CN105283547A - 用于生物合成生产的重组宿主细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成，该多酶复合体包括用于香豆酸和巴豆酸酶的生物合成的酶。

Description

用于生物合成生产的重组宿主细胞
发明领域
本发明涉及一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径，并且涉及其在香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成中用途。
背景技术
香草醛是在食品、饮料、香料和药物中的最重要的芳香风味化合物之一。从兰科扁叶香果兰(Vanillaplanifolia)豆中提取的天然香草醛是相当昂贵的。香草豆的生产是一个漫长的过程，其高度依赖于适合的土壤和气候条件。在4-5年的栽培后豆子出现并且该芳香在需要6个月的所谓的“固化”的长时间过程后在水果中发育出。消费者对天然香草醛的需求高度超过对通过植物源提取的香草醛的量。少于5％的全世界香草醛生产来自天然香草。由于天然香草提取物的稀缺和费用，长期以来已经存在合成制备其主要成分的关注。香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲-醛)是香草风味的主要感官成分。
因为对香草醛的需求高于可从兰科扁叶香果兰豆中提取的，所以其余部分通过可替代的方式产生。化学合成是香草醛的最重要来源。香草醛首先是从发现于丁子香的油中的丁香酚合成的并且后来从包含亚硫酸盐液体的木质素中合成的，该木质素是一种在纸张生产中木浆加工的副产物。尽管一些香草醛仍然由木质素废弃物制备，现今大部分合成的香草醛以一个两步法从石油化学的前体：愈创木酚和乙醛酸合成。香草醛也可通过姜黄素、丁香酚或胡椒碱的分子断裂化学地产生。
天然和合成的香草醛的价格之间的大差异、增加的消费者导向的对“天然的”和“健康的”香料需求、以及对“天然的”市场要求的服务已经导致对香料工业日益增长的关注以从其他天然来源通过生物转化1,2,3,4,5产生天然香草醛。微生物细胞和其他的酶在精细化学品的合成中作为生物催化剂的使用已经在绿色化学和白色生物技术中备受关注。由于欧洲社会法律，此类生物转化的产物被认为是天然的(包含在术语“天然产物”下通过活细胞或它们的酶从生物源产生的产物。
用于生产的可替代的基于生物技术的方法是基于木质素、二苯乙烯型酚、异丁子香酚、丁香酚、阿魏酸或芳香族氨基酸的生物转化，并且基于从头生物合成、应用真菌、细菌、植物细胞或基因工程微生物。虽然经由异丁子香酚的转化的香草醛生产已经在各种微生物中广泛被报道，包括黑曲霉6；克雷白氏菌属、肠杆菌属和沙雷氏菌属的菌株7；玫瑰色红球菌8；枯草芽孢杆菌B29；梭形芽孢杆菌10；枯草芽孢杆菌HS811；硝基还原假单胞菌12；恶臭假单胞菌13；绿针假单胞菌14；短小芽孢杆菌15；以及伊文思诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)16。最近描述了使用代谢工程化酵母菌株从葡萄糖从头合成17。
酿酒酵母是一种有用的细胞，工厂依赖其生产高价值工业生物技术产品。它非常适合于生物精炼工艺，归因于其细胞-再利用发酵和其对抗各种压力(诸如低pH、高温和各种抑制剂18)的非凡耐受性的能力。此外，酿酒酵母是一种被极好地表征的促进代谢工程19的模式生物，20归因于全基因组序列的可得性和代谢途径的详细表征21。
US6372461B1描述了香草醛通过需要五种由重组微生物提供的酶的微生物-催化转化步骤从碳源的合成以及酶-催化的还原步骤以通过芳基-醛脱氢酶还原香草酸。
EP2388333A2描述了一种能够生产香草醛的微生物细胞，包括至少三种异源酶活性，即3-脱氢莽草酸脱水酶、芳香族羧酸还原酶和3O-甲基转移酶活性。
WO2011124693A1描述了通过部分同源的体内重组产生基因嵌合体的方法，由此可以构建在自然界中不存在的代谢途径。
US2003/070188A1描述了香草醛的生物合成途径，该生物合成途径包括p-香豆酸向p-羟基苯甲醛的转化以及在具有改善的香草醛生产的经培养的扁叶香果兰(Vanillaplanifolia)或转基因细胞和植物中的香草醛生产。
汉森(Hansen)等人(《应用与环境微生物学》(ApplEnvironMicrobiol.)2009；75(9):2765-2774)描述了香草醛在裂殖酵母(粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))和面包酵母((Saccharmomycescerevisiae))中的从头生物合成。这些工程化途径用去氢莽草酸作为底物起始。
迪吉奥亚(DiGioia)等人(《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)2011；156:309-316)描述了荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)用于从阿魏酸生产香草醛的代谢工程。
布罗查多(Brochado)等人(微生物细胞工厂(MicrobialCellFactories)2010；9:84)描述了通过计算机模拟设计改善的香草醛在面包酵母中的生产。
普里费尔(Priefert)等人(《应用微生物生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)2001；56:296-314)描述了香草醛的生物技术生产和基于木质素、二苯乙烯型酚、异丁子香酚、丁香酚、阿魏酸或芳香族氨基酸的生物转化的不同生物合成途径。
考尔(Kaur)等人(《应用生物化学与微生物》(Appl.Biochem.Microbiol.)2013；169:1353-1372)提供了用于香草醛生产的生物技术和分子方法的综述。
发明概述
本发明的目的是引入一种酶或途径至宿主细胞中通过在宿主细胞中的生物合成提供一种增强的或新的香草醛形成能力。
该目的通过本发明的主体来解决。
根据本发明，提供了一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成，该多酶复合体包括用于香豆酸和巴豆酸酶的生物合成的酶。在此，香豆酸被具体地理解为p-香豆酸。
具体而言，本发明提供一种细胞，该细胞包括编码一种多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成，该多酶复合体包括用于香豆酸的生物合成的以下各项酶，这些酶包括苯丙氨酸氨解酶(PAL)、酪氨酸氨解酶(TAL)或苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶(PAL/TAL)中的任一种，以及任选地一种或多种另外的酶以将芳香族氨基酸转化为香豆酸，其中该多酶复合体进一步包括将香豆酸转化为香草醛或其羟基苯甲醛前体的酶，包括巴豆酸酶。
该香草素或羟醛前体可以在商业上如此使用，例如作为终端产物，或作为中间体例如以使用该中间体作为前体进一步产生衍生物或终端产物。
根据一个具体方面，该多酶复合体包括至少所有如用于使用香豆酸作为前体的香草醛生物合成所必要的酶，或如香草醛的生物合成或来自碳源的香草醛生物合成途径的中间体或代谢物的所有酶，例如转化为香草醛所必要的那些酶，例如在此所述的那些酶。
根据另外的具体方面，该多酶复合体包括至少所有使用芳香族氨基酸作为前体用于香豆酸的生物合成的酶，至少用于转化为香豆酸所必要的那些，例如在此所述的那些。
具体地，该多酶复合体包括苯丙氨酸氨解酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、细胞色素P450还原酶(CPR)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
根据一个另外的具体方面，该多酶复合体包括酪氨酸氨解酶(TAL)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
根据另一个具体方面，该多酶复合体包括苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶(PAL/TAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、细胞色素P450还原酶(CPR)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
根据一个具体实施例，该多酶复合体包括辅酶A连接酶，优选4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)。
根据另一个具体实施例，该多酶复合体包括3-单加氧酶，优选酚羟化酶(PheA)和黄素还原酶(FLARED)或羟基苯甲酸羟化酶(HBH)。
根据另一个具体实施例，该多酶复合体包括甲基转移酶，优选O-甲基转移酶，优选3-O-甲基转移酶或4-O-甲基转移酶，优选咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)。
根据另一个具体实施例，该巴豆酸酶是烯酰-辅酶A水合酶(ECH)。
根据一个具体方面，该巴豆酸酶是一种负责p-香豆酰辅酶A和/或阿魏酰辅酶A的链还原反应的ECH。
根据一个具体方面，该巴豆酸酶是一种将p-香豆酰辅酶A转化为4-羟基苯甲醛的ECH。
根据一个另外的具体方面，该巴豆酸酶是一种将阿魏酰辅酶A转化为香草醛的ECH。
根据一个具体方面，该细胞进一步包括
a)一种编码羧基还原酶(CAR)的异源多核苷酸，任选地连同一种编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)的多核苷酸；和/或
b)一种编码醇氧化酶、优选地香草醇氧化酶的异源多核苷酸(VAO)。
根据一个具体实施例，这些多核苷酸编码一系列由单个多顺反子操纵子表达的酶，或编码一系列的由分离的启动子表达的酶。
优选地，这些多核苷酸被稳定地整合至细胞基因组中。
该细胞可以是一种真核细胞或原核细胞，优选地选自下组，该组由以下各项组成：酵母、哺乳动物、昆虫、植物和细菌的细胞。
具体而言，该细胞是一种DNA修复缺陷型细胞，包括在错配修复(MMR)中的任何细胞缺陷或在DNA修复中的任何其他缺陷；或是一种生产细胞，包括在DNA修复缺陷型细胞中拼接的多核苷酸簇。
具体地，这些多核苷酸源自至少两种不同的物种。
根据一个具体方面，这些酶中的至少一个是一种嵌合酶。
根据本发明，具体地提供了这样一种细胞，该细胞包括一种包含编码参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成的至少五种酶、优选地至少六种酶、优选地至少七种酶的异源多核苷酸的多酶复合体，其中这些酶中的至少一个是一种嵌合酶。
在一个优选实施例中，该嵌合酶优选地是
a)由不同多核苷酸片段构成的核苷酸序列编码的，这些片段被拼接成一种嵌合核苷酸序列；和/或
b)由亲本多核苷酸中的一种或多种核苷酸的插入、缺失和/或替代而获得核苷酸序列编码的。
具体地，编码该嵌合酶的多核苷酸是由不同多核苷酸的片段构成的，优选地具有至少30％的序列一致性，其片段被拼接成一种嵌合的核苷酸序列。此外，这些片段可以任选地被诱变以包括衍生自一种或多种多核苷酸的突变序列，例如通过插入、缺失和/或替代一种或多种核苷酸来突变。
可替代地，编码该嵌合酶的多核苷酸是衍生自仅一个亲本多核苷酸及一个例如通过诱变、或通过插入、缺失和/或替代一种或多种核苷酸而获得的基因嵌合体。
根据本发明，进一步提供了一种通过将编码参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成的多酶复合体的异源多核苷酸引入至该细胞基因组中来工程化本发明的细胞的方法，该方法包括
a)提供编码个体酶的多核苷酸，任选地，其中这些多核苷酸中的至少一个是由不同多核苷酸的片段构成的，其片段被拼接为一种嵌合的核苷酸序列；
b)将这些多核苷酸拼接至簇中并且优选地通过体内重组将所述簇整合至该细胞基因组中；并且
c)任选地工程化一种生产细胞，其中将所述簇稳定地整合至该生产细胞基因组中。
具体地，至少两种不同的编码个体酶的多核苷酸以全长多核苷酸或其片段被提供，优选地具有至少30％的序列一致性，并且这些多核苷酸通过部分同源的体内重组被拼接和重组，从而产生一种具有至少一个交叉的嵌合的核苷酸序列，优选地一种基因嵌合体。
根据一个具体实施例，在一个单独的步骤程序中
a)将该细胞用所述全长的多核苷酸或片段的混合物进行转化；并且
b)将该嵌合的核苷酸序列在该细胞基因组的整合位点进行重组，
其中
