CN117004544B - 一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌及其应用，属于基因重组与代谢工程技术领域。本发明公开的一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌，为经过底盘微生物改造，且包括香兰素合成模块和甲基循环再生模块的重组谷氨酸棒状杆菌。本发明构建的基因工程菌安全无毒性，能够利用葡萄糖从头生产天然香兰素，生产成本低，产量高，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组与代谢工程技术领域，更具体的说是涉及一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌及其应用。
背景技术
香兰素（Vanillin）是一种带有羟基、醛基和氧甲基三类取代基团的芳香族化合物，其CAS号为121-33-5，分子式为C8H8O3，分子量为152.15。香兰素外观通常为白色或浅黄色晶体，熔点81-83 ℃，沸点284-285 ℃，难溶于水，可溶于甲醇等有机溶剂。香兰素作为一种重要的芳香化合物，具有广泛的用途。它不仅能够在生活中用作多种食物的食品添加剂，还能够应用于香水等化妆品以及肥皂牙膏等日用品中起到定香和增香的作用。此外，香兰素在工业上还被应用于生产塑料、橡胶杀菌剂、电镀剂以及导电剂等产品。近年来，香兰素已经被广泛应用于医药领域，用于生产各种不同的医药中间体，香兰素或将会成为医药领域最有应用价值的一种芳香族化合物。
我国作为香兰素的生产大国和香兰素的使用大国，香兰素的年需求量高达2350吨且需求量仍在逐年攀升。我国生产的香兰素除了供国内使用外，还会出口到欧美以及东南亚等地区，在全球享有良好的声誉。基于以上情况，使用生物法发酵生产香兰素是一种很有前景的生产方法，可以更有效地从廉价的糖中获得这种化合物。已有多篇文献报道了利用微生物发酵合成香兰素，但均存在产量较低的缺陷。其中，生物法从头合成香兰素最早报道的是在粟酒裂殖酵母和酿酒酵母中以原儿茶酸为中间体从头合成的香兰素，但香兰素产量仅有65和45 mg/L（Hansen EH, et al. De novo biosynthesis of vanillin in fissionyeast (Schizosaccharomyces pombe) and baker's yeast (Saccharomycescerevisiae).[J].Applied & Environmental Microbiology, 2009, 75(9):2765-74.）。后来Ni等人报道了在大肠杆菌中以阿魏酸为中间体以葡萄糖为底物，从头合成了19.3 mg/L的香兰素，香兰素从头合成的产量仍旧很低（Ni J, et al. Mimicking a naturalpathway for de novo biosynthesis: natural vanillin production from accessiblecarbon sources[J].Rep, 2015, 5(1):13670.）。随后Chen等人报道了在大肠杆菌中以葡萄糖为底物从头合成了240.69 mg/L的香草醇（Chen Z, et al. Establishing anArtificial Pathway for De Novo Biosynthesis of Vanillyl Alcohol inEscherichia coli[J].Acs Synthetic Biology, 2017:acssynbio.7b00129.）。接着Yang等人通过大肠杆菌混菌的方式以葡萄糖为底物在摇瓶中从头合成了559.4 mg/L的香草醇（Yang M , Meng H , Li X ,et al.Coculture engineering for efficient productionof vanillyl alcohol in Escherichia coli[J].aBIOTECH, 2022, 3(4):9.），但香草醇是香兰素的醛基还原产物，产品特性与香兰素存在很大差距。近年来Kim等人报道了在谷氨酸棒状杆菌中从葡萄糖经过中间体对羟基苯甲酸从头合成了310 mg/L的香兰素，香兰素从头合成的产量已有很大提升，（Kim H S, et al. Engineered Corynebacteriumglutamicum as the Platform for the Production of Aromatic Aldehydes[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2022, 10: 880277.），但这距离工业化放大生产仍旧还有一定差距。
因此，提供一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌及其应用，针对目前生物法从头合成香兰素存在的问题，研发了一种生物法高效从头合成香兰素的途径，并构建一株能够利用葡萄糖等廉价底物来生产天然香兰素的无毒性食品安全工程菌株。
本发明的目的之一是提供一种合成香兰素的基因工程菌，该菌株安全无毒性，能够利用微生物发酵法生产香兰素，生产成本较低。
具体地，一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造，且包括香兰素合成模块和甲基循环再生模块的重组谷氨酸棒状杆菌；
所述底盘微生物改造为以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，敲除pcaHG（原儿茶酸3,4-双加氧酶亚基，protocatechuate 3,4-dioxygenase subunit beta (pcaH)，protocatechuate 3,4-dioxygenase subunit alpha (pcaG)）、van（香草去甲基化酶，vanillate demethylase）、vdh（香草醛脱氢酶，Vanillin dehydrogenase）和fud（醇脱氢酶(NADP+)， alcohol dehydrogenase (NADP+)， Zn-dependent alcohol dehydrogenases）基因。
所述香兰素合成模块表达转酮酶（Transketolase1）基因、3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶（3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase）基因、O-甲基转移酶（O-methyltransferase）基因、羧酸还原酶（Carboxylic acid reductase）基因和磷酸泛酰氨基转移酶（4’-phosphopantetheinyl transferase）基因。
转酮酶可以有效地增强HMP途径中E4P的合成，提高DAHP的产量。3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶帮助PEP和E4P合成DAHP。O-甲基转移酶催化原儿茶酸生成香草酸。羧酸还原酶催化香草酸还原为香兰素。由于谷氨酸棒状杆菌表达的羧酸还原酶是一种脱辅基酶，在磷酸泛酰氨基转移酶的翻译磷酸化修饰下成为全酶。
所述甲基循环再生模块表达5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶（5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase）基因、S-腺苷蛋氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthase）基因、高丝氨酸-O-乙酰转移酶（homoserine O-acetyltransferase）基因和腺苷高半胱氨酸酶（Adenosylhomocysteinase）基因。
高丝氨酸O-酰基转移酶将乙酰-辅酶A（coenzyme A，CoA）或琥珀酰-CoA的酰基转移到高丝氨酸的羟基氧上，使高丝氨酸酰基化，形成O-乙酰-l-高丝氨酸，为下一步硫化做准备。菌株自身将O-乙酰-l-高丝氨酸转化为L-高半胱氨酸。5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶，帮助催化甲基从5-甲基四氢叶酸转移到L-高半胱氨酸，导致蛋氨酸形成；催化5-甲基四氢蝶酰三-L-谷氨酸和L-高半胱氨酸反应，生成L-蛋氨酸和四氢蝶酰三-L-谷氨酸。S-腺苷蛋氨酸合成酶催化ATP和水与L-蛋氨酸反应，生成二磷酸盐、磷酸盐和S-腺苷-L-蛋氨酸。腺苷高半胱氨酸酶，催化水和S-腺苷-L-高半胱氨酸反应，生成腺苷和L-高半胱氨酸。
进一步，所述转酮酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌转酮酶基因tktA，以及任选的外源性转酮酶基因。
所述3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroG，以及任选的外源性3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因。
所述O-甲基转移酶基因包括拟南芥（Arabidopsis thaliana，Mouseear cress）来源的O-甲基转移酶基因comt、咖啡（Coffea canephora，Robusta coffee）来源的O-甲基转移酶基因comt、人源（Homo sapiens，Human）的O-甲基转移酶基因comt、大鼠（Rattusnorvegicus，Rat）来源的O-甲基转移酶基因comt、小鼠（Mus musculus，Mouse）来源的O-甲基转移酶基因comt，以及任选的O-甲基转移酶基因comt。
所述羧酸还原酶基因包括诺卡氏菌（Nocardia iowensis）来源的羧酸还原酶基因car、海洋分支杆菌（Mycobacterium marinum）来源的羧酸还原酶基因car。
所述磷酸泛酰氨基转移酶基因包括诺卡氏菌（Nocardia iowensis）来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp、海洋分支杆菌（Mycobacterium marinum）来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp。
所述5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因metE，以及任选的外源性5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因。
所述S-腺苷蛋氨酸合成酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌S-腺苷蛋氨酸合成酶基因metK，以及任选的外源性S-腺苷蛋氨酸合成酶基因。
