BR112015015594A2 - Célula, método de produção de uma célula, uso de uma célula e método de biossíntese heteróloga de um valinoide - Google Patents

Abstract

célula, método de produção de uma célula, uso de uma célula e método de biossíntese heteróloga de um valinoide" a invenção refere-se a uma célula compreendendo polinucleotídeos heterólogos codificando um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, cujo complexo multienzimático compreende enzimas para a biossíntese de ácido cumárico e uma crotonase.

Description

CÉLULA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA, USO DE UMA CÉLULA E MÉTODO DE BIOSSÍNTESE HETERÓLOGA DE UM VALINOIDE

Domínio Da Invenção

[001] A invenção refere-se a uma célula compreendendo polinucleotídeos heterólogos codificando um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e seu uso na biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído.

Antecedentes

[002] A vanilina é um dos compostos aromáticos que conferem sabor mais importantes usados em alimentos, bebidas, perfumes, e produtos farmacêuticos. A vanilina natural que é extraída de favas da orquídea Vanilla planifolia é relativamente dispendiosa. A produção da fava de baunilha é um processo demorado que depende muito do solo e condições climáticas adequadas. As favas aparecem após 4-5 anos de cultivo e o aroma é desenvolvido no fruto após um longo processo chamado de “cura” que demora 6 meses. A demanda de vanilina natural pelos consumidores excede muito a quantidade de vanilina extraída de fontes vegetais. Menos de 5 % da produção mundial de vanilina provém da baunilha natural. Devido à escassez e custo do extrato de baunilha natural, tem havido interesse, desde há muito tempo, na produção sintética do seu componente predominante. Vanilina (4-hidroxi-3metoxibenzaldeído) é o principal componente organoléptico do sabor de baunilha.

[003] Uma vez que a demanda de vanilina é maior do que a que pode ser extraída de favas da orquídea Vanilla planifolia, o restante é produzido por meios alternativos A síntese química é a fonte mais importante de vanilina. A vanilina foi primeiramente sintetizada a partir de eugenol presente em óleo de cravo e posteriormente foi sintetizada a partir de licor de sulfito contendo lignina, um produto secundário do processamento de pasta de

2/83 madeira na fabricação de papel. Não obstante alguma vanilina ainda ser produzida a partir de resíduos de lignina, no presente a maior parte da vanilina sintética é sintetizada em um processo de duas etapas a partir dos precursores petroquímicos: guaiacol e ácido glioxílico. A vanilina também pode ser produzida quimicamente por degradação molecular de curcumina, eugenol ou piperrina.

[004] A grande diferença entre os preços da vanilina natural e sintética, a demanda crescente dos clientes de aromas “naturais” e “saudáveis”, e o atendimento de reivindicações de mercadologia “natural” têm conduzido a um interesse crescente da indústria dos produtos aromáticos em produzir vanilina natural a partir de outras fontes naturais por bioconversão^{1 2,3,4,5}. O uso de células microbianas e suas enzimas como biocatalisadores na síntese de químicos nobres tem atraído muita atenção no domínio da química verde e biotecnologia branca. Os produtos de tal bioconversão são considerados naturais desde a Legislação da Comunidade Européia (incorpora produtos que são fabricados a partir de fontes biológicas por células vivas ou suas enzimas sob a designação “produtos naturais”.

[005] Abordagens alternativas de base biotecnológica para a produção são baseadas na bioconversão de lignina, estilbenos fenólicos, isoeugenol, eugenol, ácido ferúlico, ou aminoácidos aromáticos, e em biossíntese de novo, aplicando células de fungos, bactérias, plantas, ou microrganismos geneticamente modificados. Apesar de a produção de vanilina via conversão de isoeugenol ter sido amplamente relatada em vários microrganismos, incluindo Aspergillus nigef·, estirpes dos gêneros Klebsiella, Enterobacter, e Serratia⁷; Rhodococcus rhodochrous³·, Bacillus subtilis B2⁹ ; Bacillus fusiformis¹⁰ ; B. subtilis HS8 ¹¹ ; Pseudomonas nitroreducens¹²; Pseudomonas putida™ ; Pseudomonas chlororaphis™ ; Bacillus pumilus^⁵·, e Nocardia iowensis'⁸. A síntese de novo a partir de glucose usando estirpes de

3/83 levedura metabolicamente manipuladas foi recentemente descrita¹⁷.

[006] S. cerevisiae é uma fábrica celular valiosa de base para a produção de produtos biotecnológicos industriais de alto valor. Está bem adaptada a processos de biorrefino devido a sua capacidade de fermentação com reciclagem de células e sua tolerância notável contra vários estresses, como baixo pH, alta temperatura, e vários inibidores 18. Adicionalmente, S. cerevisiae é um organismo modelo extremamente bem caracterizado, facilitando a produção metabólica19,20 devido à disponibilidade da sequência genômica completa e caracterização detalhada de vias metabólicas21.

[007] US6372461B1 descreve a síntese de vanilina a partir de uma fonte de carbono, por uma etapa de conversão catalisada por micróbios requerendo cinco enzimas que são proporcionadas por um micróbio recombinante, e uma etapa de redução catalisada por enzimas para reduzir ácido vanílico por uma aril-aldeído desidrogenase.

[008] EP2388333A2 descreve uma célula microbiana capaz de produzir vanilina, compreendendo pelo menos três atividades enzimáticas heterólogas, isto é, atividades de 3-desidroshiquimato desidratase, ácido carboxílico aromático redutase e 3 O-metil transferase.

[009] WO2011124693A1 descreve métodos de geração de mosaicos genéticos por recombinação homeóloga in vivo, pelos quais podem ser construídas vias metabólicas, que não existem na natureza.

[0010] US2003/070188 A1 descreve uma via biossintética de vanilina que compreende a conversão de ácido p-cumárico em phidroxibenzaldeído, e a produção de vanilina em Vanilla planifolia cultivada, ou células e plantas transgênicas com produção melhorada de vanilina.

[0011] Hansen et al. (Appl Environ Microbiol. 2009; 75(9): 27652774) descrevem a biossíntese de novo de vanilina em levedura de fissão (Schizosaccharomyces pombe) e levedura de padeiro (Saccharmomyces

4/83 cerevisiae). As vias manipuladas começam com ácido desidroshiquímico usado como substrato.

[0012] Di Gioia et al. (J. Biotechnol. 2011; 156: 309-316) descrevem a produção metabólica de Pseudomonas fluorescens para a produção de vanilina a partir de ácido ferúlico.

[0013] Brochado et al. (Microbial Cell Factories 2010; 9: 84) descrevem produção melhorada de vanilina em levedura de padeiro através de planejamento in silico.

[0014] Priefert et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001; 56: 296314) descrevem a produção biotecnológica de vanilina e as diferentes vias de biossíntese com base na bioconversão de lignina, estilbenos fenólicos, isoeugenol, eugenol, ácido ferúlico, ou aminoácidos aromáticos.

[0015] Kaur et al. (Appl. Biochem. Microbiol. 2013; 169: 13531372) apresentam uma revisão de abordagens biotecnológicas e moleculares para a produção de vanilina.

Resumo Da Invenção

[0016] O objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma capacidade intensificada ou nova de formação de vanilina por biossíntese em uma célula hospedeira introduzindo uma enzima ou via em uma célula hospedeira.

[0017] O objetivo é resolvido pelo assunto da presente invenção.

[0018] De acordo com a invenção, é proporcionada uma célula compreendendo polinucleotídeos heterólogos codificando um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, cujo complexo multienzimático compreende enzimas para a biossíntese de ácido cumárico e uma crotonase. No presente documento, ácido cumárico é particularmente entendido como ácido p-cumárico.

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[0019] Em particular, a invenção proporciona uma célula compreendendo polinucleotídeos heterólogos codificando um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, cujo complexo multienzimático compreende enzimas para a biossíntese de ácido cumárico incluindo qualquer uma de fenilalanina amônia liase (PAL), tirosina amônia liase (TAL), ou fenilalanina/tirosina amônia liase (PAL/TAL), e opcionalmente uma ou mais enzimas adicionais para converter um aminoácido aromático em ácido cumárico, em que o complexo multienzimático compreende adicionalmente enzimas para converter ácido cumárico em vanilina ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, incluindo uma crotonase.

[0020] O valinoide ou o precursor hidroxialdeído pode ser comercialmente usado como tal, isto é, como um produto final, ou como um intermediário, por exemplo, para produzir adicionalmente derivados ou produtos finais usando o intermediário como precursor.

[0021] De acordo com um aspecto específico, o complexo multienzimático compreende pelo menos todas as enzimas necessárias para a biossíntese de vanilina usando ácido cumárico como precursor, ou todas as enzimas necessárias para a biossíntese de vanilina, ou intermediários ou metabolites da via de biossíntese de vanilina a partir de uma fonte de carbono, por exemplo, as que são necessárias para a conversão em vanilina, como as descritas aqui.

[0022] De acordo com um aspecto específico adicional, o complexo multienzimático compreende pelo menos todas as enzimas para a biossíntese de ácido cumárico usando um aminoácido aromático como precursor, pelo menos as que são necessárias para a conversão em ácido cumárico, como as descritas aqui.

[0023] Especificamente, o

complexo multienzimático

6/83 compreende fenilalanina amônia liase (PAL), ácido cinâmico hidroxilase (C4H), citocromo P450 redutase (CPR), uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3mono-oxigenase e uma metiltransferase.

[0024] De acordo com um aspecto específico adicional, o complexo multienzimático compreende tirosina amônia liase (TAL), uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase.

[0025] De acordo com outro aspecto específico, o complexo multienzimático compreende fenilalanina/tirosina amônia liase (PAL/TAL), ácido cinâmico hidroxilase (C4H), citocromo P450 redutase (CPR), uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase.

[0026] De acordo com uma modalidade específica, o complexo multienzimático compreende uma CoA ligase, preferencialmente 4-cumaratoCoA ligase (4CL).

[0027] De acordo com outra modalidade específica, o complexo multienzimático compreende uma 3-mono-oxigenase, preferencialmente fenolhidroxilase (PheA) e flavinredutase (FLARED), ou ácido hidroxibenzoico hidroxilase (HBH).

[0028] De acordo com outra modalidade específica, o complexo multienzimático compreende uma metiltransferase, preferencialmente uma Ometiltransferase, preferencialmente uma 3-O-metiltransferase ou uma 4-Ometiltransferase, preferencialmente ácido cafeico O-metiltransferase (COMT).

[0029] De acordo com outra modalidade específica, a crotonase é enoil-CoA hidratase (ECH).

[0030] De acordo com um aspecto específico, a crotonase é uma ECH responsável pela reação de redução de cadeia em p-cumaroilCoA e/ou feruloilCoA.

[0031] De acordo com um aspecto específico, a crotonase é uma ECH convertendo p-cumaroilCoA em 4-hidroxibenzaldeído.

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[0032] De acordo com um aspecto específico adicional, a crotonase é uma ECH convertendo feruloilCoA em vanilina.

[0033] De acordo com um aspecto específico, a célula compreende adicionalmente

[0034] a) um polinucleotídeo heterólogo codificando uma carboxirredutase (CAR), opcionalmente em conjunto com um polinucleotídeo codificando uma fosfopanteteinil transferase (PPTase); e/ou

[0035] b) um polinucleotídeo heterólogo codificando uma álcool oxidase, preferencialmente álcool vanilílico oxidase (VAO).

[0036] De acordo com uma modalidade específica, os polinucleotídeos codificam uma série de enzimas expressas a partir de um único óperon policistrônico, ou codificam uma série de enzimas expressas a partir de promotores separados.

[0037] Preferencialmente, os polinucleotídeos são integrados de modo estável no genoma da célula.

[0038] A célula pode ser uma célula eucariótica ou procariótica, preferencialmente selecionada do grupo consistindo de células de levedura, mamífero, inseto, planta e bacterianas.

[0039] Em particular, a célula é uma célula deficiente em reparação de DNA, incluindo qualquer célula deficiente em reparação de emparelhamentos defeituosos (MMR) ou qualquer outra deficiência na reparação de DNA, ou uma célula de produção compreendendo um agregado de polinucleotídeos montados em uma célula deficiente em reparação de DNA.

[0040] Especificamente, os polinucleotídeos são originários de pelo menos duas espécies diferentes.

[0041] De acordo com um aspecto específico, pelo menos uma das enzimas é uma enzima quimérica.

[0042] De acordo com a invenção, é particularmente

8/83 proporcionada uma célula compreendendo um complexo multienzimático compreendendo polinucleotídeos heterólogos codificando pelo menos cinco enzimas, preferencialmente pelo menos seis enzimas, preferencialmente pelo menos sete enzimas envolvidas na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, em que pelo menos uma das enzimas é uma enzima quimérica.

[0043] Em uma modalidade preferencial, a enzima quimérica é preferencialmente

[0044] a) codificada por uma sequência de nucleotídeos que é composta de fragmentos de diferentes polinucleotídeos, cujos fragmentos são montados em uma sequência de nucleotídeos quimérica; e/ou

[0045] b) codificada por uma sequência de nucleotídeos que é obtida por inserção, deleção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um polinucleotídeo parental.

[0046] Especificamente, o polinucleotídeo codificando a enzima quimérica é composto de fragmentos de diferentes polinucleotídeos, preferencialmente com uma identidade de sequência de pelo menos 30 %, cujos fragmentos são montados em uma sequência de nucleotídeos quimérica. Adicionalmente, os fragmentos podem ser opcionalmente mutagenizados de modo a incluírem sequências mutadas derivadas de um ou mais polinucleotídeos, por exemplo, com mutação por inserção, deleção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos.

[0047] Em alternativa, o polinucleotídeo codificando a enzima quimérica é derivado de apenas um polinucleotídeo parental, e um mosaico genético obtido, por exemplo, por mutagênese, ou por inserção, deleção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos.

[0048] De acordo com a invenção, é adicionalmente proporcionado um método de produção de uma célula da presente invenção,

9/83 por introdução de polinucleotídeos heterólogos codificando um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, no genoma da célula, compreendendo

a) proporcionar os polinucleotídeos codificando as enzimas individuais, opcionalmente em que pelo menos um dos polinucleotídeos é composto de fragmentos de diferentes polinucleotídeos, cujos fragmentos são montados em uma sequência de nucleotídeos quimérica;

b) montar os polinucleotídeos em um agregado e integrar o referido agregado no genoma da célula, preferencialmente por recombinação in vivo; e

[0049] c) opcionalmente manipular uma célula de produção, em que o referido agregado é integrado de modo estável no genoma da célula de produção.

[0050] Especificamente, pelo menos dois polinucleotídeos diferentes codificando uma enzima individual são proporcionados como polinucleotídeos completos ou respectivos fragmentos, preferencialmente com uma identidade de sequência de pelo menos 30 %, e os polinucleotídeos são montados e recombinados por recombinação homeóloga in vivo, desse modo gerando uma sequência de nucleotídeos quimérica com pelo menos um cruzamento, preferencialmente um mosaico genético.

[0051] De acordo com uma modalidade específica, em um procedimento de etapa única

[0052] a) a célula é transformada com uma mistura dos referidos polinucleotídeos completos ou fragmentos; e

[0053] b) a sequência de nucleotídeos quimérica é recombinada em um local de integração do genoma da célula,

[0054] em que

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[0055] i) a sequência 5’-terminal do referido polinucleotídeo tem uma sequência flanqueadora alvo que é ancorada à extremidade 3’ do referido local de integração, e

[0056] ii) a sequência 3’-terminal do referido polinucleotídeo tem uma sequência flanqueadora alvo que é ancorada à extremidade 5’ do referido local de integração,

[0057] e

[0058] c) clones compreendendo um mosaico genético são selecionados.

[0059] Especificamente, é proporcionado um método em que pelo menos um dos polinucleotídeos é composto de fragmentos de diferentes polinucleotídeos, cujos fragmentos são montados em uma sequência de nucleotídeos quimérica em um procedimento de etapa única, em que

[0060]	a)	a célula é	transformada com	os referidos
polinucleotídeos; e
[0061]	b)	a sequência	de nucleotídeos	quimérica é

recombinada em um local de integração do genoma da célula,

[0062] em que

[0063] i) a sequência 5’-terminal do referido polinucleotídeo tem uma sequência flanqueadora alvo que é ancorada à extremidade 3’ do referido local de integração, e

[0064] ii) a sequência 3’-terminal do referido polinucleotídeo tem uma sequência flanqueadora alvo que é ancorada à extremidade 5’ do referido local de integração,

[0065] e

[0066] c) clones compreendendo um mosaico genético são selecionados.

[0067] Especificamente, polinucleotídeos codificando uma série

11/83 de pelo menos duas enzimas são proporcionados como polinucleotídeos completos ou fragmentos de origem diferente, em que

[0068] - a sequência 5’-terminal é do polinucleotídeo codificando a primeira enzima da série; e

[0069] - a sequência 3’-terminal é do polinucleotídeo codificando a última enzima da série.

[0070] Especificamente, os polinucleotídeos codificam uma série de enzimas e pelo menos um dos polinucleotídeos completos ou fragmentos é uma molécula recombinada compreendendo

[0071] a) uma parte 5’, que compreende uma sequência de nucleotídeos da primeira enzima da série;

[0072] b) uma parte 3’, que compreende uma sequência de nucleotídeos da segunda enzima da série; e

[0073] c) uma sequência terminadora e uma sequência promotora entre a parte 5' e a parte 3'.

[0074] Especificamente, são proporcionadas pelo menos duas moléculas recombinadas, em que a parte 3’ da primeira molécula recombinada tem uma homologia de sequência de pelo menos 30 % com a parte 5’ da segunda molécula recombinada.

[0075] De acordo com a invenção, é adicionalmente proporcionada uma molécula recombinada compreendendo

a) uma parte 5’, que compreende uma sequência de nucleotídeos de uma primeira enzima em uma série de enzimas de um complexo multienzimático;

b) uma parte 3’, que compreende uma sequência de nucleotídeos de uma segunda enzima da série; e

c) uma sequência terminadora e uma sequência promotora entre a parte 5' e a parte 3'.

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[0076] A primeira e segunda enzimas podem estar na ordem de reações enzimáticas consecutivas, ou não, por exemplo, em uma ordem diferente.

[0077] De acordo com um aspecto específico, o método compreende adicionalmente produzir um repertório de células, que diferem entre si no mosaico genético codificando uma enzima quimérica.

[0078] De acordo com a invenção, é adicionalmente proporcionada uma biblioteca de células compreendendo um repertório que pode ser obtido por um método da invenção, preferencialmente uma biblioteca compreendendo pelo menos 100 clones, preferencialmente pelo menos 200, 300, 400, 500, 1.000, 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, ou pelo menos 10.000 clones diferentes.

