KR20130034116A

KR20130034116A - 형절전환체를 이용한 클로로겐산의 합성

Info

Publication number: KR20130034116A
Application number: KR1020110097969A
Authority: KR
Inventors: 안중훈; 정우담; 김봉규
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2013-04-05
Also published as: KR101279092B1

Abstract

본 발명은 식물 및 미생물에서 분리한 유전자를 대사조절된 대장균에서 발현하여 chlorogenic acid유도체를 합성하는 것이다.

Description

형절전환체를 이용한 클로로겐산의 합성{Synthesis of chlorogenic acid using transformant}

본 발명은 대장균을 이용한 chlorogenic acid의 합성 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 식물에서 클로닝한 4-courmoyl-CoA ligase (4-CL)과 hydroxycinnamoyl/quinic acid transferase (HQT)와 대장균에서 분리한 quinate/shikimate 5-dehydrogenase (ydiB)을 이용하여 대사조절된 대장균에서 이들을 발현시켜 caffeic acid로부터 chlorogenic acid를 합성하는 것에 관한 것이다.

일반적으로 효소학적 합성 방법은 화학적 합성법으로 물질을 변형하기 어려운 위치 선택성과 키랄 선택성을 가지기 때문에 화학적 합성법에 비하여 여러 가지 장점을 가지고 있다.

배양방법과 유전자 조작기술이 잘 확립되어 있는 대장균과 효모와 같은 미생물을 이용하여 유용한 유전자를 이들에 도입함으로써 천연물을 효소학적으로 변형할 수 있는 유용한 도구로 이러한 것은 생물전환(biotransformation)법으로 알려져 있다. 생물전환법을 이용하면 반응중간에 들어가는 값 비싼 cofactor을 절약 할 수 있는 장점 가지고 있다.

새로운 의약 후보물질로 많은 관심을 불러일으키고 있는 폴리페놀 화합물 중 chlorogenic acid는 항산화 작용, 항바이러스, 항세균, 항 균 2 형 당뇨병과 심혈관 질환의 방지등과 같은 여러 가지 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있다 (Paynter, Nina. P.; Yeh, H.C.; Voutilainen, S.; Schmidt, M.I.; Heiss, G.; Folsom, A.R.; Brancati, F.L.; Kao, W. H. L. (2006). "Coffee and Sweetened Beverage Consumption and the Risk of Type 2 Diabetes Mellitus". American Journal of Epidemiology, 164 (11): 1075-1084; Lincoln W. Morton; Rima Abu-Amsha Caccettah; Ian B. Puddey and Kevin D. Croft (2000). "Chemistry And Biological Effects Of Dietary Phenolic Compounds: Relevance To Cardiovascular Disease". Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 27 (3): 152-159;Jassim, S.A.A; Naji, M.A. (2003). "Novel antiviral agents: a medicinal plant perspective". Journal of Applied Microbiology 95 (3): 412-427;de Sotillo, D.R.; Hadley, M.; Wolf-Hall, C. (1998). "Potato Peel Extract a Nonmutagenic Antioxidant with Potential Antimicrobial Activity". Journal of Food Science 63 (5): 907;Bowels, Bobby L.; Miller, A.J. (1994). "Caffeic Acid Activity Against Clostridium botulinum Spores". Journal of Food Science. 59 (4): 905)

chlorogenic acid는 토마토, 감자와 같은 가지과 식물에 제한적으로 존재하고 있는 것으로 보고되고 있으며, 또한 기존의 화학적인 방법을 이용해서 합성하는 것은 어려움이 있어서 대장균을 이용한 생물학적 합성은 chlorogenic acid을 대량으로 생산할 수 있는 새로운 방법이 될 수 있을 것이다.

클로로제닉산 또는 그 배당체의 제조방법과 관련된 선행특허로는 대한민국 특허공개번호 제10-2010-0081753는 클로로제닉산 배당체의 제조방법에 관한 것으로, 글루칸수크라제를 이용하여 클로로제닉산에 당을 전이하여 그 유사체들을 제조하는 방법과 이로부터 제조된 당전이 유사체 및 그 특성에 관한 것으로, 0.1-1M 농도의 설탕이 함유된 용액에 상기 글루칸수크라제를 첨가한 다음, 이를 28℃의 반응기에서 클로로제닉산과 반응시킴으로써 설탕의 글루코오스를 전이하여 상기 물질의 유사체들을 생성하는 단계; 및 상기 방법으로부터 제조된 상기 유사체들에 관한 것으로 제공된다고 기재되어 있으며, 이와 같이 합성된 당전이 유사체들은 반응 전에 비해 항산화 및 항암활성이 증가되고 용해도 및 기호도가 증가되어, 식품, 화장품 및 의약품산업 등의 조성물로 유용하게 사용될 수 있다고 기재되어 있다.