高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因metX，以及任选的外源性高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因。
所述腺苷高半胱氨酸酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌腺苷高半胱氨酸酶基因ahcY，以及任选的外源性腺苷高半胱氨酸酶基因。
所述内源性谷氨酸棒状杆菌转酮酶基因tktA的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示。
所述内源性谷氨酸棒状杆菌3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因aroG的核苷酸序列如SEQ ID NO.84所示。
所述拟南芥来源的O-甲基转移酶基因comt的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示；所述咖啡来源的O-甲基转移酶基因comt的核苷酸序列如SEQ ID NO.122所示；所述人源的O-甲基转移酶基因comt的核苷酸序列如SEQ ID NO.105所示；所述大鼠来源的O-甲基转移酶基因comt的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；所述小鼠来源的O-甲基转移酶基因comt的核苷酸序列如SEQ ID NO.137所示。
所述诺卡氏菌来源的羧酸还原酶基因car的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述海洋分支杆菌来源的羧酸还原酶基因car的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示。
所述诺卡氏菌来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；所述海洋分支杆菌来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp的核苷酸序列如SEQ IDNO.48所示；所述枯草芽孢杆菌来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因sfp的核苷酸序列如SEQ IDNO.106所示。
所述内源性谷氨酸棒状杆菌5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因metE的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示。
所述内源性谷氨酸棒状杆菌S-腺苷蛋氨酸合成酶基因metK的核苷酸序列如SEQID NO.50所示。
所述内源性谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因metX的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示。
所述内源性谷氨酸棒状杆菌腺苷高半胱氨酸酶基因ahcY的核苷酸序列如SEQ IDNO.52所示。
进一步，所述外源性转酮酶基因来源于大肠杆菌K12（tktA，Gene ID: 947420）、酿酒酵母S288C（tkl1，Gene ID: 856188）或枯草芽孢杆菌168（tktA，Gene ID: 937377）。
所述外源性3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因来源于大肠杆菌K12（核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示）、酿酒酵母S288C（aro4，Gene ID: 852551）或枯草芽孢杆菌168（aroX，Gene ID: 937853）。
所述外源性5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因来源于大肠杆菌K12（metE，Gene ID: 948323）、酿酒酵母S288C（met6，Gene ID: 856825）或枯草芽孢杆菌168（metE，Gene ID: 936480）。
所述外源性S-腺苷蛋氨酸合成酶基因来源于大肠杆菌K12（metK，Gene ID:948323）、酿酒酵母S288C（SAM2，Gene ID: 852113）或枯草芽孢杆菌168（metK，Gene ID:937090）。
所述外源性高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因来源于酿酒酵母S288C（met2，Gene ID:855444）或枯草芽孢杆菌168（metAA，Gene ID: 939083）。
优选地，所述外源性转酮酶基因来源于大肠杆菌K12。
所述外源性3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因来源于大肠杆菌K12。
所述O-甲基转移酶基因来源于大鼠。
所述羧酸还原酶基因来源于诺卡氏菌。
所述磷酸泛酰氨基转移酶基因来源于海洋分支杆菌。
所述5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌。
所述S-腺苷蛋氨酸合成酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌。
所述高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌。
所述腺苷高半胱氨酸酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌。
进一步，一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，敲除pcaHG、van、vdh和fud基因，获得改造的谷氨酸棒状杆菌；
（2）在改造的谷氨酸棒状杆菌中表达所述的香兰素合成模块和甲基循环再生模块。
本发明的目的之二是提供上述合成香兰素的基因工程菌在合成香兰素中的应用。
具体地，所述的基因工程菌或所述的方法在生产香兰素中的应用。
具体地，所述的基因工程菌或所述的方法在提高香兰素产量中的应用。
具体地，一种生产香兰素的方法，利用所述的基因工程菌或所述方法构建的基因工程菌进行发酵。
为此，本发明提供了一种生物法合成香兰素的途径（图1），其包括：
（1）葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、在微生物自身磷酸戊糖途径的作用下生成4-磷酸-赤藓糖（E4P）；
（2）转酮酶tktA催化二碳酮基从7-磷酸糖庚糖到3-磷酸甘油醛的可逆转移，生成5-磷酸木醛糖和5-磷酸核糖；
（3）磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸-赤藓糖（E4P）在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶aroG的催化作用下生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）；
（4）谷氨酸棒状杆菌自身莽草酸途径生成原儿茶酸(PCA)；
（5）原儿茶酸(PCA)在O-甲基转移酶comt的催化下生成香草酸；
（6）香草酸在羧酸还原酶car的催化作用下生成香兰素；
（7）羧酸还原酶car在磷酸泛酰氨基转移酶sfp的催化磷酸化的翻译后修饰转化为全酶；
以上是香兰素合成模块。
（8）菌株内源自身生成高丝氨酸；
（9）高丝氨酸-O-乙酰转移酶metX将一个乙酰基从乙酰辅酶a转移到l-高丝氨酸上，形成O-乙酰-l-高丝氨酸；
（10）菌株自身将O-乙酰-l-高丝氨酸转化为L-高半胱氨酸；
（11）5-甲基四氢三谷氨酸--高半胱氨酸甲基转移酶metE催化一个甲基从5-甲基四氢叶酸转移到高半胱氨酸，产生蛋氨酸；
（12）L-蛋氨酸在S-腺苷-蛋氨酸合成酶metK的催化作用下生成S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）；
（13）S-腺苷-L-蛋氨酸在O-甲基转移酶comt催化下为原儿茶酸提供一个甲基，生成S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）和香草酸；
（14）S-腺苷-L-高半胱氨酸在腺苷高半胱氨酸酶ahcY的催化下生成腺苷和L-高半胱氨酸；
以上为甲基循环再生模块。
底盘微生物改造：以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，敲除pcaHG、van、vdh和fud基因，具体途径如下：
pcaHG为原儿茶酸3,4-双加氧酶亚基；谷氨酸棒状杆菌具有β-酮己二酸途径，利用几种芳香化合物如PCA作为唯一的碳和能量来源；原儿茶酸降解由原儿茶酸3,4 -双加氧酶(PcaGH)启动，该酶由位于pcaHGBC操纵子中的pcaG和pcaH编码的两个亚基组成；敲除pcaHG可以阻止原儿茶酸β‐酮己二酸途径的消耗。
Van为香草去甲基化酶，包含香草去甲基化酶亚基ABK；可催化香草酸向原儿茶酸的转化；敲除van可阻止香草酸到原儿茶酸的脱甲基化，推动原儿茶酸的利用。
vdh催化氧化香兰素生成香草酸；对3,4-二羟基苯甲醛（原儿茶醛）和4-羟基苯甲醛也有明显的氧化作用；同时具有NAD+和NADP+活性。由于香兰素对细胞的毒性，vdh催化香兰素转化为香草酸；敲除vdh可以减少香兰素的氧化，提高香兰素的累积。
Fud为醇脱氢酶利用NADPH(而不是NADH)作为辅助因子将香兰素转化为香草醇，敲除fud可显著减少香兰素还原为香草醇的过程。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌及其应用，对谷氨酸棒状杆菌从三个方面进行改造，包括香兰素合成路径的构建及强化（涉及tktA、aroG、comt、car）、甲基再生系统的强化（涉及metE、metK、metX、ahcY）、香兰素分解代谢途径及副产物代谢途径的敲除（涉及pcaHG、van、vdh和fud）；最后构建一株高效合成香兰素的重组谷氨酸棒状杆菌。
本发明选用的宿主谷氨酸棒状杆菌是食品级微生物，对人和动物均无致病性，且在同等培养条件下具有更好的生长优势，可比其他菌株积累更高浓度的香兰素。多次重复实验表明，本发明所构建的重组谷氨酸棒状杆菌摇瓶发酵生产得到的香兰素最高浓度可达765.85 mg/L，是目前已报道的相关研究中生物法从头合成香兰素的最高产量，这对生物法高产香兰素具有很大的工业化应用前景。
本发明构建的基因工程菌安全无毒性，能够利用微生物发酵法以葡萄糖为底物生产香兰素，且培养基成分简单，批次稳定，生产成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明生物法合成香兰素的途径。
图2附图为本发明实施例1构建的基因工程菌以葡萄糖为底物摇瓶发酵合成香兰素在不同时间下的产量和生物量OD600。