[0079] De acordo com a invenção, é adicionalmente proporcionado um método da invenção, que compreende adicionalmente produzir um repertório de compostos aromáticos compreendendo fenilpropanoides, hidroxibenzaldeídos, valinoides e/ou intermediários da biossíntese de vanilina.

[0080] De acordo com a invenção, é adicionalmente proporcionado um método de produção de uma biblioteca de compostos aromáticos compreendendo fenilpropanoides, hidroxibenzaldeídos, valinoides e/ou respectivos precursores hidroxialdeído e/ou intermediários da biossíntese de vanilina, compreendendo

- proporcionar uma biblioteca da invenção, especificamente uma biblioteca de clones e/ou uma biblioteca de compostos aromáticos,

- cultivar a referida biblioteca na presença de um composto precursor inicial ou um ou mais compostos precursores intermediários para produzir uma variedade de compostos aromáticos como metabolites.

[0081] De acordo com a invenção, é adicionalmente

13/83 proporcionada uma biblioteca de compostos aromáticos compreendendo uma variedade de metabolites que podem ser obtidos por um método da invenção, em que pelo menos um metabólito é um metabólito artificial ou metabólito de ocorrência não natural.

[0082] De acordo com a invenção, é adicionalmente proporcionado o uso de uma célula da invenção, para biossíntese heteróloga de um produto metabólito. Especificamente, o produto é um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, preferencialmente

- em que o referido valinoide é selecionado do grupo consistindo de vanilina, ácido vanílico, etil-vanilina, álcool vanilílico e vanilina-glicosídeo; e/ou

- em que o referido precursor hidroxibenzaldeído é selecionado do grupo consistindo de aldeído protocatecuico, ácido protocatecuico, álcool protocatecuico, 4-hidroxialdeído, ácido 4-hidroxibenzoico, álcool 4hidroxibenzílico e ácido cafeico.

[0083] De acordo com a invenção, é adicionalmente proporcionado um método de biossíntese heteróloga de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, por conversão de um composto precursor empregando um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, cujo complexo multienzimático compreende enzimas para a biossíntese de ácido cumárico e uma crotonase, preferencialmente pelo menos todas as enzimas para a biossíntese de vanilina usando ácido cumárico como precursor, compreendendo

[0084] - proporcionar uma célula da invenção;

[0085] - cultivar a referida célula em uma cultura de células na presença do composto precursor;

[0086] - acumular um produto da biossíntese; e

14/83

[0087] - separar o referido produto do meio de cultura de células.

[0088] Especificamente, o complexo multienzimático compreende

a) PAL, C4H, CPR, uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3mono-oxigenase e uma metiltransferase; ou

b) TAL, uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase; ou

c) PAL/TAL, C4H, CPR, uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3mono-oxigenase e uma metiltransferase.

[0089] Especificamente, a invenção também proporciona um complexo multienzimático isolado como definido aqui, em particular um complexo multienzimático compreendendo

[0090] a) PAL, C4H, CPR, uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase; ou

[0091] b) TAL, uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-monooxigenase e uma metiltransferase; ou

[0092] c) PAL/TAL, C4H, CPR, uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase.

[0093] Especificamente, o referido composto precursor é um aminoácido natural, como fenilalanina, tirosina ou triptofano, preferencialmente fenilalanina ou tirosina.

[0094] Especificamente, o referido composto precursor é um monossacarídeo, preferencialmente selecionado do grupo consistindo de glucose, galactose ou arabinose.

[0095] Especificamente, o referido produto é um

[0096] - valinoide selecionado do grupo consistindo de vanilina, ácido vanílico, etil-vanilina, álcool vanilílico e vanilina-glicosídeo; ou

[0097] - um precursor hidroxibenzaldeído selecionado do grupo

15/83 consistindo de aldeído protocatecuico, ácido protocatecuico, álcool protocatecuico, 4-hidroxialdeído, ácido 4-hidroxibenzoico, álcool 4hidroxibenzílico, ácido cinâmico, ácido cumárico, ácido cafeico e ácido ferúlico.

[0098] De acordo com um aspecto específico, o referido produto é vanilina, ou um precursor de vanilina, que é adicionalmente processado para produzir vanilina, preferencialmente por métodos enzimáticos de biossíntese (como por reações in vivo) ou reações químicas (como por reações in vitro), ou um derivado de vanilina, preferencialmente ácido vanílico, etil-vanilina ou glicosil-vanilina.

[0099] Especificamente, o método da invenção proporciona a produção em alto rendimento do referido produto, por exemplo, com um rendimento de pelo menos 10 mg/L, preferencialmente pelo menos 20 mg/L, pelo menos 30 mg/L, pelo menos 40 mg/L, pelo menos 50 mg/L, pelo menos 100 mg/L, ou pelo menos 200 mg/L do produto, por exemplo, concentração do produto obtido no meio de cultura.

Figuras

[00100] Figura 1: A via de síntese da célula de produção de vanilina. A figura mostra o diagrama esquemático pelo qual fenilalanina é convertida em vanilina. A fenilalanina sofre várias reações: desaminação, hidroxilação da posição 4 do anel fenila, reação de redução da cadeia e hidroxilação da posição 3 do anel fenila, e O-metilação da posição 3 do anel fenila. A proteína CAR catalisa a redução de ácidos carboxílicos em seus aldeídos correspondentes. O papel da PPTase é transferir a fosfopanteteína da coenzima A para sua proteína CAR aceitadora. A crotonase designa uma enzima que hidrata a ligação dupla entre o segundo e terceiro carbonos em acil-CoA. A 3-mono-oxigenase designa uma enzima que incorpora um grupo hidroxila em substratos na posição 3 do anel fenila. A O-metiltransferase designa uma enzima que transfere um grupo metila de um doador para um

16/83 aceitador de hidroxila.

[00101] Figura 2: Estratégia de integração de um gene candidato no genoma de levedura para estudar sua funcionalidade. IF1 contém o local de inserção 5' na região BUD 31 do cromossomo de levedura e extremidade 5' do marcador de URA , IF2 contém a extremidade 3' do marcador de URA e promotor pGAL. IF4 contém o terminador tCYC e extremidade 5' do marcador de LEU e IF5 contém a extremidade 3' do marcador de LEU e local de inserção 3’ na região BUD 31. O gene sintetizado foi amplificado a partir do plasmídeo da GeneArt. A extremidade 5' dos oligonucleotídeos a montante usados para amplificação do gene de interesse contém uma sequência de 40 nucleotídeos homóloga à extremidade 3' do promotor pGAL1. Os oligonucleotídeos a jusante continham uma sequência de 40 nucleotídeos homóloga à extremidade 5' do terminador tCYC. Após montagem por recombinação homóloga em transformante de levedura, a seleção dupla permite o isolamento recombinante. Após recombinação, o gene possui uma sequência promotora (pGAL) e uma terminadora (tCYC) que permitem a sua expressão em células de levedura.

[00102] Figura 3: Montagem da via de vanilina por fragmentos contendo sequências genéticas homólogas. Esta figura apresenta a cotransformação de 8 fragmentos compreendendo os 6 genes para a produção de vanilina partindo de fenilalanina. URA3 e LEU2 são os marcadores flanqueadores que permitem a seleção dupla da via recombinante. Fontes de organismos de cada gene estão indicadas com três letras após o nome do gene, também mostrado com três letras. As espécies dos organismos correspondentes estão indicadas à esquerda.

[00103] Figura 4: Cromatograma de UV-Visível do sobrenadante de Y00VAN (290 nm). A linha cinzenta representa a estirpe de controle negativo e a linha preta representa Y00VAN. Os picos foram identificados comparando-os com a nossa biblioteca de compostos. 1) ácido 3

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4dihidroxibenzoico; 2) álcool vanilílico; 3) 3-4dihidroxibenzaldeído; 4) ácido vanílico; 5) ácido cumárico; 6) 4-hidroxibenzaldeído; 7) vanilina

[00104] Figura 5: Acúmulo de ácido vanílico e ácido 3-4 dihidroxibenzoico na estirpe Y00VAN. O cultivo foi efetuado por 60 horas, então células foram recolhidas e o sobrenadante foi analisado por HPLC. As concentrações de ácido vanílico e ácido 3-4 dihidroxibenzoico foram deduzidas usando soluções de padrões calibrados. O diagrama mostra acúmulo de ácido vanílico e ácido 3-4 dihidroxibenzoico no sobrenadante dependente das condições de cultivo.

[00105] Figura 6: disrupção do gene ADH6 pelo cassete CARPPTase-URA. A figura mostra a montagem e integração da construção bicistrônica no lócus ADH6. A célula recombinante Y0CP permite a expressão da proteína CAR ativa e ald6 endógeno é inativado.

[00106] Figura 7: Montagem de vias de vanilina por fragmentos contendo sequências genéticas homeólogas. Esta figura apresenta a cotransformação de 8 fragmentos compreendendo os 6 genes para a produção de vanilina partindo de fenilalanina. Os genes PAL, C4H, ECH, HBH, COMT são versões homeólogas relacionadas com um determinado grau de homologia (menos de 99,5 %). HIS3 e LEU2 são os marcadores flanqueadores que permitem a seleção dupla da via recombinante após transformação em uma levedura deficiente em MMR. Fontes de organismos de cada gene estão indicadas com três letras após o nome do gene, também mostrado com três letras. As espécies dos organismos correspondentes estão indicadas à esquerda.

[00107] Figura 8: A via de síntese da célula de produção de ácido ferúlico. A figura mostra o diagrama esquemático pelo qual fenilalanina é convertida em ácido ferúlico. A fenilalanina sofre várias reações: desaminação, hidroxilação da posição 3 e 4 do anel fenila, e O-metilação da posição 3 do

18/83 anel fenila.

[00108] Figura 9: Cromatograma de UV-Visível do sobrenadante de levedura expressando PheA/Flared (290 nm). PheA hidroxila ácido cumárico, conduzindo à produção de ácido cafeico. A linha cinzenta representa a estirpe de controle Y00; a linha preta representa célula expressando PheA/flared e nutrida com ácido cumárico 500 μΜ.

[00109] Figura 10: Montagem da via de ácido ferúlico por fragmentos contendo sequências genéticas homólogas. Esta figura apresenta a cotransformação de 7 fragmentos compreendendo os 5 genes para a produção de ácido ferúlico partindo de fenilalanina. URA3 e LEU2 são os marcadores flanqueadores que permitem a seleção dupla da via recombinante. Fontes de organismos de cada gene estão indicadas com três letras após o nome do gene, também mostrado com três letras. As espécies dos organismos correspondentes estão indicadas à esquerda.

[00110] Figura 11: Sequências de aminoácidos de enzimas exemplares de um complexo multienzimático envolvido na via metabólica representado nas Figuras 3, 6 e 9.

SEQ ID 1: PAL de Populus deltoids

SEQ ID 2: PAL de Petroselinum crispum

SEQ ID 3: C4H de Glycine max

SEQ ID 4: C4H de Petroselinum crispum

SEQ ID 5: 4CL de Populus deltoids

SEQID6:ECHde Pseudomonas fluorescens

SEQID7:ECHde Azotobacter vinelandii

SEQID8:HBHde Pseudomonas aeruginosa SEQID9:HBHde Azotobacter vinelandii SEQ ID 10: COMT de Medicago sativa SEQ ID 11: COMT de Vanilla planifolia

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SEQ ID 12: PheA de Geobacillus thermoleovorans

SEQ ID 13: FLARED de Geobacillus thermoleovorans

SEQ ID 14: CAR de Nocardia iowensis

SEQ ID 15: PPTase de Nocardia iowensis

SEQ ID 48: VAO de Penicillium simplicissimum, P56216.1 GL3024813

[00111] Figura 12: Acúmulo de vanilina, e metabolites intermediários na estirpe Y00VANCP em comparação com a estirpe de controle. O cultivo foi efetuado por 24 horas, então células foram recolhidas e o sobrenadante foi analisado por HPLC. As concentrações de metabolites foram deduzidas usando soluções de padrões calibrados.

[00112] Figura 13: Montagem da via de vanilina por fragmentos contendo sequências genéticas homólogas. Esta figura apresenta a cotransformação de 8 fragmentos compreendendo os 9 genes para a produção de vanilina partindo de fenilalanina. HIS3 e LEU2 são os marcadores flanqueadores que permitem a seleção dupla da via recombinante. Fontes de organismos de cada gene estão indicadas com três letras após o nome do gene, também mostrado com três letras. As espécies dos organismos correspondentes estão indicadas à esquerda.

Descrição Detalhada Da Invenção

[00113] O termo “montagem”, como usado aqui relativamente a polinucleotídeos, genes ou ácidos nucleicos, refere-se à ligação ou união de sequências de nucleotídeos, por exemplo, conectando pelo menos duas sequências, como genes ou partes destes, para obter a montagem genética. Em algumas modalidades, moléculas de ácidos nucleicos sintéticos lineares são montadas. Moléculas de ácidos nucleicos podem ser proporcionadas na forma de moléculas de ácidos nucleicos lineares ou podem ser linearizadas in vivo ou excisadas de moléculas de ácidos nucleicos maiores.

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[00114] Por uma montagem de genes ou fragmentos genéticos, um gene composto ou agregado genético pode ser obtido na forma de uma única sequência de nucleotídeos. Os genes são, por exemplo, ligados uns aos outros, opcionalmente com uma sobreposição. A montagem descrita aqui pode compreender especificamente cruzamento(s) ou mosaico(s) genético(s) intragênico(s) e/ou intergênico(s).

[00115] Um agregado montado pode conter uma origem da replicação e é capaz de replicação em uma célula hospedeira. Em modalidades específicas, o agregado montado é inserido no genoma da célula hospedeira. A montagem de módulos genéticos pode ser efetuada por rondas repetidas de recombinação homóloga, ou então por recombinação homeóloga in vivo, como especificamente descrito aqui. Em várias modalidades, uma estratégia de montagem envolve recombinação ou rondas sucessivas de recombinação, e pode envolver um ou mais marcadores selecionáveis. Em algumas modalidades, elementos genéticos adicionais podem ser introduzidos em série na célula hospedeira por técnicas de transfecção, como eletroporação. Ainda, em outras modalidades, elementos genéticos podem ser adicíonalmente introduzidos no agregado ou genoma da célula hospedeira, por exemplo, sequências promotoras ou terminadoras.

[00116] É entendido que o termo “célula”, como usado aqui em particular relativamente à produção e introdução de um agregado montado de genes em uma célula, ou uma célula de produção, se refere a qualquer célula procariótica ou eucariótica. Células hospedeiras procarióticas e eucarióticas são contempladas para uso de acordo com a invenção, incluindo células hospedeiras bacterianas, como E. coli ou Bacillus sp, células hospedeiras de levedura, como S. cerevisiae, células hospedeiras de inseto, como Spodooptera frugiperda, ou células hospedeiras humanas, como HeLa e Jurkat.

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[00117] Células hospedeiras preferenciais são células haploides, como de Candida sp, Pichia sp e Saccharomyces sp.

[00118] O termo “célula” inclui especificamente uma única célula ou células cultivadas em uma cultura de células, como linhagens de células.

[00119] De acordo com a presente invenção, quaisquer células procarióticas ou eucarióticas de tipo selvagem ou deficientes em reparação, incluindo as com deficiência na reparação de ácidos nucleicos, como reparação de DNA ou RNA, podem ser usadas para montar os polinucleotídeos. Em células de tipo selvagem, o local de integração adequado é selecionado, que permite recombinação (homeóloga).

[00120] O termo “célula deficiente em reparação de DNA”, como usado aqui, refere-se a uma célula procariótica ou eucariótica deficiente em reparação de DNA, especificamente aquelas com uma deficiência na reparação de ácidos nucleicos, por exemplo, aquelas com mutações ou modificações do sistema de reparação de emparelhamentos defeituosos (MMR), ou aquelas com outros sistemas deficientes em reparação, como nocautes completos ou temporários de genes de reparação de DNA, por exemplo, rad1, recQ. Em células que não são deficientes em reparação de DNA, DNA danificado e com emparelhamentos defeituosos é habitualmente reparado e a recombinação de sequências homeólogas é inibida. Mutações ou modificações do sistema MMR ou outros sistemas deficientes em reparação de DNA intensificam a frequência de recombinação nas células, desse modo preferencialmente usadas para montar e/ou recombinar os polinucleotídeos descritos aqui, por exemplo, de modo a montar um agregado de polinucleotídeos e/ou a dotar sequências de nucleotídeos quiméricas de mosaicos genéticos.

[00121] Como exemplo, a reparação de emparelhamentos defeituosos pode ser completa ou temporariamente inativada, ou pode ser condicional ou induzida por adição de substratos específicos ao meio de cultura

22/83 de células, onde as células são cultivadas durante ou após a recombinação direcionada ser realizada. Especificamente, a deficiência de MMR de uma célula pode ser obtida por qualquer estratégia que enfraqueça, de modo transitório ou permanente, a reparação de emparelhamentos defeituosos, incluindo a mutação de um gene envolvido na reparação de emparelhamentos defeituosos, tratamento com luz UV, tratamento com químicos, como 2aminopurina, expressão ou repressão induzível de um gene envolvido na reparação de emparelhamentos defeituosos, por exemplo, via promotores reguláveis, que permitem uma inativação e ativação transitórias.

[00122] Sistemas bacterianos de reparação de emparelhamentos defeituosos têm sido extensamente pesquisados. Em outros sistemas, como levedura, foram identificados vários genes cujos produtos partilham homologia com as proteínas bacterianas de reparação de emparelhamentos defeituosos, por exemplo, análogos da proteína MutS, isto é, Msh1, Msh2p, Msh3p, Msh4, Msh5, Msh6p, e análogos da proteína MutL, isto é, Mlhlp, Mlh2p, Mlh3p, e Pms1 em S. cerevisiae.

[00123] Exemplos de células preferenciais deficientes na reparação de emparelhamentos defeituosos são células de levedura específicas, como estirpes de S. cerevisiae com MSH2 defeituoso ou (temporariamente) inativado, por exemplo, as estirpes W303, BY, SK1 manipuladas, como a estirpe MXY47 (W303 com MSH2 interrompido).

[00124] Sistemas preferenciais adicionais de MMR são uma seleção de estirpes bacterianas bem conhecidas, como as descritas em US5912119, como estirpes deficientes no sistema de reparação de emparelhamentos defeituosos MutHLS enzimático, por exemplo, do tipo mutS ou mutL, que é deficiente nas proteínas MutS e MutL, que faz parte do reconhecimento dos emparelhamentos defeituosos. Estirpes preferenciais são, por exemplo, estirpes de S. Typhimurium usando F- mutL ou E. Coli Hfr/S

23/83 recombinante Typhimurium F- mutL.

[00125] Além disso, outras células eucarióticas deficientes na reparação de emparelhamentos defeituosos, como células HeLa e Jurkat, são preferencialmente usadas de acordo com a invenção.

[00126] O termo “célula de produção”, como usado aqui, refere-se especificamente a uma célula manipulada de modo recombinante para originar um produto de um processo de produção ou biossíntese, por exemplo, um produto de uma via metabólica.

[00127] O termo “linhagem de células”, como usado aqui, referese a um clone estabelecido de um tipo particular de células que adquiriu a capacidade de proliferar ao longo de um período de tempo prolongado. O termo “linhagem de células hospedeiras” refere-se a uma linhagem de células usada para produção e/ou expressão de um gene endógeno ou recombinante ou produtos de uma via metabólica para produzir polipeptídeos ou metabólitos celulares mediados por tais polipeptídeos. Uma “linhagem de células hospedeiras de produção” ou “linhagem de células de produção” é habitualmente entendida como uma linhagem de células pronta a usar para cultivo em um biorreator com o propósito de obter o produto de um processo de produção ou biossíntese, como um produto de uma via metabólica.

[00128] Depois de selecionados clones que produzem os produtos de biossíntese desejados, os produtos são tipicamente produzidos por uma linhagem de células hospedeiras de produção em larga escala por sistemas de expressão e fermentações adequados, por exemplo, por produção microbiana em cultura de células.

[00129] Como descrito aqui, um agregado de polinucleotídeos é tipicamente montado e eventualmente recombinado para obter sequências quiméricas em uma primeira célula hospedeira, por exemplo, em uma célula deficiente em reparação de DNA. O agregado pode então ser transferido para

24/83 uma segunda célula hospedeira que tem propriedades diferentes, como estabilidade para produzir altos rendimentos ao longo de um tempo de produção prolongado. Tal segunda célula hospedeira é preferencialmente uma célula hospedeira de produção. Em consequência, o agregado de polinucleotídeos pode ser excisado da referida primeira célula hospedeira, que serviu para manipular o agregado, e então integrado no genoma da célula hospedeira de produção.

[00130] O termo “quimérico”, como usado aqui relativamente a um polipeptídeo, como uma uma enzima, ou uma sequência de nucleotídeos, como um polinucleotídeo codificando uma enzima, refere-se àquelas moléculas que compreendem pelo menos duas partes heterólogas. Neste contexto, heterólogo significa que as partes não se encontram na mesma posição em um único polipeptídeo ou polinucleotídeo in vivo. Normalmente, isto significa que as partes são derivadas de pelo menos dois polipeptídeos ou polinucleotídeos diferentes, por exemplo, de origem diferente, como análogos derivados de diferentes organismos ou espécies. As partes também podem ser obtidas por mutagênese de uma sequência de fonte (paterna).

[00131] Polipeptídeos quiméricos tendo diferentes combinações de sequências polipeptídicas podem ser originários de uma ou mais moléculas paternas, que podem ter sofrido mutagênese, e assim podem compreender mutações, como inserções, deleções e/ou substituições, de um ou mais aminoácidos.

[00132] Polinucleotídeos quiméricos tendo diferentes combinações de genes ou sequências podem ser originários de um ou mais genes parentais, que podem ter sofrido mutagênese, e assim podem compreender mutações, como inserções, deleções e/ou substituições, de um ou mais nucleotídeos.

[00133] Neste contexto, o termo “originário”, por exemplo,

25/83 relativamente a uma espécie de origem, ou “origem diferente” é entendido do modo seguinte. Uma molécula endógena a uma célula de uma espécie específica é aqui entendida como sendo originária da referida espécie, na forma de ocorrência natural, por exemplo, como uma molécula de tipo selvagem e seu isômero, ou respectivos fragmentos ou mutantes. Uma molécula que é caracterizada por ter uma origem diferente relativamente a outra molécula, é especificamente entendida como referindo uma molécula de sequência diferente, por exemplo, obtida ou derivada de uma espécie diferente, como uma molécula de ocorrência natural, por exemplo, um análogo, ou proporcionada como uma molécula artificial ou recombinante, como uma molécula que não ocorre na natureza como uma molécula de tipo selvagem.

[00134] Enzimas exemplares descritas aqui têm várias origens procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, qualquer uma das enzimas com sequências como listado na Figura 10, ou qualquer uma das enzimas descritas na Tabela embaixo:

Tabela 1: Enzimas exemplares usadas para montagem de um complexo MULTIENZIMÁTICO

Enzimas	nome	organismo	Reação catalisada
PAL	fenilalanina amônia liase	Petunia sp e Populus sp	Desaminação de fenilalanina
C4H	Cinamato-4hidroxilase	Petunia sp e Glycin sp	4 Hidroxilação de cinamato
4CL	4-Cumarato: Coenzima A Ligase	Populus sp	Esterificação com CoA de ácido cumárico ou ácido ferúlico

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Enzimas	nome	organismo	Reação catalisada
ECH	Atividade de enoil- CoA hidratase/aldolase	Pseudomonas fluorescens e Azotobacter vinelandii	reação de redução de cadeia em feruloil- coA e cumaroil-coA
HBH	ácido hidroxibenzoico hidroxilase	Pseudomonas fluorescens e Azotobacter vinelandii	3 Hidroxilação de 4 hidroxibenzaldeído
COMT	ácido cafeico 0metiltransferase	Medicago sativa e Vanilla planifolia	O-metilação de 34dihidroxibenzaldeíd o e ácido cafeico
pheA	fenol hidroxilase	Geobacillus thermoleovorans	3 Hidroxilação de ácido cumárico
FlaRed	flavina redutase	Geobacillus thermoleovorans	componente 2 de fenol hidroxilase

[00135] Uma enzima quimérica descrita aqui pode especificamente compreender sequências análogas de origem diferente, por exemplo, de espécies diferentes, assim, uma sequência parcial pode ser homóloga a sequências correspondentes em enzimas derivadas de uma espécie particular, ao passo que outras partes ou segmentos podem ser homólogos a sequências correspondentes em outras espécies. Tipicamente, as moléculas completas ou partes de tais moléculas são recombinadas e opcionalmente montadas para obter uma molécula quimérica.

[00136] Em uma modalidade específica, uma enzima quimérica também pode ser uma enzima na qual o posicionamento, espaçamento ou função de duas sequências parciais endógenas foi alterado, por exemplo, por produção, relativamente à enzima de tipo selvagem. Por exemplo, elementos de uma sequência podem ser reposicionados por adição, mudança ou remoção

27/83 de nucleotídeos ou aminoácidos. Em alternativa, a própria sequência de aminoácidos ou nucleotídeos pode ser mutada, por exemplo, para introduzir propriedades desejadas. Tipicamente, tais propriedades incluem a capacidade de aumentar a atividade da enzima.

[00137] O termo “crotonase”, como usado aqui, refere-se especificamente a enzimas da superfamília que se verificou exibirem atividades de desalogenase, hidratase, e isomerase, ao passo que outras foram implicadas na formação e divagem de ligações carbono-carbono bem como na hidrólise de tioésteres. Estas diferentes enzimas partilham a necessidade de estabilizar um intermediário aniônico enolato derivado de um substrato acilCoA. Tal é alcançado por dois grupos NH peptídicos estruturalmente conservados que proporcionam ligações de hidrogênio às frações carbonila dos substratos acil-CoA e formam uma cavidade de oxiânion. Os derivados tioéster de CoA se ligam em uma forma em gancho característica e um túnel conservado liga o grupo panteteína de CoA, que liga o local de ligação de ADP 3'-fosfato ao local da reação. Enzimas da superfamília de crotonase incluem as que realizam cataliticamente uma reação de redução de cadeia em feruloilCoA ou cumaroilCoA, por exemplo, enoil-CoA hidratase (ECH, crotonase; EC 4.2.1.17), que catalisa a hidratação de 2-trans-enoil-CoA em 3-hidroxiacil-CoA.

[00138] O termo “fenilalanina amônia liase” (PAL), como usado aqui, refere-se especificamente a uma enzima que catalisa a reação de desaminação de fenilalanina. Em enzimologia, uma fenilalanina amônia-liase (EC 4.3.1.24) é uma enzima que catalisa a conversão química de L-fenilalanina em trans-cinamato e amônia. O nome sistemático desta classe enzimática é Lfenilalanina amônia-liase (formadores de trans-cinamato). Outros nomes habitualmente usados incluem tirase, fenilalanina desaminase, tirosina amônialiase, L-tirosina amônia-liase, fenilalanina amônio-liase, PAL, e L-fenilalanina amônia-liase. Esta enzima participa em cinco vias metabólicas: metabolismo de

28/83 tirosina, metabolismo de fenilalanina, metabolismo de nitrogênio, biossíntese de fenilpropanoides, e biossíntese de alcalóides. O termo “ácido cinâmico hidroxilase” (C4H), como usado aqui, refere-se especificamente a uma enzima que catalisa a 4 hidroxilação de cinamato, que é uma enzima dependente de P450. C4H também é denominada cinamato-4-hidroxilase. [EC. 1.14.13.11 ]

[00139] O termo “citocromo P450 redutase” (CPR), também conhecido como NADPH:ferrihemoproteína oxidorredutase, NADPH:hemoproteína oxidorredutase, NADPH:P450 oxidorredutase, P450 redutase, POR, CPR ou CYPOR, como usado aqui, refere-se especificamente à enzima ligada a membranas requerida para a transferência de elétrons para o citocromo P450 no retículo endoplasmático de uma célula eucariótica a partir de uma enzima contendo FAD e FMN NADPH:citocromo P450 redutase (POR; EC 1.6.2.4).

[00140] O termo “tirosina amônia liase” (TAL, L-tirosina amônialiase, ou Tirase), como usado aqui, refere-se especificamente a uma enzima que catalisa a reação de desaminação de tirosina (EC 4.3.1.23). Está envolvida na via de biossíntese de fenóis naturais.

[00141] O termo “fenilalanina/tirosina amônia liase” (PAL/TAL), como usado aqui, refere-se especificamente a uma enzima que catalisa a reação de desaminação de fenilalanina ou tirosina (EC. EC 4.3.1.25). Em enzimologia, PAL/TAL catalisa a desaminação não oxidativa de L-fenilalanina e L-tirosina para formar ácido trans-cinâmico e ácido p-cumárico, respectivamente, com eficiências similares.

[00142] O termo “CoA ligase”, como usado aqui, refere-se especificamente a uma enzima que catalisa a esterificação com CoA de ácido cumárico ou ácido ferúlico. Especificamente, a CoA ligase descrita aqui é a 4cumarato-CoA ligase (4CL; EC 6.2.1.12) que catalisa a reação química de 4cumarato e CoA para obter 4-cumaroil-CoA como produto. Esta enzima

29/83 pertence à família de ligases, especificamente as que formam ligações carbono-enxofre, como ácido-tiol ligases. O nome sistemático desta classe enzimática é 4-cumarato:CoA ligase (formadores de AMP). Outros nomes habitualmente usados incluem 4-cumaroil-CoA sintetase, p-cumaroil CoA ligase, p-cumaril coenzima A sintetase, p-cumaril-CoA sintetase, p-cumaril-CoA ligase, feruloil CoA ligase, hidroxicinamoil CoA sintetase, 4-cumarato:coenzima A ligase, cafeolil coenzima A sintetase, p-hidroxicinamoil coenzima A sintetase, feruloil coenzima A sintetase, sinapoil coenzima A sintetase, 4-cumaril-CoA sintetase, hidroxicinamato:CoA ligase, p-cumaril-CoA ligase, ácido phidroxicinâmico:CoA ligase, e 4CL. Esta enzima participa na biossíntese de fenilpropanoides.

[00143] O termo “3-mono-oxigenase”, como usado aqui, refere-se especificamente a uma enzima que catalisa a hidroxilação de 4hidroxibenzaldeído, tal como pela ácido hidroxibenzoico hidrolase (HBH), ou a 3-hidroxilação de ácido cumárico, tal como pela fenolhidroxilase (PheA) e a flavinredutase (FLARED).

[00144] ΗΒΗ, também conhecida como 4-hidroxibenzoato 3mono-oxigenase (EC 1.14.13.2), é uma enzima que catalisa a conversão química de 4-hidroxibenzoato para produzir protocatechuato. Esta enzima pertence à família de oxidorredutases, especificamente as que atuam em doadores emparelhados, com 02 como oxidante e incorporação ou redução de oxigênio. Não é necessário que o oxigênio incorporado seja derivado de 02 com NADH ou NADPH como um doador, e incorporação de um átomo de oxigênio no outro doador. O nome sistemático desta classe enzimática é 4hidroxibenzoato, NADPH:oxigênio oxidorredutase (3-hidroxilação). Outros nomes habitualmente usados incluem p-hidroxibenzoato hidroliase, phidroxibenzoato hidroxilase, 4-hidroxibenzoato 3-hidroxilase, 4-hidroxibenzoato mono-oxigenase, 4-hidroxibenzoico hidroxilase, p-hidroxibenzoato-3

30/83 hidroxilase, ácido p-hidroxibenzoico hidrolase, ácido p-hidroxibenzoico hidroxilase, e p-hidroxibenzoico hidroxilase. Esta enzima participa na degradação de benzoato via hidroxilação e degradação de 2,4-diclorobenzoato. Emprega um cofator, FAD.

[00145] PheA, também denominada fenol hidroxilase (EC 1.14.13.7), é uma mono-oxigenase dependente de flavina adenina dinucleotídeo (FAD) de dois componentes que converte compostos fenólicos. Esta enzima pertence à família de oxidorredutases. PheA é capaz de usar FADH2 e 02 para a oxidação de fenol conducente a catecol, como primeira etapa da degradação de fenol. PheA requer uma flavina redutase.

[00146] FLARED ou componente de flavina redutase (EC 1.5.1.36) é um componente enzimático da fenol hidroxilase, que catalisa a redução de flavinas livres por NADH. A enzima tem afinidade similar para FAD, FMN e riboflavina. O componente flared usa NADH para catalisar a redução de uma flavina que se difunde para o componente PheA para oxidação do substrato por oxigênio molecular.

[00147] O termo “metiltransferase”, como usado aqui, refere-se especificamente a uma metilase que é um tipo de enzima transferase que transfere um grupo metila de um doador para um aceitador. O termo refere-se especificamente a uma O-metiltransferase, preferencialmente uma 3-Ometiltransferase ou uma 4-O-metiltransferase, preferencialmente cafeato Ometiltransferase ou ácido cafeico O-metiltransferase (COMT) (EC 2.1.1.68), que é uma enzima que catalisa a conversão química de 3,4-dihidroxi-transcinamato (ácido cafeico) em 3-metoxi-4-hidroxi-trans-cinamato (ácido ferúlico). Esta enzima também é capaz de converter aldeído protocatecuico em vanilina. Esta enzima pertence à família de transferases, especificamente aquelas que transferem metiltransferases de grupos de um carbono. O nome sistemático desta classe enzimática é S-adenosil-L-metionina:3,4-dihidroxi-trans-cinamato

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3-0-metiltransferase. Outros nomes habitualmente usados incluem cafeato metiltransferase, cafeato 3-O-metiltransferase, e S-adenosil-L-metionina:ácido cafeico-O-metiltransferase. Esta enzima participa na biossíntese de fenilpropanoides.

[00148] O termo “álcool oxidase”, como usado aqui, refere-se a uma enzima que catalisa a reação química de um álcool primário em um aldeído (EC 1.1.3.38). Esta enzima pertence à família de oxidorredutases, especificamente as que atuam no grupo CH-OH do doador com oxigênio como aceitador. O nome sistemático desta classe enzimática é álcooLoxigênio oxidorredutase. Uma álcool oxidase especificamente preferencial, como usado aqui, é uma álcool vanilílico oxidase, por exemplo, como descrito em US5721125, que irá converter álcool vanilílico em vanilina.

[00149] O termo “gene”, como usado aqui, refere-se especificamente a genes ou fragmentos de DNA de um gene, em particular os que são genes parciais. Um fragmento também pode conter várias fases de leitura aberta, sendo repetições da mesma ORF ou diferentes ORFs. O termo refere-se especificamente a sequências de nucleotídeos codificantes, mas também inclui sequências de nucleotídeos que não são codificantes, por exemplo, sequências não transcritas ou não traduzidas, ou codificando polipeptídeos, na totalidade ou em parte.

[00150] O termo aplica-se em particular ao(s) polinucleotídeo(s) usado(s) aqui, por exemplo, como sequências de nucleotídeos completas ou respectivos fragmentos ou partes, que codifica(m) um polipeptídeo com atividade enzimática, por exemplo, uma enzima de uma via metabólica, ou seus fragmentos ou partes, respectivamente.

[00151] Os genes usados aqui, por exemplo, para montagem, diversificação ou recombinação, podem ser sequências não codificantes ou sequências codificando polipeptídeos ou sequências codificando proteínas, ou

32/83 respectivas partes ou fragmentos, tendo um comprimento de sequência suficiente para eventos de recombinação bem sucedidos. Mais especificamente, os referidos genes têm um comprimento mínimo de 3 pb, preferencialmente pelo menos 100 pb, mais preferencialmente pelo menos 300 pb.

[00152] O termo “mosaico genético” de acordo com a invenção significa a combinação de pelo menos dois genes diferentes ou genes parciais com pelo menos um evento de cruzamento, preferencialmente pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou mesmo mais cruzamentos em um único polinucleotídeo codificando o mesmo tipo de enzima (“intragênico”) ou em uma única molécula ou fita de ácido nucleico, por exemplo, um cruzamento na seção de ácido nucleico unindo polinucleotídeos codificando diferentes tipos de enzimas para obter uma montagem dos polinucleotídeos (“intergênico”). Especificamente, tal cruzamento proporciona a combinação ou mistura de sequências de DNA. Um mosaico genético pode ser criado por mistura intragênica de gene(s), um mosaico genético intragênico, e/ou montagem genética, por exemplo, com cruzamento intergênico, com ou sem uma seção sobreposta, ou genes compostos dispostos em série em conjunto, opcionalmente com uma sobreposição, também opcionalmente montagem de genes com cruzamento(s) ou mosaico genético(s) intragênico(s) e intergênico(s).

[00153] Os mosaicos genéticos especificamente descritos aqui têm pelo menos 3, preferencialmente até 30 000 pares de bases, um intervalo preferencial será 300 - 25 000 pb; particularmente preferenciais são grandes sequências de DNA de pelo menos 500 pb ou pelo menos 1 000 pb.

[00154] Especificamente preferenciais são mosaicos genéticos que são caracterizados por pelo menos 3 eventos de cruzamento por 700 pares de bases, preferencialmente pelo menos 4 cruzamentos por 700 pares

33/83 de bases, mais preferencialmente pelo menos 5, 6 ou 7 cruzamentos por 700 pares de bases ou por 500 pares de bases, que incluem o cruzamento de nucleotídeos únicos, ou segmentos de pelo menos 1, preferencialmente pelo menos 2, 3, 4, 5, 10, 20 até sequências de nucleotídeos maiores.

[00155] De acordo com o método preferencial de recombinação mitótica ou somática in vivo descrita aqui, não apenas um número ímpar mas também um número par de eventos de recombinação pode ser obtido em um único gene recombinado. Esta é uma vantagem específica relativamente à recombinação meiótica in vivo.

[00156] Podem ser obtidos padrões complexos de mosaicismo recombinante pelo presente método, alcançando números elevados de blocos de sequências recombinadas de diferentes comprimentos em uma única molécula. Além disso, pode obter-se troca do tipo pontual de nucleotídeos correspondente a um dos modelos de fitas como uma fonte importante de diversidade relativamente ao quadro das fases de leitura aberta. Mosaicismo e troca do tipo pontual não são necessariamente conservatives ao nível de proteínas. De fato, novos aminoácidos com diferentes propriedades polares podem ser gerados após recombinação, conferindo novas propriedades proteicas potenciais e enzimáticas às proteínas recombinantes derivadas por este método.

[00157] O termo “cruzamento” refere-se a recombinação entre genes em um local onde duas fitas de DNA podem trocar informação genética, isto é, pelo menos um nucleotideo. O processo de cruzamento conduz a genes mosaico descendentes tendo diferentes combinações de genes ou sequências originários de um ou mais genes parentais, que podem ter sofrido mutagênese, assim podem compreender mutações, como inserções, deleções e/ou substituições, de um ou mais nucleotídeos.

[00158] Em alternativa, podem ser proporcionados outros

34/83 mecanismos de reparação, que não são baseados em cruzamento, por exemplo, reparação por excisão de nucleotídeos ou mecanismos de união de extremidades não homólogas compreendendo o reconhecimento de nucleotídeos incorretos, excisão e/ou substituição após junção de fitas.

[00159] O termo “polinucleotídeo heterólogo”, como usado aqui, refere-se a um ácido nucleico que é estranho, isto é, “exógeno”, como não presente na natureza, para um dado microrganismo hospedeiro ou célula hospedeira; ou que se encontra naturalmente em um determinado microrganismo hospedeiro ou célula hospedeira , por exemplo, é “endógeno”, no entanto, no contexto de um ácido nucleico heterólogo. A sequência de nucleotídeos heteróloga presente de modo endógeno também pode ser produzida em uma quantidade não natural, por exemplo, maior do que o esperado ou maior do que naturalmente presente, na célula. A sequência da sequência de nucleotídeos heteróloga, ou de um ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos heteróloga, possivelmente difere da sequência de nucleotídeos endógena mas codifica a mesma proteína endogenamente presente. Especificamente, sequências de nucleotídeos heterólogas são as que não se encontram na mesma relação com uma célula hospedeira na natureza. É entendido que qualquer sequência de nucleotídeos recombinante ou artificial é é heteróloga. Um exemplo de um polinucleotídeo heterólogo é uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência enzimática descrita aqui, que é originária de uma espécie diferente da espécie da célula hospedeira. Um exemplo adicional é um polinucleotídeo quimérico. Um exemplo adicional é uma sequência de nucleotídeos codificando uma sequência enzimática operavelmente ligada a um elemento de controle da transcrição, por exemplo, um promotor, ao qual uma sequência codificante de enzima endógena, de ocorrência natural normalmente não está ligada de modo operável.

35/83

[00160] O termo “biossíntese heteróloga”, como usado aqui, refere-se especificamente à biossíntese de produtos por células hospedeiras recombinantes, que compreendem pelo menos um elemento heterólogo, como um polinucleotídeo heterólogo, que, por exemplo, permite a biossíntese de produtos exógenos, ou produtos endógenos com propriedades melhoradas ou um rendimento acrescido.

[00161] O termo “biossíntese”, como usado aqui, refere-se especificamente à produção celular de um produto, por exemplo, por produção in vivo, em células hospedeiras em cultura de células, especificamente células hospedeiras microbianas, cuja produção celular pode ser opcionalmente combinada com outras etapas de produção biossintéticas (por exemplo, em uma célula hospedeira diferente da anterior) e/ou com reações de síntese química, por exemplo, por reações in vitro.

[00162] O termo homóloga ou homeóloga significa que uma sequência de ácido nucléico de fita simples pode hibridizar com uma sequência de ácido nucléico de fita simples complementar. O grau de hibridização pode depender de alguns fatores, incluindo a quantidade de identidade entre as sequências e as condições de hibridização, como temperatura e concentrações de sais, como discutido mais tarde. Preferencialmente, a região de identidade é maior do que cerca de 1 pb, mais preferencialmente a região de identidade é maior do que 5 pb ou maior do que 10 pb.

[00163] Como usado aqui, duas sequências são homólogas se partilham uma região de identidade de sequência, opcionalmente interrompida por um ou mais pares de bases com emparelhamentos defeituosos, de modo que são capazes de trocas de recombinação homóloga entre si. Em uma modalidade preferencial, duas sequências de fita dupla homólogas são completamente idênticas. Em outra modalidade, a amplitude da homologia é interrompida por não mais do que 1 par de bases com emparelhamento

36/83 defeituoso aproximadamente a cada 10 pares de bases de nucleotídeos idênticos. Em uma modalidade preferencial, a amplitude da homologia é uma extensão contínua de pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80 90 ou 100 pares de bases de nucleotídeos idênticos. Em várias modalidades, a amplitude da homologia entre sequências homólogas é uma extensão contínua de pelo menos 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75 ou 100 pares de bases de nucleotídeos idênticos. Em uma modalidade alternativa, uma extensão de nucleotídeos idênticos pode ser interrompida por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos não idênticos por 100 nucleotídeos idênticos. Ainda em outras modalidades, a extensão da identidade de sequência entre sequências doadoras e sequências alvo (isto é, cada par de primeira e segunda sequências) é pelo menos 70 %, mais preferencialmente pelo menos 75 %, mais preferencialmente pelo menos 80 %, mais preferencialmente pelo menos 85 %, mesmo muito preferencialmente pelo menos 90 % ou 95 % de identidade. Em certas modalidades específicas, a extensão da identidade de sequência entre sequências doadora e alvo é pelo menos 92 %, 94 %, 96 %, 98 % ou 99 %. Sequências homólogas podem ser interrompidas por um ou mais resíduos não idênticos, desde que ainda sejam substratos eficientes para recombinação homóloga.

[00164] O termo “homologia” indica que duas ou mais sequências de nucleotídeos têm (em um determinado grau, até 100 %) os mesmos pares de bases ou pares de bases conservados em uma posição correspondente. Uma sequência homóloga, também denominada sequência complementar, correspondente ou de emparelhamento, como usado de acordo com a invenção, preferencialmente hibridiza com a sequência correspondente homóloga, por exemplo, tem pelo menos 30 % de identidade de sequência, até 100 % de identidade de sequência. Preferencialmente, uma sequência homóloga terá pelo menos cerca de 30 % de identidade de sequência de

37/83 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos cerca de 40 % de identidade, mais

preferencialmente	pelo	menos	cerca	de	50	%	de	identidade,	mais
preferencialmente	pelo	menos	cerca	de	60	%	de	identidade,	mais
preferencialmente	pelo	menos	cerca	de	70	%	de	identidade,	mais
preferencialmente	pelo	menos	cerca	de	80	%	de	identidade,	mais
preferencialmente	pelo	menos	cerca	de	90	%	de	identidade,	mais

preferencialmente pelo menos cerca de 95 % de identidade.

[00165] Assim, o termo, como usado aqui, também se refere a sequências homeólogas, que é entendido serem sequências com menos de 100 % de identidade de sequência, por exemplo, menos de 99,5 % de identidade de sequência, possivelmente menos de 95 %, menos de 90 %, menos de 85 % ou menos de 80 %, com uma sequência complementar respectiva, relativamente a uma sequência de DNA nativa completa ou um segmento de uma sequência de DNA como revelado aqui. Intervalos preferenciais com limites superiores e inferiores, como citado acima, estão na gama de 30 % e 100 % ou 99,5 % de identidade de sequência correspondente. Como usado aqui, o grau de identidade refere-se sempre também às sequências complementares.

[00166] De acordo com a invenção, é mesmo possível montar gene(s) ou fragmentos genéticos por recombinação homeóloga in vivo, sem homologia, isto é, com uma identidade de sequência de menos de 30 % ou menos de 20 % ou mesmo menos de 10 %. Assim, para o propósito de recombinação homeóloga in vivo, as sequências de gene(s) ou fragmentos genéticos a serem montadas e/ou recombinadas têm opoionalmente uma identidade de sequência de pelo menos 5 %, preferencialmente pelo menos 10 % ou pelo menos 20 %, ou pelo menos 30 %.

[00167] Percentagem (%) de identidade relativamente à sequência de nucleotídeos de um gene é definida como a percentagem de

38/83 nucleotídeos em uma sequência de DNA candidata que é idêntica aos nucleotídeos da sequência de DNA, após alinhamento da sequência e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para o propósito de determinar a percentagem de identidade de sequência de nucleotídeos pode ser efetuado de vários modos que pertencem à perícia na técnica, por exemplo, usando software computacional publicamente disponível, os peritos na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas.

[00168] O termo “valinoide”, como usado aqui, refere-se especificamente a compostos que possuem um grupo vanilila, também conhecido como grupo vaniloíla, com a seguinte fórmula (1)

em que

R¹ é selecionado do grupo consistindo de -COH, -COOH, CH₂OH, -CH2COOH, -C(=O)CH₃, -CH(OH)COOH e um glicosídeo;

R² é selecionado do grupo consistindo de H, -CH₃, -CH₂CH₃ e um glicosídeo; e

R³ é selecionado do grupo consistindo de H, -CH₃, -CH₂CH₃ e um glicosídeo.

[00169] Os compostos incluem especificamente álcool vanilílico,

39/83 vanilina, ácido vanílico, etil-vanilina, vanilina-glicosídeo, acetovanilona, ácido vanililmandélico, ácido homovanílico, e isômeros, como isovalinoides, e derivados valinoide.

[00170] Os compostos valinoides descritos aqui podem ser especificamente produzidos por biossíntese, por exemplo, produzidos como produtos secundários ou intermediários da biossíntese de vanilina, ou então produzidos por outra célula hospedeira ou por reações químicas, por exemplo, por produção in vitro.

[00171] O termo “precursor hidroxibenzaldeído de um valinoide”, como usado aqui, refere-se especificamente a uma molécula precursora em uma reação química ou biossíntese de um valinoide, por exemplo, uma molécula precursora usada em uma via metabólica e biossíntese de um valinoide, que é um hidroxibenzaldeído ou um respectivo ácido ou um respectivo álcool, como um ácido hidroxibenzoico, ou um respectivo álcool, como um álcool hidroxibenzílico, por exemplo, um precursor de biossíntese através da via de fenilpropanoides. O termo inclui especificamente aldeído protocatecuico, 4-hidroxialdeído, ou um respectivo derivado, entre esses os respectivos ácidos, como ácido protocatecuico ou ácido 4-hidroxibenzoico, ou um respectivo derivado, entre esses o respectivo álcool, como álcool protocatecuico ou álcool 4-hidroxibenzílico. O termo também inclui o precursor de vanilina, como um precursor ácido, como ácido cinâmico, ácido cumárico, ácido cafeico ou ácido ferúlico. Em consequência, um precursor hidroxibenzaldeído preferencial é selecionado do grupo consistindo de aldeído protocatecuico, ácido protocatecuico, álcool protocatecuico, 4-hidroxialdeído, ácido 4-hidroxibenzoico, álcool 4-hidroxibenzílico, ácido cinâmico, ácido cumárico, ácido cafeico e ácido ferúlico.

[00172] O precursor hidroxibenzaldeído de um valinoide descrito aqui pode ser especificamente produzido por biossíntese, por exemplo,

40/83 produzido na forma de produtos secundários ou intermediários da biossíntese de vanilina, ou então produzido por outro processo metabólico ou por reações químicas, por exemplo, por produção in vitro.

[00173] O termo “complexo multienzimático”, como usado aqui, refere-se especificamente a algumas ou série de enzimas de uma via metabólica, na ordem das reações em cascata ou então sem essa ordem, por exemplo, por uma sequência aleatória. O complexo multienzimático produzido por uma célula hospedeira de biossíntese heteróloga é tipicamente codificado por uma montagem ou pelo menos um agregado de polinucleotídeos (recombinantes), cada um codificando uma enzima, cuja montagem ou agregado(s) podem, por exemplo, estar localizados em um ou mais lóci diferentes em um ou mais cromossomos, ou localizados em parte em um ou mais cromossomos e adicionalmente localizados em plasmídeo(s). Não é necessário que o complexo multienzimático descrito aqui seja proporcionado na forma de um complexo de proteínas, em que as proteínas estão ligadas entre si. Ao invés, o termo é entendido como um complexo multienzimático proporcionado na forma de enzimas individuais envolvidas em uma via metabólica específica de uma célula.

[00174] Um complexo multienzimático exemplar descrito aqui compreende enzimas ou respectivas sequências de nucleotídeos da via de shiquimato , que é uma via metabólica de sete etapas usada por bactérias, fungos, e plantas para a biossíntese de aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, tirosina e triptofano.

[00175] Outro complexo multienzimático exemplar descrito aqui compreende enzimas ou respectivas sequências de nucleotídeos da biossíntese dos ácidos cinâmico e p-cumárico. Tipicamente, a biossíntese de todos os fenilpropanoides começa com os aminoácidos fenilalanina e tirosina. Fenilalanina amônia-liase (PAL, fenilalanina/TAL, tirosina amônia-liase) é uma

41/83 enzima responsável pela transformação de L-fenilalanina ou tirosina em ácido trans-cinâmico ou ácido p-cumárico, respectivamente. Trans-cinamato 4-monooxigenase (cinamato 4-hidroxilase) é a enzima responsável pela transformação de trans-cinamato em 4-hidroxicinamato (ácido p-cumárico). 4-Cumarato-CoA ligase é a enzima responsável pela transformação de 4-cumarato (ácido pcumárico) em 4-cumaroil-CoA.

[00176] Outro complexo multienzimático exemplar descrito aqui compreende enzimas ou respectivas sequências de nucleotídeos de biossíntese de outros ácidos hidroxicinâmicos, por exemplo, compreendendo qualquer uma de cinamil-álcool desidrogenase (CAD), uma enzima responsável pela transformação de álcool cinamílico em cinamaldeído; sinapina esterase, uma enzima responsável pela transformação de sinapoilcolina em sinapato (ácido sinápico) e colina; trans-cinamato 2-mono-oxigenase, uma enzima responsável pela transformação de trans-cinamato (ácido cinâmico) em 2hidroxicinamato; cafeato O-metiltransferase, uma enzima responsável pela transformação de ácido cafeico em ácido ferúlico; cafeoil-CoA Ometiltransferase, uma enzima responsável pela transformação de cafeoil-CoA em feruloil-CoA; 5-0-(4-cumaroil)-D-quinato 3'-mono-oxigenase, uma enzima responsável pela transformação de trans-5-0-(4-cumaroil)-D-quinato em trans5-O-cafeoil-D-quinato; sinapoilglucose—colina O-sinapoiltransferase, uma enzima responsável pela transformação de 1-O-sinapoil-beta-D-glucose em sinapoilcolina (sinapina); e sinapoilglucose—malato O-sinapoiltransferase, uma enzima responsável pela transformação de 1-O-sinapoil-beta-D-glucose em sinapoil-(S)-malato.

[00177] Complexos multienzimáticos preferenciais compreendem uma série de enzimas, por exemplo, uma mistura de enzimas. Os polinucleotídeos que codificam as enzimas de um complexo multienzimático podem ser montados e processados como um agregado, em que o ácido

42/83 nucléico codifica as enzimas, por exemplo, na ordem das reações enzimáticas (catalisadas) ou independentemente da ordem.

[00178] O termo “via metabólica” refere-se a uma série de duas ou mais reações enzimáticas em que o produto de uma reação enzimática se torna no substrato da reação enzimática seguinte. Em cada etapa de uma via metabólica, compostos intermediários são formados e usados como substratos para uma etapa subsequente. Estes compostos podem ser denominados “intermediários metabólicos”. Os produtos de cada etapa também são denominados “metabolites”.

[00179] Enzimas de uma via metabólica descrita aqui tipicamente desempenham um papel integrante no metabolismo primário e/ou secundário. No metabolismo primário, uma enzima é essencial para a viabilidade, por exemplo, diretamente envolvida no crescimento, desenvolvimento, ou reprodução normal de um organismo. No metabolismo secundário, uma enzima serve para produzir metabolites secundários, que são entendidos como compostos orgânicos que - ao contrário dos metabolites primários - não são essenciais para a viabilidade no presente caso. A ausência de metabolites secundários não origina morte imediata, mas sim um enfraquecimento de longa duração da capacidade de sobrevivência, fecundidade, ou estética do organismo, ou talvez nenhuma alteração significativa. Vaniloides ou respectivos precursores benzaldeído são especificamente entendidos como metabolites secundários, que podem ter aplicação como aromas, medicamentos, agentes que conferem sabor, fragrâncias ou como ingredientes alimentícios.

[00180] O termo “via metabólica de fenilpropanoides” descrita aqui refere-se especificamente a uma via metabólica compreendendo as reações enzimáticas catalisadas pelas enzimas envolvidas na biossíntese de fenilpropanoides, incluindo a biossíntese de precursores de aminoácidos aromáticos, a biossíntese de produtos resultantes de processamento

43/83 metabólico subsequente, por exemplo, a via de fenilpropanoides.

[00181] As enzimas envolvidas na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, abrangem particularmente um conjunto de enzimas que converte aminoácidos aromáticos em ácido cumárico, e também uma crotonase. As Figuras 1 e 7 ilustram diferentes modalidades de tal via. A via metabólica pode abranger adicionalmente enzimas que convertem fontes de carbono precursoras, como monossacarídeos ou dissacarídeos, como glucose, em aminoácidos aromáticos. A via metabólica pode incluir especificamente todas as enzimas necessárias para a biossíntese de um valinoide como vanilina, ou derivados de vanilina.

[00182] A via metabólica descrita aqui pode compreender particularmente pelo menos duas enzimas, preferencialmente pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou mesmo mais enzimas, para obter um produto de biossíntese. Pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou sete ou mesmo mais das enzimas podem ser proporcionadas como enzimas quiméricas, por exemplo, codificadas por um polinucleotídeo ou sequência nucleica quimérica. Especificamente, a via metabólica descrita aqui compreende ácido cumárico como substância precursora ou intermediária. No processo de biossíntese de um valinoide da invenção, o ácido cumárico é particularmente usado como intermediário universal porque todos os compostos valinoides são daí derivados de acordo com a nova via.

[00183] O termo “polinucleotídeos”, como usado aqui, refere-se especificamente a um polímero desoxirribonucleotídico ou ribonucleotídico de fita simples ou dupla de qualquer comprimento, e inclui, como exemplos não limitativos, sequências codificantes e não codificantes de um gene, polinucleotídeos recombinantes, sequências de DNA ou RNA de ocorrência

44/83 natural isoladas e purificadas, sequências de RNA e DNA sintéticas, sondas de ácidos nucleicos, primers, fragmentos, construções genéticas, vetores e polinucleotídeos modificados. A referência a ácidos nucleicos, moléculas de ácidos nucleicos, sequências de nucleotídeos e sequências polinucleotídicas deve ser entendida de modo similar.

[00184] O termo agregado, como usado aqui especificamente em relação a polinucleotídeos, refere-se a um grupo de polinucleotídeos localizados de modo muito próximo no mesmo cromossomo cujos produtos desempenham um papel coordenado em um aspecto específico do metabolismo celular primário ou secundário. Um agregado descrito aqui referese particularmente a um agregado de biossíntese de metabólito (secundário).

[00185] O termo “precursor”, como usado aqui, refere-se especificamente a uma molécula de substrato que é sujeita a reação enzimática e conversão em um produto, por exemplo, um produto de biossíntese ou reação química. O termo aplica-se especificamente a um precursor hidroxibenzaldeído de um valinoide, por exemplo, um precursor inicial de uma via metabólica, como um monossacarídeo, em particular glucose, ou um precursor inicial que é adicionado a uma célula metabolizante, como um aminoãcido aromático natural, em particular fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou um intermediário de uma via metabólica, isto é, uma molécula obtida por uma célula como metabólito de uma célula, que pode ser adicionalmente usada como substrato para processamento enzimático adicional.

[00186] Uma célula que metaboliza um precursor descrito aqui, pode especificamente produzir metabolites celulares ou produtos desejados por reação enzimática em uma ou mais etapas em série. Por exemplo, um composto precursor pode ser processado empregando um complexo multienzimático, por exemplo, um complexo multienzimático que é totalmente

45/83 heterólogo ou parcialmente heterólogo, compreendendo pelo menos duas enzimas, preferencialmente pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete ou mesmo mais enzimas, para obter um produto de biossíntese. Assim, uma célula metabolizante compreendendo o complexo multienzimático (heterólogo) pode ser cultivada em uma cultura de células na presença do composto precursor, para obter o produto. Preferencialmente, pelo menos uma das enzimas heterólogas do complexo multienzimático é uma enzima quimérica.

[00187] Um precursor específico descrito aqui é ácido cumárico, por exemplo, para a biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor benzaldeído. O próprio ácido cumárico pode ser produzido por biossíntese por uma célula metabolizante, por exemplo, usando um aminoácido aromático como precursor.

[00188] O termo “produto”, como usado aqui especificamente com relação a biossíntese, refere-se a qualquer produto do metabolismo primário e/ou secundário, em particular um composto que pode ser usado como precursor, intermediário, subproduto ou produto final de uma via metabólica.

[00189] O termo “procedimento de etapa única”, especificamente com relação a um método de montagem e/ou recombinação, significa que várias etapas processuais da produção de recombinantes, como transformação de células com um gene, a recombinação de genes, geração de um gene mosaico e integração de um gene no genoma alvo, são tecnicamente realizadas em uma etapa do método. Assim, não será necessária recombinação in vitro de transportadores de DNA antes de recombinação in vivo, ou quaisquer ciclos repetidos de etapas processuais, incluindo as que empregam meiose. Vantajosamente, o uso de células meióticas de levedura pode ser evitado.

[00190] O procedimento de etapa única da invenção pode mesmo

46/83 incluir a expressão de tais recombinantes manipulados por um hospedeiro ao mesmo tempo. Desse modo não é necessária manipulação adicional para obter um produto de expressão.

[00191] O termo “ancoragem”, como usado aqui especificamente com relação a um ácido de nucleotídeos que hibridiza com um elemento de um local de integração genômica, de modo a inserir sequências heterólogas no genoma da célula hospedeira, significa a ligação de um gene ou mosaico genético a uma sequência de integração através de um segmento denominado “sequência de ancoragem” com homologia de sequência parcial ou completa, para permitir a integração de tal gene ou mosaico genético no local de integração de um genoma. Especificamente, a sequência de ancoragem pode ser uma região alvo flanqueadora homóloga ou pelo menos parcialmente homóloga a um local de integração de uma sequência genômica. A sequência de ancoragem preferencial tem preferencialmente pelo menos cerca de 70 % de homologia de sequência com um local de integração alvo, mais preferencialmente pelo menos 80 %, 90 %, 95 % até 99,5 % ou correspondência completa com com a seção de hibridização do genoma.

[00192] O termo “sequência alvo flanqueadora”, como usado aqui especificamente com relação a uma parte terminal de uma sequência de ácido nucléico, por exemplo, uma sequência heteróloga, que hibridiza, desse modo sofrendo ancoragem, com um elemento de um local de integração genômica, de modo a inserir sequências heterólogas no genoma da célula hospedeira, refere-se a regiões de uma sequência de nucleotídeos que são complementares ao alvo de interesse, como um local alvo de integração genômica, incluindo um local do(s) gene(s) a ser(em) montado(s) e/ou recombinado(s), polinucleotídeos lineares, plasmídeos lineares ou circulares, YACs e similares. Devido a um grau específico de complementação ou homologia, a sequência flanqueadora alvo pode hibridizar com e integrar

47/83 gene(s) no local de integração alvo.

[00193] Como descrito aqui, o comprimento da sequência flanqueadora alvo é especificamente pelo menos 5 pb, preferencialmente pelo menos 10 pb, mais preferencialmente pelo menos 20 pb, 50 pb, 100 pb até 5 000 pb de comprimento. Especificamente, a sequência flanqueadora alvo é ligada ao referido gene ou é uma parte integrante, terminal do referido gene. É preferencial que a referida sequência flanqueadora alvo tenha homologia no intervalo de 30 % até 99,5 %, preferencialmente menos de 95 %, menos de 90 %, menos de 80 %, hibridizando com a sequência de ancoragem do referido local de integração.

[00194] Preferencialmente, a sequência flanqueadora alvo, como usado aqui para técnicas de recombinação in vivo, é única, por exemplo, em apenas um lado de uma sequência de nucleotídeos específica, por exemplo, prolongando a sequência 5’-terminal ou a sequência 3’terminal da sequência de nucleotídeos específica, não em ambos os lados. Tal proporciona uma hipótese aumentada de gerar mosaicos genéticos.

[00195] Quando pelo menos duas sequências flanqueadoras alvo diferentes com ancoragem ao local de integração alvo do genoma são usadas de acordo com a invenção, é preferencial que não sofram recombinação entre si, preferencialmente que partilhem menos de 30 % de homologia.

[00196] O local de integração referido aqui pode adequadamente ser um lócus definido no genoma do hospedeiro, onde ocorre uma elevada frequência de eventos de recombinação. Um lócus preferencial é, por exemplo, o lócus BUD31-HCM1 no cromossomo III de S. cerevisiae. Em geral, são preferenciais quaisquer outros lóci no cromossomo da célula hospedeira, por exemplo, os cromossomos de levedura que exibem recombinação a frequências elevadas mas nenhuma alteração da viabilidade celular.

[00197] O termo “genoma” de uma célula refere-se à totalidade da

48/83 informação hereditária de um organismo, representada por genes e sequências de DNA não codificantes, elementos genéticos cromossômicos ou não cromossômicos, como polinucleotídeos lineares, por exemplo, incluindo o(s) gene(s) a ser(em) montado(s) e/ou recombinado(s), vírus, transportadores e vetores autorreplicantes, plasmídeos, e elementos transponíveis, incluindo cromossomos artificiais e similares.

[00198] Um método de montagem e/ou recombinação preferencial descrito aqui pode empregar seleção por seleção direta, isto é, determinação do intermediário ou produto desejado de biossíntese bem sucedida no meio de cultura de células, ou então seleção auxiliada por marcadores de produção de um produto de recombinação bem sucedido. O uso de ferramentas tais como marcadores moleculares ou impressão digital de DNA permite mapear os genes de interesse. Tal permite rastrear um grande repertório de células para obter uma seleção de células que possuem a característica de interesse. O rastreio é baseado na presença ou ausência de um determinado gene.

[00199] O termo “marcador de seleção”, usado de acordo com a invenção, refere-se a sequências de DNA codificantes ou não codificantes de proteínas que proporcionam uma marca por integração bem sucedida. Especificamente, as sequências marcadoras codificantes de proteínas são selecionadas do grupo de marcadores nutricionais, marcadores de pigmentos, marcadores de resistência a antibióticos, marcadores de sensibilidade a antibióticos, marcadores fluorescentes, marcadores de knock-in, marcadores de domínios ativadores/ligantes e marcadores recessivos dominantes, marcadores colorimétricos, e sequências codificando diferentes subunidades de uma enzima, que só funciona se duas ou mais subunidades forem expressas na mesma célula. O termo também se refere a um gene rastreável a ser recombinado que proporciona a determinação direta do mosaico genético, sem a necessidade de usar sequências marcadoras separadas.

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[00200] Um “marcador nutricional” é uma sequência marcadora que codifica um produto genético que pode compensar uma auxotrofia da célula e, assim, conferir prototrofia a essa célula auxotrófica. De acordo com a presente invenção, o termo “auxotrofia” significa que a célula deve ser cultivada em meio contendo um nutriente essencial que não pode ser produzido pela própria célula auxotrófica. O produto genético do gene marcador nutricional promove a síntese deste nutriente essencial ausente na célula auxotrófica. Ao expressar com êxito o gene marcador nutricional, então não é necessário adicionar este nutriente essencial ao meio de cultivo onde a célula cresce.

[00201] Sequências marcadoras preferenciais são URA3, LEU2, HIS3, CAN1, CYH2, TRP1, ADE1 e MET5.

[00202] Um gene codificando um “marcador de pigmento” codifica um produto genético, que está envolvido na síntese de um pigmento que, por expressão, pode corar a célula. Desse modo é proporcionada detecção fenotípica rápida de células que expressam com êxito marcadores de pigmentos.

[00203] Um “marcador de resistência a antibióticos” é um gene codificando um produto genético, que permite que a célula seja cultivada na presença de antibióticos a uma concentração tal que as células que não expressam o referido produto não podem crescer.

[00204] Um “marcador de sensibilidade a antibióticos” é um gene marcador, em que o produto genético inibe o crescimento de células que expressam o referido marcador na presença de um antibiótico.

[00205] Um marcador de “knock-in” é entendido como uma sequência de nucleotídeos que representa uma ligação em falta em uma célula nocaute, desse modo causando o crescimento da célula por recombinação e operação bem sucedidas. Uma célula nocaute é uma célula geneticamente manipulada, em que um ou mais genes foram desligados através de uma

50/83 mutação direcionada. Tais genes em falta podem ser adequadamente usados como marcadores de knock-in.

[00206] Um “marcador de fluorescência” significa uma sequência de nucleotídeos codificando um fluoróforo que é detectável por emissão do respectivo sinal de fluorescência. Células podem ser facilmente submetidas a triagem por técnicas bem conhecidas de citometria de fluxo com base em etiquetagem fluorescente diferencial.

[00207] “Recombinante”, como usado aqui, significa que um ácido nucleico (DNA ou RNA) particular é o produto de várias combinações de etapas de clonagem, restrição, ligação, e/ou síntese de DNA in vitro que originam uma construção tendo uma sequência codificante ou não codificante estrutural que pode ser distinguida de ácidos nucleicos endógenos presentes em sistemas naturais. Em geral, sequências de DNA codificando a sequência codificante estrutural podem ser montadas a partir de fragmentos de cDNA e pequenos ligadores oligonucleotídicos, ou a partir de uma série de oligonucleotídeos sintéticos, para proporcionar um ácido nucleico sintético que pode ser expresso a partir de uma unidade de transcrição recombinante contida em uma célula ou em um sistema de transcrição e tradução desprovido de células. Tais sequências podem ser proporcionadas na forma de uma fase de leitura aberta não interrompida por sequências internas não traduzidas, ou introns, que estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. DNA genômico compreendendo as sequências relevantes também pode ser usado na formação de um gene ou unidade de transcrição recombinante. Sequências de DNA não traduzido podem estar presentes a 5' ou 3' da fase de leitura aberta, em que tais sequências não interferem na produção ou expressão das regiões codificantes, e de fato sua ação pode consistir em modular a produção de um produto desejado por vários mecanismos.

[00208] Assim, por exemplo, o termo polinucleotídeo ou ácido

51/83 nucléico “recombinante” refere-se a um que não ocorre naturalmente, por exemplo, é preparado pela combinação artificial de dois segmentos, de outro modo separados, de sequência através de intervenção humana. Esta combinação artificial é muitas vezes obtida pela produção artificial de segmentos de ácidos nucleicos isolados, por exemplo, por técnicas de engenharia genética. Por exemplo, é efetuada para unir segmentos de ácidos nucleicos de funções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções. O termo “recombinação” aplica-se especificamente a montagem de polinucleotídeos, unindo tais polinucleotídeos ou suas partes, com ou sem recombinação para alcançar um cruzamento ou um mosaico genético.

[00209] O termo recombinante, como usado aqui, especificamente com relação a sequências de ácidos nucleicos, refere-se a ácidos nucleicos ou polinucleotídeos produzidos por técnicas de DNA recombinante, por exemplo, uma construção de DNA compreendendo um polinucleotídeo heterólogo para uma célula hospedeira, que é opcionalmente incorporado na célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeos quimérica pode ser especificamente produzida como uma molécula recombinante.

[00210] O termo recombinante, como usado aqui, especificamente com relação a enzimas, refere-se a enzimas produzidas por técnicas de DNA recombinante, isto é, produzidas a partir de células transformadas com uma construção de DNA exógena codificando a enzima desejada. Enzimas sintéticas são as preparadas por síntese química. Uma enzima quimérica pode ser especificamente produzida como uma molécula recombinante.

[00211] O termo hospedeiro recombinante, também denominado célula hospedeira geneticamente modificada, designa uma célula hospedeira que compreende um ácido nucléico heterólogo.

[00212] O termo “repertório”, especificamente com relação a uma

52/83 variedade de elementos recombinantes, como vias metabólicas recombinantes ou células recombinantes, é aqui entendido como uma população de diversas variantes, por exemplo, variantes de ácidos nucleicos que diferem na sequência de nucleotídeos ou variantes polipeptídicas que diferem na sequência de aminoácidos, ou células hospedeiras ou clones de células hospedeiras recombinantes, por exemplo, compreendendo uma variedade de enzimas heterólogas ou uma variedade de vias metabólicas. Uma biblioteca da invenção abrangerá um repertório de células ou um repertório de compostos aromáticos produzidos como metabolites por tais células. De acordo com a presente invenção, um repertório de clones é planejado de modo a possuir uma via metabólica, em que é empregue um complexo multienzimático compreendendo pelo menos uma enzima quimérica, particularmente em que as referidas células diferem entre si no número e/ou tipo de mosaico genético, de modo que compreendem um agregado diferente de polinucleotídeos ou uma sequência de ácido nucléico com diferentes mosaico(s) genético(s), por exemplo, de modo que a atividade enzimática do referido complexo multienzimático ou referidos produtos de biossíntese ou o rendimento de produto será diferente.

[00213] A invenção proporciona particularmente uma biblioteca que pode ser obtida por um método de produção de uma via metabólica por recombinação in vivo, por exemplo, por recombinação homeóloga, de modo a obter uma variedade de células com diferentes polinucleotídeos envolvidos na via metabólica. Bibliotecas preferenciais compreendendo pelo menos 100 clones diferentes, preferencialmente pelo menos 1 000 clones diferentes ou mesmo mais, cujos clones produzem o produto de biossíntese desejado, cada um dos clones é considerado um membro da biblioteca. As variantes podem especificamente conter pelo menos 1 %, mais preferencialmente pelo menos 10 %, mais preferencialmente pelo menos 20 %, mais preferencialmente pelo

53/83 menos 40 %, mais preferencialmente pelo menos 60 %, mais preferencialmente pelo menos 80 %, ainda mais preferencialmente pelo menos 90 %, mais preferencialmente pelo menos 95 % de ORFs funcionais. A biblioteca preferencial que pode ser obtida de acordo com a presente invenção compreende especificamente uma elevada percentagem de mosaicos genéticos em uma fase de leitura aberta (ORF) funcional, preferencialmente pelo menos 80 %.

[00214] É preferencial caracterizar os clones variantes, por exemplo, através de análise genômica ou determinando a estrutura e função de metabolites secundários produzidos pela variante. A variante produtora de um produto de biossíntese desejado, por exemplo, um valinoide, em níveis elevados, pode ser selecionada para manipular adicíonalmente uma linhagem de células de produção recombinantes para propósitos de produção industrial.

[00215] Em consequência, a invenção é particularmente baseada na descoberta de uma nova via metabólica ou variantes de tal nova via metabólica, que pode ser usada na produção de valinoides e compostos relacionados por células hospedeiras recombinantes. Elementos chave de tal via nova são ácido cumárico e outras enzimas, entre estas uma crotonase, para proporcionar a biossíntese de valinoides ou precursores benzaldeído de tais valinoides. As células hospedeiras preferenciais compreendem um agregado heterólogo de polinucleotídeos codificando enzimas ou variantes enzimáticas, como pelo menos uma enzima quimérica compreendendo um mosaico genético.

[00216] Em uma modalidade específica, variantes enzimáticas são obtidas por tais mosaicos genéticos, por exemplo, diretamente por recombinação e eventual montagem dos mosaicos genéticos, ou como consequência de tal mosaico genético, por exemplo, através de uma sequência de processos enzimáticos. Um método exemplar refere-se a cinamato-4

54/83 hidrolase (C4H) e genes gerados por C4H codificando enzimas tendo propriedades enzimológicas melhoradas ou novas, por exemplo, como determinado em um ensaio funcional.

[00217] Um método especificamente preferencial emprega recombinação e montagem de enzimas e vias enzimáticas, compreendendo pelo menos 2 enzimas tendo atividade biológica, para obter um complexo multienzimático, variantes enzimáticas, vias ou variantes de vias tendo respectivas enzimas de tipo selvagem e/ou enzimas com mosaicos genéticos, para o processamento de material biológico de fonte ou séries para produzir os produtos de biossíntese desejados em níveis desejados.

[00218] Vias genéticas podem ser construídas de forma combinatorial de modo que cada membro da biblioteca combinatorial tenha uma combinação diferente de variantes genéticas. Por exemplo, uma biblioteca combinatorial de variantes pode ser construída a partir de elementos de DNA individuais, em que diferentes fragmentos são recombinados e montados e em que cada um dos diferentes fragmentos tem diversas variantes. A recombinação e montagem de uma via metabólica pode não requerer a presença de uma sequência marcadora para demonstrar a produção bem sucedida. A expressão de um metabolite de um modo desejado já será indicativa para o exemplo prático. A recombinação e montagem bem sucedidas da via metabólica podem ser determinadas, por exemplo, pela detecção do metabólito secundário em um meio de cultura de células.

[00219] Pode ser desejável simplesmente montar, por exemplo, alinhar em conjunto e opcionalmente misturar polinucleotídeos de ocorrência natural de origens diferentes, em que pelo menos um é heterólogo para a célula hospedeira, cujos polinucleotídeos codificam enzimas de tipo selvagem específicas. Também pode ser desejável proporcionar variantes de tais polinucleotídeos, por exemplo, por diversificação através de técnicas de

55/83 mutação, por exemplo, para criar variantes (multiplicidades) de vias metabólicas. Vias metabólicas que não existem na natureza podem ser construídas deste modo. Assim, enzimas que estão presentes em um organismo que operam em um substrato desejado produzido por um organismo diferente desprovido de uma tal enzima jusante, podem ser codificadas no mesmo organismo em virtude da construção da montagem de genes ou genes parciais para obter enzimas recombinadas. Múltiplas enzimas podem ser incluídas para construir vias metabólicas complexas. Tal é vantajoso, se um agregado de polipeptídeos ou polipeptídeos parciais for disposto na via de acordo com sua função bioquímica.

[00220] Preferencialmente, a biblioteca é uma biblioteca de levedura e a célula hospedeira de levedura exibe preferencialmente a via metabólica com as atividades de biossíntese desejadas. Em modalidades específicas, os produtos permanecem dentro da célula ou são secretados para fora da célula. A célula hospedeira de levedura é preferencialmente selecionada dos gêneros Saccharomyces, Pichia, Hansenula, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia e Candida. Muito preferencialmente, a célula hospedeira usada para produção da via metabólica heteróloga por montagem e/ou recombinação é Saccharomyces cerevisiae.

[00221] Qualquer célula hospedeira eucariótica ou procariótica competente para recombinação pode ser usada para gerar um agregado de polinucleotídeos e/ou um mosaico genético por recombinação somática in vivo de acordo com a presente invenção. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a célula é uma célula deficiente em reparação, por exemplo, uma célula deficiente em reparação de ácidos nucleicos, como com deficiência em reparação de DNA, isto é, uma célula deficiente em reparação de DNA, ou uma célula deficiente em MMR.

[00222] Especificamente, a célula é uma célula eucariótica,

56/83 preferencialmente uma célula fúngica, de mamífero ou planta, ou célula procariótica.

[00223] Preferencialmente, a célula é uma célula de Aspergillus sp ou fúngica, preferencialmente pode ser selecionada do grupo consistindo dos gêneros Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccaromyces, Yarrowia, Pichia e Aspergillus.

[00224] Preferencialmente são empregues estirpes haploides, como estirpes haploides de levedura.

[00225] Em alternativa, podem ser usados procariotas, como células de E. coli, Bacillus, Streptomyces, ou mamífero, como células HeLa ou células Jurkat, ou células de plantas, como Arabidopsis.

[00226] Por produção da via metabólica apropriada por técnicas de recombinação in vivo, pode ser vantajoso excisar o agregado de polinucleotídeos e incorporar o agregado em uma célula hospedeira de produção. Depois de sintetizados como metabolites ou intermediários de tais metabólitos por clones selecionados compreendendo o novo agregado heterólogo e opcionalmente o mosaico genético, são tipicamente produzidos em larga escala por sistemas de expressão adequados, por exemplo, por produção microbiana, e/ou por (outras) etapas do processo de síntese in vitro.

[00227] Preferencialmente, a célula hospedeira de produção é uma célula de levedura.

[00228] De acordo com a presente invenção podem ser empregues técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, e de DNA recombinante que pertencem à perícia na área.

[00229] Para recombinação in vivo, o gene a ser recombinado com o genoma ou outros genes é usado para transfecção do hospedeiro usando técnicas de transfecção padrão. Em uma modalidade adequada, DNA proporcionando uma origem de replicação é incluído na construção. A origem

57/83 de replicação pode ser adequadamente selecionada pelo perito. Dependendo da natureza dos genes, pode não ser requerida uma origem de replicação suplementar se já estiverem presentes sequências com os próprios genes ou genoma que são operáveis como origens de replicação.

[00230] Sequências de ácidos nucléicos sintéticos ou cassetes e subconjuntos podem ser produzidos na forma de polinucleotídeos lineares, plasmídeos, megaplasmídeos, cromossomos sintéticos ou artificiais, como cromossomos artificiais de planta, bacterianos, de mamífero ou levedura.

[00231] Uma célula pode ser transformada por DNA exógeno ou heterólogo quando tal DNA tiver sido introduzido no interior da célula. O DNA transformante pode ou não ser integrado, isto é, covalentemente ligado no genoma da célula. Em procariotas, células de levedura, e mamífero, por exemplo, o DNA transformante pode ser mantido em um elemento epissomal, como um plasmídeo. Relativamente a células eucarióticas, uma célula transformada de modo estável é uma célula em que o DNA transformante ficou integrado em um cromossomo de modo que é herdado por células filhas através de replicação cromossômica. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica de estabelecer linhagens de células ou clones compreendidos de uma população de células filhas contendo o DNA transformante.

[00232] Os diversos substratos genéticos podem ser incorporados em plasmídeos. Os plasmídeos são muitas vezes vetores de clonagem padrão, por exemplo, plasmídeos bacterianos de múltiplas cópias. Os substratos podem ser incorporados no mesmo plasmídeo ou em plasmídeos diferentes. Muitas vezes, pelo menos dois tipos diferentes de plasmídeos tendo diferentes tipos de marcadores selecionáveis são usados para permitir seleção quanto a células contendo pelo menos dois tipos de vetor.

[00233] Plasmídeos contendo diversos substratos genéticos são

58/83 inicialmente introduzidos em células por qualquer método (por exemplo, transformação química, competência natural, eletroporação, biolística, embalamento em sistemas fágicos ou virais). Muitas vezes, os plasmídeos estão presentes na concentração saturante ou quase (relativamente à capacidade máxima de transfecção) para aumentar a probabilidade de mais do que um plasmídeo entrar na mesma célula. Os plasmídeos contendo os vários substratos podem ser transfectados simultaneamente ou em múltiplas rondas. Por exemplo, na última abordagem, células podem ser transfectadas com uma primeira alíquota de plasmídeo, transfectantes são selecionados e propagados, e então são infectados com uma segunda alíquota de plasmídeo. Plasmídeos preferenciais são, por exemplo, derivados pUC e pBluscribe, como pMXY9, pMXY12 e pMIX-LAM, ou derivados YAC, como YCp50.

[00234] A velocidade de evolução pode ser aumentada permitindo que todos os substratos genéticos participem na recombinação. Tal pode ser alcançado sujeitando células transfectadas a eletroporação. As condições de eletroporação são iguais às convencionalmente usadas para introduzir DNA exógeno em células. A velocidade de evolução também pode ser aumentada por fusão de células para induzir troca de plasmídeos ou cromossomos. A fusão pode ser induzida por agentes químicos, como PEG, ou proteínas virais, como hemaglutinina do vírus influenza, gB e gD de HSV-1. A velocidade de evolução também pode ser aumentada usando células hospedeiras de mutação (por exemplo, Mut L, S, D, T, H em bactérias, mutantes análogos em levedura, e linhagens de células humanas de Ataxia telangiectasia).

[00235] Em uma modalidade preferencial da invenção, a montagem de um gene mosaico, sua recombinação com um genoma hospedeiro, e adicionalmente a expressão do gene mosaico para produzir um polipeptídeo recombinante de interesse ou um metabólito da referida célula hospedeira, são realizados em um procedimento de etapa única.

59/83

[00236] Células contendo os genes recombinados podem ser sujeitas a rastreio ou seleção quanto a uma função desejada. Por exemplo, se o substrato a evoluir contiver um gene de resistência a fármacos, será selecionada resistência a fármacos.

[00237] Especificamente, metabolites de aminoácidos aromáticos, como fenilalanina, tirosina ou e triptofano, como os produzidos por plantas ou levedura por atividade enzimática, ou quaisquer intermediários ou derivados, podem ser produzidos de um modo novo. Assim, o repertório de variantes enzimáticas conduz à formação de diversos metabólitos, que então são rastreados quanto à estrutura e função desejadas.

[00238] Phe e Tyr são intimamente relacionados. Contêm um anel benzeno que está adicionalmente hidroxilado em tirosina. Tirosina é sintetizada diretamente a partir do aminoácido essencial fenilalanina. Triptofano contém um anel indol conjugado. Estas relações metabólicas originam uma dependência nutricional intrincada.

[00239] Em plantas, a via de shiquimato produz o composto fenilalanina para a biossíntese de fenilpropanoides. Os hidroxicinamatos e ésteres produzidos por uma combinação de redutases, oxigenases, e transferases definem o padrão específico de metabólitos em um órgão e, dependendo do seu desenvolvimento, este perfil é característico para cada espécie de planta. As três etapas iniciais da via de fenilpropanoides são, por exemplo, catalisadas pelas enzimas PAL, C4H e 4CL e proporcionam a base de todos os ramos subsequentes e metabólitos resultantes, por exemplo: flavonoides, ligninas, ésteres fenilpropanoides, auronas, isoflavonas, estilbenos, proantocianinas, etc.

[00240] Por exemplo, é conhecido que PAL catalisa a desaminação de Phe para originar ácido cinâmico, que é a primeira etapa da via de fenilpropanoides, e um ponto de regulação entre o metabolismo primário

60/83 e secundário Compostos fenilpropanoides são precursores de uma gama de compostos fenólicos com muitas funções na natureza, incluindo lignina, flavonoides, isoflavonoides, cumarinas e estilbenos.

[00241] Produtos de vias metabólicas são tipicamente pequenas moléculas naturais ou respectivas variantes, por exemplo, diferindo em glicosilação, acilação, aminação, hidroxilação ou metilação, com funções aperfeiçoadas ou novas. Estes metabolites são adequadamente usados como fragrâncias ou aromas ou como uma molécula terapêutica (por exemplo, antiinfecciosa ou para o tratamento de câncer).

[00242] Exemplos específicos referem-se a uma nova fábrica de células de levedura para produção de vanilina a partir de uma fonte de açúcar, usando montagem e recombinação somáticas in vivo da via metabólica artificial. É especificamente proporcionada uma nova fábrica de células de levedura para produção de vanilina a partir de uma fonte de açúcar, usando montagem e recombinação somáticas in vivo da via metabólica artificial. De acordo com um exemplo específico, uma via artificial para a produção de vanilina a partir de uma fonte de carbono é proporcionada em um microrganismo. O esquema de bioconversão exemplar requer seis etapas de conversão catalisada por enzimas. Gene codificantes de enzimas podem ser integrados em genoma de levedura por recombinação somática in vivo. A prevenção da redução de vanilina em álcool vanilílico pode ser especificamente alcançada por nocaute da álcool desidrogenase hospedeira ADH6. ADH6 pode sofrer disrupção por integração de uma proteína ácido carboxílico redutase com sua proteína de acoplamento ativadora fosfopanteteinil transferase.

[00243] Os exemplos descritos aqui são ilustrativos da presente invenção e não é pretendido que sejam limitações à mesma. Diferentes modalidades da presente invenção foram descritas de acordo com a presente invenção. Podem ser feitas muitas modificações e variações nas técnicas

61/83 descritas e ilustradas aqui sem abandonar o espírito e escopo da invenção. Em conformidade, deve ser entendido que os exemplos são somente ilustrativos e não limitam o escopo da invenção.

Exemplos

Exemplo 1: Via De Vanilina Artificial: Via Metabólica Para Produzir Vanilina Usando Fenilalanina Como Composto Precursor

[00244]Uma vez que a vanilina não é um metabólito endógeno, é necessário recriar uma via de produção sintética em levedura. A síntese de vanilina começa na forma de todos os fenilpropanoides com fenilalanina que é produzida endogenamente pela célula. São necessárias seis enzimas para a conversão de L-fenilalanina em vanilina (Figura 1). A fenilalanina é convertida em cumarato pela ação sucessiva das enzimas fenilalanina amônia liase (PAL), cinamato-4-hidroxilase (C4H). A etapa seguinte é a reação de redução de cadeia do ácido cumárico conducente ao 4-hidroxibenzaldeído. A reação é iniciada pela ativação de ácido cumárico em cumaroil-CoA proporcionada pela por enzima 4CL (4Cumarato Coenzima A Ligase), seguida de uma β-oxidação efetuada pela enzima ECH (enoil-CoA hidratase/aldolase, enzima da família das crotonases). A etapa seguinte é a hidroxilação na posição 3 do anel fenila efetuada pela enzima HBH (ácido hidroxibenzoico hidroxilase, família de enzimas 3-mono-oxigenases). A etapa final é a 3-O-metilação conducente ao produto final vanilina. Esta etapa é catalisada pela enzima COMT (ácido cafeico O-metiltransferase, família de enzimas O-metiltransferases). Para diminuir a conversão endógena de produto intermediário aldeído, adicionou-se proteína ácido carboxílico redutase.

[00245] Em S. cerevisiae, a enzima CAR requereu ativação por fosfopanteteinilação, e tal foi alcançado por coexpressão de uma fosfopanteteinil transferase.

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a) Montagem da via de vanilina em célula hospedeira de levedura

[00246] Todas as estirpes de Saccharomyces cerevisiae usadas neste trabalho foram haploides isogênicos de BY4741 e foram obtidas da EUROSCARF (BY00 a-mater ou BY10 a-mater haploide). Estirpe de levedura BY47 derivada de uma coleção de estirpes que contêm nocautes de genes marcadores auxotróficos (-ura3, -Ieu2, his3) . As diferentes estirpes e genótipos relevantes estão listados na Tabela 2. O enriquecimento e propagação de clones foram efetuados em culturas líquidas YPD (10 g/L de extrato de levedura Bacto, 20 g/L de bacto-peptona e 2 % de dextrose) a 30 °C. Recombinantes foram selecionados em placas de ágar Dropout (YNB + CSM) na ausência de uracila ou leucina ou histidina. As deficiências genéticas na via biossintética de uracila, histidina e leucina resultam em auxotrofia. Para recombinação homeóloga, usámos uma estirpe deficiente em emparelhamentos defeituosos (BY00775 a-mater ou BY10775 a-mater haploide, sgs1-, Euroscarf). Todas as ORFs usadas para a via foram sintetizadas na GeneArt (Alemanha) e então foram amplificadas por PCR. A amplificação foi realizada usando PhusionTaq de alta fidelidade (New England Biolabs). Os amplicons foram limpos usando o Sistema de Limpeza por PCR Wizard (Promega) e foram usados para ensaios de transformação.

Tabela 2: Genótipo de estirpes de S. cerevisiae usadas neste trabalho (EUROSCARF)

Gene defeituoso (ORF)	NQ Ac.	Estirpe	Genótipo
Estirpes de tipo selvagem	Y00000	BY4741	MATa: his3A1; leu2A0; met15A0; ura3A0
Y10000	BY4741	MAT a: his3A 1; leu2A0; lys1A0; ura3A0

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Gene defeituoso (ORF)	NQ Ac.	Estirpe	Genótipo
YMR190C (Asgsl)	Y00775	BY4741	MATa: his3A1; leu2A0; met15A0; ura3A0; YMR191 c::kanMX4
Y10775	BY4741	MATa: his3A1; leu2A0; lysIAO; ura3A0; YMR191 c::kanMX4

[00247] Foi empregue uma abordagem em Três etapas para identificar enzimas heterólogas para a via de vanilina sintética. Em primeiro lugar, os candidatos foram individualmente expressos em levedura para avaliar a atividade enzimática. Em segundo lugar, depois de identificadas todas as enzimas, a via completa foi montada usando uma montagem somática de DNA in vivo. E em terceiro lugar, a evolução foi realizada na via de vanilina usando recombinação homeóloga in vivo e montagem em levedura.

b) Caracterização de atividades de proteínas exóoenas individualmente expressas em levedura.

[00248] Em primeiro lugar, enzimas candidatas foram individualmente expressas em S. cerevisiae e testadas quanto à atividade (ver Tabela 3 quanto a detalhes das fontes das sequências).

Tabela 3: Identidades de referência dos genes usados neste exemplq Gene Espécie Referência Comprim ento de ORF (pb) (base de dados de nucleotídeos do NCBI)

PAL	Petroselinum crispum	X81158.1 GL534892	2157
Populus trichocarpa x Populus deltoides	L11747.1 GL169453	2148
C4H	Glycine max	FJ770468.1 GL225194700	1521

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Gene	Espécie Petroselinum crispum	Referência Q43033.1 GL3915088	Comprim ento de ORF (pb) 1521
4CL	Populus tremuloides	AF041049.1 GL3258634	1713
ECH	Pseudomonas fluorescens	AJ536325.1	831
Azotobacter vinelandii	YP_002798614.1 GL226943541	831
HBH	Pseudomonas aeruginosa	ZP_07797957.1 GL313112178	1185
Azotobacter vinelandii	NC_012560.1 GL226943557	1185
COMT	Medicago sativa	ACY06328.1 Gl:261889456	1098
Vanilla planifolia	AAS64572.1 G 1:45444737	1098
CAR	Nocardia iowensis	AAR91681.1 G 1:40796035	3525
PPTase	Nocardia iowensis	ABI83656.1 Gl:114848891	669
URA3	Kluyveromyces lactis (pJJH726: nucleotídeo 1 até 2246)	AF298788.1 Gl:11344892	2146
LEU2	Saccharomyces cerevisiae	G 1:259144874	2218
CPR	Populus trichocarpa x Populus deltoides	AF302497.1 Gl:13183563	2139

[00249] Para cada gene, clones recombinantes foram construídos usando recombinação homóloga in vivo no lócus bud31 (Figura 2). Fragmentos de integração foram designados. T 5’ e T 3’ correspondem às sequências alvo de bud31 no genoma de levedura permitindo integração homóloga no lócus

65/83 cromossômico. URA e LEU são os marcadores flanqueadores para a seleção dupla. Sequências sobrepostas correspondem à parte 5’ e à parte 3’ dos genes marcadores. Todos os fragmentos de integração IF1-IF2-IF4 e IF5 foram amplificados por PCR e amplicons foram purificados usando o Sistema de Limpeza por PCR Wizard (Promega). ORF sintetizada foi amplificada a partir do plasmídeo da GeneArt. A extremidade 5' dos oligonucleotídeos a montante usados para amplificação do gene de interesse contém uma sequência de 40 nucleotídeos homóloga à extremidade 3' do promotor pGAL1. Os oligonucleotídeos a jusante continham uma sequência de 40 nucleotídeos homóloga à extremidade 5' do terminador tCYC. Após montagem por recombinação homóloga em levedura, a seleção dupla permite a seleção dos recombinantes.

[00250] Para cada transformação, cinco clones recombinantes foram escolhidos aleatoriamente e a integração correta do agregado foi analisada por PCRs direcionados usando gDNA como modelo. PCR de colônias foi realizado como descrito embaixo. Uma quantidade mínima de células (lado de uma ponta de 10 pL) foi ressuspensa em um tubo de PCR contendo 15 pL de mistura de lise (Tris-HCI 100 mM pH=7,5 + 5 pL de zimolase (10 mg/mL) da Sigma). Os tubos foram primeiramente incubados por 20 minutos a 20 °C, então 5 minutos a 37 °C e finalmente 5 minutos a 95 °C. Foram usados 2 pL de cada mistura de lisados em 25-100 pL de reações de PCR DreamTaq como indicado pelo fornecedor (Fermentas). DNAs amplificados para sequenciamento foram separados de primers usando o Sistema de Limpeza por PCR Wizard (Promega).

[00251] Então, os clones recombinantes foram cultivados em meio de indução para permitir a síntese de proteínas. Uma vez que, nesta construção, a expressão genética é controlada por promotores de GAL1 induzíveis, células foram cultivadas em meio YPAGAL (meio YEP com

66/83 galactose como única fonte de carbono). Após cultivo por 24 horas, as células foram nutridas com 500 μΜ do substrato apropriado. Os sobrenadantes foram então analisados por Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para identificar o produto apropriado. Intermediários da biossíntese de vanilina e catabólitos de vanilina foram analisados usando um sistema de HPLC Agilent série 1200 usando uma coluna ACE5-C18 (4,6 por 250 mm, dimensão das partículas 5 μιτι). Foi determinado um gradiente de acetonitrila/água e foi usado um detector de arranjo de diodos para detectar compostos que eluíram por sua fluorescência UV a 260 nm, 280 nm e 320 nm. Todos os padrões foram obtidos da Sigma Aldrich.

c) Montagem da via de vanilina.

[00252] Em segundo lugar, depois de identificadas todas as enzimas, a via completa foi montada usando uma montagem somática de DNA in vivo. Oito fragmentos (F1 até F8) contendo os 6 genes da via de vanilina foram planejados por análise computacional. Os fragmentos, as ORFs bem como as sequências a montante e a jusante estão apresentados na Figura 3 (quanto à amplificação de cada fragmento, ver a Tabela 4 e Tabela 5, quanto a detalhes das fontes das sequências, ver a Tabela 3).

Tabela 4: Primers usados para a amplificação dos fragmentos usados em

RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA.

primer	Sequência 5' ->3'	função
OL01	SEQID 16:CTGTGCTGTCTGCGCTGC	Amplificação
OL02	SEQ ID 17 : ATCGTGCAAAACAACTCTGTATTCAG	de F1
OL126	SEQ ID 18 : CCAGAAGATGCTCCATTGGAAGAT	Amplificação
OL127	SEQ ID 19 : TTAAGACATAGTAGTAGCAGTAGCCAA	de F2
OL132	SEQID 20:ATGATGTCTGTTGCTACTGTTGAACCA	Amplificação
OL133	SEQ ID 21 : TTAACAAATTGGCAATGGAGAACCGTTC	de F3

67/83

primer	Sequência 5' ->3'	função
OL09	SEQ ID 22 : ATGGAAACTGTTACTAAGAACGGTTA	Amplificação
OL10	SEQ ID 23 : TTAGAAAGATCTTGGCTTAGCAACA	de F4
OL140	SEQ ID 24 : ATGGATTTGTTGTTGTTGGAAAAGACTT	Amplificação
OL219	SEQ ID 25 : ATGTCTAACTACGAAGGTAGATGGACT	de F5
OL222	SEQ ID 26 : TCATCTCTTGTAAGCTTGCAAACCTG	Amplificação
OL149	SEQ ID 27 : TTATTCAATTTCTTCGTATGGCAAACCAACGTA	de F6
OL156	SEQ ID 28 : ATGAAGACTCAAGTTGCTATTATTGGTG	Amplificação
OL157	SEQ ID 29 : TTAAACCTTCTTCAAGAATTCCATAATGTAAGTGTTG AAAG	de F7
OL15	SEQ ID 30 : ATGGGTTCTACTGGTGAAACTCAA	Amplificação
OL16	SEQ ID 31 : GCGCATGTGTCCGATCTTTG	de F8

Tabela 5: Identidades de referência das sequências a montante e a jusante PARA OS GENES DE VANILINA USADAS NOS EXEMPLOS 1 E 2.

Promotor	Espécie	Referência (base de dados de nucleotídeos do NCBI)	Comp rimen to (Pb)
pMET2Pp X	Saccharomyces paradoxus (nucleotídeol4989 até 15458)	AABY01000028.1 GL29362583	474
pGAL1/p GAL10	pESC-URA (nucleotídeos 2271- 2934)	AF063585.2 G 1:6446607	664
pMET2Sb y	Saccharomyces bayanus (nucleotideo 4779 até 5247)	AACG02000186.1 GL77693693	479

68/83

Promotor	Espécie	Referência (base de dados de nucleotídeos do NCBI)	Comp rimen to (Pb)
pADH1	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 160595 até 162095 [C])	NC_001147.5 GL84626310	1501
pGDP	Saccharomyces cerevisiae	Part:BBa K124002	680
Terminad or	Espécie	Referência (base de dados de nucleotídeos do NCBI)	Comp rimen to (Pb)
tTPISce	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 1406 até 1649)	J01366.1 Gl:173007	243
tPGKSce	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 1553 até 1839)	J01342.1 Gl:172143	286
tADHISc e	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 1798 até 1991)	V01292.1 GL3338	194
tCYCISc e	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 559 até 838)	V01298.1 GL3626	279

[00253]0 fragmento hibridiza e sofre recombinação em conjunto na região de toda a ORF de cada par de genes. Desse modo, toda a via é montada na célula de levedura, e então é integrada no cromossomo. Tg 5’ e Tg 3’ correspondem às sequências alvo no genoma de levedura que correspondem ao local de inserção no lócus BUD 31 do cromossomo de levedura que desencadeia a integração homóloga no local

69/83 cromossômico desejado. HIS3 e LEU2 são os marcadores flanqueadores que permitem a seleção dupla da via recombinante. Cada gene está sob o controle de uma sequência promotora e uma terminadora permitindo a sua expressão em células de levedura. Após montagem dos fragmentos por recombinação homóloga em levedura, uma via funcional completa de 20291 pb é reconstituída e a seleção dupla permite o isolamento de recombinantes.

[00254]Todos os fragmentos foram amplificados por PCR e amplicons foram purificados usando the Sistema de Limpeza por PCR Wizard (Promega). Transformações de células de levedura competentes foram realizadas como descrito por Gietz e Woods (Transformation of yeast by the LiAc/ss Carrier DNA/PEG method. Meth. Enzymol., 350, 87-96) com algumas modificações para otimizar o volume inicial de DNA. Células foram pré-cultivadas em meio YPD e então foram usadas para inocular novo meio rico. Foram recolhidas quando a GD600 alcançou 0,6, o pélete foi lavado duas vezes e concentrado em 1/50 de volume. Células competentes foram adicionadas à mistura de transformação PEG/LiAC/ssDNA com 250 ng de cada fragmento (F1-F2-F3-F4-F5-F6-F7 e F8). Adicíonalmente, células competentes foram transformadas sem DNA (controle negativo). A seleção de clones recombinantes foi realizada em meio sem His e Leu. Passados 3 dias, clones transformados com os vários fragmentos foram observados em meio de seleção. Três clones (Y00VAN) foram escolhidos aleatoriamente para análise da sequência e atividade. DNA isolado e genômico (gDNA) foi preparado usando o kit de purificação de DNA Genômico Wizard (Promega). Então, os 7 genes de vanilina de cada um destes clones foram amplificados com primers específicos que também verificaram a montagem correta dos fragmentos. A análise de clones revelou que os genes haviam sido montados originando ORFs corretas.

70/83

d) Expressão da via de vanilina em levedura.

->Expressão da via de vanilina em estirpe de levedura de tipo selvagem (Y00VAN).

[00255] Primeiramente analisámos a via de vanilina em uma estirpe de levedura de tipo selvagem sem expressão da proteína CAR. Alguns genes de vanilina são controlados por promotores induzíveis, como GAL1/10 para ECH e HBH e MET2 para PAL. Culturas de levedura foram cultivadas em condições indutoras: meio mínimo contendo galactose como única fonte de carbono na ausência de metionina e com adição de fenilalanina como precursores (10 mM). O cultivo foi realizado por pelo menos 60 horas. Foram recolhidas por centrifugação e sobrenadantes foram recuperados. Como controles, usámos a estirpe de tipo selvagem Y00 (sem gene de vanilina) cultivada nas mesmas condições de Y00VAN (clone expressando genes da via de vanilina), e o meio sem levedura. HPLC foi usado para medir a produção de vanilina e intermediários da via em culturas de S. cerevisiae. A análise mostrou que cromatogramas de células que expressam genes da via de vanilina (Y00VAN) continham picos adicionais em comparação com um controle de Y00. Estes picos foram identificados por comparação com a nossa biblioteca de moléculas. Assim, foram identificados ácido cinâmico, ácido cumárico, ácido 4 hidroxibenzoico, ácido 3-4 dihidroxibenzoico e ácido vanílico. Não foram detectados 4 hidroxibenzaldeído, 3-4 dihidroxibenzaldeído e vanilina. Quando culturas de Y00VAN são alimentadas com 500 μΜ de 3-4 dihidroxibenzaldeído, são detectados vanilina, ácido vanílico e álcool vanilílico. O desvio dos derivados ácidos ocorre imediatamente após a etapa de redução da cadeia. Por fim, quando células são alimentadas com 3-4 dihidroxibenzaldeído em meio de indução total, a maior parte dos precursores intermediários bem como produtos finais é detectada (Figura 4).

[00256] Y00VAN foi então cultivado em meio YPAGAL rico: meio

71/83

YEP com galactose como única fonte de carbono e com fenilalanina como precursor (10 mM). Presumimos que a quantidade de metionina contida no meio é rapidamente consumida e o promotor pMET é então induzido. Foi observado um crescimento mais elevado usando meio rico. O sobrenadante foi analisado usando HPLC e foi comparado com a composição do sobrenadante de Y00. Passadas 60 horas, grandes quantidades de ácido 3-4 dihidroxibenzoico e ácido vanílico foram detectadas no sobrenadante (Figura 5).

[00257] Quando a cultura não é suplementada com fenilalanina exógena, a proteína PAL usa fenilalanina endógena. A via é totalmente funcional, pois foram detectados ácido 3-4 dihidroxibenzoico e ácido vanílico, mas o rendimento é reduzido 4 vezes em comparação com o meio suplementado com fenilalanina (Figura 5). A biossíntese endógena de fenilalanina prossegue através de uma via comum com outros aminoácidos aromáticos para corismato e alimenta a via de vanilina.

->Expressão da via de vanilina em estirpe de levedura modificada (YOOCP).

[00258] Na via de vanilina, muitos precursores intermediários são aldeídos. No entanto, é conhecido que aldeídos são substratos de muitas enzimas endógenas conducentes a derivados relativos de álcool ou ácido. Em Y00VAN, aldeídos são oxidados em derivados ácidos imediatamente após reação de redução de cadeia e não é detectada nenhuma vanilina. Para diminuir esta conversão, uma proteína ácido carboxílico redutase foi adicionada com sua proteína de acoplamento ativadora fosfopanteteinil transferase. A construção bicistrônica foi integrada no genoma de levedura por recombinação homóloga usando URA como marcador de seleção no lócus ADH6. A prevenção da redução de vanilina em álcool vanilílico foi alcançada por nocaute da álcool desidrogenase hospedeira ADH6. Para retirar o marcador de seleção, sequências flanqueadoras repetidas foram adicionadas ao gene URA3 para

72/83 permitir a excisão do gene URA3. Células recombinantes foram selecionadas em meio seletivo -URA e a integração correta foi verificada por PCR. URA3 codifica uma oritidina 5’ fosfato descarboxilase que está implicada na síntese de uracila. 5FOA (ácido 5 fluoro-orótico) é convertido em 5 fluorouracila por URA3. Este metabólito tóxico é uma pressão seletiva que favorece a excisão de URA3 com sequências flanqueadoras repetidas conducentes ao genótipo ura3. A estirpe de levedura foi denominada YOCP. Quando a cultura de YOCP é alimentada com 500 μΜ de ácido vanílico, vanilina é detectada no sobrenadante, indicando que CAR é funcional.

[00259] A estirpe recombinante YOCPVAN compreende a via de vanilina completa.

e) Evolução usando recombinação homeólocia e montagem de genes da via de vanilina.

[00260] Uma biblioteca de genes mosaico complexos da via de vanilina foi gerada usando recombinação homeóloga e montagem. Neste experimento, dois genes homólogos de cada enzima foram montados/recombinados. Para prosseguir a recombinação homeóloga, três fragmentos foram novamente planejados por introdução de sequências relacionadas de genes da via Figura 7 (quanto à amplificação dos fragmentos F4’, F6’ e F7’, ver a Tabela 6). F04’ contém o gene homeólogo de PAL e C4H que partilham 91 e 90 % de homologia com outra sequência paterna, respectivamente. F06’ contém o gene homeólogo de ECH e HBH que partilham 88 e 77 % de homologia com outra sequência paterna, respectivamente. F07’ contém COMT homeólogo que partilha 73 % de homologia com a outra sequência paterna.

[00261] Cada fragmento hibridiza e sofre recombinação na região da ORF completa de cada gene homeólogo. Desse modo, a totalidade da via de mosaico é montada, recombinada e integrada no cromossomo na célula de

73/83 levedura deficiente na reparação de emparelhamentos defeituosos. Após montagem dos fragmentos por recombinação homeóloga em levedura, uma via funcional completa de 20291 pb é reconstituída e a seleção dupla permite o isolamento de recombinantes.

Tabela 6: Primers usados para a amplificação dos fragmentos substituídos

primer	Sequência 5' --> 3'	função
OL19	SEQ ID 32 : ATGGCTTACGTTAACGGTACTACT	Amplificação
OL20	SEQ ID 33 : TTA CAA AG A TCT TGG CTT ACA AAC AAT A	do Frag. 4'
OL275	SEQ ID 34 : TTATCTCTTGTAAGCTTGCAAACCTGG	Amplificação do Frag. 6'
OL276	SEQ ID 35 : TTAAGCAAI I ICTTCGTATGGCAAACCAAC
OL156	SEQ ID 36 : ATGAAGACTCAAGTTGCTATTATTGGTG	Amplificação do Frag. 7'
OL281	SEQ ID 37 : TCACTTGTTGAATTCCATAACCCAAACGTT

[00262]0s fragmentos F1-F2-F3-F4’-F5-F6’-F7’ e F8 foram amplificados por PCR e amplicons purificados foram usados para transformar levedura de reparação de emparelhamentos defeituosos. Células Y10775CP foram pré-cultivadas em meio YPD e então foram usadas para inocular novo meio rico. Foram recolhidas quando a OD600 alcançou 0,6, o pélete foi lavado duas vezes e concentrado em 1/50 de volume. Células competentes foram adicionadas à mistura de transformação PEG/LiAC/ssDNA com 250 ng de cada fragmento. Adicionalmente, células competentes foram transformadas sem DNA (controle negativo). A seleção de clones recombinantes foi realizada em meio sem His e Leu. Passados 3 dias, clones transformados com os diferentes fragmentos foram observados em meio de seleção. Três clones (YOOVANev) foram

74/83 escolhidos aleatoriamente para análise da sequência e atividade. DNA isolado e genômico (gDNA) foi preparado usando o kit de purificação de DNA Genômico Wizard (Promega). Então, os 7 genes de vanilina de cada um destes clones foram amplificados com primers específicos que também verificaram a montagem correta dos fragmentos. A análise de clones revelou que os genes haviam sido montados originando ORFs corretas.

Bioconversão de vanilina a partir de uma fonte de açúcar

[00263]A via de vanilina foi montada em estirpe hospedeira modificada. Para reduzir o ácido de vanilina em vanilina, ácido carboxílico redutase foi adicionada com sua proteína de acoplamento ativadora fosfopanteteinil transferase. A construção bicistrônica foi integrada no genoma de levedura por recombinação homóloga usando URA como marcador de seleção no lócus ADH6. A prevenção da redução de vanilina em álcool vanilílico foi alcançada por nocaute da álcool desidrogenase hospedeira ADH6. Então, a estirpe modificada foi pré-cultivada em meio YPD e então foi usada para inocular novo meio rico. Foram recolhidas quando a GD600 alcançou 0,6, o pélete foi lavado duas vezes e concentrado em 1/50 de volume. Células competentes foram adicionadas à mistura de transformação PEG/LiAC/ssDNA com 250 ng de cada fragmento (F1-F2-F3-F4-F5-F6-F7 e F8). A seleção de clones recombinantes foi realizada em meio sem His e Leu. Passados 3 dias, clones transformados com os vários fragmentos foram observados em meio de seleção. Então, os 7 genes de vanilina de cada um destes clones foram amplificados com primers específicos que também verificaram a montagem correta dos fragmentos. A análise de clones revelou que os genes haviam sido montados originando ORFs corretas.

[00264] A estirpe recombinante contendo toda a via foi

75/83 cultivada em condições indutoras: meio mínimo contendo galactose como única fonte de carbono. O cultivo foi realizado por pelo menos 24 horas. Foram recolhidas por centrifugação e sobrenadantes foram recuperados. HPLC foi usado para medir a produção de vanilina e intermediários da via em culturas de S. cerevisiae. A análise mostrou que cromatogramas de células que expressam genes da via de vanilina (YOOVAN) continham picos adicionais em comparação com um controle de Y00. Estes picos foram identificados por comparação com a nossa biblioteca de moléculas (Figura 12). Assim, ácido cinâmico e ácido cumárico não foram detectados; no entanto, 4 hidroxibenzaldeído (8,6 μΜ), 3-4 dihidroxibenzaldeído (0,29 μΜ), ácido 3-4 dihidroxibenzoico (22,64), ácido vanílico (2 μΜ) e vanilina (1 μΜ) foram identificados. Não estava presente álcool vanilílico.

