆菌为宿主，重组表达编码所述的氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因，得到重组菌；将重组大肠杆菌经种子培养基活化后转入发酵培养基，于35～38℃、pH＝6～8条件下培养，OD600达到18～22时加入IPTG诱导氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的表达，使重组菌以葡萄糖为底物生产乙酰氨基葡萄糖。
进一步地，种子培养基按g/L计含有：胰蛋白脉5～15，酵母粉3～7，NaCl 8～12。
进一步地，发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨10～15，酵母粉20～30，磷酸氢二钾12～13，磷酸二氢钾2～3，甘油2～6，葡萄糖流加。
进一步地，所述的IPTG的浓度为0.2～0.6mM。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明通过定点突变glmS基因，提高了N-乙酰氨基葡萄糖在胞外的积累量，其浓度最高可达140g/L，为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。
具体实施方式
涉及的检测方法：
N-乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260,RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相:5mM H2S04，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。
glmS是基因工程大肠杆菌合成氨糖的代谢途径中第一个限速反应，为了解决目前glmS催化活力弱和受负反馈抑制，限制大肠杆菌乙酰氨糖产量的问题，本发明提供一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生glmS的第39位和149位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第250位的精氨酸突变为半胱酰胺以及第472位的甘氨酸突变为丝氨酸。编码所述野生型glmS的碱基序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。来源于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。突变后碱基序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。
实施例1：
定点突变
利用快速PCR技术，以表达有野生型glmS的基因的质粒pET28a-glmS-gna1(pET28a-glmS-gna1的构建方法参见:陈欣.代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制[D].无锡：江南大学,2012)为模板，进行定点突变。使用第39位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物(SEQ ID NO.5)：5’-atgaccttctgtatcaacaacggc-3’
反向引物(SEQ ID NO.6)：5’-gccgttgttgatacagaaggtcat-3’
PCR反应体系均为：PrimeSTAR Max(购自Takara公司)25μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，加入双蒸水22μL。
PCR反应扩增条件为：98℃预变性5min；随后98℃10s，55℃15s，72℃3min进行30个循环，最后72℃保温5min。
将PCR产物加入Dpn I消化2h后，取6μL消化产物转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中。
大肠杆菌感受态细胞通过Competent Cell Preparation Kit(感受态细胞制备试剂盒，购自Takara公司)制作，制作方法参见试剂盒说明书。
质粒转化大肠杆菌感受态细胞方法如下：超底温冰箱保存的大肠杆菌感受态细胞置于冰上融化；加入6μL消化后的PCR产物轻轻混合，冰浴45min：将装有感受态细胞的离心管置于42℃的水浴中热激90s：将离心管转移至冰浴中使细胞冷却2min；加入800μL LB培养基于37℃培养1h；离心去除少量上请，再悬浮菌休，将培养液涂布在含有相应抗生素的LB平板上，37℃倒置培养10～12h，观察菌落。挑取单菌落于LB液体培养基中培养过夜后提取质粒并进行测序验证。
测序验证正确无误后以此质粒为模板，引入第149位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物(SEQ ID NO.7)：5’-tgcgggatagtacgcagaacg-3’
反向引物(SEQ ID NO.8)：5’-cgttctgcgtactatcccgca-3’
消化、转化后提取质粒测序验证。将验证正确的质粒作为模板，使用第211位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物(SEQ ID NO.9)：5’-aagagggcaatattgcggaaatcac-3’
反向引物(SEQ ID NO.10)：5’-gtgatttccgcaatattgccctctt-3’
消化、转化后提取质粒测序验证。将验证正确的质粒作为模板，使用第250位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物(SEQ ID NO.11)：5’-aggcatttactgtcactacatgcag-3’
反向引物(SEQ ID NO.12)：5’-ctgcatgtagtgacagtaaatgcct-3’
消化、转化后提取质粒测序验证。将验证正确的质粒作为模板，使用第472位氨基酸突变的引物进行PCR扩增。
正向引物(SEQ ID NO.13)：5’-tactgatcgccacggctcag-3’
反向引物(SEQ ID NO.14)：5’-ctgagccgtggcgatcagta-3’
消化、转化后提取质粒测序验证。将验证正确的五个点突变的质粒转化入菌株E.coli BL21(DE3)-ΔmanX-ΔnagE中。
实施例2：
发酵验证
种子培养基(g/L)：胰蛋白脉10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，磷酸氢二钾12.54，磷酸二氢钾2.31，甘油4，葡萄糖5。
灭菌条件：115℃，20min。
挑取转入突变后pET28a-glmS-gna1质粒的目的菌株的单菌落于装有1.5L种子培养基的10L锥形瓶中培养，37℃、220rpm下培养9小时，按照10％接种量将培养好的种子液接入装有15L发酵培养基的30L发酵罐中，37℃、pH＝7下发酵，葡萄糖耗尽后开始流加80％葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度在1g/L以下，维持DO值在30％-40％之间，DO值通过适当调整葡萄糖流加速度进行调节。培养至OD为26.6时加入0.4mmol/L IPTG诱导目的基因表达。诱导后继续培养48小时。最终乙酰氨糖产量达到140g/L，对葡萄糖转化率达到51％。与转化突变前pET28a-glmS-gna1质粒的对照菌株相比，发酵液中乙酰氨基葡萄糖浓度提高了18.6％。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学，山东润德生物科技有限公司
<120> 氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1830
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60
ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatgcagaa 120
ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180
gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240
ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300
atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360
tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420
actctgcgtg aggccgttct gcgtgctatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480
atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540
attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600
acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc gatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660
aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720
tatgacgcgg gcgataaagg catttaccgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780
ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840
gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900
tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960
attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020
aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080
cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140
tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200
gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260
tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320
ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380
gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgggccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440
ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500
ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560
gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620
ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680
cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740
ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800
aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830
<210> 2
<211> 609
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
35 40 45
Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
50 55 60
His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu
65 70 75 80
Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
85 90 95
Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
100 105 110
Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
115 120 125
Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130 135 140
Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val
145 150 155 160
Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
165 170 175
Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
195 200 205
Glu Gly Asp Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210 215 220
Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln
225 230 235 240
Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Arg His Tyr Met Gln Lys Glu
245 250 255
Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
275 280 285
Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290 295 300
Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly
305 310 315 320
Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
325 330 335
Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
340 345 350
Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370 375 380
Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val
385 390 395 400
Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
405 410 415
Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
420 425 430
Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
435 440 445
Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460
Lys His His Ala Leu Phe Leu Gly Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala
465 470 475 480
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
485 490 495
Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
500 505 510
Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
515 520 525
Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530 535 540
Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met
545 550 555 560
His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
565 570 575
Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
580 585 590
Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
595 600 605
Glu
<210> 3
<211> 1830
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atgtgtggaa ttgttggcgc gatcgcgcaa cgtgatgtag cagaaatcct tcttgaaggt 60
ttacgtcgtc tggaataccg cggatatgac tctgccggtc tggccgttgt tgatacagaa 120
ggtcatatga cccgcctgcg tcgcctcggt aaagtccaga tgctggcaca ggcagcggaa 180
gaacatcctc tgcatggcgg cactggtatt gctcacactc gctgggcgac ccacggtgaa 240
ccttcagaag tgaatgcgca tccgcatgtt tctgaacaca ttgtggtggt gcataacggc 300
atcatcgaaa accatgaacc gctgcgtgaa gagctaaaag cgcgtggcta taccttcgtt 360
tctgaaaccg acaccgaagt gattgcccat ctggtgaact gggagctgaa acaaggcggg 420
actctgcgtg aggccgttct gcgtactatc ccgcagctgc gtggtgcgta cggtacagtg 480
atcatggact cccgtcaccc ggataccctg ctggcggcac gttctggtag tccgctggtg 540
attggcctgg ggatgggcga aaactttatc gcttctgacc agctggcgct gttgccggtg 600
acccgtcgct ttatcttcct tgaagagggc aatattgcgg aaatcactcg ccgttcggta 660
aacatcttcg ataaaactgg cgcggaagta aaacgtcagg atatcgaatc caatctgcaa 720
tatgacgcgg gcgataaagg catttactgt cactacatgc agaaagagat ctacgaacag 780
ccgaacgcga tcaaaaacac ccttaccgga cgcatcagcc acggtcaggt tgatttaagc 840
gagctgggac cgaacgccga cgaactgctg tcgaaggttg agcatattca gatcctcgcc 900