또 다른 선행특허로는 대한민국 특허공개번호 제10-2007-0107086호는 클로로겐산류 조성물의 제조 방법은 클로로겐산류를 고농도로 함유하고, 카페인을 저감시킨 클로로겐산류 조성물을 고수율로 얻는 방법이 기재되어 있으며, 생 커피 원두 또는 배전 커피 원두로부터 추출된 수용성 조성물을 흡착제가 충전된 칼럼에 흡착시키고, 이어서 0.5 ～ 20 vol% 의 에탄올 수용액을 통액하여 용출시키는 것을 특징으로 하는 클로로겐산류 조성물의 제조 방법이 기재되어 있다.

그러나 생물전환(biotransformation)법을 이용한 chlorogenic acid를 대량 생산할 수 있는 방법에 대해서는 선행기술로 공개되지 아니하여 이들에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 chlorogenic acid를 대량 생산할 수 있는 새로운 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 생물전환(biotransformation)법을 이용한 chlorogenic acid를 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생물전환(biotransformation)법을 이용한 chlorogenic acid를 대량 생산할 수 있는 방법에 사용될 수 있는 재조합벡터를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 담배에서 유래한 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 유전자 및 벼에서 유래한 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 유전자는 서열번호 7에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 7에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 유전자에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈 유전자는 서열번호 8에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제너러시를 고려하여 상기 서열번호 8에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈 유전자에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2의 개열 지도를 갖는 재조합 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 벡터 및 대장균으로부터 유래한 서열번호 9에 기재된 퀸산(quinate)/시킴산(shikimate) 5-탈수소효소 유전자가 삽입된 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 형질전환체는 3-디하이드로퀸산 탈수효소(dehydroquinate dehydratase)가 결손된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질 전환체는 대한민국 수원시 서둔동 소재 국립농업과학원 산하 농업유전자원센터(KACC)에 기탁번호 KACC 91664P로 2011년 9월 22일에 기탁한 형질 전환체 E. coli BL21(DE3)- △aroD인 형질전환체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 대장균에서 3-디하이드로퀸산 탈수효소를 결손시키고, 상기 결손된 대장균에 상기 본 발명의 재조합 벡터 및 대장균으로부터 유래한 서열번호 9에 기재된 퀸산(quinate)/시킴산(shikimate) 5-탈수소효소 유전자가 삽입된 재조합벡터를 형질전환시키는 단계를 포함하는 대장균 형질전환체의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체를 퀸산을 기질로 사용하여 배양하여 퀸산으로부터 클로로겐산을 생물학적으로 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환체를 포함하는 클로로겐산 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 클로로겐산 생성용 조성물은 예를 들어 상기 형질전환체를 배양하여 클로로겐산을 생성하는데 적합한 폴리펩타이드, 브로쓰, 세포 용해물, 정제 또는 정제되지 않은 효소 추출물 또는 폴리펩타이드 등을 포함한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주로서는, 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속,랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움( Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터( Enterobacter)속, 리조비움( Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속,아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움 (Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다.

예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 담배에서 유래한 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 유전자 및 벼에서 유래한 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 대장균 클로닝 벡터인 pACYC-Duet (Novagen) 등을 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

프로모터는 숙주속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J.Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 포함한다.

또 본 발명에 관한 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 및 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈 효소의 제조는 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 및 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈를 생성축적시켜, 배양물로부터 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,NB배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 및 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈를 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙,효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는,예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 및 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈의 취득은 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출,친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 및 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈의 생산과 균체 내에의 축적, 및, 균체로부터의 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 및 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 chlorogenic acid의 생합성에 필요한 유전자를 대사조절된 대장균에서 과발현시켜 chlorogenic acid를 대량 생산할 수 있는 새로운 대장균을 개발하는 것이다. 이 목적을 달성하기 위하여 클로닝한 유전자들을 대장균 돌연변이체 도입하여 새로운 "microbial factory"를 이용하여 chlorogenic acid를 생산하는 것이다.