图3附图为本发明实施例2构建的基因工程菌以葡萄糖为底物摇瓶发酵合成香兰素在不同时间下的产量和生物量OD600。
图4附图为本发明实施例3构建的基因工程菌以葡萄糖为底物摇瓶发酵合成香兰素在不同时间下的产量和生物量OD600。
图5附图为本发明实施例4构建的基因工程菌以葡萄糖为底物摇瓶发酵合成香兰素在不同时间下的产量和生物量OD600。
图6附图为本发明实施例5构建的基因工程菌以葡萄糖为底物摇瓶发酵合成香兰素在不同时间下的产量和生物量OD600。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
LBHIS液体培养基：蛋白胨5.0 g/L，酵母粉2.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，脑心浸提液（BHI）18.5 g/L，山梨醇91.0 g/L。对应的LBHIS固体培养基添加1.8%-2%琼脂。LBHIS培养基主要用于谷氨酸棒状杆菌在试管中和固体平板上培养。
EPO培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，甘氨酸30.0 g/L，Tween80 10.0 g/L。EPO培养基主要用于谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的制备。
30%蔗糖培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，蔗糖（sucrose）300.0 g/L。
20%蔗糖固体培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，蔗糖（sucrose）200.0 g/L，琼脂15.0 g/L。LB-suc培养基（30%蔗糖培养基、20%蔗糖固体培养基）主要用于谷氨酸棒状杆菌基因敲除实验中的同源重组筛选。
LBG培养基：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L。LBG培养基主要作为谷氨酸棒状杆菌发酵时用的种子培养基。
发酵培养基：葡萄糖65.0 g/L，尿素5.0 g/L，玉米浸粉8.0 g/L，生物素4×10-4 g/L，VB1生物素4×10-4 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，CaCl2•2H2O 29.4 mg/L，MgSO4•7H2O 1.2325 g/L，微量元素溶液0.2%。（微量元素溶液配制方法：称取1g FeSO4·7H2O，1gMnSO4·H2O，0.1g ZnSO4·7H2O，0.2g CuSO4，0.002g NiCl2·6H2O，加水定容成100 mL，再加入100 µl浓盐酸调节pH，然后过膜虑菌，在发酵培养基体系中加0.2%）。发酵培养基主要作为谷氨酸棒状杆菌的摇瓶发酵。
实施例1
一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
（1）以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，使用引物pcaHG-L-up/pcaHG-L-down扩增pcaHG-L（如SEQ ID NO.1所示），使用引物pcaHG-R-up/pcaHG-R-down扩增pcaHG-R（如SEQ ID NO.2所示），获得全部删除pcaHG的上游和下游同源臂。引物序列为：
pcaHG-L-up：5’-ATGATTACGCCATCGCATTGCCGAAAAGC-3’；SEQ ID NO.3；
pcaHG-L-down：5’-GGTCAATGCGAGACCTTTCTGCGTC-3’；SEQ ID NO.4；
pcaHG-R-up：5’-AAAGGTCTCGCATTGACCCGATCTTTATACTCCGAC-3’；SEQ ID NO.5；
pcaHG-R-down：5’-CTCAACGTTGACGGTGATGCCA-3’；SEQ ID NO.6。
基因扩增体系：Primestar（Takara）25 µL，上下游引物各2 µL，模板 1 µL，ddH2O20 µL。
基因扩增程序：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，55℃退火30秒，72延伸10 s/kb，35个循环；72℃延伸10分钟。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到基因片段pcaHG-L和pcaHG-R。
质粒载体pk18mobsacb用引物pk-pcaHG-F和pk-pcaHG-R线性化得到pk-pcaHG载体，引物序列如下：
pk-pcaHG-F：5’-ATCACCGTCAACGTTGAGCTCGGTAGATCCTCTAGAGT-3’；SEQ ID NO.7；
pk-pcaHG-R：5’-AATGCGATGGCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTG-3’；SEQ ID NO.8。
在PCR管中加入3 µL pcaHG-L、3 µL pcaHG-R、4 µL pk-pcaHG载体，10.0 µlGibson连接酶，连接温度为50 ℃，连接时间为15 min，其总体系为20 µL。
Gibson连接的20 µl连接总体系都转化到E.coli Trans10商业感受态（北京全式金生物）中进行培养和保留。转化操作严格按照说明书进行操作，37 ℃养1 h后涂板到LB平板（含50μg/mL卡那霉素）上，随后再37 ℃养12 h，挑单菌落10-20个左右进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。菌落PCR扩增及DNA测序引物为：
Pklj-F：5’-GCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；SEQ ID NO.9；
Pklj-R：5’-cgggcctcttcgctattac-3’；SEQ ID NO.10。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ001，经扩繁，提质粒，获得WJ001质粒。将大肠杆菌WJ001质粒电转至谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态中。
谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞制备如下：挑取谷氨酸棒杆菌ATCC13032甘油保存菌种划线接种于LBHIS平板上，在30℃培养箱中培养24-30h 左右；从平板上挑取菌落接入含有LBHIS液体培养基的试管中培养12 h，以一定的接种量接入20ml EPO培养基中，使初始OD600为0.3左右，30℃摇瓶培养约3-5 h，当OD600达0.9左右时取菌液于离心管中，冰浴15min，使菌体冷却到0℃；4℃，4500 rpm冷冻离心10min收集菌体（1.5mL离心管分装），弃上清，用100μL预冷的10%的甘油重悬菌体（三管菌体混一管）；重复上一步骤三次；洗涤完成后用100μL 10%的无菌甘油重悬菌体，分装直接用于电转。
电转方法如下：在每管感受态细胞中加入2-4μL质粒，混匀，冰浴5-10 min；将混合液移入预冷的0.2 cm电击杯中，1.8 kv，电击5 ms，50μF，100Ω。电击完毕后立即加入800μLLBHIS液体培养基，轻柔地混合后吸出置于1.5 mL离心管中，46℃水浴或金属浴6min，后置于30℃培养2~3 h； 8000 rpm离心1.5 min，弃上清，留菌液约100-200μl，混匀涂布于含50μg/mL卡那霉素的LBHIS固体培养基平板上，30℃培养24~36h。
挑取平板上长出的单菌落进行sacB基因的验证，只有既能在卡那抗性平板上生长的菌又能扩增出sacB基因（条带大小为999 bp）的菌落才是发生了第一次同源重组的菌种，验证引物如下：
sac-F：5’-CCCATATTACACGCCATGATATGCT-3’；SEQ ID NO.11；
sac-R：5’-GCATGTAAATATCGTTAGACGTAATGCCG-3’；SEQ ID NO.12。
挑取验证正确的菌种接种于30%蔗糖培养基中培养24h，待菌液变混浊后划线于20%蔗糖固体培养基上；挑取平板上的单菌落，进行sacB基因的菌落PCR；没有扩增出sacB基因的单菌落，使用验证引物进行二次菌落PCR，pcaHG验证（条带大小为3376 bp）引物如下：
pcaHG-验证-F：5’-CGCGACTTGCCATCACATC-3’；SEQ ID NO.13；
pcaHG-验证-R：5’-GTCAAGCAGGCTAAACCGGAG-3’；SEQ ID NO.14。
因为依据谷氨酸棒状杆菌敲除原理，发生第二次同源重组后，整个敲除质粒会从基因组脱落，从而达到敲除的目的，因此发生二次重组的菌落将不再含有sacB基因；通过验证引物验证已成功敲除的菌体接种于LBHIS液体培养基中进行培养，并划线于LBHIS固体培养基平板上进行纯化和再次验证，确定无误后可保菌待用，将cgATCC13032∆pcaHG命名为谷氨酸棒状杆菌CG001。
（2）以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，使用引物van-L-up/van-L-down扩增van-L（如SEQ ID NO.15所示），使用引物van-R-up/van-R-down扩增van-R（如SEQID NO.16所示），获得部分删除van的上游和下游同源臂。引物序列为：
van-L-up：5’-AACAGCTATGACATGATTACGATAAGCTGCTCATGCTTGGC-3’；SEQ IDNO.17；
van-L-down：5’-CTGATATCTCGACATTGCTGAGTTAATGTCAGCTGGGGTCTC-3’；SEQ IDNO.18；
van-R-up：5’-CAGCAATGTCGAGATATCAGTGG-3’；SEQ ID NO.19；
van-R-down：5’-AGAGGATCTACCGAGCTCTCATCAGTGTGTTTCGGGAGC-3’；SEQ IDNO.20。
质粒载体PK-JL用引物pk-van-F和pk-van -R线性化得到pk-van载体，引物序列如下
pk-van-F：5’-GAGCTCGGTAGATCCTCTAGAGT-3’；SEQ ID NO.21；
pk-van-R：5’-CGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTG-3’；SEQ ID NO.22。
基因扩增体系、基因扩增程序同上，得到van-L、van-R、pk-van载体，连接转化验证方式同上，得到大肠杆菌WJ002，经扩繁，提质粒，获得WJ002质粒。
将大肠杆菌WJ002质粒电转至谷氨酸棒状杆菌CG001感受态中。感受态制备、电转、sacB验证、蔗糖培养基培养同上，部分删除van验证（条带大小为4459 bp）引物如下：