tgtggtactt cttataactc cggtatggtt tcccgctact ggtttgaatc gctagcaggt 960
attccgtgcg acgtcgaaat cgcctctgaa ttccgctatc gcaaatctgc cgtgcgtcgt 1020
aacagcctga tgatcacctt gtcacagtct ggcgaaaccg cggataccct ggctggcctg 1080
cgtctgtcga aagagctggg ttaccttggt tcactggcaa tctgtaacgt tccgggttct 1140
tctctggtgc gcgaatccga tctggcgcta atgaccaacg cgggtacaga aatcggcgtg 1200
gcatccacta aagcattcac cactcagtta actgtgctgt tgatgctggt ggcgaagctg 1260
tctcgcctga aaggtctgga tgcctccatt gaacatgaca tcgtgcatgg tctgcaggcg 1320
ctgccgagcc gtattgagca gatgctgtct caggacaaac gcattgaagc gctggcagaa 1380
gatttctctg acaaacatca cgcgctgttc ctgagccgtg gcgatcagta cccaatcgcg 1440
ctggaaggcg cattgaagtt gaaagagatc tcttacattc acgctgaagc ctacgctgct 1500
ggcgaactga aacacggtcc gctggcgcta attgatgccg atatgccggt tattgttgtt 1560
gcaccgaaca acgaattgct ggaaaaactg aaatccaaca ttgaagaagt tcgcgcgcgt 1620
ggcggtcagt tgtatgtctt cgccgatcag gatgcgggtt ttgtaagtag cgataacatg 1680
cacatcatcg agatgccgca tgtggaagag gtgattgcac cgatcttcta caccgttccg 1740
ctgcagctgc tggcttacca tgtcgcgctg atcaaaggca ccgacgttga ccagccgcgt 1800
aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 1830
<210> 4
<211> 609
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala
20 25 30
Gly Leu Ala Val Val Asp Thr Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg
35 40 45
Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu
50 55 60
His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu
65 70 75 80
Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val
85 90 95
Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu
100 105 110
Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile
115 120 125
Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu
130 135 140
Ala Val Leu Arg Thr Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val
145 150 155 160
Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly
165 170 175
Ser Pro Leu Val Ile Gly Leu Gly Met Gly Glu Asn Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Asp Gln Leu Ala Leu Leu Pro Val Thr Arg Arg Phe Ile Phe Leu Glu
195 200 205
Glu Gly Asn Ile Ala Glu Ile Thr Arg Arg Ser Val Asn Ile Phe Asp
210 215 220
Lys Thr Gly Ala Glu Val Lys Arg Gln Asp Ile Glu Ser Asn Leu Gln
225 230 235 240
Tyr Asp Ala Gly Asp Lys Gly Ile Tyr Cys His Tyr Met Gln Lys Glu
245 250 255
Ile Tyr Glu Gln Pro Asn Ala Ile Lys Asn Thr Leu Thr Gly Arg Ile
260 265 270
Ser His Gly Gln Val Asp Leu Ser Glu Leu Gly Pro Asn Ala Asp Glu
275 280 285
Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser
290 295 300
Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly
305 310 315 320
Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser
325 330 335
Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu
340 345 350
Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
355 360 365
Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg
370 375 380
Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val
385 390 395 400
Ala Ser Thr Lys Ala Phe Thr Thr Gln Leu Thr Val Leu Leu Met Leu
405 410 415
Val Ala Lys Leu Ser Arg Leu Lys Gly Leu Asp Ala Ser Ile Glu His
420 425 430
Asp Ile Val His Gly Leu Gln Ala Leu Pro Ser Arg Ile Glu Gln Met
435 440 445
Leu Ser Gln Asp Lys Arg Ile Glu Ala Leu Ala Glu Asp Phe Ser Asp
450 455 460
Lys His His Ala Leu Phe Leu Ser Arg Gly Asp Gln Tyr Pro Ile Ala
465 470 475 480
Leu Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile His Ala Glu
485 490 495
Ala Tyr Ala Ala Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala Leu Ile Asp
500 505 510
Ala Asp Met Pro Val Ile Val Val Ala Pro Asn Asn Glu Leu Leu Glu
515 520 525
Lys Leu Lys Ser Asn Ile Glu Glu Val Arg Ala Arg Gly Gly Gln Leu
530 535 540
Tyr Val Phe Ala Asp Gln Asp Ala Gly Phe Val Ser Ser Asp Asn Met
545 550 555 560
His Ile Ile Glu Met Pro His Val Glu Glu Val Ile Ala Pro Ile Phe
565 570 575
Tyr Thr Val Pro Leu Gln Leu Leu Ala Tyr His Val Ala Leu Ile Lys
580 585 590
Gly Thr Asp Val Asp Gln Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val
595 600 605
Glu
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
gccgttgttg atacagaagg tcat 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
atgaccttct gtatcaacaa cggc 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
cgttctgcgt actatcccgc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
tgcgggatag tacgcagaac g 21
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
aagagggcaa tattgcggaa atcac 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
