CN110241146B - 一种组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法及通过该方法生产的3,4-二羟基肉桂酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种组合酶法制备3，4‑二羟基肉桂酸的方法及通过该方法生产的3，4‑二羟基肉桂酸。本发明的目的在于提供一种组合酶法制备3，4‑二羟基肉桂酸的方法及通过该方法生产的3，4‑二羟基肉桂酸，其中，组合酶法制备3，4‑二羟基肉桂酸的方法为：将3‑苯基‑2‑丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以1∶(1～3)∶(1～5)的比例溶解形成溶液，将所述溶液依次通过固定化的双铁羟化酶、固定化的甲苯单加氧酶处理得到粗产物，所述粗产物经过纯化后得到3，4‑二羟基肉桂酸。本发明的方法得到的3，4‑二羟基肉桂酸收益率高，纯度高，操作过程易控制。

Description

一种组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法及通过该方法生 产的3,4-二羟基肉桂酸
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种组合酶法制备3，4-二羟基肉桂酸的方法及通过该方法生产的3，4-二羟基肉桂酸。
背景技术
3，4-二羟基肉桂酸，又称为咖啡酸(Caffeic acid)，一种黄色结晶，微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。3，4-二羟基肉桂酸是化妆品的有效成分，主要有吸收紫外线，抑制皮肤黑色素生成，美白的作用；也具有收缩凝固微血管、提高凝血因子的功能。作为一种重要的医药中间体，3，4-二羟基肉桂酸及其酯类衍生物是中草药的主要活性成分，它们大多具有抗菌、抗炎、增强免疫力、抗癌的作用。
双铁羟化酶的研究开始于1955年，Hayaishi和Mason证明了羟基化酶的存在。双铁羟化酶具有能够催化烷烃的羟基化、烯烃的环氧化和卤代烃及芳烃的降解反应等作用。同时，双铁羟化酶具有高效、温和、无污染的特点，在工业应用、医药和环境治理上有着广泛的应用前景。
甲苯单加氧酶(Toluene monooxygenase，又名：TMO羟化酶)是一种来源于假单胞菌属的苯环羟基化取代酶，广泛存在于门多萨假单胞菌 (Pseudomonas mendocina)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等菌种中，甲苯单加氧酶经提取纯化后为无色结晶粉末，目前也广泛应用于化妆品、医药的防腐剂、食品添加剂、塑料和生产液晶聚合物等方面。
目前，3，4-二羟基肉桂酸的制备方法通常是通过中药提取或化学合成的方法从植物中提取分离3，4-二羟基肉桂酸，这些方法大多步骤复杂或反应条件苛刻，并不适合大规模的工业生产。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种组合酶法制备 3，4-二羟基肉桂酸的方法及通过该方法生产的3，4-二羟基肉桂酸，产率高，纯度高，操作过程易控制。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
本发明提供一种组合酶法制备3，4-二羟基肉桂酸的方法，将3-苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为1∶(1～3)∶(1～5)的比例溶解形成溶液，将所述溶液依次通过经固定化处理的双铁羟化酶、经固定化处理的甲苯单加氧酶处理得到粗产物，所述粗产物经过纯化后得到3，4-二羟基肉桂酸。
进一步地，所述双铁羟化酶的获取方法包括以下步骤：从恶臭假单胞菌中提取双铁羟化酶基因；对所述双铁羟化酶基因进行聚合酶链式反应扩增，并连接到克隆载体；采用限制性内切酶针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体，获得第一重组表达质粒；将所述第一重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第一工程菌，将所述第一工程菌进行破碎分离，收集双铁羟化酶。
进一步地，所述双铁羟化酶的固定化方法为：将偶联剂和/或交联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将所述改性后的二氧化硅载体和所述双铁羟化酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5～8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的双铁羟化酶。
进一步地，所述甲苯单加氧酶的获取方法包括以下步骤：从洋葱伯克霍尔德菌中提取甲苯单加氧酶基因；对所述甲苯单加氧酶基因进行聚合酶链式反应扩增，并连接到克隆载体；采用限制性内切酶针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体，获得第二重组表达质粒；将所述第二重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第二工程菌，将所述第二工程菌进行破碎分离，收集甲苯单加氧酶。