van-验证-F：5’-TTGATGGTGTCCGCAAAATCG-3’；SEQ ID NO.23；
van-验证-R：5’-ACCGACACGACCCATACCAA-3’；SEQ ID NO.24。
通过验证引物验证已成功敲除的菌体接种于LBHIS液体培养基中进行培养，并划线于LBHIS固体培养基平板上进行纯化和再次验证，确定无误后可保菌待用，将cgATCC13032∆pcaHG∆van命名为谷氨酸棒状杆菌CG002。
（3）以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，使用引物vdh-L-up/vdh-L-down扩增vdh-L（如SEQ ID NO.25所示），使用引物vdh-R-up/vdh-R-down扩增vdh-R（如SEQID NO.26所示），获得全部删除vdh的上游和下游同源臂。引物序列为：
vdh-L-up：5’-AACAGCTATGACATGATTACGCGACGGTATTCCTGCAGATGA-3’；SEQ IDNO.27；
vdh-L-down：5’-CTTTAGGAGACCTTCGCTAATCCGCTGAACAGG-3’；SEQ ID NO.28；
vdh-R-up：5’-GATTAGCGAAGGTCTCCTAAAGTTGATTGTGGATAC-3’；SEQ ID NO.29；
vdh-R-down：5’-AGCTCAGTATGGGAAGCATTGCTTGC-3’；SEQ ID NO.30。
质粒载体PK-JL用引物pk-vdh-F和pk-vdh -R线性化得到pk-vdh载体，引物序列如下：
pk-vdh-F：5’-AATGCTTCCCATACTGAGCTCGGTAGATCCTCTAGAGT-3’；SEQ ID NO.31；
pk-vdh -R：5’-CGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTG-3’；SEQ ID NO.32。
基因扩增体系、基因扩增程序同上，得到vdh-L、vdh-R、pk-vdh载体，连接转化验证方式同上，得到大肠杆菌WJ003，经扩繁，提质粒，获得WJ003质粒。
将大肠杆菌WJ003质粒电转至谷氨酸棒状杆菌CG002感受态中。感受态制备、电转、sacB验证、蔗糖培养基培养同上，vdh验证（条带大小为3653 bp）引物如下：
vdh-验证-F：5’-GTGAATCAATCATTGCTGATTACCTTGTC-3’；SEQ ID NO.33；
vdh-验证-R：5’-CTTATGCCTTTGCGTAATGTTGATAGAAC-3’；SEQ ID NO.34。
通过验证引物验证已成功敲除的菌体接种于LBHIS液体培养基中进行培养，并划线于LBHIS固体培养基平板上进行纯化和再次验证，确定无误后可保菌待用，将cgATCC13032∆pcaHG∆van∆vdh命名为谷氨酸棒状杆菌CG003。
（4）以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，使用引物fud-L-up/fud-L-down扩增fud-L（如SEQ ID NO.35所示），使用引物fud-R-up/fud-R-down扩增fud-R（如SEQID NO.36所示），获得fud的上游和下游同源臂。引物序列为：
fud-L-up：5’-TTACGAATTCGAGCTCGGTAAAGCCACCGGATTTAGCGC-3’；SEQ ID NO.37；
fud-L-down：5’-CCCAGTTAGCCTACCGAAAAATCAA-3’；SEQ ID NO.38；
fud-R-up：5’-TTCGGTAGGCTAACTGGGCCCTGGCTTTGGAGAGTTACT-3’；SEQ ID NO.39；
fud-R-down：5’-TCGACTCTAGAACACGATTCTCAAGCTTACTGCG-3’；SEQ ID NO.40。
质粒载体PK-JL用引物pk-fud-F和pk-fud -R线性化得到pk-fud载体，引物序列如下：
pk-fud-F：5’-AGAATCGTGTTCTAGAGTCGACCTGCAGGC-3’；SEQ ID NO.41；
pk-fud -R：5’-TTTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGT-3’；SEQ ID NO.42。
基因扩增体系、基因扩增程序同上，得到fud-L、fud-R、pk-fud载体，连接转化验证方式同上，得到大肠杆菌WJ004，经扩繁，提质粒，获得WJ004质粒。
将大肠杆菌WJ004质粒电转至谷氨酸棒状杆菌CG003感受态中。感受态制备、电转、sacB验证、蔗糖培养基培养同上，fud验证（条带大小为3431 bp）引物如下：
fud-验证-F：5’-CTTTCTTGGGAAAGGCCCG-3’；SEQ ID NO.43；
fud-验证-R：5’-TGGCACCTACAACCTCACCAA-3’；SEQ ID NO.44。
通过验证引物验证已成功敲除的菌体接种于LBHIS液体培养基中进行培养，并划线于LBHIS固体培养基平板上进行纯化和再次验证，确定无误后可保菌待用，将cgATCC13032∆pcaHG∆van∆vdh∆fud命名为谷氨酸棒状杆菌CG004。
（5）以大肠杆菌k12的基因组DNA为模板，使用引物tktA-up/tktA-down扩增片段tktA（Gene ID: 947420），获得带与aroG连接的无缝克隆同源臂和RBS（核糖体结合位点）的大肠杆菌来源的tktA片段。
将大肠杆菌k12来源的aroG基因序列第436位的A碱基突变为G碱基，获得抗反馈抑制基因序列（如SEQ ID NO.45所示）；以抗反馈抑制基因序列为模板，使用引物aroG-up/aroG-down扩增片段aroG，获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的大肠杆菌来源的aroG片段。
以华大基因合成的大鼠（Rattus norvegicus，Rat）经密码子优化的comt片段（如SEQ ID NO.46所示）为模板，使用引物comt-up/comt-down扩增片段comt，获得带与tktA连接的无缝克隆同源臂和RBS的大鼠来源的comt片段。
以华大基因合成的诺卡氏菌（Nocardia iowensis）经密码子优化的car基因片段（如SEQ ID NO.47所示）为模板，使用引物car-up/car-down扩增片段car，获得带与metX连接的无缝克隆同源臂和RBS的诺卡氏菌来源的car片段。
以华大基因合成的海洋分支杆菌（Mycobacterium marinum）经密码子优化的sfp基因片段（如SEQ ID NO.48所示）为模板，使用引物sfp-up/sfp-down扩增片段sfp，获得带与car、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的海洋分支杆菌来源的sfp片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物metE-up/metE-down扩增片段metE（如SEQ ID NO.49所示），获得带与ahcY、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的metE片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物metK-up/metK-down扩增片段metK（如SEQ ID NO.50所示），获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的metK片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物metX-up/metX-down扩增片段metX（如SEQ ID NO.51所示），获得带与metK连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的metX片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物ahcY-up/ahcY-down扩增片段ahcY（如SEQ ID NO.52所示），获得带与comt连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的ahcY片段。
引物序列为：
tktA-up：5’-TAAAAGCGCGTCGCGGGTAAAAGGAGGATATACATATGTCCTCACGTAAAGAGCTT GC-3’；SEQ ID NO.53；
tktA-down：5’-TTACAGCAGTTCTTTTGCTTTCGC-3’；SEQ ID NO.54；
aroG-up：5’-GGAAACAGACCATGGAATTCAAGGAGGATATACATATGAATTATCAGAACGACGATT TACGC-3’；SEQ ID NO.55；
aroG-down：5’-TTACCCGCGACGCGCTTTTA-3’；SEQ ID NO.56；
comt-up：5’-AAAGCAAAAGAACTGCTGTAAAAGGAGGATATACATATGGGTGATACCAAAGAACAG CG-3’；SEQ ID NO.57；
comt-down：5’-TTAAGATTTATCAGGGCTACTAGGTCCC-3’；SEQ ID NO.58；
car-up：5’-CATCGAGTTCTACATCTAATCTAGAAAGGAGGATATACATATGGCAGTGGATTCCCC AG-3’；SEQ ID NO.59；
car-down：5’-TTACAGCAGCTGCAGCAGTTC-3’；SEQ ID NO.60；
sfp-up：5’-AACTGCTGCAGCTGCTGTAAGGATCCCCAAGGAGGATATACATATGACCGTGGGCACT CTG-3’；SEQ ID NO.61；
sfp-down：5’-CGCCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCTTACAGCACGATTGCAGTC AG-3’；SEQ ID NO.62；
metE-up：5’-CGGAGCACTACCGCTACTAAAAGGAGGATATACATATGACTTCCAACTTTTCTTCCA CTG-3’；SEQ ID NO.63；
metE-down：5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTTAGATAGTTGCTCCGATTTTCTCACG-3’；SEQ ID NO.64；
metK-up：5’-TTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACAAGGAGGATATACATGTGGCTCAGCCAACCG-3’；SEQ ID NO.65；
metK-down：5’-TTAGGCCAACTTGAGGGCTG-3’；SEQ ID NO.66；