i)所述多核苷酸的5’-末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所述整合位点的3’-端，并且
ii)所述多核苷酸的3’-末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所述整合位点的5’-端，
并且
c)选择包括一个基因嵌合体的克隆。
具体地，提供了一种方法，其中这些多核苷酸中的至少一个是由不同多核苷酸的片段构成的，其片段在一个单独的步骤程序中被拼接为一种嵌合的核苷酸序列，其中
a)将该细胞用所述多核苷酸进行转化；并且
b)将该嵌合的核苷酸序列在该细胞基因组的整合位点进行重组，
其中
i)所述多核苷酸的5’-末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所述整合位点的3’-端；并且
ii)所述多核苷酸的3’-末端序列具有一种侧翼的靶序列，该靶序列正锚定到所述整合位点的5’-端；
并且
c)选择包括一个基因嵌合体的克隆。
具体地，编码一系列至少两种酶的多核苷酸以全长多核苷酸或不同起源的片段被提供，其中
-该5’-末端序列是编码该系列中的第一个酶的多核苷酸的；并且
-该3’-末端序列是编码该系列中的最后一个酶的多核苷酸的。
具体地，这些多核苷酸编码一系列酶并且这些全长多核苷酸或片段中的至少一个是一种重组分子，该重组分子包括
a)一个5’-部分，其包括该系列中的第一个酶的核苷酸序列；
b)一个3’-部分，其包括该系列中的第二个酶的核苷酸序列；以及
c)在该5’-部分和该3’-部分之间的一个终止子序列和一个启动子序列。
具体地，提供了至少两种重组分子，其中第一个重组分子的3’-部分与第二个重组分子的5’-部分具有至少30％的序列同源性。
根据本发明，进一步提供了一种重组分子，该重组分子包括
a)一个5’-部分，其包括多酶复合体的一系列酶中的第一个酶的核苷酸序列；
b)一个3’-部分，其包括该系列中的第二个酶的核苷酸序列；并且
c)在该5’-部分和该3’-部分之间的一个终止子序列和一个启动子序列。
第一个和第二个酶可以是按照连续的酶促反应的顺序或不是，例如按照不同的顺序。
根据一个具体方面，该方法进一步包括生产细胞谱系，其在编码嵌合酶的基因嵌合体中彼此不同。
根据本发明，进一步提供了包括通过本发明的方法可获得的谱系的细胞文库，优选的是包括至少100个不同的克隆、优选地至少200、300、400、500、1.000、2.000、3.000、4.000、5.000，或至少10.000个克隆的文库。
根据本发明，进一步提供了本发明的方法，该方法进一步包括产生包括苯丙烷、羟基苯甲醛、香草素和/或香草醛生物合成的中间体的芳香族化合物的谱系。
根据本发明，进一步提供了产生一种芳香族化合物文库的方法，该芳香族化合物文库包括苯丙烷、羟基苯甲醛、香草素和/或其羟醛前体和/或香草醛生物合成的中间体，该方法包括
-提供本发明的一种文库，具体地是一种克隆的文库和/或一种芳香族化合物的文库，
-在初始前体化合物或一种或多种中间体前体化合物存在的情况下，培养所述文库以产生作为代谢物的多种芳香族化合物。
根据本发明,进一步提供了一种芳香族化合物文库，该芳香族化合物文库包括多种通过本发明的方法可获得的代谢物，其中至少一种代谢物是人工的代谢物或非天然发生的代谢物。
根据本发明，进一步提供了本发明的细胞用于代谢物的异源生物合成的用途。具体地，该产物是香草素或其羟基苯甲醛前体，优选地
-其中所述香草素选自下组，该组由以下各项组成：香草醛、香草酸、乙基-香草醛、香草醇和香草醛-糖苷；和/或
-其中所述羟基苯甲醛前体选自下组，该组由以下各项组成：原儿茶醛、原儿茶酸、儿茶醇、4-羟醛、4-羟基苯甲酸、4-羟基苄醇和咖啡酸。
根据本发明，进一步提供了一种通过利用参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成的多酶复合体转化一种前体化合物进行的香草素或其羟基苯甲醛前体的异源生物合成的方法，该多酶复合体包括用于香豆酸和巴豆酸酶的生物合成的酶，优选地使用香豆酸作为前体用于香草醛的生物合成的至少所有酶，该方法包括
-提供一种本发明的细胞；
-在该前体化合物存在的情况下，在细胞培养物中培养所述细胞；
-累积生物合成的产物；并且
-从该细胞培养基分离所述产物。
具体地，该多酶复合体包括
a)PAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
b)TAL、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
c)PAL/TAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
具体地，本发明进一步提供了一种如在此所定义的分离的多酶复合体，特别是一种包括以下项的多酶复合体
a)PAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
b)TAL、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
c)PAL/TAL、C4H、CPR、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
具体地，所述前体化合物是一种天然氨基酸，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸，优选苯丙氨酸或酪氨酸。
具体地，所述前体化合物是单糖，优选地选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、半乳糖或阿拉伯糖。
具体地，所述产物是一种
-香草素，选自下组，该组由以下各项组成：香草醛、香草酸、乙基-香草醛、香草醇和香草醛-糖苷；或者
-羟基苯甲醛前体，选自下组，该组由以下各项组成：原儿茶醛、原儿茶酸、儿茶醇、4-羟醛、4-羟基苯甲酸、4-羟基苄醇、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸。
根据一个具体方面，所述产物是香草醛或香草醛的一种前体，优选地通过生物合成(诸如通过体内反应)或化学反应(诸如通过体外反应)的酶法将其进一步加工以产生香草醛、或香草醛的衍生物，优选香草酸、乙基-香草醛或糖基-香草醛。
具体地，本发明的方法提供了针对所述产物的高产率生产，例如具有产率为至少10mg/L，优选地至少20mg/L、至少30mg/L、至少40mg/L、至少50mg/L、至少100mg/L或至少200mg/L的该产物，例如在该培养基中获得产物浓度。
附图
图1：香草醛生产细胞的合成途径。该图显示用以将苯丙氨酸转化为香草醛的示意图。苯丙氨酸经受若干反应：苯环的4-位的脱氨基作用、羟基化，苯环的3-位的还原链反应和羟基化，以及苯环的3-位的O-甲基化。CAR蛋白催化羧酸还原为其对应的醛。PPTase的作用是将磷酸泛酰巯基乙胺从辅酶A转移至其受体CAR蛋白上。巴豆酸酶指代将酰基-辅酶A上的第二和第三个碳之间的双键进行水合的一种酶。3-单加氧酶指代将一个羟基基团结合至苯环的3-位中的底物中的一种酶。O-甲基转移酶指代将甲基基团从供体转移至羟基受体的一种酶。
图2：用于将候选基团整合至酵母基因组中以便研究其功能性的策略。IF1包含在酵母染色体的BUD31区域中的5’-插入位点和URA标记的5’-端，IF2包含3’端URA标记和pGAL启动子。IF4包含tCYC终止子和LEU标记的5’端并且IF5包含LEU标记的3’-端和在BUD31区域中的3’-插入位点。将合成的基因从GeneArt质粒中扩增。用于扩增感兴趣的基因的上游寡核苷酸的5′-端包含具有与该pGAL1启动子的3’-端同源的40个核苷酸的序列。该下游寡核苷酸包含与该tCYC终止子的5’-端同源的40-nt序列。通过在酵母转化体中的同源重组拼接后，该双重选择允许该重组体分离。重组后，该基因具有允许其在酵母细胞中表达的一个启动子(pGAL)和一个终止子(tCYC)序列。
图3：由包含同源基因序列的片段进行的香草醛途径的拼接。这个图显示包括用于从苯丙氨酸起始的香草醛生产的6个基因的8个片段的共转化。URA3和LEU2是使得能够对重组途径进行双重选择的侧翼标记。将每个基因的生物体来源在该基因的名字后用三个字母来指示，该基因也以三个字母示出。将对应的生物体物种在左侧指示。
图4：Y00VAN上清液的紫外-可见光色谱图(290nm)。灰色线代表阴性对照菌株并且黑色线代表Y00VAN。通过将它们与我们的化合物文库相比较来鉴定峰值。1)3-4二羟基苯甲酸；2)香草醇；3)3-4二羟基苯甲醛；4)香草酸；5)香豆酸；6)4-羟基苯甲醛；7)香草醛
图5：香草酸和3-4二羟基苯甲酸在Y00VAN菌株中的累积。将培养进行60小时，然后收获细胞并且将上清液通过HPLC进行分析。使用校准用基准溶液来推断香草酸和3-4二羟基苯甲酸的浓度。该图显示在上清液中的香草酸和3-4二羟基苯甲酸依赖该生长条件的累积。
图6：CAR-PPTase-URA盒对ADH6基因的破坏。该图显示双顺反子构建至ADH6基因座的拼接和整合。该重组细胞Y0CP允许活性CAR蛋白的表达并且内源的ald6被钝化。
图7：香草醛途径的包含部分同源基因序列片段的拼接。这个图显示包括用于从苯丙氨酸起始的香草醛生产的6个基因的8个片段的共转化。基因PAL、C4H、ECH、HBH、COMT是具有给定同源度(少于99.5％)的相关的部分同源译本(homeologousversion)。HIS3和LEU2是使得能够在MMR缺陷型酵母中转化后对重组途径进行双重选择的侧翼标记。将每个基因的生物体来源在该基因的名字后用三个字母来指示，该基因也以三个字母示出。将对应的生物体物种在左侧指示。
图8：阿魏酸生产细胞的合成途径。该图显示用以将苯丙氨酸转化为阿魏酸的示意图。苯丙氨酸经受若干反应：苯环的3和4位的脱氨基作用、羟基化，以及苯环的3位的O-甲基化。
图9：PheA/Flared表达酵母的上清液的紫外-可见光色谱图(290nm)。PheA羟基化香豆酸导致咖啡酸产生。灰色线代表Y00对照菌株；黑色线代表表达PheA/flared的细胞并且用500μM香豆酸进料。
图10：阿魏酸途径的包含同源基因序列片段的拼接。该图显示包括用于从苯丙氨酸起始的阿魏酸生产的5个基因的7个片段的共转化。URA3和LEU2是使得能够对重组途径进行双重选择的侧翼标记。将每个基因的生物体来源在该基因的名字后用三个字母来指示，该基因也以三个字母示出。将对应的生物体物种在左侧指示。
图11：参与如在图3、6和9所描述的代谢途径的多酶复合体的示例性酶的氨基酸序列。
SEQID1：美洲黑杨(Populusdeltoids)的PAL
SEQID2：皱叶欧芹(Petroselinumcrispum)的PAL
SEQID3：大豆(Glycinemax)的C4H
SEQID4：皱叶欧芹(Petroselinumcrispum)的C4H
SEQID5：美洲黑杨(Populusdeltoids)的4CL
SEQID6：荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的ECH
SEQID7：棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)的ECH
SEQID8：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginos)的HBH
SEQID9：棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)的HBH
SEQID10：紫苜蓿(Medicagosativa)的COMT
SEQID11：扁叶香果兰(Vanillaplanifolia)的COMT
SEQID12：喜热噬油芽胞杆菌(Geobacillusthermoleovorans)的PheA
SEQID13：喜热噬油芽胞杆菌(Geobacillusthermoleovorans)的FLARED
SEQID14：伊文思诺卡氏菌(Nocardiaiowensis)的CAR
SEQID15：伊文思诺卡氏菌室温PPTase
SEQID48：简青霉(Penicilliumsimplicissimum)的VAO，P56216.1GI：3024813
图12：与对照菌株相比，Y00VANCP菌株中的香草醛和中间体代谢物的累积。将培养进行24小时，然后收获细胞并且将上清液通过HPLC进行分析。使用校准用基准溶液来推断代谢物的浓度。
图13：香草醛途径的包含同源基因序列片段的拼接。这个图显示包括用于从苯丙氨酸起始的香草醛生产的9个基因的8个片段的共转化。HIS3和LEU2是使得能够对重组途径进行双重选择的侧翼标记。将每个基因的生物体来源在该基因的名字后用三个字母来指示，该基因也以三个字母示出。将对应的生物体物种在左侧指示。
发明详细说明
相对于多核苷酸、基因或核酸，如在此所使用的术语“拼接”是指核苷酸序列的连接或接合，例如连接至少两种序列，诸如它们的基因或部分，以获得基因拼接。在一些实施例中，将线性合成核酸分子进行拼接。核酸分子可以作为线性核酸分子被提供或可以在体内被线性化或从较大的核酸分子切除。
通过基因或基因片段的拼接，可以获得一种呈单一核苷酸序列的复合基因或基因簇。将这些基因例如串联在一起，任选地具有重叠。如在此所述的拼接可以具体地包括一种或多种基因间和/或基因内的交叉或一种或多种基因嵌合体。
一种拼接的簇可以包含复制原点并且能够在宿主细胞中复制。在具体实施例中，将该拼接的簇插入至宿主细胞基因组中。遗传组件的拼接可以通过同源重组的重复循环或通过体内部分同源重组(诸如在此具体所述的)来实现。在不同的实施例中，一种拼接策略涉及重组或连续几轮的重组，并且可以涉及一种或多种选择性标记。在一些实施例中，另外的基因元件可以通过转染技术(诸如电穿孔)连续地引入至该宿主细胞中。又在另外的实施例中，可以进一步将基因元件引入至该簇或宿主细胞基因组例如启动子或终止子序列中。
如在此所使用的术语“细胞”，具体关于进行工程化及将基因的拼接簇引入至一种细胞或生产细胞，被理解为是指任何原核或真核细胞。根据本发明，原核生物的和真核生物的宿主细胞两者均被考虑用于使用，包括细菌宿主细胞，像大肠杆菌或芽孢杆菌属；酵母宿主细胞，诸如酿酒酵母；昆虫宿主细胞，诸如草地贪夜蛾；或人宿主细胞，例如海拉(HeLa)和尤尔卡特(Jurkat)。
优选的宿主细胞是单倍体细胞，诸如自念珠菌属(Candidasp)，毕赤酵母属(Pichiasp)和酵母菌属(Saccharomycessp)。
术语“细胞”应具体地包括一种单一细胞或在细胞培养物中培养的细胞，诸如细胞系。
根据本发明，任何野生型或修复缺陷型原核或真核细胞，包括具有核酸修复(诸如DNA或RNA修复)中的缺陷的那些，可以被用来拼接这些多核苷酸。在野生型细胞中，选择允许用于(部分同源的)重组的适合的整合位点。
如在此所使用的术语“DNA修复缺陷型细胞”应是指一种DNA修复缺陷型原核或真核细胞，具体是具有在核酸修复中的缺陷的那些，例如具有错配修复(MMR)系统的突变或修饰的那些，或具有其他修复缺陷系统诸如DNA修复基因(例如rad1、recQ)的完全或临时敲除的那些。在不是DNA修复缺陷型的细胞中，损伤和错配的DNA通常被修复并且部分同源序列的重组被抑制。MMR系统或其他DNA修复缺陷型系统的突变或修饰将会增强细胞中的重组频率，从而优选地被用来拼接和/或重组如在此所述的多核苷酸，例如由此拼接多核苷酸簇和/或提供具有基因嵌合体的嵌合核苷酸序列。
作为一个实例，错配修复可以完全地或暂时地被敲除，或可以通过添加特异的底物至该细胞培养基中来调节或诱导，其中在进行定向重组过程中或之后培养这些细胞。具体地，细胞的MMR缺陷可以通过任何瞬时或永久性损害错配修复的策略来实现，包括参与错配修复的基因的突变、用紫外线处理、用化学物质诸如2-氨基嘌呤处理、参与错配修复的基因例如通过将会允许瞬时失活和活化的可调控的启动子的诱导型表达或阻遏。
细菌的错配修复系统已经被广泛地研究。在其他系统例如酵母中，若干基因已经被鉴定，在酿酒酵母中，这些基因的产物与细菌的错配修复蛋白共有同源性，这些细菌的错配修复蛋白例如MutS蛋白的类似物，即Msh1、Msh2p、Msh3p、Msh4、Msh5、Msh6p，以及MutL蛋白的类似物，即Mlh1p、Mlh2p、Mlh3p和Pms1。
对于优选的错配修复缺陷型细胞的实例是特定的酵母细胞，诸如具有缺陷或(暂时)失活的MSH2的酿酒酵母菌株，例如工程化的W303、BY、SKl菌株诸如MXY47(具有经破坏的MSH2的W303)菌株。
MMR的另外优选的系统是众所周知的细菌菌株的选择，诸如US5912119中所述的那些，像例如mutS或mutL型的酶促MutHLS错配修复系统的缺陷株，其对于参与错配识别的蛋白质MutS和MutL为缺陷型。优选的菌株是例如使用F-mutL或大肠杆菌Hfr/鼠伤寒沙门氏菌F-mutL的重组体的鼠伤寒沙门氏菌。
此外，根据本发明优选使用其他真核错配修复缺陷型细胞，像海拉(HeLa)和尤尔卡特(Jurkat)细胞。
如在此所使用的术语“生产细胞”应具体地是指一种经重组工程化的细胞以产生一种生产过程或生物合成的产物，例如代谢途径的产物。
如在此所使用的术语“细胞系”是指经长期实践已经获得增殖能力的特定细胞类型的建立的克隆。术语“宿主细胞系”是指这样一种细胞系，如用于工程化和/或表达一种内源或重组基因或代谢途径的产物以产生多肽或通过此类多肽介导的细胞代谢物。一种“生产宿主细胞系”或“生产细胞系”通常理解为一种可立即使用的用于在生物反应器中培养的细胞系以获得生产过程或生物合成的产物，诸如一种代谢途径的产物。
一旦选择产生所希望的生物合成产物的克隆，这些产物就典型地通过一种大规模的生产宿主细胞系通过适合的表达系统及发酵来产生，例如通过细胞培养物中的微生物生产。
如在此所述的，典型地拼接并且最终重组一种多核苷酸簇以在第一宿主细胞中例如在DNA修复缺陷型细胞中获得嵌合序列。然后，该簇可以被转移至一个第二宿主细胞，该第二宿主细胞具有不同的特性(例如稳定性)以经过长期生产时间产生高产率。此类第二宿主细胞优选是一种生产宿主细胞。因此，该多核苷酸簇可以从用来工程化该簇的所述第一宿主细胞中切除，并且然后整合至生产宿主细胞基因组中。
相对于一种多肽(诸如一种酶)或一种核苷酸序列(诸如一种编码酶的多核苷酸)，如在此所使用的术语“嵌合体”应是指包括至少两种异源部分的那些分子。在此上下文中，异源表示这些部分未在体内的单一多肽或多核苷酸中的相同位置中发现。通常，这意指这些部分衍生自至少两种不同的多肽或多核苷酸，例如自不同来源，诸如衍生自不同有机体或物种的类似物。这些部分也可以通过一种来源(亲本)序列的诱变来获得。
具有多肽序列的不同重组的嵌合多肽可以源自一种或多种可能已经经受诱变的亲本分子，因此可以包括突变，诸如一种或多种氨基酸的插入、缺失和/或替代。
具有基因或序列的不同重组的嵌合多核苷酸可以源自一种或多种可能已经经受诱变的亲本基因，因此可以包括突变，诸如一种或多种核苷酸的插入、缺失和/或替代。
在此上下文中，例如相对于起源的物种，术语“起源”或“不同起源”按以下方式被理解。对于特定物种的细胞是分子异源的在此被理解为起源于所述物种，以天然发生的形式(例如呈一种野生型分子及其异构体)或其片段或突变体。通过相对于另一个分子的不同起源表征的分子被具体地理解为是指具有例如获自或衍生自不同物种的不同序列的分子，诸如一种天然发生的分子，例如一种类似物、或提供呈一种人工或重组的分子，诸如呈一种事实上不作为野生型分子存在的分子。
如在此所述的示例性酶是不同原核生物或真核生物起源的，例如任一种具有如列于图10中的序列的酶或任一种如在下表中所述的酶：
表1：用于拼接多酶复合体的示例性酶
如在此所述的一种嵌合酶具体地可以包括不同起源(例如来自不同物种)的类似序列，因此，一种部分序列可以与衍生自一种具体物种的酶中的对应序列是同源的，然而其他部分或区段可以与另一个物种中的对应序列是同源的。典型地，将该全长分子或此类分子的部分进行重组并且任选地进行拼接以或获得一种嵌合分子。
在一个具体实施例中，相对于该野生型酶，一种嵌合酶也可以是这样一种酶，其中两种内源性部分序列的定位、间隔或功能已经例如通过操纵被改变。例如，一种序列的元件可以通过添加、位移或去除核苷酸或氨基酸来重定位。可替代地，该氨基酸或核苷酸序列自身可突变，例如以引入所希望的特性。典型地，此类特性包括增加该酶活性的能力。
如在此所使用的术语“巴豆酸酶”应具体地是指在超家族中的酶，这些酶已经被示出具有脱卤素酶、水合酶和异构酶活性，而其他已经被示出涉及碳-碳键形成和切割连同硫代酯的水解。这些不同的酶共享对稳定衍生自酰基-辅酶A底物的烯醇化物阴离子中间体的需要。这通过两种结构上保守的肽的NH基团来完成，这些NH基团向酰基-辅酶A底物的羰基部分提供氢键并且形成一种“氧阴离子穴”。这些辅酶A硫代酯衍生物结合在典型的钩形状中并且一个保守通道结合辅酶A的泛酰巯基乙胺基团，该泛酰巯基乙胺基团将该3'-磷酸ADP结合位点连接至反应的位点。在巴豆酸酶超家族中的酶包括在阿魏酰辅酶A或香豆酰辅酶A上催化地进行链还原反应的那些酶，例如烯酰-辅酶A水合酶(ECH，巴豆酸酶；EC4.2.1.17)，其催化2-反式-烯酰-辅酶A水合为3-羟酰基-辅酶A。
如在此所使用的术语“苯丙氨酸氨解酶”(PAL)应具体地是指一种催化苯丙氨酸脱氨反应的酶。在酶学中，一种苯丙氨酸氨解酶(EC4.3.1.24)是这样一种酶，其催化L-苯丙氨酸化学转化为反式-肉桂酸和氨。该类酶的分类名称是L-苯丙氨酸氨解酶(反式-肉桂酸-形成)。通常所使用的其他名称包括酪氨酸酶、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸氨解酶、L-酪氨酸氨解酶、苯丙氨酸氨解酶、PAL和L-苯丙氨酸氨解酶。该酶参与五种代谢途径：酪氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、氮代谢、苯丙烷生物合成、和生物碱生物合成。如在此所使用的术语“肉桂酸羟化酶”(C4H)应具体地是指一种催化肉桂酸4羟基化的酶，其是一种P450-依赖性酶。C4H也被称为肉桂酸-4-羟化酶。[EC.1.14.13.11]
如在此所使用的术语“细胞色素P450还原酶”(CPR)(也被称为NADPH：高铁血红蛋白氧化还原酶，NADPH：血红素蛋白氧化还原酶，NADPH：P450氧化还原酶、P450还原酶、POR、CPR或CYPOR)应具体地是指在真核细胞的内质网中从包含FAD和FMN的酶NADPH：细胞色素P450还原酶进行电子传递至细胞色素P450所需要的膜结合酶(POR；EC1.6.2.4)。
如在此所使用的术语“酪氨酸氨解酶”(TAL，L-络氨酸氨解酶，或酪氨酸酶)应具体地是指一种催化酪氨酸脱氨反应的酶(EC4.3.1.23)。它参与天然苯酚生物合成途径。
如在此所使用的术语“苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶”(PAL/TAL)应具体地是指一种催化苯丙氨酸或酪氨酸脱氨反应的酶(EC.EC4.3.1.25)。在酶学中，PAL/TAL催化L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的非氧化脱氨以形成分别具有相似效率的反式-肉桂酸和p-香豆酸。
如在此所使用的术语“辅酶A连接酶”应具体地是指一种催化香豆酸或阿魏酸的辅酶A酯化的酶。具体地，如在此所述的辅酶A连接酶是4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL；EC6.2.1.12)，其催化4-香豆酸和辅酶A(CoA)的化学反应以获得呈一种产物的4-香豆酸-辅酶A。该酶属于连接酶家族，具体地形成碳-硫键的那些酶，如酸-硫醇连接酶。该类酶的分类名称是4-香豆酸:辅酶A连接酶(AMP-形成)。通常使用的其他名称包括4-香豆酰-辅酶A合成酶、p-辅酶A连接酶、p-香豆酰辅酶A合成酶、p-香豆酰-辅酶A合成酶、p-香豆酰-辅酶A连接酶、阿魏酰辅酶A连接酶、羟基肉桂酰辅酶A合成酶、4-香豆酸:辅酶A连接酶、咖啡酰辅酶A合成酶、p-羟基肉桂酰辅酶A合成酶、阿魏酰辅酶A合成酶、芥子酰(sinapoyl)辅酶A合成酶、4-香豆酰-辅酶A合成酶、羟基肉桂酸:辅酶A连接酶、p-香豆酰-辅酶A连接酶、p-羟基肉桂酸:辅酶A连接酶和4CL。该酶参与苯丙烷生物合成。
如在此所使用的术语“3-单加氧酶”应具体地是指一种诸如通过羟基苯甲酸水解酶(HBH)催化4-羟基苯甲醛的羟基化的酶或诸如通过酚羟化酶(PheA)和黄素还原酶(FLARED)催化香豆酸3-羟基化的酶。
HBH，也被称为4-羟基苯甲酸酯3-单加氧酶(EC1.14.13.2)，是一种催化4-羟基苯甲酸酯的化学转化以产生原儿茶酸的酶。该酶属于氧化还原酶家族，具体是那些对具有O2作为氧化剂及氧的掺入和还原的成对供体起作用的那些酶。该结合的氧并不需要衍生自其中NADH或NADPH作为一种供体的O2以及一个氧原子结合至其他供体。该类酶的分类名称是4-羟基苯甲酸酯、NADPH：氧的氧化还原酶(3-羟基化)。通常使用的其他名称包括p-羟基苯甲酸酯水解酶、p-羟基苯甲酸酯羟化酶、4-羟基苯甲酸酯3-羟化酶、4-羟基苯甲酸酯单加氧酶、4-羟基苯甲酸羟化酶、p-羟基苯甲酸酯-3-羟化酶、p-羟基苯甲酸水解酶、p-羟基苯甲酸羟化酶、和p-羟基苯甲酸羟化酶。该酶经由羟基化和2,4-二氯苯甲酸酯降解参与苯甲酸酯降解。它利用一种辅因子，FAD。