본 발명은 벼에서 클로닝한 4CL유전자를 이용하여 caffeic acid를 caffeoyl-CoA로 전환하고 이를 담배에서 클로닝한 HQT가 ydiB유전자를 통해 대장균에서 집적되는 quinic acid에 결합하여 chlorogenic acid를 만든다. 이때 ydiB의 기질인 dehyroquinic acid의 집적을 위해 대장균의 aroD유전자를 deletion하였다.

본 발명자들은 담배에서 hydroxycinnamoyl/quinic acid transferase (HQT)유전자의 분리, 벼에서 4-courmoyl-CoA ligase (4-CL)의 분리 및 이들을 대장균 발현 벡터에 클로닝 그리고 대장균에서 ydiB 분리하여 대장균발현 벡터에 클로닝한다. 또한, dehydroquinic acid의 집적을 위해 대장균의 aroD (3-dehydroquinate dehydratase)를 deletion한다. 이 대장균에 위에서 클로닝한 세 개의 유전자들을 도입하여 caffeic acid로부터 chlorogenic acid의 생합성을 실시하였다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이,본 발명자들은 chlorogenic acid의 생합성에 필요한 유전자를 대사조절된 대장균에서 과발현시켜 chlorogenic acid를 대량 생산할 수 있는 새로운 대장균을 개발하고 이 새로운 "microbial factory"를 이용하여 chlorogenic acid를 생산하였다.

도 1은 본 발명의 대표적인 반응을 나타낸 그림.
도 2는 재조합 plasmid pACYC-R4CL/HQT 구축도,
도 3은 재조합 plasmid pCDF-ydiB 구축도,
도 4는 상단 그래프부터 하단으로 각각 Caffeic acid(S1), chlorogenic acid(S2), 및 R4CL 및 THQT를 가지는 BL21 △ aroD를 이용한 반응 산물의 HPLC 프로파일을 나타낸 그래프.
도 5는 wild type E. coli BL21 (DE3)에서 이들을 발현시킨 것 보다 aroD를 deletion 시킨 대사 조절된 대장균에서 chlorogenic acid의 생산량이 17.5배 증가함을 확인한 그림이다.
도 6은 대사 조절된 대장균에서 quinic acid 함량 증가를 나타내는 그림.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: HQT ( hydroxycinnamoyl CoA quinic acid transferase ) 및 4 CL 유전자의 분리

약 30일 정도 자란 담배의 전체 식물체 1g을 액체질소로 곱게 갈아 total RNA를 plant total RNA isolation kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 분리하였다. 분리한 total RNA 5 ug를 사용하여 oligo dT를 시발물질(primer)로 하여 Ominscript reverse transcriptase (Qiagen, Germany)를 이용하여 역전사를 실시하여 cDNA를 합성하였다. Total cDNA를 주형으로 담배에서 얻은 염기 서열[GenBank accession number AJ582651)을 바탕으로 만든 프라이머는 이용하여 중합효소연쇄반응 (PCR, polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. 이 때 사용된 염기 서열은 다음과 같다.

서열번호 1. 5'GATATCCATGGGAAGTGAAAAAATGATGA-3'(EcoRV site에 밑줄침)

서열번호 2. 5'GGTACCTCAAAATTCATACAAATACTT-3'(KpnI site에 밑줄침)

PCR은 Hotstart Taq 폴리머라제(Qiagen)를 위의 역전사체와 프라이머들은 혼합하여 94℃ 60sec. 55℃ 60sec, 72℃ 90sec의 사이클을 40회 반복하여 약 1.3kbp 에 해당되는 HQT 유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 제한효소 EcoRV와 KpnI으로 절단한 후에 대장균 클로닝 벡터인 pACYC-Duet (Novagen)의 EcoRV/KpnI site에 클로닝한 후 염기서열을 결정하였다. 담배에서 분리한 HQT가 클로닝된 벡터에 기존에 분리해 놓았던 벼의 4CL (R4CL, GenBank Accession number BAD27987)유전자를 BamHI/NotI site에 클로닝 하였다. 이렇게 만들어진 construct를 pACYC-R4CL/HCT라 명명하였다.

실시예 2: ydiB ( quinate / shikimate 5- dehydrogenase ) 유전자의 분리

대장균의 BL21 DE3의 genomic DNA를 template로 하여 대장균의 ydiB유전자의 염기서열[GenBank accession number AM946981.2]을 바탕으로 만든 프라이머는 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR, polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. 이 때 사용된 염기 서열은 다음과 같다.

서열번호 3. 5'ATGAATTCgATGGATGTTACCGCAAAATAC-3'(EcoRI site에 밑줄)

서열번호 4. 5'GCGGCCGCTCAGGCACCGAACCCCATG-3'(NotI site에 밑줄)

PCR은 Taq 폴리머라제(Taq DNA polymerase)를 위의 역전사체와 프라이머들은 혼합하여 94℃, 60sec. 55℃, 60sec, 72℃, 90sec의 사이클을 30회 반복하여 약 0.8kbp에 해당되는 ydiB유전자를 증폭하였다. 증폭된 DNA는 EcoRI과 NotI으로 절단한 후에 대장균 클로닝 벡터인 pCDF-Duet의 EcoRI/NotI에 클로닝한 후에 염기서열을 결정하였다. 만들어진 construct를 pCDF-ydiB라 불렀다.

실시예 3: HCT 의 발현 및 생물전환방법을 이용한 새로운 물질 생산

pACYC-R4CL/HQT와 pCDF-ydiB을 E. coli BL21(DE3)에 형질 전환한 후 형질전환체를 50 ㎍/ml 클로람페니콜과 50 ㎍/ml 스펙트로마이신을 첨가하여 LB배지에 seed culture하였다. 밤샘 배양한 seed culture대장균은 항생제가 함유된 새로운 LB배지에 접종하였다. 대장균을 600 nm에서 흡광도가 0.6 까지 될 때까지 배양하였다. 배양된 대장균에 IPTG를 1mM로 첨가해 주고, 18℃에서 20시간 동안 단백질을 발현시켰다. 배양된 대장균은 원심분리를 하여 상등액을 버리고, 회수된 대장균은 50 ㎍/ml 클로람페니콜, 50 ㎍/ml 스펙트로마이신과 2% glucose 가 첨가된 M9 배지에 600nm에서 흡광도가 3이 되게 맞추었다.. 여기에 최종 농도가 1mM이 되게 기질을 첨가한 후 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 배양액은 100℃에서 3분 동안 끓인 후 13000 rpm에서 15분 원심분리하여 상등액만을 취하여 HPLC에서 분석하였다. HQT가 형질전환된 대장균을 이용하여 quinic acid을 기질로 생물전환을 실시 한 결과 도 1에 기재된 반응 결과물이 생성되었다.

실시예 4: 대사조절된 대장균을 이용한 생산량 증대

대장균에서 quinic acid의 함량을 증가시키기 위해 생합성에 관련하는 유전자 aroD(3-dehydroquinate dehydratase)를 deletion하였다. aroD유전자를 deletion하면 quinic acid의 전구물질인 dehydroquinic acid가 축적되어 이렇게 축척된 dehydroquinic acid는 유전자 ydiB에 의해서 만들어지는 quinate/shikimate 5-dehydrogenase에 의해서 quinic acid로 전환되어 chlorogenic acid에 사용이 된다. aroD 결손 대장균을 만들기 위해서 GENE BRIDGES사의 Quick and Easy E. coli Gene Deletion Kit를 사용하여 제작하였다. 여기에 사용된 프라이머는 다음과 같다.

Forward primer(서열번호 5)

5'-TGGGGTTCGGTGCCTGACAGGCTGACCGCGTGCAGAAAGGGTAAAAAATGAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3'

Reverse primer(서열번호 6)

5'-GGGAGGATATTCCCGCCGAAATATTATTGCTTATGCCTGATGTAAAATAGTTAATACGACTCACTATAGGGCTC-3'

aroD가 결손된 대장균에서 pACYC-R4CL/HQT와 pCDF-ydiB를 발현시킨 결과 wild type E. coli BL21 (DE3)에서 이들을 발현시킨 것 보다 aroD를 deletion 시킨 대사 조절된 대장균에서 chlorogenic acid의 생산량이 17.5배 증가함을 알 수 있었다(도 5). 이 방법으로 252.5 mg/L의 chlorogenic acid를 만들 수 있었다(도 6).

농업생명공학연구원

KACC91664

20110922

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Synthesis of chlorogenic acid using transformant <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gatatccatg ggaagtgaaa aaatgatga 29 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtacctcaa aattcataca aatactt 27 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgaattcga tggatgttac cgcaaaatac 30 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcggccgctc aggcaccgaa ccccatg 27 <210> 5 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggggttcgg tgcctgacag gctgaccgcg tgcagaaagg gtaaaaaatg aattaaccct 60 cactaaaggg cg 72 <210> 6 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggaggatat tcccgccgaa atattattgc ttatgcctga tgtaaaatag ttaatacgac 60 tcactatagg gctc 74 <210> 7 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hydroxycinnamoyl CoA quinic acid transferase <400> 7 atgggaagtg aaaaaatgat gaaaattaat atcaaggaat caacattagt aaaaccatca 60 aaaccaacac caacaaaaag actttggagt tctaacttag atttaatagt gggaagaatt 120 catcttttaa cagtatattt ctataaacca aatggatctt caaatttctt tgattcaaaa 180 ataatgaaag aagcattaag taatgttctt gtttcatttt acccaatggc tggaagatta 240 gctagagatg aacaaggaag aattgagata aattgtaatg gagaaggagt tttatttgtt 300 gaagctgaaa gtgatgcttt tgttgatgat tttggtgatt ttactccaag tttggaactt 360 aggaaactta ttcctactgt tgacacttct ggtgatattt ctactttccc cctcatcatc 420 tttcaggtta ctcgtttcaa atgtggtgga gtttcacttg gtggaggagt attccacact 480 ttatcagatg gtctctcatc aattcacttc atcaacacat ggtccgatat agcccgaggc 540 ctctccgtcg ccatcccgcc gttcatcgac cggaccctcc tccgtgcacg ggacccacca 600 acatcgtctt tcgagcacgt cgagtatcat cctcctccat ctctaatttc atcatcaaaa 660 agcttagaat ccactagccc aaagcctagt accacaacca tgttaaaatt ctctagtgac 720 caacttgggc ttctaaagtc caagtccaaa catgatggta gcacttacga aatcctcgcg 780 gcccatattt ggcgttgcac gtgcaaggca 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ccccgagttc gccttctcct tcctcggcgc ggccaggctg 300 ggcgccgcca ccacgacggc gaacccgttc tacacgccgc acgaggtcca ccgccaggcg 360 gaggccgcgg gcgccagggt gatcgtcacc gaggcgtgcg ccgtcgagaa ggtgcgggag 420 ttcgccgcgg agaggggcgt ccccgtggtc accgtggacg gcgcgttcga cggctgcgtg 480 gagttccgcg aggtgctcgc cgcggaggag ctcgacgccg acgccgacgt ccaccccgac 540 gacgtcgtcg ccctccccta ctcctccggc accaccggcc tccccaaggg cgtcatgctc 600 acccaccgca gcctcatcac cagcgtcgcc cagcaggtgg atggagagaa ccctaacctg 660 tacttcagca aggatgatgt tatactatgc ctgctgccac tgttccacat ctactcgctc 720 aactccgtgc tgctggctgg cctgcgtgcc gggtcgacca tcgtgatcat gcggaagttt 780 gatcttggcg cgctcgtcga ccttgtgcgc aagcacaaca tcaccatcgc ccccttcgtg 840 ccccccatcg tggtggagat cgccaagagc ccccgcgtca ccgcggagga cctcgcctcc 900 atccgcatgg tcatgtccgg tgccgcgccc atggggaagg accttcagga tgcattcatg 960 gccaagatcc ccaatgccgt cctcggacag ggttacggta tgactgaggc tgggccagtg 1020 ctggcaatgt gcctggcgtt tgccaaggag cccttcaagg ttaagtccgg gtcgtgcggt 1080 acagtggtgc gcaacgcgga gctgaagatc gtcgaccccg acaccggcac ctccctcggc 1140 cggaaccagt ccggcgagat ctgcatccgc ggagaacaga tcatgaaagg ctatctgaat 1200 gatcctgagg cgaccaagaa caccatcgac gaggacgggt ggctgcacac cggagacatc 1260 ggcttcgtcg acgacgacga cgagatcttc atcgtggaca ggctcaagga gatcatcaag 1320 tacaaggggt tccaggtgcc accggccgag ctggaggcgc tgctcatcac tcacccggag 1380 atcaaggacg ccgccgtcgt ctcgatgaag gatgatcttg ccggtgaagt gccagtcgcc 1440 ttcattgtcc ggacagaagg ctcagaaatc accgaggatg agatcaagaa attcgttgca 1500 aaagaggtgg tgttctacaa gaggatcaac aaggtgttct tcaccgattc catccccaag 1560 aacccttccg gcaagatcct caggaaggac ttgagagcca ggctcgccgc cggcatcccc 1620 gacgccgtcg ccgccgccgc cgccgatgcg cccaaaagca gc 1662 <210> 9 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> quinate/shikimate 5-dehydrogenase <400> 9 atggatgtta ccgcaaaata cgaattgatt gggttgatgg cttatcctat ccgccacagt 60 ttatcgcctg aaatgcagaa taaagcctta gaaaaagcgg gattgccatt tacctatatg 120 gccttcgaag tggataacga tagctttccc ggagcaattg aaggattaaa agctctaaaa 180 atgcgcggaa ctggtgtatc aatgccgaac aaacaactgg cgtgtgaata tgttgatgaa 240 ttaacgccag cagccaaact ggtgggtgcc atcaacacca tcgttaatga tgatggctac 300 ctgcgcggct ataacaccga cggcacgggc catattcgag ccattaaaga gagcggtttt 360 gatatcaaag gcaaaacaat ggtgctgtta ggggccggag gtgcctcaac ggcgattggc 420 gcgcaggggg caattgaagg tttaaaagaa attaaactct ttaaccgtcg ggatgagttc 480 ttcgataaag ccctcgcctt cgcgcagcgg gttaacgaaa acaccgattg tgtcgtcacg 540 gttaccgatc tcgccgatca gcaagccttt gctgaagccc tggcttccgc cgacatttta 600 accaatggca caaaagtggg tatgaaaccc cttgagaatg aatcattggt taatgatatc 660 agtctgttac atccgggact gctggtcact gaatgcgtgt ataacccgca tatgacgaag 720 ttattgcagc aggcgcaaca agctggttgc aaaacgattg atggatacgg catgttgttg 780 tggcaagggg ctgaacagtt cacgttatgg actggcaaag atttccctct ggaatatgtt 840 aaacaggtca tggggttcgg tgcctga 867

Claims

담배에서 유래한 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 유전자 및 벼에서 유래한 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈 유전자가 삽입된 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 담배에서 유래한 하이드록시시나모일(hydroxycinnamoyl) CoA 퀸산(quinic acid) 트랜스퍼레이즈(HQT) 유전자는 서열번호 7에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 벼에서 유래한 4-코모일(courmoyl)-CoA 라이게이즈 유전자는 서열번호 8에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 1항의 재조합 벡터 및 대장균으로부터 유래한 서열번호 9에 기재된 퀸산(quinate)/시킴산(shikimate) 5-탈수소효소 유전자가 삽입된 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 5항에 있어서, 상기의 형질전환체는 3-디하이드로퀸산 탈수효소(dehydroquinate dehydratase)가 결손된 것을 특징으로 하는 대장균 형질전환체.
제 5항 또는 제6항에 있어서, 상기 형질전환체는 E. coli BL21(DE3)-△aroD KACC 91664P 형질전환체.
대장균에서 3-디하이드로퀸산 탈수효소를 결손시키고, 상기 결손된 대장균에 제1항의 재조합 벡터 및 대장균으로부터 유래한 서열번호 9에 기재된 퀸산(quinate)/시킴산(shikimate) 5-탈수소효소 유전자가 삽입된 재조합벡터를 형질전환시키는 단계를 포함하는 대장균 형질전환체의 제조방법.
제 5항 또는 제6항의 형질전환체를 퀸산을 기질로 사용하여 배양하여 퀸산으로부터 클로로겐산을 생물학적으로 생산하는 방법.
제 5항 또는 제6항의 형질전환체를 포함하는 클로로겐산 생산용 조성물.