metX-up：5’-CAGCCCTCAAGTTGGCCTAAAAGGAGGATATACATATGCCCACCCTCGCG-3’；SEQID NO.67；
metX-down：5’-TCTAGATTAGATGTAGAACTCGATGTAGGTCG-3’；SEQ ID NO.68；
ahcY-up：5’-CCTAGTAGCCCTGATAAATCTTAAAAGGAGGATATACATATGGACTTCAAGGTTGCC GA-3’；SEQ ID NO.69；
ahcY-down：5’-TTAGTAGCGGTAGTGCTCCG-3’；SEQ ID NO.70。
基因扩增体系、基因扩增程序同上。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到相应的不同来源的基因产物tktA、aroG、comt、car、sfp、metE、metK、metX和ahcY。
质粒载体pEC-XK99E用引物pec-F和pec-R线性化得到pec载体，引物序列如下：
pec-F：5’-TACCCGGGGATCCTCTAGAGTC-3’；SEQ ID NO.71；
pec-R：5’-GAATTCCATGGTCTGTTTCCTGTG-3’；SEQ ID NO.72。
扩增体系和程序同基因扩增体系和程序。
质粒载体pXMJ19用引物px-F和px-R线性化得到pxmj载体，引物序列如下：
px-F：5’-CGAATTCAGCTTGGCTGTTTTGGCG-3’；SEQ ID NO.73；
px-R：5’-TGCAGGCATGCAAGCTTAATTAATT-3’；SEQ ID NO.74。
在PCR管中加入不同来源的1.5 µl tktA、2.5 µl aroG、1.0 µl comt、1.5 µlmetE、1.5 µl ahcY、2.0 µl pec载体，10.0 µl的Gibson酶。
连接温度为50 ℃，连接时间为15 min，其总体系为20 µL。
Gibson连接的20 µl连接总体系都转化到E.coli Trans10商业感受态中进行培养和保留。转化操作严格按照说明书进行操作，37 ℃养1 h后涂板到LB平板（含50μg/mL卡那霉素）上，随后再37 ℃养12 h，挑单菌落10-20个左右进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。菌落PCR扩增及DNA测序引物为：
Pec-F1：5’-GGCTGTGCAGGTCGTAAATCAC-3’；SEQ ID NO.75；
Pec-R1：5’-AGTTCCCTACTCTCGCATGGG-3’；SEQ ID NO.76。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ101，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ101质粒。
在PCR管中加入3.0 µl car、1.0 µl sfp、2.0 µl metK、2.0 µl metX、2.0 µlpxmj载体，10.0 µl Gibson酶。
连接温度为50 ℃，连接时间为15 min，其总体系为20 µL。
Gibson连接的20 µl连接总体系都转化到E.coli Trans10商业感受态（北京全式金生物）中进行培养和保留。转化操作严格按照说明书进行操作，37 ℃养1 h后涂板到LB平板（含50μg/mL卡那霉素）上，随后再37 ℃养12 h，挑单菌落10-20个左右进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。菌落PCR扩增及DNA测序引物为：
Pxmj-F：5’-CTGTGGTATGGCTGTGCAGGTC-3’；SEQ ID NO.77；
Pxmj-R：5’-ATGCCTGGCAGTTCCCTACT-3’；SEQ ID NO.78。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ201，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ201质粒。
将2.0 µl大肠杆菌WJ101质粒和2.0 µl大肠杆菌WJ201质粒同时电转至谷氨酸棒状杆菌CG004感受态中。感受态制备、电转同上。混匀涂布于含50μg/mL卡那霉素和5 μg/mL氯霉素的LBHIS固体培养基平板上，30℃培养24~36h。
挑取平板上长出的单菌落进行kana和cm基因的验证，只有既能在卡那和氯霉素双抗性平板上生长的菌又能扩增出kana和cm基因的菌落才是目标菌种，命名为谷氨酸棒状杆菌CG101，验证引物如下：
kana-F：5’-ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG-3’；SEQ ID NO.79；
kana-R：5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’；SEQ ID NO.80；
Cm-R：5’-CCTGCCACTCATCGCAGTAC-3’；SEQ ID NO.81；
Cm-F：5’-ATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACC-3’；SEQ ID NO.82。
谷氨酸棒状杆菌基因工程改造菌株“谷氨酸棒状杆菌CG101”进行50 mL体系发酵验证，培养种子用LBG培养基，发酵用发酵培养基实施方案。
谷氨酸棒状杆菌CG101发酵分为三步：
接试管：取存放在温度设置为-80℃的谷氨酸棒状杆菌CG101 100 µL，转接到含有4 mL LBHIS液体培养基（含50μg/mL卡那霉素和5 μg/mL氯霉素）的试管中，30℃，培养12 h-14 h。
接种子：取出培养12-14 h后的试管，取1 mL试管中的菌液转接到20 mL体系的LBG液体培养基（容器为100 mL无挡板锥形瓶，含50μg/mL卡那霉素和5 μg/mL氯霉素）中，置于30 ℃，200 rpm的恒温摇床中培育12-14 h。
接发酵培养基：在50 mL体系的发酵液（容器为250 mL挡板锥形瓶，发酵培养基含50μg/mL卡那霉素和5 μg/mL氯霉素）中所接种的种子量为总发酵体系的5%，使用浓氨水来调节发酵液的pH至中性，置于30 ℃，200 rpm的恒温摇床中培养96 h（培养3 h时加入0.8mM IPTG诱导），期间每24 h为取样点，检测OD600及目标产物香兰素浓度。（1）OD600的检测：发酵液注入比色皿，再用去离子水稀释50倍后用紫外分光光度计测量吸光值（600 nm），测出OD600。（2）发酵液中香兰素浓度测定：采用UltiMate3000高效液相色谱仪（HPLC，赛默飞）检测发酵液中的香兰素，检测方法：流动相包括A相（0.1%甲酸水溶液）和B相（纯甲醇），色谱柱使用ZORBAX SB-C18反向色谱柱，柱温设置为28℃，流动相的流速设置为1.0 mL/min，使用紫外检测器进行检测，紫外吸收波长设置为260 nm，最后根据由标准样品绘制的标准曲线对不同发酵样品的数据峰图进行产物及其他代谢物的含量计算。结果见表1和图2。
表1
实施例2
一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物tktA-up2/tktA-down2扩增片段tktA（如SEQ ID NO.83所示），获得带与aroG连接的无缝克隆同源臂和RBS（核糖体结合位点）的谷氨酸棒状杆菌来源的tktA片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物aroG-up2/aroG-down2扩增片段aroG（如SEQ ID NO.84所示），获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的aroG片段。
以华大基因合成的拟南芥（Arabidopsis thaliana，Mouseear cress）经密码子优化的comt片段（如SEQ ID NO.85所示）为模板，使用引物comt-up2/comt-down2扩增片段comt，获得带与tktA连接的无缝克隆同源臂和RBS的拟南芥来源的comt片段。
以华大基因合成的海洋分支杆菌（Mycobacterium marinum）经密码子优化的car基因片段（如SEQ ID NO.86所示）为模板，使用引物car-up2/car-down2扩增片段car，获得带与met2连接的无缝克隆同源臂和RBS的海洋分支杆菌来源的car片段。
以华大基因合成的诺卡氏菌（Nocardia iowensis）经密码子优化的sfp基因片段（如SEQ ID NO.87所示）为模板，使用引物sfp-up2/sfp-down2扩增片段sfp，获得带与car、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的诺卡氏菌来源的sfp片段。
以大肠杆菌k12的基因组DNA为模板，使用引物metE-up2/metE-down2扩增片段metE（Gene ID: 948323），获得带与ahcY、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的大肠杆菌来源的metE片段。
以大肠杆菌k12的基因组DNA为模板，使用引物metK-up2/metK-down2扩增片段metK（Gene ID: 945389），获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的大肠杆菌来源的metK片段。
以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，使用引物met2-up2/met2-down2扩增片段met2（Gene ID: 855444），获得带与metK连接的无缝克隆同源臂和RBS的酿酒酵母S288C来源的met2片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物ahcY-up2/ahcY-down2扩增片段ahcY（如SEQ ID NO.52所示），获得带与comt连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的ahcY片段。
引物序列为：
tktA-up2：5’-ACGCCGAGCAGCAGCCAAGTAAAAGGAGGATATACATGTGGACACCAAGGCTGTA GA-3’；SEQ ID NO.88；
tktA-down2：5’-TTAACCGTTAATGGAGTCCTTGG-3’；SEQ ID NO.89；
aroG-up2：5’-GGAAACAGACCATGGAATTCAAGGAGGATATACATATGAGTTCTCCAGTCTCACT CG-3’；SEQ ID NO.90；
aroG-down2：5’-TTACTTGGCTGCTGCTCG-3’；SEQ ID NO.91；