进一步地，所述甲苯单加氧酶的固定化方法为：将偶联剂和/或交联剂加入二含有氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将所述改性后的二氧化硅载体和所述甲苯单加氧酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5～8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的甲苯单加氧酶。
进一步地，所述偶联剂为溴化氰、三氯均三嗪、酰肼、硫芥子气、钛的氯化物、锡的氯化物、锌的氯化物、钒的氯化物和铁的氯化物中的一种或两种以上；所述交联剂为戊二醛、二重氮联苯胺-2，2’-二磺酸、4，4’-二氟-3，3’ -二硝基二苯砜、1，5’-二氟-2，4’-二硝基苯和甲苯-2-异氰酸-异硫氰酸盐中的一种或两种以上。
进一步地，所述偶联剂和/或所述交联剂的重量百分比小于所述双铁羟化酶或所述甲苯单加氧酶的10％。
进一步地，将3-苯基-2-内烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为 1∶2∶3的比例溶解形成溶液，将所述溶液依次通过经固定化处理的双铁羟化酶、经固定化处理的甲苯单加氧酶处理得到粗产物，所述粗产物经过纯化后得到3，4-二羟基肉桂酸。
进一步地，调节所述粗产物的pH值小于5，并经过搅拌析晶、抽滤、洗涤、干燥后获得到纯化后的3，4-二羟基肉桂酸。
本发明还提供一种以上任一实施例所述的组合酶法制备3，4-二羟基肉桂酸的方法生产的3，4-二羟基肉桂酸。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明将3-苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇溶液依次通过固定化的双铁羟化酶和甲苯单加氧酶，进行反应，得到3，4-二羟基肉桂酸，操作过程容易控制，提高3，4-二羟基肉桂酸的收益率。
附图说明
图1为本发明双铁羟化酶和甲苯单加氧酶的蛋白电泳图；
图2为本发明3，4-二羟基肉桂酸的液相色谱；
图3为本发明第一重组表达质粒的构建图；
图4为本发明第二重组表达质粒的构件图。
具体实施方式
以下将结合附图，对本发明进行更为详细的描述，需要说明的是，下参照附图对本发明进行的描述仅是示意性的，而非限制性的。各个不同实施例之间可以进行相互组合，以构成未在以下描述中示出的其他实施例。
本发明提供一种组合酶法制备3，4-二羟基肉桂酸的方法，包括步骤：将3- 苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为1∶(1～3)∶(1～5)的比例溶解形成溶液，将溶液用恒流泵以2mL/min的流速依次通过经固定化处理的双铁羟化酶填充管和经固定化处理的甲苯单加氧酶(Toluene monooxygenase)填充管进行处理，收集流出的粗产物，粗产物经过纯化后得到3，4-二羟基肉桂酸。本发明操作过程容易控制，提高3，4-二羟基肉桂酸的收益率。
其中所述纯化过程为：调节上述流出的粗产物的pH小于5，优选pH＝2，室温下搅拌析晶1h，在进行抽滤，将滤出物以2倍体积的ddH2O洗涤2次，置于40℃烘箱内干燥，得到高纯3，4-二羟基肉桂酸，纯度为99.93％。
根据本发明的实施例，双铁羟化酶的获取方法包括以下步骤：
(1)克隆恶臭假单胞菌的双铁羟化酶基因：从恶臭假单胞菌中提取双铁羟化酶基因；以提取到的双铁羟化酶基因为模板，对双铁羟化酶基因进行聚合酶链式反应扩增得到双铁羟化酶基因，并连接到克隆载体pJET1.2；采用限制性内切酶NdeI和HindIII针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体pET28a，获得第一重组表达质粒，即获得了本发明中所需的双铁羟化酶的重组表达质粒。其中，进行聚合酶链式反应扩增的引物为：
上游引物-5’-aaCATATGGCCATGTTCGTGGCCGAGCAGT-3’，
下游引物-5’-aaAAGCTTTCAACCGCCGAAGCGGTCTTCGT-3’；聚合酶链式反应体系包括：10×扩增缓冲液10μL，4种dNTP(分别为dGTP、 dATP、dTTP、dCTP)混合物各200μmol/L，引物各10pmol，高保真DNA 聚合酶2.5酶活力单位，加双蒸水(ddH2O)至100μL；反应的条件为98℃初始变性处理30秒，60℃下进行30秒，72℃进行60秒，共30个循环。
上述的恶臭假单胞菌(Pochonia chlamydosporia)购自中国工业微生物菌种保藏中心，编号为CCTCC NO.M2013444；大肠杆菌表达质粒pET28a、高保真DNA聚合酶、限制性核酸内切酶NdeI和HindIII及聚合酶链式反应所需生化试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；引物订购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；其它生化试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
(2)双铁羟化酶基因在大肠杆菌中的表达、工程菌的培养、分离：将第一重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第一工程菌，将第一工程菌进行破碎分离，收集第一上清液并进行纯化，获取双铁羟化酶。将表达的第一工程菌破碎后进行离心，取含蛋白的第一上清液进行免疫印迹实验，如图1，其中，M为分子量标记，1和2为双铁羟化酶蛋白条带(其余杂蛋白未展示)，双铁氧化酶蛋白分子量约20KDa。参照《分子生物学实验指导》(第2版)介绍的方法，将上述第一重组表达质粒，通过氯代钙介导的化学转化方法导入大肠杆菌BL21(DE3)中，即得本发明所需的重组表达双铁羟化酶的第一工程菌。大肠杆菌BL21(DE3)及所需生化试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。
第一工程菌的扩大培养：从第一工程菌的LB固体培养基上挑取单个菌落于3mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基之中，37℃，200r/min培养12h，即得第一工程菌的种子培养基；然后取1mL上述种子培养基加入到1L含有50μg/mL的青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD600达0.5，向培养基中加入终浓度为200μM的IPTG，28℃，200 r/min继续培养48h。
第一工程菌的破碎分离：将第一工程菌最终培养物转移入多个5mL离心管中，8,000r/min，5min，收集沉淀。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液(100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)，并小心混匀。利用超声波破碎仪破碎离心管中菌体，条件：功率80w，工作2s，间隔2s，5个循环1次，共处理4次。8,000r/min离心5min，随后在冰浴中间隔脉冲处理。收集全部上清液。
Ni柱纯化过程：Ni-NTA装柱(1.6×20cm，10mL)后，取收集的第一上清液，以1mL/min流速上样；用含200mM咪唑的缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗脱5个柱体积。收集洗脱液待用。所述缓冲液为：0.5M NaH2PO419mL，0.5M Na2HPO481 mL，NaCl 29.3g，咪唑34g，加ddH2O 定容至1000mL。
进一步地，双铁羟化酶的固定方法为：将偶联剂和/或交联剂加入含有管状空心二氧化硅载体的胶体溶液中，500r/min充分搅拌，维持体系的pH值在8～10之间，搅拌时间为20h；对表面改性后的二氧化硅载体进行洗涤、过滤，以5℃/min的速度升温至60℃，进行干燥，获得改性后的二氧化硅载体；将改性后的二氧化硅载体和上述步骤获得的双铁羟化酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5～8，即在弱酸和弱碱环境下，并将改性后的二氧化硅载体、双铁羟化酶和缓冲溶液充分混合进行负载，负载结束后进行洗涤、过滤、冷冻干燥4h，获得固定化的双铁羟化酶，将干燥后的双铁羟化酶粉体保存在4℃下备用。
进一步地，偶联剂为溴化氰、三氯均三嗪、酰肼、硫芥子气、钛的氯化物、锡的氯化物、锌的氯化物、钒的氯化物和铁的氯化物中的一种或两种以上；交联剂为戊二醛、二重氮联苯胺-2，2’-二磺酸、4，4’-二氟-3，3’-二硝基二苯砜、1，5’-二氟-2，4’-二硝基苯和甲苯-2-异氰酸-异硫氰酸盐中的一种或两种以上。具体地，偶联剂和/或交联剂的重量百分比小于双铁羟化酶的10％。也就是说，偶联剂和/或交联剂在负载到二氧化硅载体上之前先确认用量，即其用量是以酶的重量去标定，以防止双铁羟化酶失活。
根据本发明的实施例，甲苯单加氧酶的获取方法包括以下步骤：
(S1)克隆洋葱伯克霍尔德菌的甲苯单加氧酶基因：从洋葱伯克霍尔德菌中提取甲苯单加氧酶基因；以提取到的甲苯单加氧酶基因为模板，对甲苯单加氧酶基因进行聚合酶链式反应扩增得到甲苯单加氧酶基因，并连接到克隆载体pJET1.2；采用限制性内切酶NdeI和HindIII针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体pET28a，获得第二重组表达质粒，即获得了本发明中所需的甲苯单加氧酶的重组表达质粒。其中，进行聚合酶链式反应扩增的引物为：
上游引物-5’-aaCATATGAAGCTTGCCCCCT-3’，
下游引物-5’-aaAAGCTTACCCGGAGACAGAGT-3’。聚合酶链式反应体系包括：10×扩增缓冲液10μL，4种dNTP(分别为dGTP、dATP、 dTTP、dCTP)混合物各200μmol/L，引物各10pmol，高保真DNA聚合酶2.5酶活力单位，加双蒸水(ddH2O)至100μL；反应的条件为98℃初始变性处理30秒，60℃下进行30秒，72℃进行60秒，共30个循环。
上述的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacian)购自美国典型培养物保藏中心，编号为CGMCC No.5384；大肠杆菌表达质粒pET28a、高保真DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶NdeI和HindIII及聚合酶链式反应所需生化试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；引物订购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其它生化试剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