又名酚羟化酶(EC1.14.13.7)的Phe是一种二组分的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性单加氧酶，其转化酚类化合物。该酶属于氧化还原酶家族。PheA能够使用FADH2和O2用于氧化苯酚导致儿茶酚，作为苯酚降解的第一步骤。PheA需要黄素还原酶。
FLARED或黄素还原酶组分(EC1.5.1.36)是一种酚羟化酶的酶组分酶，其通过NADH催化游离黄素的还原。该酶具有与FAD、FMN和核黄素相似的亲和力。该flared组分使用NADH来催化黄素的还原，该黄素扩散至PheA组分用于通过分子氧氧化底物。
如在此所使用的术语“甲基转移酶”应具体地是指一种甲基化酶，该甲基化酶是一种将甲基基团从供体转化到受体的转移酶类型。该术语应具体地是指一种O-甲基转移酶，优选3-O-甲基转移酶或4-O-甲基转移酶，优选咖啡酸酯O-甲基转移酶或咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)(EC2.1.1.68)，其是一种催化3,4-二羟基-反式-肉桂酸(咖啡酸)化学转化为3-甲氧基-4-羟基-反式-肉桂酸(阿魏酸)的酶。该酶也能够将原儿茶醛转化为香草醛。该酶属于转移酶家族，具体的是转移一碳基团甲基转移酶的那些。该类酶的分类名称是S-腺苷基-L-甲硫氨酸：3,4-二羟基-反式-肉桂酸3-O-甲基转移酶。通常使用的其他名称包括咖啡酸酯甲基转移酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶和S-腺苷基-L-甲硫氨酸：咖啡酸-O-甲基转移酶。该酶参与苯丙烷生物合成。
如在此所使用的术语“醇氧化酶”应是指一种催化伯醇至乙醛的化学反应的酶(EC1.1.3.38)。该酶属于氧化还原酶家族，具体的是在具有氧作为受体的供体CH-OH基团上起作用的那些酶。该类酶的分类名称是醇：氧的氧化还原酶。如在此所使用的一种特别优选的醇氧化酶是香草醇氧化酶，例如如在US5721125中所述的，其将转化香草醇为香草醛。
如在此所使用的术语“基因”应具体地是指基因或基因的DNA片段，特别地是部分基因的那些片段。一个片段也可以包含若干开放阅读框，相同ORF或不同ORF的重复。该术语应具体地是指编码的核苷酸序列，但也应包括非编码的(例如未转录的或未翻译的)序列或编码整体或部分多肽的核苷酸序列。
该术语应具体地适用于如在此所使用的一种或多种多核苷酸，例如如全长核苷酸序列或其片段或部分，分别编码具有酶(例如一种代谢途径的酶)活性的多肽或其片段或部分。
如在此所使用的例如用于拼接、多样化或重组的基因可以是非编码序列或编码多肽的序列或蛋白编码序列或其部分或片段，具有足够的序列长度用于成功重组事件。更具体地，所述基因具有最小长度为3bp，优选地至少100bp，更优选的至少300bp。
根据本发明术语“基因嵌合体”意指具有至少一个交叉事件的至少两种不同基因或部分基因的重组，优选在编码相同类型的酶(“基因内的”)内单一多核苷酸内或在单一分子或核酸链内的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或甚至更多个交叉，例如在接合编码不同类型的酶的多核苷酸的核酸部分处一个交叉以获得这些多核苷酸(“基因间的”)的拼接。具体地，这样一种交叉提供DNA序列的重组和混合。一种基因嵌合体可以通过一种或多种基因的基因内混合、基因内(intrangenic)的基因嵌合和/或基因拼接，例如具有基因间交叉、具有或不具有重叠部分、或串联到一起的复合基因，任选地具有一个重叠，进一步任选地具有基因内和基因间的一个或多个交叉两者的基因或一种或多种基因嵌合体的拼接来产生。
具体在此所述的这些基因嵌合体具有至少3个，优选多达30.000个碱基对，优选的范围将是300-25.000bp；特别优选的是具有至少500bp或至少1.000bp的大DNA序列。
具体优选的基因嵌合体的表征在于：每700个碱基对至少3个交叉事件，优选每700个碱基对至少4个交叉，更优选每700个碱基对或每500个碱基对至少5、6或7个交叉，其包括该单一核苷酸或至少1个、优选至少2、3、4、5、10、20至更多个较大的核苷酸序列的片段的交叉。
根据如在此所述的有丝分裂或体细胞内重组的优选的方法，不仅奇数的而且偶数的重组事件可以在一个单一重组基因中获得。这是优于体内重组中的减数分裂的一个具体优点。
重组体嵌合性的复杂模式可以通过本发明的方法获得，在单一分子内延伸出大量不同长度的重组序列嵌段。此外，可获得相应于链模板之一的核苷酸的点状置换(point-likereplacement)作为关于开放阅读框的读码框的多样性的重要来源。嵌合现象和点状交换在蛋白质水平并非必然保守。的确，重组后可以产生具有不同极性的新氨基酸，将新型潜在的和酶促蛋白质性质赋予到由该方法衍生的重组蛋白质。
术语“交叉”是指在两DNA链可交换遗传信息的位点，即至少一个核苷酸处的基因之间的重组。交叉过程导致后代嵌合基因具有来源于一个或多个亲本基因的基因或序列的不同组合，这个或这些亲本基因可能已经受诱变，由此可以包括突变，诸如一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或替代。
可替代地，可以提供不基于交叉的其他修复机制，例如包括链接合后不正确核苷酸的识别、切除和/或替换的核苷酸切除修复或非同源端连接机制。
如在此所使用的术语“异源多核苷酸”是指这样一种核酸，其对给定的宿主微生物或宿主细胞是外源的(foreign)，即“外源的(exogenous)”，例如实质上未发现；或其是自然地发现于给定的宿主微生物(microorganismor)宿主细胞中，然而例如在异源核苷酸的情况下是“内源的”。如以内源方式发现的异源核苷酸序列也可以在细胞中以非天然的数量被产生，例如大于预期的或大于天然发现的。该异源核苷酸序列或包括该异源核苷酸序列的核酸可能依次不同于该内源核苷酸序列，但编码相同的如以内源方式发现的蛋白。具体地，异源核苷酸序列是那些实质上未发现与宿主细胞有相同亲缘的那些序列。任何重组体或人工的核苷酸序列被理解为是异源的。异源多核苷酸的一个实例是编码如在此所述的酶序列的核苷酸序列，其起源于除了该宿主细胞物种外的物种。一个另外的实例是一种嵌合多核苷酸。一个另外的实例是编码一种酶序列的核苷酸序列，可操作地连接到转录调控元件例如启动子上，对其来说一种内源的、天然发生的酶编码序列被非正常地可操作地连接。
如在此所使用的术语“异源生物合成”具体地是指通过重组宿主细胞生物合成产物，这些重组宿主细胞包括至少一种例如能够使得生物合成外源产物或具有改善的特性或以增加的产率的内源产物的异源元件，诸如异源多核苷酸。
如在此所使用的术语“生物合成”应具体地是指一种产物的细胞生产，例如通过在细胞培养物中的宿主细胞(具体地微生物宿主细胞)中体内生产，其中细胞生产可以任选地与另外的生物合成产物步骤(例如在不同于之前一种的宿主细胞中)和/或与化学合成的反应(例如通过体外反应)合并。
术语“同源的”或“部分同源的”意指一种单链的核酸核酸序列可以与一种互补的单链核酸序列杂交。杂交的程度可以依赖大量的因子，这些因子包括在这些序列和杂交条件如在后面所讨论的诸如温度和盐浓度之间的同一性的量。优选地，该同一性区域是大于约1bp，更具体地，该同一性区域是大于5bp或大于10bp。
如在此所使用，如果两种序列共有任选地通过一种或多种错配碱基对中断的序列一致性的区域的话，它们是“同源的”，这样使得它们能够彼此同源重组的交换。在一个优选的实施例中，两种异源双链序列是完全一相同的。在另一个实施例中，该同源性程度通过相同核苷酸的每大约10个碱基对不超过1个错配碱基对被中断。在一个优选的实施例中，该同源性程度是一种相同核苷酸的至少30、40、50、60、70、8090或100个碱基对的连续链。在不同的实施例中，同源序列之间的同源性程度是一种相同核苷酸的至少6、8、10、15、20、25、30、35、40、50、60、75或100个碱基对的连续链。在一个可替代的实施例中，相同核苷酸的链可以通过每100个一致的核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个不相同的核苷酸被中断。在又另外的实施例中，供体序列和靶序列(即每对第一和第二序列)之间的序列同一性程度是至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，又最优选至少90％或95％同一性。在某些具体实施例中，供体和靶序列之间的序列同一性程度是至少92％、94％、96％、98％或99％。同源序列可以通过一种或多种非同源残基被中断，其条件是它们仍然是同源重组的有效底物。
术语“同源性”表示两种或两种以上的核苷酸序列在相应位置具有相同或保守的碱基对(在一定程度上，高达100％)。如根据本发明所使用的同源序列也称为互补、相应或匹配序列，优选与同源对应序列(homologouscounterpartsequence)杂交，例如具有至少30％序列同一性，高达100％序列同一性。优选地，一种同源序列将具有至少约30％核苷酸序列同一性，优选至少约40％同一性，更优选至少约50％同一性，更优选至少约60％同一性，更优选至少约70％同一性，更优选至少约80％同一性，更优选至少约90％同一性，更优选至少约95％同一性。
因此，如在此所使用的该术语也应是指部分同源序列，其被理解为相对于在此所公开的全长天然DNA序列或DNA序列的片段，与各自的互补序列具有少于100％序列同一性例如少于99.5％序列同一性，可能小于95％、小于90％、小于85％或小于80％序列同一性的序列。如上举出的优选的上下限范围在30％和100％或99.5％相应序列同一性的范围之内。如在此所使用，同一性程度始终还是指互补序列。
根据本发明，甚至可能通过体内部分同源重组拼接未具有同源性、即具有少于30％或少于20％或甚至少于10％的序列同一性的一个或多个基因或基因片段。因此，为了体内部分同源重组的目的，被拼接和/或重组的一个或多个基因或基因片段的序列任选地具有序列同一性为至少5％，优选地至少10％或至少20％或至少30％。
相对于基因的核苷酸序列，“同一性百分数(％)”被定义为在比对序列和必要时引入缺口以达到最大序列同一性百分数后，候补DNA序列中与DNA序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分数，并且不考虑任何保守性替代作为序列同一性的部分。以确定核苷酸序列同一性的百分数为目的的比对可以通过本领域技术人员熟知的各种方式，例如使用公众可获得的计算机软件来实现。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括为了实现在被比较的序列的全长上进行最大比对所需要的任何算法。
如在此所使用的术语“香草素”应具体地是指具有香草基基团(也被称为香草酰基团)的化合物，其具有以下化学式(1)
其中
R1选自下组，该组由以下各项组成：-COH、-COOH、-CH2OH、-CH2COOH、-C(＝O)CH3、-CH(OH)COOH和糖苷；
R2选自下组，该组由以下各项组成：H、-CH3、-CH2CH3和糖苷；并且
R3选自下组，该组由以下各项组成：H、-CH3、-CH2CH3和糖苷。
这些化合物具体地包括香草醇、香草醛、香草酸、乙基-香草醛、香草醛-糖苷、乙酰香草酮、香草扁桃酸、高香草酸和异构体，诸如异香草素(isovanilloid)和香草素衍生物。
如在此所述的香草素化合物可以具体地通过生物合成产生，例如香草醛生物合成的副产物或中间体产生的，或另外通过另一个宿主细胞或通过化学反应例如通过体外生产产生的。
如在此所使用的术语“香草素的羟基苯甲醛前体”应具体地是指在香草素的化学反应或生物合成中的前体分子，例如一种如在香草素的代谢途径和生物合成中所使用的前体分子，其是一种羟基苯甲醛或相应的酸或相应的醇，例如羟基苯甲酸，或相应的醇例如羟基苄醇，例如一种通过苯丙烷途径的生物合成的前体。该术语具体地包括原儿茶醛、4-羟醛或其衍生物，在它们之中的相应的酸诸如原儿茶酸或4-羟基苯甲酸或其衍生物，在它们中该相应的醇例如儿茶醇或4-羟基苄醇。术语也将包括香草醛的前体，例如一种酸的前体，像肉桂酸、香豆酸、咖啡酸或阿魏酸。因此，一种优选的羟基苯甲醛前体选自下组，该组由以下各项组成：原儿茶醛、原儿茶酸、儿茶醇、4-羟醛、4-羟基苯甲酸、4-羟基苄醇、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸。
如在此所述的香草素的羟基苯甲醛前体可以具体地通过生物合成产生，例如香草醛生物合成的副产物或中间体产生的，或另外通过另一个代谢过程或通过化学反应例如通过体外生产产生的。