comt-up2：5’-CCAAGGACTCCATTAACGGTTAAAAGGAGGATATACATATGGGTAGCACCGCGG-3’；SEQ ID NO.92；
comt-down2：5’-TTACAGTTTTTTCAGCAGTTCAATCAGG-3’；SEQ ID NO.93；
car-up2：5’-AAGAAGTTACCAACTGGTAGtctagaAAGGAGGATATACATATGTCCCCAATCACCC GC-3’；SEQ ID NO.94；
car-down2：5’-TTGGATCCTTACAGCAGGCCCAGCAGG-3’；SEQ ID NO.95；
sfp-up2：5’-CTGCTGGGCCTGCTGTAAggatccAAGGAGGATATACATATGATCGAAACCATCCTG-3’；SEQ ID NO.96；
sfp-down2：5’-CGCCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCTTATGCGTATGCGATTGC GGTC-3’；SEQ ID NO.97；
metE-up2：5’-CGGAGCACTACCGCTACTAAAAGGAGGATATACATATGACAATATTGAATCACACC CTCG-3’；SEQ ID NO.98；
metE-down2：5’-GACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTTACCCCCGACGCAAGTTC-3’；SEQ ID NO.99；
metK-up2：5’-TTAATTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACAAGGAGGATATACATATGGCAAAACA CCTTTTTACGTC-3’；SEQ ID NO.100；
metK-down2：5’-TTACTTCAGACCGGCAGCA-3’；SEQ ID NO.101；
met2-up2：5’-GCTGCCGGTCTGAAGTAAAAGGAGGATATACATATGTCGCATACTTTAAAATCGAA AACG-3’；SEQ ID NO.102；
met2-down2：5’-CTACCAGTTGGTAACTTCTTCGG-3’；SEQ ID NO.103；
ahcY-up2：5’-ATTGAACTGCTGAAAAAACTGTAAAAGGAGGATATACATATGGACTTCAAGGTTGC CGA-3’；SEQ ID NO.104；
ahcY-down2：同ahcY-down。
基因扩增体系、基因扩增程序同上。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到相应的不同来源的基因产物tkt、aroG、comt、car、sfp、metE、metK、metX和ahcY。
质粒载体pEC-XK99E用引物pec-F和pec-R线性化得到pec载体，同实施例1。
连接体系、程序和转化、验证同实施例1。挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ102，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ102质粒。
质粒载体pXMJ19用引物px-F和px-R线性化得到pxmj载体，同实施例1。
连接体系、程序和转化、验证同实施例1。挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ202，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ202质粒。
将大肠杆菌WJ102质粒和大肠杆菌WJ202质粒电转至谷氨酸棒状杆菌CG004感受态（实施例1制备）中，命名为谷氨酸棒状杆菌CG102。感受态制备、电转、验证、发酵同实施例1。结果见表2和图3。
表2
实施例3
一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，使用引物tkl1up3/ tkl1-down3扩增片段tkl1（Gene ID: 856188），获得带与aro4连接的无缝克隆同源臂和RBS（核糖体结合位点）的酿酒酵母S288C来源的tkl1片段。
以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，使用引物aro4-up3/aro4-down3扩增片段aro4（Gene ID: 852551），获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的酿酒酵母S288C来源的aro4片段。
以华大基因合成的人源（Homo sapiens，Human）经密码子优化的comt片段（如SEQID NO.105所示）为模板，使用引物comt-up3/comt-down3扩增片段comt，获得带与tkl1连接的无缝克隆同源臂和RBS的人源来源的comt片段。
以华大基因合成的诺卡氏菌（Nocardia iowensis）经密码子优化的car基因片段（如SEQ ID NO.47所示）为模板，使用引物car-up3/car-down3扩增片段car，获得带与met2连接的无缝克隆同源臂和RBS的诺卡氏菌来源的car片段。
以华大基因合成的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）经密码子优化的sfp基因片段（如SEQ ID NO.106所示）为模板，使用引物sfp-up3/sfp-down3扩增片段sfp，获得带与car、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的枯草芽孢杆菌来源的sfp片段。
以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，使用引物met6-up3/met6-down3扩增片段met6（Gene ID: 856825），获得带与ahcY、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的酿酒酵母S288C来源的met6片段。
以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，使用引物SAM2-up3/ SAM2-down3扩增片段SAM2（Gene ID: 852113），获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的酿酒酵母S288C来源的SAM2片段。
以酿酒酵母S288C的基因组DNA为模板，使用引物met2-up3/met2-down3扩增片段met2（Gene ID: 855444），获得带与SAM2连接的无缝克隆同源臂和RBS的酿酒酵母S288C来源的met2片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物ahcY-up3/ahcY-down3扩增片段ahcY（如SEQ ID NO.52所示），获得带与comt连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的ahcY片段。
引物序列为：
tkl1up3：5’-AGAGAAGTTAACAAGAAATAGAAGGAGGATATACATATGACTCAATTCACTGACATT GATAAGC-3’；SEQ ID NO.107；
tkl1-down3：5’-TTAGAAAGCTTTTTTCAAAGGAGAAATTAGC-3’；SEQ ID NO.108；
aro4-up3：5’-GGAAACAGACCATGGAATTCAAGGAGGATATACATATGAGTGAATCTCCAATGTTC GC-3’；SEQ ID NO.109；
aro4-down3：5’-CTATTTCTTGTTAACTTCTCTTCTTTGTCTG-3’；SEQ ID NO.110；
comt-up3：5’-CTCCTTTGAAAAAAGCTTTCTAAAAGGAGGATATACATATGCCGGAAGCCCCG-3’；SEQ ID NO.111；
comt-down3：5’-TTACGGACCCGCTTCACTACC-3’；SEQ ID NO.112；
car-up3：5’-AAGAAGTTACCAACTGGTAGTCTAGAAAGGAGGATATACATATGGCAGTGGATTCCC CAG-3’；SEQ ID NO.113；
car-down3：同car-down；
sfp-up3：5’-CTGCTGCAGCTGCTGTAAGGATCCCCAAGGAGGATATACATATGAAGATCTACGGCA TC-3’；SEQ ID NO.114；
sfp-down3：5’-CTGAATTCGAGCTCGGTACCCTTACAGCAGTTCTTCGTAGGACAC-3’；SEQ IDNO.115；
met6-up3：5’-CGGAGCACTACCGCTACTAAAAGGAGGATATACATATGGTTCAATCTGCTGTCTTA GG-3’；SEQ ID NO.116；
met6-down3：5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTTAATTCTTGTATTGTTCACGGAAGTA CTTG-3’；SEQ ID NO.117；
SAM2-up3：5’-TTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACAAGGAGGATATACATATGTCCAAGAGCAAA ACTTTCTTAT-3’；SEQ ID NO.118；
SAM2-down3：5’-TTAAAATTCCAATTTCTTTGGTTTTTCCC-3’；SEQ ID NO.119；
met2-up3：5’-CCAAAGAAATTGGAATTTTAAAAGGAGGATATACATATGTCGCATACTTTAAAATC GAAAACG-3’；SEQ ID NO.120；
met2-down3：同met2-down2；
ahcY-up3：5’-GGTAGTGAAGCGGGTCCGTAAAAGGAGGATATACATATGGACTTCAAGGTTGCCGA-3’；SEQ ID NO.121；
ahcY-down3：同ahcY-down。
基因扩增体系、基因扩增程序同上。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到相应的不同来源的基因产物tkl1、aro4、comt、car、sfp、met6、SAM2、met2和ahcY。
质粒载体pEC-XK99E用引物pec-F和pec-R线性化得到pec载体，同实施例1。
连接体系、程序和转化、验证同实施例1。挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ103，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ103质粒。