gtgatttccg caatattgcc ctctt 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
aggcatttac tgtcactaca tgcag 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
ctgcatgtag tgacagtaaa tgcct 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
ctgagccgtg gcgatcagta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
tactgatcgc cacggctcag 20
Claims (10)
1.一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶（glmS）突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQID NO.2所示的野生glmS的第39位和149位的丙氨酸突变为苏氨酸，第211位的天冬氨酸突变为天冬酰胺，第250位的精氨酸突变为半胱氨酸以及第472位的甘氨酸突变为丝氨酸。
2.一种编码权利要求1所述的氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种携带权利要求2所述的基因的表达载体。
5.一种表达权利要求1所述的氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的细胞。
6.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求1所述的氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体为催化剂，催化葡萄糖生产乙酰氨基葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法具体是以大肠杆菌为宿主，重组表达编码所述的氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的基因，得到重组菌；将重组大肠杆菌经种子培养基活化后转入发酵培养基，于35~38℃、pH=6~8条件下培养，OD600达到18~22时加入IPTG诱导氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体的表达，使重组菌以葡萄糖为底物生产乙酰氨基葡萄糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，种子培养基按g/L计含有：胰蛋白胨5~15，酵母粉3~7，NaCl 8~12。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵培养基按g/L计含有：胰蛋白胨10~15，酵母粉20~30，磷酸氢二钾12~13，磷酸二氢钾2~3，甘油2~6，葡萄糖流加。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的IPTG的浓度为0.2~0.6 mM。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110077091.9A CN112899248B (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110077091.9A CN112899248B (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112899248A CN112899248A (zh) | 2021-06-04 |
| CN112899248B true CN112899248B (zh) | 2022-10-18 |
Family
ID=76117713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110077091.9A Active CN112899248B (zh) | 2021-01-20 | 2021-01-20 | 氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112899248B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609525A (zh) * | 2019-01-10 | 2019-04-12 | 江苏大学 | 灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434585A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体 |
| CN106929499A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-07-07 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | 一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用 |
-
2021
- 2021-01-20 CN CN202110077091.9A patent/CN112899248B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434585A (zh) * | 2016-09-29 | 2017-02-22 | 江南大学 | 一种氨基葡萄糖‑6磷酸合成酶突变体 |
| CN110157693A (zh) * | 2016-09-29 | 2019-08-23 | 江南大学 | 一种氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体 |
| CN106929499A (zh) * | 2017-04-26 | 2017-07-07 | 扬州日兴生物科技股份有限公司 | 一种定向改造的氨基葡萄糖合酶突变体及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112899248A (zh) | 2021-06-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112322565B (zh) | 提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法 | |
| CN108424868B (zh) | 一种利用天然双碳源高产n-乙酰神经氨酸的重组菌 | |
| CN114480240A (zh) | 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 | |
| CN112522223B (zh) | 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用 | |
| CN114874964A (zh) | 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
| CN115074376B (zh) | 一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成d-阿洛酮糖的方法 | |
| CN112899248B (zh) | 氨基葡萄糖-6磷酸合成酶突变体及其应用 | |
| CN113073074B (zh) | 一种高效合成核黄素的基因工程菌及其应用 | |
| CN111154748B (zh) | 一种提高l-异亮氨酸合成纯度的乙酰羟酸合酶突变体 | |
| CN112746067B (zh) | 用于制备d-鸟氨酸的赖氨酸脱羧酶突变体 | |
| CN107828754B (zh) | 一种酶活提高的γ-谷氨酰转肽酶突变体及其构建方法 | |
| WO2022016641A1 (zh) | 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的菌株及其构建方法和应用 | |
| CN111411066B (zh) | 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法 | |
| CN114806995B (zh) | 一种基于乙酰辅酶a代谢改造后高效合成四氢嘧啶的基因工程菌的构建和应用 | |
| CN110872593A (zh) | 一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其应用 | |
| CN116355820A (zh) | 一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法 | |
| CN112458073B (zh) | 一种h-蛋白突变体及其应用 | |
| CN114107143A (zh) | 一种生产5’-胞苷酸的方法 | |
| CN113684163A (zh) | 一种提高乳酰-n-四糖产量的基因工程菌及其生产方法 | |
| CN108103046B (zh) | 一种麦芽寡糖基海藻糖水解酶突变体及其应用 | |
| CN111019875A (zh) | 一种转录因子SugR编码基因及其在N-乙酰氨基葡萄糖生产中的应用 | |
| CN114317476B (zh) | 葡萄糖基甘油的生物催化生产工艺及其蔗糖磷酸化酶 | |
| CN114250207B (zh) | 一种高活性的蔗糖磷酸化酶及应用 | |
| CN114395542B (zh) | 一种蔗糖磷酸化酶及其应用 | |
| CN114231509B (zh) | 一种蔗糖磷酸化酶及葡萄糖基甘油生产工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |