CN108642035A - 一种硅胶固定gdh催化制备nadph的方法 - Google Patents

一种硅胶固定gdh催化制备nadph的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化工领域，尤其涉及一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法，以葡萄糖为底物，采用酶法合成NADPH，选取硅胶为载体，固定GDH后加入反应柱，以一定的流速将葡萄糖和氧化型NADP+混合液通过反应柱，实现固定化GDH制备NADPH。经实验，GDH的固载率为57％－62％，固定化GDH催化生成NADPH效率为0.53g/g－0.55g/g，与传统游离酶催化相比，固定化酶催化效率提高了60％－62％，说明固定化GDH催化制备NADPH时，具有酶催化效率高、生产成本低、产品纯度高的优点，适合工业化生产。

Description

一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法
技术领域
本发明属于医药化工领域，尤其涉及一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法。
背景技术
酶作为一种生物催化剂，具有选择性高、催化效率高、催化条件温和的优点，广泛应用于各种行业。但酶作为一种天然的高分子蛋白质，其失活快、不能重复利用的缺点限制了酶在工业中大规模的应用。在此条件下，固定化酶概念和技术得以提出和发展。
固定化酶作为一种清洁、高效、环保的新型技术，是通过吸附、包埋、交联及共价等方式将酶固定在不溶于水的载体中进行催化反应。固定化酶技术具有酶催化效率高、与产物易分离的优点，还具有一定的机械强度，可以采用搅拌或装柱的方式进行催化反应，便于连续化和自动化操作。
葡萄糖脱氢酶(GDH)催化葡萄糖生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的反应式如下：
目前，利用GDH催化制备NADPH的技术已经成熟，具有一定的工业价值，但仍存在以下问题：
①产品纯度低，尽管利用硅藻土可以吸附回收GDH，但仍会有部分酶残留于产品中，对产品的提纯造成很大的影响；
②成本昂贵，酶利用率低，生产成本昂贵，限制了其在工业中的应用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法，其反应条件温和、生产成本低、酶催化效率高，适合工业化生产。
本发明提出了一种用于制备NADPH的催化剂，包括固定到载体上的GDH。
进一步的，所述载体包括硅胶、大孔树脂、海藻酸钠中的任意一种或多种，硅胶上GDH的固载率为：57％－62％。
本发明提出了一种制备NADPH的催化剂的制备方法，将硅胶置于GDH溶液中进行吸附固定。
进一步的，将固定了GDH的硅胶加入反应柱中，进行加压处理。
进一步的，压力为0.01MPa－0.02MPa。
进一步的，吸附固定的温度为20℃－25℃。
进一步的，吸附固定的时间为50min－60min。
进一步的，GDH溶液的质量浓度为16.7％－25％，GDH溶液是GDH用磷酸缓冲溶液稀释4－6倍得到。
进一步的，稀释GDH的磷酸缓冲浓度为0.1mol/L。
进一步的，GDH溶液中硅胶的加入量为1.37g/g－2.23g/g。
进一步的，GDH的比活力为600u/mg。
进一步的，将GDH固定到硅胶上之前，还包括对硅胶的处理步骤：将硅胶加入磷酸缓冲溶液中浸泡，然后清洗。
进一步的，磷酸缓冲溶液中硅胶的加入量为0.4g/mL－0.43g/mL。
进一步的，磷酸缓冲溶液的浓度为0.2mol/L。
进一步的，浸泡时间为10-15h。
进一步的，清洗的步骤包括：将硅胶加入到磷酸缓冲溶液中，震荡后静置，然后更换缓冲液。
进一步的，震荡和静置的时间为3min-6min。
进一步的，清洗的步骤重复3-5次。
本发明提出了一种制备NADPH的催化剂在催化葡萄糖反应中的应用。
进一步的，将葡萄糖、NADP+溶于磷酸缓冲溶液中制成混合溶液。
进一步的，将葡萄糖、NADP+溶于0.1mol/L磷酸缓冲溶液中制成混合溶液。
进一步的，上述混合溶液中，葡萄糖加入量为180g/L－220g/L、NADP+加入量为9g/L－11g/L。
进一步的，将上述混合溶液流过反应柱，催化葡萄糖反应，流经反应柱的混合溶液总量为3.83mL/cm2－4.59mL/cm2。
进一步的，催化葡萄糖的反应中，混合溶液的温度为25℃－40℃。
进一步的，反应柱流速为25mL/min－30mL/min。
进一步的，反应时间为18min－24min。
进一步的，用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸缓冲溶液，pH 6.8－7.2。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明提供一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法，以硅胶为载体，固定GDH并装入反应柱，以葡萄糖和NADP+为底物制备NADPH，硅胶上GDH的固载率为57％－62％，固定化酶催化生成NADPH效率为0.53g/g－0.55g/g，与传统游离酶催化相比，固定化酶催化效率提高了60％－62％，说明固定化GDH催化制备NADPH时，具有酶催化效率高、生产成本低、产品纯度高的优点，适合工业化生产。在催化反应过程中，通过向反应柱不断的进样，实现了对酶的重复利用，酶被固定后，酶不易失活，相较于游离酶，其反应时间延长，催化效率提高。
附图说明
图1为实施例3中反应柱的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例中NADP+由江苏美科生物科技有限公司提供，GDH由上海鼓臣生物技术有限公司提供，大孔硅胶由青岛康业鑫药用硅胶干燥剂有限公司提供。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1(固定化酶催化)
一种固定化酶催化制备NADPH的工艺，包括如下步骤：
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH6.8－7.2)，备用。
2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液，备用。
3)将130g硅胶加入到300mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h；浸泡后，清洗硅胶：去除上清液，将130g浸泡后的硅胶加入300mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液，震荡3min，静置2min，更换缓冲液，清洗硅胶的步骤重复4次。
4)将处理好的硅胶置于73g GDH溶液(14.6g GDH用0.1mol/L磷酸缓冲溶液稀释5倍，GDH的比活力为600u/mg)中，并在25℃下吸附固定55min，得到固定化GDH。
GDH的固载率测定：采用考马斯亮蓝法，测出固定前游离酶含量、固定后上清液游离酶含量，测出GDH的固载率为60％。
5)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+，用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL，备用。
6)取一烧杯向其中加入580mL上述混合溶液和步骤4中固定的GDH，于37℃下保温搅拌反应，并滴加氢氧化钠溶液维持pH＝7.0。
7)实验表明，当反应时间为15min时，NADPH-Na4生成量为4.008g，15min后，NADPH-Na4的合成速率显著下降。
实施例2(反应柱固定化酶催化)
一种反应柱固定化酶催化制备NADPH的工艺，包括如下步骤：
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH6.8－7.2)，备用。
2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液，备用。
3)将130g硅胶加入到300mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h；浸泡后，清洗硅胶：去除上清液，将130g浸泡后的硅胶加入300mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液，震荡3min，静置2min，更换缓冲液，清洗硅胶的步骤重复4次。
4)将处理好的硅胶置于73g GDH溶液(14.6g GDH用0.1mol/L磷酸缓冲溶液稀释5倍，GDH的比活力为600u/mg)中，并在25℃下吸附固定55min，得到固定化GDH。
GDH的固载率测定：采用考马斯亮蓝法，测出固定前游离酶含量、固定后上清液游离酶含量，算出GDH的固载率为60％。
5)将步骤4中固定的GDH加入反应柱，反应柱为玻璃材质的圆柱体，规格为：高18.5cm，内径3cm，然后用高压泵对反应柱进行加压处理，压力为0.02MPa，确保填充均匀紧实。
6)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+，用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL，备用。
7)取580mL上述混合溶液，于37℃，以29mL/min的流速通过反应柱，并在进样口滴加氢氧化钠溶液，维持pH＝7.0。
8)实验表明，当反应时间为18min时，NADPH-Na4生成量为4.737g，18min后，NADPH-Na4的合成速率显著下降。
对比例1(游离酶催化)
一种GDH催化制备NADPH的工艺，包括如下步骤：
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.1mol/L的磷酸缓冲溶液，其pH为7.0，备用。
2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液，备用。
3)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+，用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL，备用。
4)取一烧杯向其中加入580mL上述混合溶液和8.76g GDH，于37℃下保温搅拌反应，并滴加氢氧化钠溶液维持pH＝7.0。
5)实验表明，当反应时间为10min时，NADPH-Na4生成量为2.915g，10min后，NADPH-Na4的合成速率显著下降。具体结果见表1。
表1实施例1、2、对比例1中各时间段NADPH-Na4的生成量
反应时间20min，反应柱固定化酶催化效率为0.541g/g(酶催化效率：催化生成的NADPH-Na4质量除以参与催化反应的GDH质量)，固定化酶催化效率为0.459g/g，游离酶催化效率为0.334g/g，反应柱固定化酶催化效率是固定化酶催化效率的1.18倍，是游离酶催化效率的1.62倍，因此反应柱固定化酶催化制备NADPH时，具有酶催化效率高、生产成本低、产品纯度高的优点，适合工业化生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种用于制备NADPH的催化剂，其特征在于：包括固定到载体上的GDH。
2.根据权利要求1所述的用于制备NADPH的催化剂，其特征在于：所述载体包括硅胶、大孔树脂、海藻酸钠中的任意一种或多种，硅胶上GDH的固载率为57％－62％。
3.权利要求1或2所述的催化剂的制备方法，其特征在于：将硅胶置于GDH溶液中进行吸附固定。
4.根据权利要求3所述的催化剂的制备方法，其特征在于：将固定了GDH的硅胶加入反应柱中，进行加压处理。
5.根据权利要求4所述的催化剂的制备方法，其特征在于：压力为0.01MPa－0.02MPa。
6.根据权利要求3所述的催化剂的制备方法，其特征在于：GDH溶液的质量浓度为16.7％－25％，GDH溶液中硅胶的加入量为1.37g/g－2.23g/g。
7.根据权利要求3所述的催化剂的制备方法，其特征在于：吸附固定的温度为20℃－25℃，吸附固定的时间为50min－60min。
8.根据权利要求3所述的催化剂的制备方法，其特征在于：将GDH固定到硅胶上之前，还包括对硅胶的处理步骤：将硅胶加入磷酸缓冲溶液中浸泡。
9.根据权利要求8所述的催化剂的制备方法，其特征在于：磷酸缓冲溶液中硅胶的加入量为0.4g/mL－0.43g/mL。
10.权利要求1-2任一项所述的催化剂或权利要求3-9任一项所述方法制备得到的催化剂在催化葡萄糖的反应中的应用。
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