(S2)甲苯单加氧酶基因在大肠杆菌中的表达、工程菌的培养、分离：将第二重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第二工程菌，将第二工程菌进行破碎分离，收集第二上清液并进行纯化，获取甲苯单加氧酶。将表达的第二工程菌破碎后进行离心，取含蛋白的第二上清液进行免疫印迹实验，如图1，其中，M为分子量标记，3和4为甲苯单加氧酶(TMO 羟化酶)蛋白条带(其余杂蛋白未展示)，甲苯单加氧酶蛋白分子量约59KDa。其中，参照《分子生物学实验指导》(第2版)介绍的方法，将上述第二重组表达质粒，通过氯代钙介导的化学转化方法导入大肠杆菌BL21(DE3)中，即得本发明所需的重组表达双铁羟化酶的第二工程菌。大肠杆菌BL21(DE3)及所需生化试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。
第二工程菌的扩大培养：从第二工程菌的LB固体培养基上挑取单个菌落于3mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基之中，37℃，200r/min培养12h，即得第二工程菌的种子培养基；然后取1mL上述种子培养基加入到1L含有50μg/mL的青霉素的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD600达0.5，向培养基中加入终浓度为200μM的IPTG，28℃，200 r/min继续培养48h。
第二工程菌的破碎分离：将第二工程菌最终培养物转移入多个5mL离心管中，8,000r/min，5min，收集沉淀。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液(100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)，并小心混匀。利用超声波破碎仪破碎离心管中菌体，条件：功率80w，工作2s，间隔2s，5个循环1次，共处理4次。8,000r/min离心5min，随后在冰浴中间隔脉冲处理。收集全部上清液。
Ni柱纯化过程：Ni-NTA装柱(1.6×20cm，10mL)后，取收集的第二上清液，以1mL/min流速上样；用含100mM咪唑的缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，洗脱5个柱体积。收集洗脱液待用。所述缓冲液为：0.5M NaH2PO419mL，0.5M Na2HPO481mL，NaCl 29.3g，咪唑17g，加ddH2O 定容至1000mL。
进一步地，甲苯单加氧酶的固定方法为：将偶联剂和/或交联剂加入含有管状空心二氧化硅载体的胶体溶液中，500r/min充分搅拌，维持体系的pH 值在8～10之间，搅拌时间为20h，获得改性后的二氧化硅载体；将改性后的二氧化硅载体和上述步骤中获得的甲苯单加氧酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5～8，并将改性后的二氧化硅载体、双铁羟化酶和缓冲溶液充分混合进行负载，负载结束后进行洗涤、过滤、冷冻干燥4h，获得固定化的甲苯单加氧酶，将干燥后的甲苯单加氧酶粉体保存在4℃下备用。
进一步地，偶联剂为溴化氰、三氯均三嗪、酰肼、硫芥子气、钛的氯化物、锡的氯化物、锌的氯化物、钒的氯化物和铁的氯化物中的一种或两种以上；交联剂为戊二醛、二重氮联苯胺-2，2’-二磺酸、4，4’-二氟-3，3’-二硝基二苯砜、1，5’-二氟-2，4’-二硝基苯和甲苯-2-异氰酸-异硫氰酸盐中的一种或两种以上。偶联剂和/或交联剂的重量百分比小于甲苯单加氧酶的10％。也就是说，偶联剂和/或交联剂在负载到二氧化硅载体上之前先确认用量，即其用量是以酶的重量去标定，以防止甲苯单加氧酶失活。
将3-苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为1∶2∶3比例溶解后，用恒流泵以2mL/min流速依次通过固定化双铁羟化酶填充管、固定化甲苯单加氧酶填充管，收集流出液。将所收集的流出液，调节pH值至2，室温下搅拌析晶1h，抽滤，滤出物以2倍体积ddH2O洗涤2次，置于40℃烘箱内干燥，得到高纯3，4-二羟基肉桂酸，纯度99.93％，参考图2。
其中3，4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)的含量测定方法为：实验条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相；梯度洗脱从5％甲醇到 95％甲醇，洗脱时间25min，洗脱条件：0～20min为5％提高至95％，2～25min 为95％下降至5％。检测波长：324nm，柱温：30℃；流速：1mL/min。