如在此所使用的术语“多酶复合体”应具体地是指代谢途径的以级联反应顺序或另外不具有这样的序列(例如通过随机序列)的大量的或一系列的酶。通过异源生物合成的宿主细胞产生的多酶复合体典型地通过一个拼接或至少一个簇(重组)的各自编码一种酶的多核苷酸来编码，其中拼接或一个或多个簇可以例如定位在一种或多种染色体上的一个或多个不同位点，或部分地定位在一种或多种染色体上并且此外定位在一个或多个质粒上。如在此所述的多酶复合体不需要作为蛋白的复合体被提供，其中这些蛋白彼此地连接。该术语应被理解为一种作为参与细胞的具体代谢途径的个体酶提供的多酶复合体。
如在此所述的示例性多酶复合体包括莽草酸途径的酶或相应的核苷酸序列，该莽草酸途径是通过用于芳香族氨基酸(像苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的生物合成的细菌、真菌和植物所使用的七步代谢途径。
如在此所述的一个另外的示例性多酶复合体包括肉桂酸和p-香豆酸生物合成的酶或相应的核苷酸序列。典型地，所有苯丙烷的生物合成开始于氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸氨解酶(PAL，苯丙氨酸/TAL，酪氨酸氨解酶)是一种负责将L-苯丙氨酸或酪氨酸分别转化为反式-肉桂酸或p-香豆酸的酶。反式-肉桂酸4-单加氧酶(肉桂酸4-羟化酶)是负责将反式-肉桂酸转化为4-羟基肉桂酸(p-香豆酸)的酶。4-香豆酸-辅酶A连接酶是负责将4-香豆酸(p-香豆酸)转化为4-香豆酰-辅酶A的酶。
如在此所述的一个另外的示例性多酶复合体包括其他羟基肉桂酸生物合成的酶或相应的核苷酸序列，例如包括以下项中任一种：肉桂醇脱氢酶(CAD)，一种负责将肉桂醇转化为肉桂醛的酶；芥子碱酯酶，一种负责将芥子酰氯(sinapoylcholine)转化为芥子酸(芥子酸)(sinapate或sinapicacid)和氯的酶；反式-肉桂酸2-单加氧酶，一种负责将反式-肉桂酸(肉桂酸)转化为2-羟基肉桂酸的酶；咖啡酸O-甲基转移酶，一种负责将咖啡酸转化为阿魏酸的酶；咖啡酰-辅酶AO-甲基转移酶，一种负责将咖啡酰-辅酶A转化为阿魏酰-辅酶A的酶；5-O-(4-香豆酰)-D-奎尼酸3'-单加氧酶，一种负责将反式-5-O-(4-香豆酰)-D-奎尼酸转化为反式-5-O-咖啡酰-D-奎尼酸的酶；芥子酰葡萄糖—胆碱O-芥子酰转移酶，一种负责将1-O-芥子酰-β-D-葡萄糖转化为芥子酰氯(芥子碱)的酶；以及芥子酰葡萄糖—苹果酸O-芥子酰转移酶，一种负责将1-O-芥子酰-β-D-葡萄糖转化为芥子酰-(S)-苹果酸的酶。
优选的多酶复合体包括一系列酶，例如一种酶的混合物。编码多酶复合体的酶的多核苷酸可以被拼接并作为簇被提供，其中该核酸例如以酶促(催化)反应的顺序或不考虑该顺序编码该酶。
术语“代谢途径”是指一系列的两个或多个酶促反应，其中一个酶促反应的产物成为下一个酶促反应的底物。在代谢途径的每个步骤，中间体化合物被形成并且被用作随后步骤的底物。这些化合物可以称为“代谢中间体”。每个步骤的产物也被称为“代谢物”。
如在此所述的代谢途径的酶典型地在初级和/或次级代谢中发挥着整合作用。在初级代谢中，一种酶对生活力是关键的，例如直接参与正常生长、发育或生物体的生殖。在次级代谢中，一种酶用于产生次级代谢物，其被理解为起初对生活力不是关键的有机化合物，有别于初级代谢物。次级代谢物的缺乏不会导致立即死亡，而是导致生物体的可生存性、繁殖力或美感的长期损伤或可能根本无显著变化。香草素或其苯甲醛前体被具体地理解为次级代谢物，其可发现用作香料、药物、调味品、芳香剂或食品成分。
如在此所述的术语“苯丙烷代谢途径”具体地是指一种代谢途径，该途径包括通过参与苯丙烷的生物合成的酶催化的酶促反应，包括芳香族氨基酸的前体的生物合成、从随后的代谢过程产生的产物的生物合成，例如苯丙烷途径。
参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成的酶具体地包括将芳香族氨基酸转化为香豆酸并且进一步为巴豆酸酶的一组酶。图1和7说明了此类途径的不同实施例。该代谢途径可以进一步包括将前体碳源像单糖或二糖诸如葡萄糖转化为芳族氨基酸的酶。该代谢途径具体地可以包括用于香草素的生物合成(诸如香草醛或香草醛的衍生物)所必需的所有酶。
如在此所述的该代谢途径可以具体地包括至少两种酶，优选地至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或甚至更多酶以获得生物合成的产物。至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种或甚至更多的酶可以作为例如通过嵌合的多核苷酸或核酸序列编码的嵌合酶被提供。具体地，如在此所述的代谢途径包括作为前体或中间体物质的香豆酸。本发明的香草素的生物合成的过程中，该香豆酸被具体地用作一种通用中间体，因为所有香草素化合物是根据该新的途径衍生的。
如此处使用的术语“多核苷酸”具体地是指任何长度的一种单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，并且包括作为非限制实例的一种基因的编码和非编码序列、重组多核苷酸、分离和纯化的天然发生DNA或RNA序列、合成RNA和DNA序列、核酸探针、引物、片段、遗传构建体、载体以及修饰的多核苷酸。类似地应理解提及的核酸、核酸分子、核苷酸序列以及多核苷酸序列。
相对于多核苷酸，如此处使用的术语“簇”具体地是指一起紧密位于相同染色体上的一组多核苷酸，其产物在细胞初级或次级代谢的特定方面发挥协调作用。如此处所述的簇具体地是指一个(次级)代谢物生物合成簇。
如此处使用的术语“前体”具体地是指经受酶促反应并且转化为一种产物(例如生物合成或化学反应的产物)的底物分子。该术语具体地适用于一种香草素的羟基苯甲醛前体，例如一个代谢途径的初始前体，诸如一种单糖，具体而言葡聚糖，或被添加到一个代谢细胞的初始前体，诸如一种天然芳香族氨基酸，具体而言苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸；或一个代谢途径的中间体，即通过一个细胞获得的作为细胞的代谢物的分子，其可进一步被用作用于进一步酶加工的一种底物。
代谢如此处所述的一个前体的细胞可具体地通过一个或多个连续步骤的酶促反应而产生细胞代谢物或所希望的产物。例如，可采用多酶复合体加工一种前体化合物，例如一种完全异源或部分异源的多酶复合体，包括至少两种酶，优选地至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种或甚至更多酶，以获得生物合成的产物。因此，在存在该前体化合物的情况下可在细胞培养物中培养包括该(异源)多酶复合体的代谢细胞，以获得该产物。优选地，在该多酶复合体中的异源酶中的至少一种是嵌合酶。
如此处所述的一个具体前体是香豆酸，例如用于生物合成一种香草素或其一种苯甲醛前体。可通过一个代谢细胞生物合成来产生该香豆酸本身，例如使用一种芳香族氨基酸作为一个前体。
相对于生物合成，如此处使用的术语“产物”具体地是指初级和/或次级代谢的任何产物，具体而言可被用作一个代谢途径的前体、中间体、副产物或末端产物的一种化合物。
相对于一个拼接和/或重组方法，术语“单个步骤程序”具体地意指在一个方法步骤中技术性地进行工程化重组体的若干加工步骤，像用一个基因转化细胞、重组基因、产生嵌合基因以及将基因整合至该靶基因组中。因此，不存在对在体内重组之前体外重组DNA载体的需要，或任何重复的加工步骤周期，包括采用减数分裂的那些。有利地，可以避免使用减数分裂酵母细胞。
本发明的单个步骤程序可甚至包括在相同时间通过宿主表达此类加工的重组体。从而没有必要进一步操纵获得一种表达产物。
相对于杂交至一个基因组整合位点的元件以将异源序列插入至宿主细胞基因组中的核苷酸酸，如此处使用的术语“锚定”具体地应意指通过具有部分或全序列同源性的称作“锚定序列”的一个区段将一个基因或基因嵌合结合至一个整合序列中，以使得能够整合此类基因或基因嵌合体至一个基因组的整合位点中。具体地该锚定序列可以是同源或至少部分同源于一个基因组序列的整合位点的一个侧翼靶区域。优选的锚定序列优选地与一个靶整合位点具有至少约70％序列同源性，更优选地至少80％、90％、95％高达99.5％或完全匹配该基因组的杂交部分。
相对于一个核酸序列例如异源序列的末端部分，该核酸序列杂交从而锚定一个基因组整合位点的元件以将异源序列插入至宿主细胞基因组中，如此处使用的术语“侧翼靶序列”具体地是指互补于感兴趣的靶标的一个核苷酸序列的区域，诸如一个基因组靶整合位点，包括待拼接和/或重组的一个或多个基因、线性多核苷酸、线性或圆形质粒YAC等的一个位点。归因于具体程度的互补或同源性，该侧翼靶序列可与一个或多个基因杂交并将其整合至该靶整合位点中。
如此处所述的，该侧翼靶序列的长具体地是至少5bp，优选地至少10bp，更优选地至少20bp、50bp、100bp高达5,000bp长。具体地该侧翼靶序列被连接至所述基因或是所述基因的一个整合、末端部分。优选地，所述侧翼靶序列具有30％至99.5％的范围内(优选地少于95％、少于90％、少于80％)的同源性，与所述整合位点的锚定序列杂交。
优选地，如此处使用的用于体内重组技术的侧翼靶序列是一个单侧，例如在一个具体核苷酸序列的仅一侧上，例如延长该具体核苷酸序列的5’-末端序列或3’末端序列，不是在两侧上。这提供了产生基因嵌合的增加的机会。
当根据本发明使用锚定到该基因组的靶整合位点的至少两个不同的侧翼靶序列时，优选的是它们不会与彼此重组，优选地它们享有少于30％同源性。
此处提到的整合位点适合地可以是宿主基因组上一个定义的基因座，在该基因座处会发生高频度的重组事件。一个优选的基因座是，例如，酿酒酵母的染色体III上的BUD31-HCM1基因座。通常，在显示高频率重组但细胞生活力不改变的宿主细胞染色体例如酵母染色体上的任何其他基因座是优选的。
术语一个细胞的“基因组”是指由以下项代表的一种生物的遗传信息的整体：基因以及DNA的非编码序列，染色体或非染色体遗传元件，诸如线性多核苷酸，例如包括待拼接和/或重组的一个或多个基因、病毒、自主复制携带者和载体、质粒、以及转座元件，包括人工染色体等。
如此处所述的拼接和/或重组的优选方法可通过直接选择采用选择，即测定细胞培养基中的成功生物合成的所希望的中间体或产物，或另外成功重组产物的生产标记辅助选择。使用工具诸如分子标记或DNA指纹法可对感兴趣的基因进行作图。这允许筛选一个大的细胞谱系以获得对具有感兴趣的性状的细胞的选择。该筛选是基于某些基因的存在或缺失进行的。
根据本发明使用的术语“选择标记物”是指在成功整合后提供标记的蛋白编码或非编码DNA序列。具体地，蛋白编码标记物序列是选自下组：营养标记物、色素标记物、抗生素抗性标记物、抗生素敏感性标记物、荧光标记物、敲入标记物、激活剂/结合结构域标记物以及显性隐性标记物、比色标记物、以及编码一种酶的不同亚基的序列，该酶仅在两个或更多个亚基在相同细胞中表达时起作用。该术语还指待重组的一种可追踪的基因，该基因提供对基因嵌合的直接测定，不需要使用分离的标记物序列。
“营养标记物”是编码一种基因产物的一种标记物序列，该基因产物可补偿该细胞的营养缺陷并且因此赋予营养缺陷型细胞原养型。根据本发明术语“营养缺陷”意指该细胞必须生长在包含一种必需营养素的培养基中，该必需营养素是该营养缺陷型细胞本身不可产生的。该营养标记基因的基因产物促进合成营养缺陷型细胞中缺失的此类必需营养素。通过成功表达该营养标记基因，然后不需要将此类必需营养素添加至细胞生长于其中的培养基中。
优选标记物序列是URA3、LEU2、HIS3、CAN1、CYH2、TRP1、ADE1以及MET5。
编码一种“色素标记物”的基因是编码一种基因产物，该基因产物涉及一种色素的合成，该色素在表达时可对该细胞进行染色。从而提供了对成功表达色素标记物的细胞的快速表型检测。
“抗生素抗性标记物”是编码一种基因产物的基因，该基因产物允许该细胞在存在如下浓度的抗生素的情况下生长，在所述浓度下不表达所述产物的细胞不能够生长。
“抗生素敏感性标记物”是一种标记基因，其中该基因产物抑制在存在一种抗生素的情况下表达所述标记物的细胞的生长。
“敲入”标记物被理解为一个核苷酸序列，其代表一个敲除细胞的缺失环节，因此在成功重组和操作时引起该细胞生长。敲除细胞是一种基因工程化细胞，其中通过一个定向突变关闭一个或多个基因。此类缺失基因可适合用作敲入标记物。
“荧光标记物”应意指编码一个荧光团的核苷酸序列，该荧光团可通过发射各自的荧光信号被检测到。细胞可容易地通过基于微分荧光标记的流式细胞术的众所周知的技术进行分类。