质粒载体pXMJ19用引物px-F和px-R线性化得到pxmj载体，同实施例1。
连接体系、程序和转化、验证同实施例1。挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ203，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ203质粒。
将大肠杆菌WJ103质粒和大肠杆菌WJ203质粒电转至谷氨酸棒状杆菌CG004感受态（实施例1制备）中，命名为谷氨酸棒状杆菌CG103。感受态制备、电转、验证、发酵同实施例1。结果见表3和图4。
表3
实施例4
一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，使用引物tktA-up4/tktA-down4扩增片段tktA（Gene ID: 937377），获得带与aroX连接的无缝克隆同源臂和RBS（核糖体结合位点）的枯草芽孢杆菌168来源的tktA片段。
以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，使用引物aroX-up4/aroX-down4扩增片段aroX（Gene ID: 937853），获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的枯草芽孢杆菌168来源的aroX片段。
以华大基因合成的咖啡（Coffea canephora，Robusta coffee）经密码子优化的comt片段（如SEQ ID NO.122所示）为模板，使用引物comt-up4/comt-down4扩增片段comt，获得带与tktA连接的无缝克隆同源臂和RBS的咖啡来源的comt片段。
以华大基因合成的诺卡氏菌（Nocardia iowensis）经密码子优化的car基因片段（如SEQ ID NO.47所示）为模板，使用引物car-up4/car-down4扩增片段car，获得带与metAA连接的无缝克隆同源臂和RBS的诺卡氏菌来源的car片段。
以华大基因合成的海洋分支杆菌（Mycobacterium marinum）经密码子优化的sfp基因片段（如SEQ ID NO.48所示）为模板，使用引物sfp-up4/sfp-down4扩增片段sfp，获得带与car、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的海洋分支杆菌来源的sfp片段。
以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，使用引物metE-up4/metE-down4扩增片段metE（Gene ID: 936480 ），获得带与ahcY、质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的枯草芽孢杆菌168来源的metE片段。
以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，使用引物metK-up4/metK-down4扩增片段metK（Gene ID: 937090），获得带与质粒连接的无缝克隆同源臂和RBS的枯草芽孢杆菌168来源的metK片段。
以枯草芽孢杆菌168的基因组DNA为模板，使用引物metAA-up4/metAA-down4扩增片段metAA（Gene ID: 939083），获得带与metK连接的无缝克隆同源臂和RBS的枯草芽孢杆菌168来源的metAA片段。
以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板，使用引物ahcY-up4/ahcY-down4扩增片段ahcY（如SEQ ID NO.52所示），获得带与comt连接的无缝克隆同源臂和RBS的谷氨酸棒状杆菌来源的ahcY片段。
引物序列为：
tktA-up4：5’-CAATGGTGAAAGTCAACGCTTAAAAGGAGGATATACATATGGATACAATTGAAAAG AAATCAGTTGC-3’；SEQ ID NO.123；
tktA-down4：5’-TTACTTATTGATTAATGCCTTAACTCGATTC-3’；SEQ ID NO.124；
aroX-up4：5’-GGAAACAGACCATGGAATTCAAGGAGGATATACATATGAGCAACACAGAGTTAGA GC-3’；SEQ ID NO.125；
aroX-down4：5’- TTAAGCGTTGACTTTCACCATTG-3’；SEQ ID NO.126；
comt-up4：5’-AGGCATTAATCAATAAGTAAAAGGAGGATATACATATGGCCGAAGAAGAAGCATG-3’；SEQ ID NO.127；
comt-down4：5’-TTATTTACACAGTTCCATAATCCAGGTATTC-3’；SEQ ID NO.128；
car-up4：5’-TCCTTATGAATGGGACTAAtctagaAAGGAGGATATACATATGGCAGTGGATTCCCC AG-3’；SEQ ID NO.129；
car-down4：同car-down1；
sfp-up4：同sfp-up 1；
sfp-down4：同sfp-down 1；
metE-up4：5’-CGGAGCACTACCGCTACTAAAAGGAGGATATACATATGACAACCATCAAAACATCG AAT-3’；SEQ ID NO.130；
metE-down4：5’-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCTTATACTAGCTGTGTCTGCTGTGC-3’；SEQ ID NO.131；
metK-up4：5’-TTAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACAAGGAGGATATACATATGAGTAAAAATCGT CGTTTATTTACATC-3’；SEQ ID NO.132；
metK-down4：5’-TTATTCTCCTAACGCTTCTTTACGC-3’；SEQ ID NO.133；
metAA-up4：5’-AAGAAGCGTTAGGAGAATAAAAGGAGGATATACATTTGCCTATTAATATACCAAC ACACCTG-3’；SEQ ID NO.134；
metAA-down4：5’-TTAGTCCCATTCATAAGGAGTTTCTTG-3’；SEQ ID NO.135；
ahcY-up4：5’-TTATGGAACTGTGTAAATAAAAGGAGGATATACATATGGACTTCAAGGTTGCCGA-3’；SEQ ID NO.136；
ahcY-down4：同ahcY-down。
基因扩增体系、基因扩增程序同上。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到相应的不同来源的基因产物tktA、aroX、comt、car、sfp、metE、metK、metAA和ahcY。
质粒载体pEC-XK99E用引物pec-F和pec-R线性化得到pec载体，同实施例1。
连接体系、程序和转化、验证同实施例1。挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ104，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ104质粒。
质粒载体pXMJ19用引物px-F和px-R线性化得到pxmj载体，同实施例1。
连接体系、程序和转化、验证同实施例1。挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ204，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ204质粒。
将大肠杆菌WJ104质粒和大肠杆菌WJ204质粒电转至谷氨酸棒状杆菌CG004感受态（实施例1制备）中，命名为谷氨酸棒状杆菌CG104。感受态制备、电转、验证、发酵同实施例1。结果见表4和图5。
表4
实施例5
一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：
以华大基因合成的小鼠（Mus musculus，Mouse）经密码子优化的comt片段（如SEQID NO.137所示）为模板，使用引物comt-up5/comt-down4扩增片段comt，获得带与tktA连接的无缝克隆同源臂和RBS的小鼠来源的comt片段。
引物序列如下：
comt-up5：5’-AAAGCAAAAGAACTGCTGTAAAAGGAGGATATACATATGCTGCTGGCGGCC-3’；SEQ ID NO.138；
comt-down4：5’-TTAGCTTTTAACCGGGCTGCT-3’；SEQ ID NO.139；
ahcY-up5：5’-AGCAGCCCGGTTAAAAGCTAAAAGGAGGATATACATATGGACTTCAAGGTTGCCGA-3’；SEQ ID NO.140。
其余基因、引物同实施例1。
基因扩增体系、基因扩增程序同上。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳和产物回收后得到相应的不同来源的基因产物tktA、aroG、comt、car、sfp、metE、metK、metX和ahcY。
质粒载体pEC-XK99E用引物pec-F和pec-R线性化得到pec载体，同实施例1。
连接体系、程序和转化、验证同实施例1。挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌WJ105，经扩繁，提质粒，获得大肠杆菌WJ105质粒。
将大肠杆菌WJ105质粒和大肠杆菌WJ201质粒电转至谷氨酸棒状杆菌CG004感受态（实施例1制备）中，命名为谷氨酸棒状杆菌CG105。感受态制备、电转、验证、发酵同实施例1。结果见表5和图6。
表5
香兰素标品的HPLC的检测结果的出峰时间为17.231 min，实施例1-5制备的基因工程菌株的发酵培养产物的出峰时间为17.233 min，工程菌株发酵样品的出峰时间与香兰素标品的出峰时间相一致，证明工程菌株的发酵产物是目标产品——香兰素。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌，其特征在于，
所述基因工程菌为经过底盘微生物改造，且包括香兰素合成模块和甲基循环再生模块的重组谷氨酸棒状杆菌；
所述底盘微生物改造为以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为出发菌株，敲除pcaHG、van、vdh和fud基因；
所述香兰素合成模块表达转酮酶基因、3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因、O-甲基转移酶基因、羧酸还原酶基因和磷酸泛酰氨基转移酶基因；