操作方法：(1)对照品(对照品为购自阿拉丁的咖啡酸产品(C108306)) 溶液的制备：称取对照品约12.5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。(2)供试品溶液的制备：称取本品约12.5mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。(3) 测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10L，注入液相色谱仪，测定，按外标法计算，即得。本品按干燥品计算，含3，4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)不少于99％。(5)结果计算：含量＝(S1×c×V)/(S2×m)×100％其中：S1 为供试品溶液色谱图中3，4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)的峰面积；S2为对照品溶液色谱图中3，4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)的峰面积；c为对照品溶液中 3，4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；V为供试品溶液的体积，单位为毫升(mL)；m为试样的质量，单位为毫克(mg)。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，将3-苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为1:(1~3):(1~5)的比例溶解形成溶液，将所述溶液依次通过经固定化处理的双铁羟化酶、经固定化处理的甲苯单加氧酶处理得到粗产物，所述粗产物经过纯化后得到3,4-二羟基肉桂酸；所述双铁羟化酶来源于保藏编号为CCTCC NO.M2013444的恶臭假单胞菌，所述甲苯单加氧酶来源于保藏编号为CGMCC No. 5384的洋葱伯克霍尔德菌。
2.如权利要求1中所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述双铁羟化酶的获取方法包括以下步骤：
从所述恶臭假单胞菌中提取双铁羟化酶基因；
对所述双铁羟化酶基因进行聚合酶链式反应扩增，并连接到克隆载体；采用限制性内切酶针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体，获得第一重组表达质粒；
将所述第一重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第一工程菌，将所述第一工程菌进行破碎分离，收集所述双铁羟化酶。
3.如权利要求2所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述双铁羟化酶的固定化方法为：将偶联剂和/或交联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将所述改性后的二氧化硅载体和所述双铁羟化酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5~8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的双铁羟化酶。
4.如权利要求1中所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述甲苯单加氧酶的获取方法包括以下步骤：
从所述洋葱伯克霍尔德菌中提取甲苯单加氧酶基因；
对所述甲苯单加氧酶基因进行聚合酶链式反应扩增，并连接到克隆载体；采用限制性内切酶针对酶切位点进行酶切处理，并连接到质粒载体，获得第二重组表达质粒；
将所述第二重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的第二工程菌，将所述第二工程菌进行破碎分离，收集所述甲苯单加氧酶。
5.如权利要求4所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述甲苯单加氧酶的固定化方法为：将偶联剂和/或交联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将所述改性后的二氧化硅载体和所述甲苯单加氧酶加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5~8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的甲苯单加氧酶。
6.如权利要求3或5所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述偶联剂为溴化氰、三氯均三嗪、酰肼、硫芥子气、钛的氯化物、锡的氯化物、锌的氯化物、钒的氯化物和铁的氯化物中的一种或两种以上；所述交联剂为戊二醛、二重氮联苯胺-2,2’-二磺酸、4,4’-二氟-3,3’-二硝基二苯砜、1,5’-二氟-2,4’-二硝基苯和甲苯-2-异氰酸-异硫氰酸盐中的一种或两种以上。
7.如权利要求6所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，所述偶联剂和/或所述交联剂的重量百分比小于所述双铁羟化酶或所述甲苯单加氧酶的10%。
8.如权利要求1所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，将3-苯基-2-丙烯酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、乙醇以质量比为1:2:3的比例溶解形成溶液，将所述溶液依次通过经固定化处理的双铁羟化酶、经固定化处理的甲苯单加氧酶处理得到粗产物，所述粗产物经过纯化后得到3,4-二羟基肉桂酸。
9.如权利要求8所述的组合酶法制备3,4-二羟基肉桂酸的方法，其特征在于，调节所述粗产物的pH值小于5，并经过搅拌析晶、抽滤、洗涤、干燥后获得纯化后的3,4-二羟基肉桂酸。
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