CN104357502A - 一种(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 - Google Patents

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张文明
吴会
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Abstract

本发明公开了一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，所述方法包括如下步骤：将固定化全细胞组合物、(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯、辅因子、葡萄糖和缓冲液按一定比例混合，在pH＝5～8、温度为20～45℃下反应，经后处理得到产物。与现有技术相比，本发明所采用的方法具有生物催化剂容易与反应液分离、操作方便、催化剂可回收利用、产物收率及光学纯度高等优点，具有良好的应用价值。

Description

一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
技术领域
本发明属于制药工业生物技术领域，具体涉及一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
背景技术
辉瑞公司生产的立普妥自1997年上市以来迅速占领降胆固醇他汀类药物市场，成为该药物领域和医药界的重磅炸弹药物，迄今上市17年，销售额远超千亿美元。其有效成分为阿托伐他汀(Atorvastatin)，而(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯是该有效成分的关键手性中间体，故此中间体的合成技术受到广泛的研究与关注。目前文献报道的制备方法主要有化学法和生物法。
化学法工艺生产(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯是利用硼烷类衍生物在-70℃下将(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯不对称还原得到。该工艺需要极端低温和无水无氧的反应条件，所用的还原剂硼烷易燃，能耗严重且产品的立体异构纯度仅为98％(US2009/0216029A1)，不利于工业化生产。
CN103911403公开了生物法合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，该方法以(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯为底物，重组大肠杆菌发酵液为催化剂，底物浓度最高只有55g/L，且需添加助溶剂二甲亚砜。该方法采用发酵液直接作催化剂时发酵液中含有的杂质会对反应带来不利影响，且助溶剂二甲亚砜对环境污染较大，底物浓度过低，这些因素都不利于工业化生产。
此外，我们在申请号为201410462724.8的专利申请中报道了一种酶法制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法所用生物催化剂不可回收套用，后处理时生物催化剂的分离去除比较困难，无形中增加了生产时间和成本。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
具体工艺路线如下所示：
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
将按一定比例混合并经固定化处理的酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞组合物、(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯、辅因子、葡萄糖和缓冲液按一定比例混合，在pH＝5～8、温度为20～45℃下反应1-48小时；反应混合液中固定化全细胞湿重浓度为100～400g/L，优选为60～150g/L、(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯的浓度为100～400g/L，优选为200～250g/L、辅因子的浓度为0.001～0.01g/L，优选为0.008g/L、葡萄糖的浓度为100～400g/L，优选为200～250g/L、缓冲液的浓度为10～100mM/L，优选为80mM/L；反应结束后过滤回收固定化全细胞；滤液经有机溶剂萃取、浓缩得到收率大于95％、光学纯度大于99.9％的目标产物，可直接用于下游中间体或产品的制备。
进一步说，固定化全细胞组合物为酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例混合并经固定化处理后的组合物。
进一步说，酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞的组合比例为1：0.1～1：1。
进一步说，酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞由基因工程菌发酵得到，基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。
进一步说，反应的pH＝5～8，优选为pH＝7；反应温度为20～45℃，优选为30℃。
进一步说，辅因子为NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
进一步说，辅因子为NADP，可以是冻干粉或水溶液，其中优选为水溶液。
进一步说，缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为三乙醇胺缓冲液。
进一步说，固定化全细胞组合物的制备方法为：将酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型，固定剂为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙的一种或它们的组合。
进一步说，固定化全细胞组合物与固定剂的比例为：1：1～1：2。
进一步说，酮还原酶全细胞选自市场上可以购得的KRED101～KRED250全细胞(尚科生物医药(上海)有限公司)，优选KRED100全细胞；葡萄糖脱氢酶全细胞为市场上可以购得的GDH101～GDH106全细胞(尚科生物医药(上海)有限公司)，优选为GDH106全细胞。
进一步说，提取用的有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯，其中优选为乙酸乙酯。
进一步说，固定化全细胞组合物经过滤后可以回收套用，套用次数为1～3次。
与现有技术相比，本发明利用固定化全细胞组合物催化合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，具有固定化全细胞容易与反应液分离、操作方便、催化剂可回收利用、产物收率及光学纯度高等优点，具有良好的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
一、固定化全细胞组合物的制备
室温下，将600g聚乙烯醇加入3.5L的水中，升温至90～95℃，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25～30℃；向上述溶液中加入300g酮还原酶全细胞KRED100(尚科生物医药(上海)有限公司)和100g葡萄糖脱氢酶全细胞GDH106(尚科生物医药(上海)有限公司)，混匀后搅拌1h；用蠕动泵和塑料排枪吸取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30℃干燥1.0-1.5h；移入0.1M Na2SO4溶液稳定2h，滤干并用清水洗涤两次，得到1.3kg固定化全细胞组合物。
二、(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成
将150g(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯和150g葡萄糖加入反应器中，加入200ml80mM/L磷酸盐缓冲液，用饱和碳酸钠水溶液调pH＝7.0，加入100g固定化全细胞组合物和0.01g NADP，继续加入磷酸盐缓冲液到反应体系为1L，室温搅拌24h；过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯得到148g淡黄色液体，纯度﹥95％，光学纯度﹥99.9％。
实施例2
一、固定化全细胞组合物的制备
室温下，将300g聚乙二醇溶解在3.5L水中，向溶液中加入500g聚乙烯醇，升温至90～95℃，待聚乙烯醇完全溶解后，将温度降至25～30℃；向上述溶液中加入300g酮还原酶全细胞KRED100(尚科生物医药(上海)有限公司)和100g葡萄糖脱氢酶全细胞GDH106(尚科生物医药(上海)有限公司)，混匀后搅拌1h；用蠕动泵和塑料排枪吸取混合液，并注在平面上形成圆片状；移入鼓风干燥箱，30℃干燥1.0-1.5h；移入0.1MNa2SO4溶液稳定2h，滤干并用清水洗涤两次，得到1.6kg固定化全细胞组合物。
二、(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成
将250g(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯和250g葡萄糖加入反应器中，加入200ml80mM/L三乙醇胺缓冲液，用饱和碳酸钠水溶液调pH＝7.0，加入180g固定化全细胞组合物和0.008g NADP，继续加入三乙醇胺缓冲液到反应体系为1L，室温搅拌24h；过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯得到245g淡黄色液体，纯度﹥95％，光学纯度﹥99.9％。
实施例3
用回收固定化细胞合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
将250g(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯和250g葡萄糖加入反应器中，加入200ml80mM/L三乙醇胺缓冲液，用饱和碳酸钠水溶液调pH＝7.0，加入180g实施例2回收的固定化全细胞组合物和0.008g NADP，继续加入三乙醇胺缓冲液到反应体系为1L，室温搅拌24h；过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯得到242g淡黄色液体，纯度﹥95％，光学纯度﹥99.9％。

Claims (10)

1.一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于：将固定化全细胞组合物、(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯、辅因子、葡萄糖和缓冲液按一定比例混合后反应得到产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定化全细胞组合物为酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例混合并经固定化处理的组合物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酮还原酶全细胞和所述葡萄糖脱氢酶全细胞的组合比例为1：0.1～1：1。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述酮还原酶全细胞和所述葡萄糖脱氢酶全细胞由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自大肠杆菌或酵母菌，其中优选为大肠杆菌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定化全细胞组合物的浓度为100～400g/L、所述(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯的浓度为100～400g/L、所述辅因子的浓度为0.001～0.01g/L、所述葡萄糖的浓度为100～400g/L和所述缓冲液的浓度为10～100mM/L。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在pH＝5～8、温度为20～45℃下进行。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述辅因子为NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺缓冲液，其中优选为三乙醇胺缓冲液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化全细胞组合物的制备方法为：将酮还原酶全细胞和葡萄糖脱氢酶全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型，所述固定剂为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸钙的一种或它们的组合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述固定化全细胞组合物与所述固定剂的比例为：1：1～1：2。
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