所述甲基循环再生模块表达5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因、S-腺苷蛋氨酸合成酶基因、高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因和腺苷高半胱氨酸酶基因。
2.根据权利要求1所述的一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌，其特征在于，
所述转酮酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌转酮酶基因，或外源性转酮酶基因；
所述3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因，或外源性3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因；
所述O-甲基转移酶基因包括拟南芥（Arabidopsis thaliana，Mouseear cress）来源的O-甲基转移酶基因、咖啡（Coffea canephora，Robusta coffee）来源的O-甲基转移酶基因、人源（Homo sapiens，Human）的O-甲基转移酶基因、大鼠（Rattus norvegicus，Rat）来源的O-甲基转移酶基因、小鼠（Mus musculus，Mouse）来源的O-甲基转移酶基因；
所述羧酸还原酶基因包括诺卡氏菌（Nocardia iowensis）来源的羧酸还原酶基因、海洋分支杆菌（Mycobacterium marinum）来源的羧酸还原酶基因；所述磷酸泛酰氨基转移酶基因包括诺卡氏菌（Nocardia iowensis）来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因、海洋分支杆菌（Mycobacterium marinum）来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因；
所述5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因，或外源性5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因；
所述S-腺苷蛋氨酸合成酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌S-腺苷蛋氨酸合成酶基因，以及任选的外源性S-腺苷蛋氨酸合成酶基因；
高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因，以及任选的外源性高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因；
所述腺苷高半胱氨酸酶基因包括内源性谷氨酸棒状杆菌腺苷高半胱氨酸酶基因，以及任选的外源性腺苷高半胱氨酸酶基因；
所述内源性谷氨酸棒状杆菌转酮酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.83所示；
所述内源性谷氨酸棒状杆菌3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.84所示；
所述拟南芥来源的O-甲基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.85所示；所述咖啡来源的O-甲基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.122所示；所述人源的O-甲基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.105所示；所述大鼠来源的O-甲基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；所述小鼠来源的O-甲基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.137所示；
所述诺卡氏菌来源的羧酸还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述海洋分支杆菌来源的羧酸还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示；
所述诺卡氏菌来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；所述海洋分支杆菌来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示；所述枯草芽孢杆菌来源的磷酸泛酰氨基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.106所示；
所述内源性谷氨酸棒状杆菌5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.49所示；
所述内源性谷氨酸棒状杆菌S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示；
所述内源性谷氨酸棒状杆菌高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.51所示；
所述内源性谷氨酸棒状杆菌腺苷高半胱氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.52所示。
3.根据权利要求2所述的一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌，其特征在于，
所述外源性转酮酶基因来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288C或枯草芽孢杆菌168；所述来源于大肠杆菌K12的转酮酶基因：Gene ID: 947420；所述来源于酿酒酵母S288C的转酮酶基因：Gene ID: 856188；所述来源于枯草芽孢杆菌168的转酮酶基因：Gene ID: 937377；
所述外源性3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288C或枯草芽孢杆菌168；所述来源于大肠杆菌K12的3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示；所述来源于酿酒酵母S288C的3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因：Gene ID: 852551；所述来源于枯草芽孢杆菌168的3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因：Gene ID: 937853；
所述外源性5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288C或枯草芽孢杆菌168；所述来源于大肠杆菌K12的5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因：Gene ID: 948323；所述来源于酿酒酵母S288C的5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因：Gene ID: 856825；所述来源于枯草芽孢杆菌168的5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因：Gene ID: 936480；
所述外源性S-腺苷蛋氨酸合成酶基因来源于大肠杆菌K12、酿酒酵母S288C或枯草芽孢杆菌168；所述来源于大肠杆菌K12的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因：Gene ID: 948323；所述来源于酿酒酵母S288C的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因：Gene ID: 852113；所述来源于枯草芽孢杆菌168的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因：Gene ID: 937090；
所述外源性高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因来源于酿酒酵母S288C或枯草芽孢杆菌168；所述来源于酿酒酵母S288C的高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因：Gene ID: 855444；所述来源于枯草芽孢杆菌168的高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因：Gene ID: 939083。
4.根据权利要求3所述的一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌，其特征在于，
所述外源性转酮酶基因来源于大肠杆菌K12；
所述外源性3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合成酶基因来源于大肠杆菌K12；
所述O-甲基转移酶基因来源于大鼠；
所述羧酸还原酶基因来源于诺卡氏菌；
所述磷酸泛酰氨基转移酶基因来源于海洋分支杆菌；
所述5-甲基四氢三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌；
所述S-腺苷蛋氨酸合成酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌；
所述高丝氨酸-O-乙酰转移酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌；
所述腺苷高半胱氨酸酶基因来源于内源性谷氨酸棒状杆菌。
5.一种以葡萄糖为底物从头合成香兰素的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032为出发菌株，敲除pcaHG、van、vdh和fud基因，获得改造的谷氨酸棒状杆菌；
（2）在改造的谷氨酸棒状杆菌中表达权利要求1中所述的香兰素合成模块和甲基循环再生模块。
6.权利要求1-4任一项所述的基因工程菌或权利要求5所述的方法在生产香兰素中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的基因工程菌或权利要求5所述的方法在提高香兰素产量中的应用。
8.一种生产香兰素的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的基因工程菌或权利要求5所述方法构建的基因工程菌进行发酵。
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