Exemplo 2: Via de vanilina artificial: via metabólica para produzir ácido FERÚLICO USANDO FENILALANINA COMO COMPOSTO PRECURSOR

a) Via de ácido ferúlico artificial

[00265] Cinco enzimas são requeridas para a conversão de Lfenilalanina em ácido ferúlico (Figura 8). Fenilalanina é convertida em cumarato pela ação sucessiva das enzimas PAL e C4H. Na sequência proposta de reação para a segunda via, ácido cumárico é primeiramente hidroxilado na posição 3 do anel fenila pela proteína pheA (fenol hidroxilase) usando proteína de acoplamento flavina redutase. O metabólito intermediário é o ácido cafeico. Então ocorre O-metilação, que converte a função hidroxila no grupo metoxi, conduzindo à síntese de ácido ferúlico usando proteína COMT. A maior parte das proteínas são comuns a ambas as vias. Diferem na ordem sequencial das reações. Esta ordem é maioritariamente devida a reação de hidroxilação e à especificidade de ambas as enzimas selecionadas para realizar esta reação (PheA e HBH). As proteínas PAL, C4H e COMT usadas nesta via são os mesmos candidatos da via de vanilina. É interessante notar que a adição de uma CoA-ligase e uma crotonase à via ferúlica

76/83 conduz à produção de vanilina.

b) Montagem da via de ácido ferúlico em célula hospedeira de levedura

[00266]De modo similar à via de vanilina, 7 fragmentos (F1, F8, F9, F10, F11, F12, F13) contendo os 5 genes da via ferúlica foram planejados por análise computacional. Os fragmentos, as ORFs bem como as sequências a montante e a jusante estão apresentados na Figura 9 (quanto a detalhes das fontes das sequências, ver a Tabela 3 e Tabela 7, quanto à amplificação de cada fragmento, ver a Tabela 8). HIS3 e LEU2 são os marcadores flanqueadores que permitem a seleção dupla da via recombinante. Cada gene possui uma sequência promotora e uma terminadora que permitem sua expressão em células de levedura. Após montagem dos fragmentos por recombinação homeóloga em levedura, uma via funcional completa de 19068 pb é reconstituída e a seleção dupla permite o isolamento de recombinantes.

Tabela 7: Identidades de referência dos genes suplementares usados

NESTE EXEMPLO

Gene Espécie Referência Comprimento de ORF (pb) (base de dados de nucleotídeos do NCBI)
PheA flared	Geobacillus thermoleovorans	AAC38324.1 GL3046914	1572
Geobacillus thermoleovorans	AAQ04677.1 GL33317300	441

Tabela 8: Primers usados para a amplificação dos fragmentos usados na via Ferúlica

primer	Sequência 5' --> 3'	função
OL01	SEQID 16:CTGTGCTGTCTGCGCTGC	Amplificação de F1
OL02	SEQ ID 17 : ATCGTGCAAAACAACTCTGTATTCAG
OL03	SEQ ID 38: CGAAAGAGGTGAATGGTTGAAG	Amplificação de F9

77/83

primer	Sequência 5' --> 3'	função
OL288	SEQ ID 39:TTAACCTTCGTTAGATGGGAAAGAAGT
OL289	SEQ ID 40:ATGGATAGAGGTAAGACTATGATTGAAA	Amplificação de F10
OL8	SEQ ID 41 :TTAACAAATTGGCAATGGAGCACC
OL19	SEQ ID 42:ATGGCTTACGTTAACGGTACTACT	Amplificação de F11
OL20	SEQ ID 43:TTACAAAGATCTTGGCTTACAAACAATA
OL11	SEQ ID 44:ATGGATTTCG I I I I GTTGGAAAAGG	Amplificação de F12
OL12	SEQ ID 45:TCATCTCTTTCTAATAATGTTAACATCATC
OL13	SEQ ID 46:ATGACTATTACTTCTCCAGCTCCA	Amplificação de F13
OL14	SEQ ID 47:TCACTTGTTGAATTCCATAACCCAAA
OL15	SEQ ID 30 : ATGGGTTCTACTGGTGAAACTCAA	Amplificação de F8
OL16	SEQ ID 31 : GCGCATGTGTCCGATCTTTG

c) 3-hidroxilação de ácido cumárico

[00267]Uma vez que todas as enzimas são comuns à via de vanilina excetuando as implicadas na 3 hidroxilação de ácido cumárico, PheA e Flared foram individual ou conjuntamente expressos em levedura e foram testados quanto à atividade usando um ensaio enzimático in vivo. Foi usada estratégia de integração genômica para clonar ambas as sequências. Todos os fragmentos de integração IF1-IF2-IF4 e IF5 foram amplificados por PCR e amplicons foram purificados. PheA e flared foram amplificados a partir do plasmídeo da GeneArt. BYOO a-mater haploide foi usada para clonar o gene pheA e BY10 α-mater foi usada para clonar o gene flared. Após montagem por recombinação homóloga em transformante de levedura, a seleção dupla permite o isolamento recombinante. Para cada transformação, cinco clones recombinantes foram escolhidos aleatoriamente e a integração correta do agregado foi analisada por PCRs direcionadas a partir de gDNA. Estirpes diploides foram geradas

78/83 por união de YOO-PheA e Y1O-flared para coexpressar ambas as proteínas. Então, clones recombinantes expressando pheA, flared ou ambos PheA e flared foram cultivados em meio de indução YPAGAL para permitir a síntese de proteínas. Após cultivo por 24 horas, as células foram alimentadas com 500 μΜ de ácido cumárico. Sobrenadantes foram então analisados por HPLC. O meio de células recombinantes foi alimentado com ácido cumárico 500 μΜ e ácido cafeico foi detectado no sobrenadante (Figura 10).

Exemplo 3: Bioconversão de vanilina a partir de fonte de carbono de GLUCOSE

[00268] Para adaptar a célula para fermentação, a via foi modificada para converter glucose em vanilina. Os promotores induzíveis pGAL e pMET foram removidos e substituídos por promotores constitutivos. Além disso, introduzimos em um fragmento genes codificando Carboxílico redutase e seu componente regulatório fosfopanteteinil transferase. De modo similar ao exemplo 1, 8 fragmentos (F14, F15, F16, F17, F18, F19, F20 e F8) contendo os 9 genes da via de vanilina foram planejados por análise computacional. Os fragmentos, as ORFs bem como as sequências a montante e a jusante estão apresentados na Figura 13 (quanto a detalhes das fontes das sequências, ver a Tabela 9). HIS3 e LEU2 são os marcadores flanqueadores que permitem a seleção dupla da via recombinante. Cada gene possui uma sequência promotora e uma terminadora que permitem sua expressão em células de levedura. Após montagem dos fragmentos por recombinação homeóloga em levedura, uma via funcional completa de 28593 pb é reconstituída e a seleção dupla permite o isolamento de recombinantes.

[00269]Tabela 9: Identidades de referência das sequências a montante e a jusante para os genes de vanilina

79/83

Promot or	Espécie	Referência (base de dados de nucleotídeos do NCBI)	Compr imento (pb)
pPGPK 1sce	Saccharomyces cerevisiae	FJ415226.1 Gl:212656667	781
pENO1	Saccharomyces cerevisiae	D 14474.1 GL218423	500
pENO2	Saccharomyces cerevisiae	M13623.1 GL171458	601
pPYK	Saccharomyces cerevisiae	V01321.1 GL4179	727
pHXT7	Saccharomyces cerevisiae	Z31692.1 GL469160	395
pADH1	Saccharomyces cerevisiae (nucleotideo 160595 até 162095 [C])	NC_001147.5 GL84626310	1501
pGDP	Saccharomyces cerevisiae	Part:BBa K124002	680
pADH1	Saccharomyces cerevisiae (nucleotideo 160595 até 162095 [C])	NC_001147.5 GL84626310	1501
pGDP	Saccharomyces cerevisiae	Part:BBa K124002	680

80/83

Promot or	Espécie	Referência (base de dados de nucleotídeos do NCBI)	Compr imento (Pb)
pTPISc e	Saccharomyces cerevisiae	J01366.1 Gl:173007	430
Termin ador	Espécie	Referência (base de dados de nucleotídeos do NCBI)	Compr imento (Pb)
tPYK	Saccharomyces cerevisiae	V01321.1 GL4179	401
tURA	Kluyveromyces lactis	D00431.1 GL218526	223
tTPISce	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 1406 até 1649)	J01366.1 Gl:173007	243
tPGKSc e	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 1553 até 1839)	J01342.1 GL172143	286
tADHIS ce	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 1798 até 1991)	V01292.1 GL3338	194
tCYCIS ce	Saccharomyces cerevisiae (nucleotídeo 559 até 838)	V01298.1 GL3626	279

[00270]Todos os fragmentos foram amplificados por PCR e amplicons foram purificados usando the Sistema de Limpeza por PCR Wizard (Promega). Transformações de células competentes de levedura

81/83 foram realizadas com mistura equimolar de 8 fragmentos de DNA. Adicíonalmente, células competentes foram transformadas com mistura equimolar de fragmentos menos um (8 controles negativos). A seleção de clones recombinantes foi realizada em meio sem His e Leu. Passados 3 dias, clones transformados com os vários fragmentos foram observados em meio de seleção somente para transformação que continha todos os 8 fragmentos. Todos os controles negativos foram negativos.

Referências ¹ Cheetham. (1994) The use of biotransformations for the production of flavours and fragrances. Trends biotechnol. 11:478-488;

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¹³ Yamada,M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa,T. (2007). Biotransformation of isoeugenol to vanillin by Pseudomonas putida IE27 cells. Applied Microbiology and Biotechnology, 73, 10251030.

¹⁴ Kasana, R. C., Sharma, U. K., Sharma, N., & Sinha, A. K. (2007). Isolation and identification of a novel strain of Pseudomonas chlororaphis capable of transforming isoeugenol to vanillin. Current Microbiology, 54, 457-461.

¹⁵ Hua, D., Ma, C., Lin, S., Song, L., Deng, Z., Maomy, Z., et al. (2007). Biotransformation of isoeugenol to vanillin by a newly isolated Bacillus pumilus strain: identification of major metabolites. Journal of Biotechnology, 130, 463-470.

¹⁶ Seshadri, R., Lamm, A. S., Khare, A., & Rosazza, J. P. N.

83/83 (2008). Oxidation of isoeugenol by Nocardia iowensis. Enzyme and Microbial Technology, 43, 486-494.

¹⁷ Esben H. Hansen, Birger Lindberg Moller, Gertrud R. Kock,Camilla M. Bünner, Charlotte Kristensen, Ole R. Jensen, Finn T. Okkels, Carl E. Olsen, Mohammed S. Motawia, e Jorgen Hansen De Novo Biosynthesis of Vanillin in Fission Yeast {Schizosaccharomyces pombe) and Baker's Yeast {Saccharomyces cerevisiae) Appl Environ Microbiol, maio de 2009; 75(9): 2765-2774.

¹⁸ Akihiko Kondo, Jun Ishii, Kiyotaka Y. Hara, Tomohisa Hasunuma, Fumio Matsuda Development of microbial cell factories for bio-refinery through synthetic bioengineering Journal of Biotechnology, Disponível online 19 de junho de 2012 ¹⁹ J.M. Cherry, E.L. Hong, C. Amundsen, R. Balakrishnan, G. Binkley, E.T. Chan, K.R. Christie, M.C. Costanzo, S.S. Dwight, S.R. Engel, D.G. Fisk, J.E. Hirschman, B.C. Hitz, K. Karra, C.J. Krieger, S.R. Miyasato, R.S. Nash, J. Park, M.S. Skrzypek, M. Simison, S. Weng, E.D. Wong. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research, 40 (2012), páginas D700-D705 ²⁰ J. Nielsen, M.C. Jewett. Impact of systems biology on metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research, 8 (2008), páginas 122-131 ²¹ J.M. Otero, W. Vongsangnak, M.A. Asadollahi, R. OlivaresHernandes, J. Maury, L. Farinelli, L. Barlocher, M. Osteras, M. Schalk, A. Clark, J. Nielsen. Whole genome sequencing of Saccharomyces cerevisiae·. from genotype to phenotype for improved metabolic engineering applications. BMC Genomics, 11 (2010), página 723

Claims (17)

1. Reivindicações

   1. CÉLULA, caracterizada por compreender polinucleotídeos heterólogos codificando um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, cujo complexo multienzimático compreende enzimas para a biossíntese de ácido cumárico incluindo qualquer uma de fenilalanina amônia liase (PAL), tirosina amônia liase (TAL), ou fenilalanina/tirosina amônia liase (PAL/TAL), e opcionalmente uma ou mais enzimas adicionais para converter um aminoácido aromático em ácido cumárico, em que o complexo multienzimático compreende adicionalmente enzimas para converter ácido cumárico em vanilina ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, incluindo uma crotonase.
2. 2. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo complexo multienzimático compreender

   a) fenilalanina amônia liase (PAL), ácido cinâmico hidroxilase (C4H), citocromo P450 redutase (CPR), uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase;

   b) tirosina amônia liase (TAL), uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase; ou

   c) fenilalanina/tirosina amônia liase (PAL/TAL), ácido cinâmico hidroxilase (C4H), citocromo P450 redutase (CPR), uma CoA ligase, uma crotonase, uma 3-mono-oxigenase e uma metiltransferase.
3. 3. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo complexo multienzimático compreender

   a) uma crotonase, preferencialmente enoil-CoA hidratase (ECH);

   b) uma CoA ligase, preferencialmente 4-cumarato-CoA ligase (4CL);

   c) uma 3-mono-oxigenase, preferencialmente fenolhidroxilase

   2/5 (PheA) e flavinredutase (FLARED), ou ácido hidroxibenzoico hidroxilase (HBH); e/ou

   d) uma metiltransferase, preferencialmente uma Ometiltransferase, preferencialmente uma 3-0-metiltransferase ou uma 4-0metiltransferase, preferencialmente ácido cafeico O-metiltransferase (COMT).
4. 4. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela crotonase ser enoil-CoA hidratase (ECH), que é qualquer uma de

   a) uma ECH responsável pela reação de redução de cadeia em pcumaroilCoA e/ou feruloilCoA;

   b) uma ECH que converte p-cumaroilCoA em 4hidroxibenzaldeido; ou

   c) uma ECH que converte feruloilCoA em vanilina.
5. 5. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por compreender adicionalmente

   a) um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma carboxirredutase (CAR), opoionalmente em conjunto com um polinucleotídeo que codifica uma fosfopanteteinil transferase (PPTase); e/ou

   b) um polinucleotídeo heterólogo que codifica uma álcool oxidase, preferencialmente álcool vanilílico oxidase.
6. 6. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pela célula ser uma célula eucariótica ou procariótica, preferencialmente selecionada do grupo consistindo de células de levedura, mamífero, inseto, planta e bacterianas.
7. 7. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pela célula ser uma célula deficiente em reparação de DNA ou uma célula de produção compreendendo um agregado de polinucleotídeos montados em uma célula deficiente em reparação de DNA.

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8. 8. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelos polinucleotídeos que codificam uma série de enzimas serem expressos a partir de um único óperon policistrônico, ou em que polinucleotídeos que codificam uma série de enzimas são expressos a partir de promotores separados.
9. 9. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelos polinucleotídeos serem integrados de modo estável no genoma da célula.
10. 10. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, em caracterizada pelos polinucleotídeos serem originários de pelo menos duas espécies diferentes.
11. 11. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por pelo menos uma das enzimas ser uma enzima quimérica.
12. 12. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pela enzima quimérica ser

    a) codificada por uma sequência de nucleotídeos que é composta de fragmentos de diferentes polinucleotídeos, cujos fragmentos são montados em uma sequência de nucleotídeos quimérica; e/ou

    b) codificada por uma sequência de nucleotídeos que é obtida por inserção, deleção e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um polinucleotídeo parental.
13. 13. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo valinoide ser selecionado do grupo consistindo de vanilina, ácido vanílico, etil-vanilina, álcool vanilílico e vanilina-glicosídeo.
14. 14. CÉLULA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo precursor hidroxibenzaldeído ser selecionado do grupo consistindo de aldeído protocatecuico, ácido protocatecuico, álcool protocatecuico, 4-hidroxialdeído, ácido 4-hidroxibenzoico, álcool 4 hidroxibenzílico, ácido cinâmico, ácido cumárico, ácido cafeico e ácido ferúlico.
15. 15. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA CÉLULA, conforme definida em uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada por ser por introdução de polinucleotídeos heterólogos que codificam um complexo multienzimático envolvido na via metabólica de fenilpropanoides e biossíntese de um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, no genoma da célula, compreendendo

    a) proporcionar os polinucleotídeos que codificam as enzimas individuais;

    b) montar os polinucleotídeos em um agregado e integrar o referido agregado no genoma da célula, preferencialmente por recombinação in vivo; e

    c) opcionalmente produzir uma célula de produção, em que o referido agregado é integrado de modo estável no genoma da célula de produção.
16. 16. USO DE UMA CÉLULA, conforme definida em uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para biossíntese heteróloga de um produto metabólito, preferencialmente em que o produto é um valinoide ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído.
17. 17. MÉTODO DE BIOSSÍNTESE HETERÓLOGA DE UM VALINOIDE, ou um respectivo precursor hidroxibenzaldeído, caracterizado por ser por conversão de um composto precursor empregando um complexo multienzimático, compreendendo

    a) proporcionar uma célula conforme definida em uma das reivindicações 1 a 14;

    b) cultivar a referida célula em uma cultura de células na presença do composto precursor, preferencialmente em que o composto precursor é um aminoácido natural ou um monossacarídeo;

    5/5

    c) acumular um produto da biossíntese, preferencialmente em que o referido produto é um

    i. valinoide selecionado do grupo consistindo de vanilina, ácido vanílico, etil-vanilina, álcool vanilílico e vanilina-glicosídeo; ou ii. um precursor hidroxibenzaldeído selecionado do grupo consistindo de aldeído protocatecuico, ácido protocatecuico, álcool protocatecuico, 4-hidroxialdeído, ácido 4-hidroxibenzoico, álcool 4hidroxibenzílico, ácido cinâmico, ácido cumárico, ácido cafeico e ácido ferúlico;

    e

    d) separar o referido produto do meio de cultura de células.