如此处使用的“重组体”意味着一种具体的核酸(DNA或RNA)是克隆、限制、连接、和/或体外DNA合成步骤的不同组合的产物，导致具有可与在天然系统中发现的内源核酸区别的结构编码或非编码序列的构建体。通常，编码该结构编码序列的DNA序列可以从cDNA片段以及短寡核苷酸接头或从一系列的合成寡核苷酸拼接以提供一种合成核酸，该合成核酸能够从包含在一个细胞或无细胞转录和翻译系统中的一个重组转录单位表达。此类序列能以开放阅读框的形式提供，该开放阅读框未被典型地存在于真核基因中的内部非翻译的序列或内含子中断。包括相关序列的基因组DNA也可在一个重组基因或转录单位的形成中使用。非翻译的DNA的序列可存在在该开放阅读框的5′或3′，此处此类序列不会干扰这些编码区的操纵或表达，并且的确可起作用以通过不同机制调整所希望的产物的生产。
因此，例如，术语“重组体”多核苷酸或核酸是指天然发生的一种，例如，是通过人为干涉对两个另外分离的序列区段的人工组合进行的。这种人工组合时常通过对分离的核苷酸片段进行人工操纵来完成，例如基因工程技术。例如，照这样进行以将具有所希望的功能的核酸区段连接在一起以产生所希望的功能的组合。术语“重组”具体地适用于拼接多核苷酸，将此类多核苷酸或其部分连接在一起，进行或不进行重组，以实现交叉或基因嵌合。
相对于核酸序列，如此处使用的术语“重组体”具体地是指通过重组DNA技术产生的核酸或多核苷酸，例如包括异源于宿主细胞的多核苷酸的一种DNA构建体，其任选地结合至该宿主细胞中。一种嵌合核苷酸序列可具体地产生为重组分子。
相对于酶，如此处使用的术语“重组体”具体地是指通过重组DNA技术产生的酶，即从通过编码所希望的酶的外源DNA构建体转化的细胞产生的。“合成”酶是通过化学合成制备的那些。一种嵌合酶可具体地产生为重组分子。
术语“重组宿主”，也称为“遗传修饰的宿主细胞”，表示包括一种异源核酸的宿主细胞。
相对于多种重组体元件，诸如重组代谢途径或重组细胞，术语“表达谱”具体地此处被理解为相异的变体的一个群体，例如在核苷酸序列上不同的核酸变体，或在氨基酸序列、或宿主细胞或重组宿主细胞的克隆上不同的多肽变体，例如包括多种异源酶或多个代谢途径。本发明的文库将包括细胞表达谱或通过此类细胞产生为代谢物的芳香族化合物表达谱。根据本发明，克隆表达谱被设计成具有一个代谢途径，其中采用包括至少一种嵌合体的酶的一种多酶复合体，具体地其中所述细胞与彼此在基因嵌合的数目和/或类型上不同，以包括一个不同簇的多核苷酸或具有一个或多个不同基因嵌合的一个核酸序列，例如使得生物合成的所述多酶复合体或所述产物的酶活性或产物产率不同。
本发明具体地提供可通过由体内重组(例如通过同源重组)工程化一个代谢途径的方法获得的一个文库，以获得具有涉及该代谢途径的不同多核苷酸的多种细胞。优选的文库包括至少100个不同克隆，优选地至少1.000个不同克隆或甚至更多，其克隆产生生物合成的所希望的产物，这些克隆的每个被认为是一个文库成员。这些变体具体地可包含至少1％，更优选地至少10％，更优选地至少20％，更优选地至少40％，更优选地至少60％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％，更优选地至少95％功能性ORF。可根据本发明获得的优选的文库具体地包括在一个功能性开放阅读框(ORF)内高百分数的基因嵌合，优选地至少80％。
优选的是例如通过基因组分析或通过测定由该变体产生的次级代谢物的结构和功能表征这些变体克隆。以高水平产生生物合成的所希望的产物(例如香草素)的变体可被选择以进一步工程化重组生产细胞系用于工业生产目的。
因此，本发明具体地是基于新的代谢途径或此类新的代谢途径的变体的发现，其可通过重组宿主细胞被用于生产香草素以及相关化合物。此类新的途径的关键元件是香豆酸以及它们中的另外的酶，巴豆酸酶，以提供香草素或此类香草素的苯甲醛前体的生物合成。优选的宿主细胞包括编码酶或酶变体(诸如包括一个基因嵌合的至少一种嵌合酶)的一个异源多核苷酸簇。
在一个特定实施例中，酶变体是通过此类基因嵌合获得，例如直接通过基因嵌合的重组以及最终拼接，或作为此类基因嵌合的结果，例如通过一个序列的酶工艺。一个示例性方法是指肉桂酸-4-水解酶(C4H)以及C4H产生的编码具有改善的或新的酶学特性的酶的基因，例如如在一个功能测定中确定的。
一个特别优选的方法采用酶以及酶途径的重组和拼接，包括具有生物活性的至少2种酶，以获得一种多酶复合体、酶变体、具有各自的野生型酶和/或具有基因嵌合的酶的途径或途径变体，用于加工生物来源材料或阵列以产生所希望的水平的生物合成的所希望的产物。
遗传途径能以组合方式构建使得组合文库中的每个成员具有不同组合的基因变体。例如，变体的组合文库可以从个体DNA元件构建，此处不同片段被重组和拼接，并且其中这些不同片段中的每个具有若干变体。一个代谢途径的重组和拼接可能不需要存在一种标记物序列以证明成功工程化。以希望的方式表达一种代谢物对于该工作实例是指示性的。该代谢途径的成功重组和拼接可以例如通过检测该细胞培养基中的次级代谢物来确定。
可希望的是简单地拼接，例如以串联在一起并且任选地混合不同起源的天然发生的多核苷酸，其中至少一个异源于该宿主细胞，其多核苷酸编码特异性的野生型酶。可能也希望提供此类多核苷酸的变体，例如通过突变技术多样化，例如以建立代谢途径的变体(重数)。在自然中不存在的代谢途径能以此方式构建。因此，存在于一种生物中的在由缺少这样的下游酶的不同生物产生的希望的底物上操作的酶可以在相同生物中编码，凭借构建基因或部分基因的拼接以获得重组酶。可以包括多种酶以构建复合体代谢途径。这是有利的，如果一簇多肽或部分多肽应该根据其在该途径内的生物化学功能安排。
优选地该文库是一个酵母文库，并且该酵母宿主细胞优选地展现具有希望的生物合成活性的代谢途径。在特定的实施例中，这些产物停留在该细胞内或分泌出该细胞。该酵母宿主细胞优选地选自以下属：酵母属、毕赤酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、亚罗酵母属以及假丝酵母属。最优选地，通过拼接和/或重组用于工程化该异源代谢途径的宿主细胞是酿酒酵母。
任何重组感受态真核的或原核宿主细胞可被用于根据本发明通过体细胞内重组产生一簇多核苷酸和/或一个基因嵌合体。根据本发明的一个优选实施例，该细胞是一种修复缺陷型细胞，例如一种核酸修复缺陷型细胞，诸如具有DNA修复缺陷型，即DNA修复缺陷型细胞，或一种MMR缺陷型细胞。
确切地，该细胞是一种真核细胞，优选地真菌、哺乳动物或植物细胞、或原核细胞。
优选地，该细胞是曲霉属或真菌细胞，优选地，它可以选自下组，该组由以下属组成：酵母属、假丝酵母属，念珠菌属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、亚罗酵母属、毕赤酵母属以及曲霉属。
优选地采用单倍体菌株，诸如单倍体酵母菌株。
可替代地，可使用原核生物，诸如大肠杆菌、芽胞杆菌属、链霉菌属、或哺乳动物细胞，像海拉和尤尔卡特细胞，或植物细胞，像拟南芥属。
在通过体内重组技术工程化适合的代谢途径时，可以有利地是切去该簇多核苷酸并且将该簇结合至一个生产宿主细胞中。一旦通过选择包括新的异源簇以及任选地该基因嵌合的克隆合成为代谢物或此类代谢物的中间体，它们典型地通过适合的表达系统，例如通过微生物生产，和/或通过(进一步)体外合成加工步骤而大规模产生。
优选地，该生产宿主细胞是酵母细胞。
根据本发明，可以采用本领域中的常规分子生物学、微生物学、和重组DNA技术。
对于体内重组，使用标准转染技术，待用该基因组或其他基因重组的基因被用以转染该宿主。在一个适合的实施例中，提供一个复制起点的DNA包括在该构建体中。该复制起点可适合地通过普通技术人员选择。依赖于这些基因的性质，如果序列与作为复制起源本身可操作的这些基因或基因组一起存在，则可能不需要一个补充的复制起点。
合成核酸序列或盒以及子集能以线性多核苷酸、质粒、大质粒、合成或人工染色体(诸如植物、细菌、哺乳动物或酵母人工染色体)形式产生。
当此类DNA被引入该细胞内时，可通过外源或异源DNA转化一个细胞。转化DNA可以被整合或未整合(即共价连接)到该细胞的基因组中。在例如原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以维持在附加型元件例如质粒上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是其中转化DNA已变得整合到染色体内的那种，从而使得它通过染色体复制由子代细胞继承。这种稳定性通过真核细胞建立由包含转化DNA的子代细胞群体组成的细胞系或克隆的能力加以证实。
相异的基因底物可被结合至质粒中。这些质粒常常是标准克隆载体，例如，细菌多拷贝质粒。这些底物可以结合至相同或不同质粒中。时常使用具有不同类型的选择性标记的至少两个不同类型的质粒以允许针对包含至少两个类型的载体的细胞进行选择。
包含相异的基因底物的质粒最初通过任何方法(例如，化学转化、天然感受态、电穿孔、基因枪、封装至噬菌体或病毒系统中)被引入到细胞中。时常，这些质粒以饱和浓度或靠近饱和浓度存在(相对于最大转染能力)以增加超过一个质粒进入相同细胞的可能性。包含这些不同底物的质粒可以同时或多次被转染。例如，在后一个通路中，细胞可以被一个第一等分试样的质粒转染，对转染子进行选择并且繁殖，并且然后被一种第二等分试样的质粒感染。优选的质粒是，例如，pUC以及pBluscribe衍生物如pMXY9、pMXY12以及pMIX-LAM或YAC衍生物如YCp50。
可以通过允许所有基因底物参与到重组中增加演化速率。这可以通过使转染细胞经受电穿孔实现。电穿孔的条件与常规用于将外源DNA引入至细胞中的那些相同。也可通过融合细胞以诱导质粒或染色体的交换增加演化速率。融合可以通过化学剂诸如PEG，或病毒蛋白诸如流行性感冒病毒血球凝集素、HSV-1gB以及gD诱导。也可通过使用突变基因宿主细胞(例如，细菌中的MutL、S、D、T、H，酵母以及共济失调性毛细血管扩张症人类细胞系中的类似突变体)增加演化速率。
在本发明的优选实施例中，一个嵌合基因的拼接、其与一个宿主基因组的重组、以及进一步该嵌合基因的表达以产生感兴趣的一种重组多肽或所述宿主细胞的一种代谢物，是以单个步骤程序进行的。
具有重组的基因的细胞可经受对希望的功能的筛选或选择。例如，如果演化的底物包含一种药物抗性基因，则将对药物耐受性进行选择。
确切地，能以新的方式产生芳香族氨基酸诸如苯丙氨酸、酪氨酸或和色氨酸的代谢物，诸如通过植物或酵母由酶活性产生的那些，或任何中间体或衍生物。酶变体的谱系因此导致相异的代谢物形成，然后针对希望的结构和功能进行筛选。
Phe以及Tyr是密切相关的。它们包含此外在酪氨酸中羟基化的一个苯环。直接从必需氨基酸苯丙氨酸合成酪氨酸。色氨酸包含一个共轭吲哚环。这些代谢关系引起错综的营养依赖。
在植物中，该莽草酸途径产生用于生物合成苯丙烷的化合物苯丙氨酸。这些羟基苯乙烯以及通过还原酶、氧合酶、以及转移酶的组合产生的酯定义器官中的特异型的代谢物，并且依赖于其发育，此分布图对于每个植物物种是特征性的。该苯丙烷途径的初始的三个步骤是例如通过PAL、C4H以及4CL酶进行催化并且提供所有后续分支的基础并且得到代谢物例如：类黄酮、木质素、苯丙烷酯、橙酮、异黄酮、二苯乙烯、原花青素等。
例如，已知PAL催化Phe的脱氨作用以给出肉桂酸，这是苯丙烷途径中的第一步骤以及初级和次级代谢之间的一个调节点。苯丙烷化合物是一个范围的在性质上具有许多功能的酚类化合物的前体，包括木质素、类黄酮、异类黄酮、香豆素以及二苯乙烯。
代谢途径的产物典型地是具有改善的或新的功能的天然小分子或其变体，例如糖基化、酰化、氨基化、羟基化或甲基化上的不同。这些代谢物适合地作为芳香剂或调味剂或作为治疗分子(例如抗感染或用于癌症治疗)。
具体实例涉及用于从糖源生产香草醛的一个新的酵母细胞工厂，使用人工代谢途径的体细胞内拼接和重组。特别提供了用于从糖源生产香草醛的一个新的酵母细胞工厂，使用人工代谢途径的体细胞内拼接和重组。根据一个具体实例，在微生物中提供了用于从碳源生产香草醛的人工途径。该示例性生物转化方案需要六个步骤的酶催化版本。编码酶的基因可通过体细胞内重组被整合至酵母基因组中。确切地，防止将香草醛还原为香草醇可通过敲除宿主醇脱氢酶ADH6来实现。通过将羧酸还原酶蛋白用其激活偶联蛋白磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶整合，可破坏ADH6。
此处描述的实例是对本发明的说明并且不旨在对其进行限制。本发明的不同实施例已经根据本发明进行描述。可对此处描述和说明的技术进行多种修饰和变化，而不脱离本发明的精神和范围。因此，应理解，这些实例仅是说明性并且不限制本发明的范围。
实例
实例1：人工香草醛途径：使用苯丙氨酸作为前体化合物来产生香草醛 的代谢途径
由于香草醛不是一种内源代谢物，没有必要在酵母中重建一个合成生产途径。香草醛合成开始为具有苯丙氨酸的所有苯丙烷，该苯丙氨酸是通过该细胞内源产生的。需要六种酶用于将L-苯丙氨酸转化为香草醛(图1)。苯丙氨酸通过酶苯丙氨酸氨解酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)的连续作用被转化为香豆酸。以下步骤是香豆酸的还原链反应，产生4-羟基苯甲醛。该反应是通过激活香豆酸至由4CL酶(4-香豆酸辅酶A连接酶)提供的香豆酰-CoA，随后是ECH酶(烯酰-CoA水合酶/醛缩酶，巴豆酸酶家族酶)进行β-氧化起始的。下一步骤是通过HBH酶(羟基苯甲酸羟化酶、3-单加氧酶酶家族)在苯基环的3-位置上进行的羟基化。最终步骤3-O-甲基化，产生香草醛终产物。此步骤是由COMT酶(咖啡酸O-甲基转移酶、O-甲基转移酶酶家族)催化的。为了降低醛中间产物的内源转化，添加羧酸还原酶蛋白。
在酿酒酵母中，该CAR酶需要通过磷酸泛酰巯基乙胺化激活，并且这是通过共表达一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶实现的。
a)在酵母宿主细胞中的香草醛途径拼接
在此工作中使用的所有这些酿酒酵母菌株是来自BY4741的同基因单倍体并且是从EUROSCARF(单倍体a-materBY00或α-materBY10)获得的。酵母菌株BY47源自于包含营养缺陷型(-ura3，-leu2，his3)标记基因的敲除的一个菌株保藏。这些不同的菌株以及相关的基因型列于表2中。克隆的富集以及繁殖是在YPD液体培养物(10g/lBacto-酵母提取物，20g/lbacto-蛋白胨以及2％右旋糖)中在30℃下进行的。在不存在尿嘧啶或亮氨酸或组氨酸的情况下，在退出琼脂板(YNB+CSM)上选择重组体。尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸生物合成途径中的基因缺陷导致营养缺陷型。对于部分同源重组，我们使用一种错配缺陷型菌株(单倍体a-materBY00775或α-materBY10775、sgs1-、Euroscarf)。在GeneArt(德国)合成用于该途径的所有ORF并且然后通过PCR扩增。使用高保真度PhusionTaq(新英格兰生物实验室)进行扩增。扩增子是通过使用WizardPCR净化系统(普洛麦格公司(Promega))净化并且用于转化测定。
表2：在该工作中使用的酿酒酵母菌株的基因型(EUROSCARF)
采用一个三步骤途径来鉴定异源酶用于合成香草醛途径。第一批候选者在酵母中单独表达以对酶活性进行评价。第二，一旦鉴定所有这些酶，完全途径是使用一个体细胞内DNA拼接来拼接的。并且第三，演化是在酵母中使用部分同源体内重组和拼接在香草醛途径上进行的。
b)在酵母中单独表达的外源蛋白活性的表征。
第一，候选酶单独表达在酿酒酵母中并且针对活性进行测试(这些序列的来源的细节参见表3)。
表3：在这个实例中使用的基因的参考标识
针对每个基因，使用在bud31基因座的体内同源重组构建重组克隆(图2)。设计整合片段。T5’以及T3’对应于在酵母基因组上的bud31靶序列，允许同源整合到该染色体基因座上。URA以及LEU是用于双重选择的侧翼标记物。重叠序列对应于这些标记基因的5’部分以及3’部分。通过PCR扩增所有整合片段IF1-IF2-IF4和IF5，并且使用WizardPCR净化系统(普洛麦格公司(Promega))纯化扩增子。将合成的ORF从GeneArt质粒中扩增。用于扩增感兴趣的基因的上游寡核苷酸的5′端包含具有与该pGAL1启动子的3’端同源的40个核苷酸的序列。该下游寡核苷酸包含与该tCYC终止子的5’端同源的40-nt序列。通过在酵母中的同源重组拼接后，该双重选择允许该重组体选择。
对于每个转化，随机选择五个重组克隆并且该簇的正确整合是通过靶向PCR使用gDNA作为模板分析的。已经如下所述进行菌落PCR。将极小量的细胞(10μl尖端的边缘)重悬浮于包含15μl的溶解混合物(来自西格玛公司的100mMTris-HClpH＝7.5+5μL消解酶(10mg/mL))的PCR管中。将这些管首先在20℃孵育20min，然后在37℃孵育5min并且最终在95℃孵育5min。公司将2μl的每种裂解物混合物用在25-100μlDreamTaqPCR反应中，如由供应商表明的(菲门特斯(Fermentas))。用于测序的扩增的DNA是使用WizardPCR净化系统(普洛麦格公司(Promega))从引物分离的。
然后将重组克隆培养在诱导培养基中以允许合成蛋白。因为在此构建中，基因表达是通过诱导型GAL1启动子控制的，细胞生长于YPAGAL培养基(YEP培养基，用半乳糖作为唯一的碳源)中。生长24小时之后，用500μM适合的底物供给细胞。然后通过高效液相色谱法(HPLC)分析上清液以鉴定适合的产物。使用安捷伦1200系列HPLC系统使用ACE5-C18柱(4.6乘250mm，5-μm颗粒尺寸)分析在香草醛生物合成以及香草醛分解代谢物中的中间体。测定一个乙腈/水梯度并且使用二极管阵列检测器对洗脱的化合物通过其在260nm、280nm以及320nm的UV荧光进行检测。所有标准品是从西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)获得的。
c)香草醛途径的拼接。
第二，一旦鉴定所有这些酶，完全途径是使用一个体细胞内DNA拼接来拼接的。包含该香草醛途径的6个基因的8个片段(F1至F8)是通过计算机分析设计的。这些片段、ORF的连同上游和下游序列示于图3中(对于每个片段的扩增，参见表4和表5，这些序列的来源的细节，参见表3)。
表4：用于在同源重组中使用的这些片段的扩增的引物
表5：用于在实例1和2中使用的该香草醛基因的上游和下游序列的参考标识
片段杂交并且在每几个基因的整个ORF的区中重组在一起。通过此方式，整个途径在酵母细胞中拼接，并且然后整合至该染色体中。Tg5’以及Tg3’对应于酵母基因组上的靶序列，该靶序列对应于引发同源整合至所希望的染色体位点中的酵母染色体的BUD31基因座中的插入位点。HIS3和LEU2是使得能够对重组途径进行双重选择的侧翼标记。每个基因处于允许其在酵母细胞表达的一个启动子以及一个终止序列的控制下。通过同源重组在酵母中拼接片段之后，重构20291bp的一个功能性完全途径并且该双重选择允许分离重组体。
通过PCR扩增所有片段，并且使用WizardPCR净化系统(普洛麦格公司(Promega))纯化扩增子。如通过吉士(Gietz)和伍兹(Woods)所述的进行感受态酵母细胞的转化(通过LiAc/ss载体DNA/PEG方法转化酵母(TransformationofyeastbytheLiAc/ssCarrierDNA/PEGmethod)，酶学方法(Meth.Enzymol.)，350，87-96)，进行一些修饰以优化DNA输入的体积。将细胞预培养于YPD培养基中并且然后用以接种新的丰富培养基。当OD600超出0.6时收获它们，将该球粒洗涤两次并且以1/50体积浓缩。将感受态细胞添加到具有250ng的每种片段(F1-F2-F3-F4-F5-F6-F7以及F8)的转化PEG/LiAC/ssDNA混合物中。此外感受态细胞未受DNA转化(阴性对照)。重组克隆的选择是在不具有His和Leu的培养基上进行的。在3天之后，在选择培养基上观察到用不同片段转化的克隆。随机选择3个克隆(Y00VAN)用于序列和活性分析。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(普洛麦格公司(Promega))制备分离的和基因组DNA(gDNA)。然后，也验证了这些片段的正确拼接的特异性引物扩增这些克隆中的每个的7个香草醛基因。克隆的分析揭示已拼接这些基因，得到正确的ORF。
d)香草醛途径在酵母中的表达。
→在野生型酵母菌株(Y00VAN)中的香草醛途径表达。
我们首先分析在没有表达CAR蛋白的野生型酵母菌株中的香草醛途径。因为一些香草醛基因受诱导型启动子控制，诸如GAL1/10(用于ECH和HBH)以及MET2(用于PAL)。酵母培养物是在诱导条件下生长：在不存在甲硫氨酸并且添加苯丙氨酸作为前体(10mM)的情况下，包含半乳糖作为唯一碳源的基本培养基。进行培养持续至少60小时。通过离心以及上清液回收收获它们。作为对照，我们在与Y00VAN(表达香草醛途径基因的克隆)相同的条件下使用Y00野生型菌株(无香草醛基因)以及不具有酵母的培养基培养。使用HPLC来测量在酿酒酵母培养中香草醛以及途径中间体的产生。分析显示，相较于Y00对照，来自细胞表达香草醛途径基因(Y00VAN)的色谱图包含额外的峰。通过与我们的分子文库进行比较来鉴定这些峰。因此，鉴定肉桂酸、香豆酸、4羟基苯甲酸、3-4二羟基苯酸以及香草酸。未检测到4羟基苯甲醛、3-4二羟基苯甲醛以及香草醛。当Y00VAN培养用500μM的3-4二羟基苯甲醛供应时，检测到香草醛、香草酸以及香草醇。从酸衍生物的偏离直接发生在该链的还原步骤之后。最终当细胞用3-4二羟基苯甲醛以总诱导培养基供应时，检测到大部分中间体前体连同最终产物(图4)。
然后Y00VAN生长于富YPAGAL培养基中：具有半乳糖作为唯一碳源并且具有苯丙氨酸作为前体(10mM)的YEP培养基。我们假定包含在该培养基中的甲硫氨酸的量被快速消耗并且然后诱导pMET启动子。使用丰富培养基观察到更高细胞生长。使用HPLC分析上清液并且与Y00上清液组合物比较。60h之后，在上清液中检测到大量的3-4二羟基苯酸以及香草酸(图5)。
当该培养未通过外源苯丙氨酸补充时，该PAL蛋白使用内源苯丙氨酸。该途径完全作为3-4二羟基苯酸起作用并且检测到香草酸，但产率相较于苯丙氨酸补充的培养基被减少4倍(图5)。苯丙氨酸的内源生物合成通过一个常见途径使用其他芳香族氨基酸进行到分支酸酯并且供应香草醛途径。
→经修饰的酵母菌株(Y00CP)中的香草醛途径表达。
在香草醛途径中，许多中间体前体是醛类。然而已知醛是许多内源酶的底物，导致相对的醇或酸衍生物。在Y00VAN中，醛在还原链反应之后在酸衍生物中立即氧化并且未检测到香草醛。为了减少这种转化，将羧酸还原酶蛋白与其激活偶联蛋白磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶一起添加。将双顺反子构建体通过同源重组使用URA作为选择标记物整合至酵母基因组ADH6基因座中。通过敲除宿主醇脱氢酶ADH6来实现防止将香草醛还原为香草醇。为了拿走选择标记物，侧翼重复序列被添加到URA3基因中以允许URA3基因切除。在-URA选择性培养基上选择重组细胞并且通过PCR验证正确的整合。URA3编码隐含在尿嘧啶合成中的乳清苷(oritidine)5’磷酸脱羧酶。通过URA3在5氟尿嘧啶中转化5FOA(5氟乳清酸)。这种有毒代谢物是有利于切除具有侧翼重复序列的URA3(导致ura3基因型)的选择压力。酵母菌株被称为Y0CP。当将Y0CP培养用500μM的香草酸供应时，在上清液中检测到香草醛，指示CAR是功能性的。
重组菌株Y0CPVAN包括完全香草醛途径。
e)使用来自香草醛途径的基因的部分同源重组和拼接的演化。
使用部分同源重组和拼接产生来自香草醛途径的复合体嵌合基因的文库。在此试验中，拼接/重组每种酶的两个同源基因。为了进行部分同源重组，通过引入途径基因的相关序列重新设计三个片段，图7(针对F4’、F6’以及F7’片段的扩增，参见表6)。F04’包含PAL和C4H的部分同源基因，其与其他亲本序列分别享有91％和90％同源性。F06’包含ECH和HBH的部分同源基因，其与其他亲本序列分别享有88％和77％同源性。F07’包含部分同源COMT，其与其他亲本序列享有73％同源性。
每个片段杂交并且在每个部分同源基因的整个ORF的区中重组。通过此方式，将全部的嵌合途径拼接、重组并且整合到错配修复缺陷型酵母细胞的染色体中。通过部分同源重组在酵母中拼接片段之后，重构20291bp的一个功能性完全途径并且该双重选择允许分离重组体。
表6：用于替代片段的扩增的引物
通过PCR扩增片段F1-F2-F3-F4’-F5-F6’-F7’和F8并且使用纯化的扩增子以转化错配修复酵母。将Y10775CP细胞预培养于YPD培养基中并且然后用以接种新的丰富培养基。当OD600超出0.6时收获它们，将该球粒洗涤两次并且以1/50体积浓缩。将感受态细胞添加到具有250ng的每种片段的转化PEG/LiAC/ssDNA混合物中。此外感受态细胞未受DNA转化(阴性对照)。重组克隆的选择是在不具有His和Leu的培养基上进行的。在3天之后，在选择培养基上观察到用不同片段转化的克隆。随机选择3个克隆(Y00VANev)用于序列和活性分析。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(普洛麦格公司(Promega))制备分离的和基因组DNA(gDNA)。然后，也验证了这些片段的正确拼接的特异性引物扩增这些克隆中的每个的7个香草醛基因。克隆的分析揭示已拼接这些基因，得到正确的ORF。
香草醛从糖源的生物转化
在经修饰的宿主菌株中拼接香草醛途径。为了将香草醛酸还原为香草醛，将羧酸还原酶与其激活偶联蛋白磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶一起添加。将双顺反子构建体通过同源重组使用URA作为选择标记物整合至酵母基因组ADH6基因座中。通过敲除宿主醇脱氢酶ADH6来实现防止将香草醛还原为香草醇。然后将修饰的菌株预培养于YPD培养基中并且然后用以接种新的丰富培养基。当OD600超出0.6时收获它们，将该球粒洗涤两次并且以1/50体积浓缩。将感受态细胞添加到具有250ng的每种片段(F1-F2-F3-F4-F5-F6-F7以及F8)的转化PEG/LiAC/ssDNA混合物中。重组克隆的选择是在不具有His和Leu的培养基上进行的。在3天之后，在选择培养基上观察到用不同片段转化的克隆。然后，也验证了这些片段的正确拼接的特异性引物扩增这些克隆中的每个的7个香草醛基因。克隆的分析揭示已拼接这些基因，得到正确的ORF。
包含全部途径的重组体菌株生长在诱导条件下：包含半乳糖作为唯一碳源的基本培养基。进行培养持续至少24小时。通过离心以及上清液回收收获它们。使用HPLC来测量在酿酒酵母培养中香草醛以及途径中间体的产生。分析显示，相较于Y00对照，来自细胞表达香草醛途径基因(Y00VAN)的色谱图包含额外的峰。通过与我们的分子文库进行比较来鉴定这些峰(图12)。因此，未检测到肉桂酸和香豆酸；然而，鉴定了4羟基苯甲醛(8.6μM)、3-4二羟基苯甲醛(0.29μM)、3-4二羟基苯甲酸(22.64)、香草酸(2μM)和香草醛(1μM)。没有香草醇存在。
实例2：人工香草醛途径：使用苯丙氨酸作为前体化合物来产生阿魏酸 的代谢途径
a)人工阿魏酸途径
需要五种酶用于将L-苯丙氨酸转化为阿魏酸(图8)。苯丙氨酸通过酶PAL和C4H的连续作用被转化为香豆酸。在针对第二途径的反应的建议序列中，通过pheA蛋白(酚羟化酶)使用黄素还原酶偶联蛋白，香豆酸首先在苯环的3-位置上羟基化。该中间代谢物是咖啡酸。然后O-甲基化在甲氧基中发生羟基功能转化，导致使用COMT蛋白合成阿魏酸。大部分蛋白对于两个途径都是常见的。它们的不同在于反应的顺序。此顺序主要归因于羟基化反应以及选择以进行此反应的两种酶(PheA以及HBH)的特异性。在此途径中使用的PAL、C4H以及COMT蛋白是与香草醛途径相同的候选物。有趣地注意到，将一种CoA-连接酶和一种巴豆酸酶添加到阿魏酸途径导致香草醛产生。
b)在酵母宿主细胞中的阿魏酸途径拼接
类似于香草醛途径，包含阿魏酸途径的5个基因的7个片段(F1、F8、F9、F10、F11、F12、F13)是通过计算机分析设计的。这些片段、ORF的连同上游和下游序列示于图9中(这些序列的来源的细节参见表3和表7，每个片段的扩增参见表8)。HIS3和LEU2是使得能够对重组途径进行双重选择的侧翼标记。每个基因具有允许其在酵母细胞中表达的一个启动子以及一个终止子序列。通过部分同源重组在酵母中拼接片段之后，重构19068bp的一个功能性完全途径并且该双重选择允许分离重组体。
表7：在这个实例中使用的补充基因的参考标识
表8：用于在阿魏酸途径中使用的这些片段的扩增的引物
c)香豆酸的3-羟基化
因为所有酶对于香草醛途径是常见的，除了隐含在香豆酸的3羟基化中的那些，PheA以及Flared单独或一起表达在酵母中并且使用体内酶测定针对活性进行测试。基因组整合策略被用以克隆两个序列。通过PCR扩增所有整合片段IF1-IF2-IF4和IF5，并且纯化扩增子。从GeneArt质粒扩增PheA以及flared。单倍体a-materBY00被用以克隆pheA基因，并且α-materBY10被用以克隆flared基因。通过在酵母转化体中的同源重组拼接后，该双重选择允许该重组体分离。对于每个转化，随机选择五个重组克隆并且该簇的正确整合是通过靶向PCR从gDNA分析的。通过对Y00-PheA和Y10-flared消光以共表达两种蛋白而产生二倍体菌株。然后将表达pheA、flared或PheA以及flared两者的重组克隆培养在YPAGAL诱导培养基中以允许合成蛋白。生长24小时之后，用500μM香豆酸供给细胞。然后通过HPLC分析上清液。用500μM香豆酸供给重组细胞培养基，并且在上清液中检测到咖啡酸(图10)。
实例3：香草醛从葡萄糖碳源的生物转化
为了使细胞适合于发酵，修饰途径以将葡萄糖转化为香草醛。去除诱导型启动子pGAL以及pMET并且改变成组成型启动子。此外，我们在一个片段中引入编码羧基还原酶及其调控组分磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因。类似于实例1，包含该香草醛途径的9个基因的8个片段(F14、F15、F16、F17、F18、F19、F20以及F8)是通过计算机分析设计的。这些片段、ORF的连同上游和下游序列示于图13中(这些序列的来源的细节参见表9)。HIS3和LEU2是使得能够对重组途径进行双重选择的侧翼标记。每个基因具有允许其在酵母细胞中表达的一个启动子以及一个终止子序列。通过部分同源重组在酵母中拼接片段之后，重构28593bp的一个功能性完全途径并且该双重选择允许分离重组体。
表9：用于该香草醛基因的上游和下游序列的参考标识
通过PCR扩增所有片段，并且使用WizardPCR净化系统(普洛麦格公司(Promega))纯化扩增子。感受态酵母细胞的转化是用8个DNA片段的克分子数相等的混合物进行的。此外，感受态细胞是用缺少一个(8个阴性对照)片段的克分子数相等的混合物转化的。重组克隆的选择是在不具有His和Leu的培养基上进行的。3天之后，在选择培养基上观察到用不同片段转化的克隆，该选择培养基仅用于包含所有8个片段的转化。所有阴性对照是阴性的。
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Claims (17)

1.一种细胞，该细胞包括编码多酶复合体的异源多核苷酸，该多酶复合体参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成，该多酶复合体包括用于香豆酸的生物合成的以下各项酶，这些酶包括苯丙氨酸氨解酶(PAL)、酪氨酸氨解酶(TAL)或苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶(PAL/TAL)中的任一种，以及任选地一种或多种另外的酶以将芳香族氨基酸转化为香豆酸，其中该多酶复合体进一步包括将香豆酸转化为香草醛或其羟基苯甲醛前体的酶，包括巴豆酸酶。
2.根据权利要求1所述的细胞，该多酶复合体包括
a)苯丙氨酸氨解酶(PAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、细胞色素P450还原酶(CPR)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；
b)酪氨酸氨解酶(TAL)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶；或者
c)苯丙氨酸/酪氨酸氨解酶(PAL/TAL)、肉桂酸羟化酶(C4H)、细胞色素P450还原酶(CPR)、辅酶A连接酶、巴豆酸酶、3-单加氧酶和甲基转移酶。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中该多酶复合体包括
a)巴豆酸酶，优选烯酰-辅酶A水合酶(ECH)；
b)辅酶A连接酶，优选4-香豆酸-辅酶A连接酶(4CL)；
c)3-单加氧酶，优选酚羟化酶(PheA)和黄素还原酶(FLARED)或羟基苯甲酸羟化酶(HBH)；和/或
d)甲基转移酶，优选O-甲基转移酶，优选3-O-甲基转移酶或4-O-甲基转移酶，优选咖啡酸O-甲基转移酶(COMT)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中该巴豆酸酶是以下项中的任一项的烯酰-辅酶A水合酶(ECH)
a)负责p-香豆酰辅酶A和/或阿魏酰辅酶A的链还原反应的ECH；
b)将p-香豆酰辅酶A转化为4-羟基苯甲醛的ECH；或者
c)将阿魏酰辅酶A转化为香草醛的ECH。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞，该细胞进一步包括
a)编码羧基还原酶(CAR)的异源多核苷酸，任选地连同编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)的多核苷酸；和/或
b)编码醇氧化酶、优选香草醇氧化酶的异源多核苷酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞，其中该细胞是真核细胞或原核细胞，优选地选自下组，该组由以下各项组成：酵母、哺乳动物、昆虫、植物和细菌的细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞，其中该细胞是DNA修复缺陷型细胞或包括在DNA修复缺陷型细胞中拼接的多核苷酸簇的生产细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞，其中编码一系列酶的多核苷酸由单个多顺反子操纵子表达，或其中编码一系列酶的多核苷酸编码由分离的启动子表达。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞，其中这些多核苷酸被稳定地整合至该细胞基因组中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞，其中这些多核苷酸源自至少两种不同的物种。
11.根据定义1至10中任一项所述的细胞，其中这些酶中的至少一个是嵌合酶。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中该嵌合酶是
a)由不同多核苷酸片段构成的核苷酸序列编码的，这些片段被拼接成嵌合核苷酸序列；和/或
b)由亲本多核苷酸中的一种或多种核苷酸的插入、缺失和/或替代而获得核苷酸序列编码的。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的细胞，其中该香草素选自下组，该组由以下各项组成：香草醛、香草酸、乙基-香草醛、香草醇和香草醛-糖苷。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞，其中该羟基苯甲醛前体选自下组，该组由以下各项组成：原儿茶醛、原儿茶酸、儿茶醇、4-羟醛、4-羟基苯甲酸、4-羟基苄醇、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸。
15.通过将编码参与苯丙烷代谢途径和香草素或其羟基苯甲醛前体的生物合成的多酶复合体的异源多核苷酸引入至根据权利要求1至14中任一项所述的细胞的基因组中来工程化该细胞的方法，该方法包括
a)提供编码个体酶的多核苷酸；
b)将这些多核苷酸拼接至簇中并且优选地通过体内重组将所述簇整合至该细胞基因组中；并且
c)任选地工程化生产细胞，其中将所述簇稳定地整合至该生产细胞基因组中。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的细胞用于代谢产物的异源生物合成的用途，优选地其中该产物是香草素或其羟基苯甲醛前体。
17.通过利用多酶复合体转化前体化合物来异源生物合成香草素或其羟基苯甲醛前体的方法，该方法包括
a)提供根据权利要求1至14中任一项所述的细胞；
b)在该前体化合物存在的情况下，在细胞培养物中培养所述细胞，优选地其中该前体化合物是天然氨基酸或单糖；
c)累积生物合成产物，优选地其中所述产物是
i.香草素，选自下组，该组由以下各项组成：香草醛、香草酸、乙基-香草醛、香草醇和香草醛-糖苷；或者
ii.羟基苯甲醛前体，选自下组，该组由以下各项组成：原儿茶醛、原儿茶酸、儿茶醇、4-羟醛、4-羟基苯甲酸、4-羟基苄醇、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸和阿魏酸；
并且
d)从该细胞培养基分离所述产物。
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