CN108642035B - 一种硅胶固定gdh催化制备nadph的方法 - Google Patents

一种硅胶固定gdh催化制备nadph的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药化工领域,尤其涉及一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法,以葡萄糖为底物,采用酶法合成NADPH,选取硅胶为载体,固定GDH后加入反应柱,以一定的流速将葡萄糖和氧化型NADP+混合液通过反应柱,实现固定化GDH制备NADPH。经实验,GDH的固载率为57%-62%,固定化GDH催化生成NADPH效率为0.53g/g-0.55g/g,与传统游离酶催化相比,固定化酶催化效率提高了60%-62%,说明固定化GDH催化制备NADPH时,具有酶催化效率高、生产成本低、产品纯度高的优点,适合工业化生产。

Description

一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法
技术领域
本发明属于医药化工领域,尤其涉及一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法。
背景技术
酶作为一种生物催化剂,具有选择性高、催化效率高、催化条件温和的优点,广泛应用于各种行业。但酶作为一种天然的高分子蛋白质,其失活快、不能重复利用的缺点限制了酶在工业中大规模的应用。在此条件下,固定化酶概念和技术得以提出和发展。
固定化酶作为一种清洁、高效、环保的新型技术,是通过吸附、包埋、交联及共价等方式将酶固定在不溶于水的载体中进行催化反应。固定化酶技术具有酶催化效率高、与产物易分离的优点,还具有一定的机械强度,可以采用搅拌或装柱的方式进行催化反应,便于连续化和自动化操作。
葡萄糖脱氢酶(GDH)催化葡萄糖生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的反应式如下:
Figure BDA0001653239270000011
目前,利用GDH催化制备NADPH的技术已经成熟,具有一定的工业价值,但仍存在以下问题:
①产品纯度低,尽管利用硅藻土可以吸附回收GDH,但仍会有部分酶残留于产品中,对产品的提纯造成很大的影响;
②成本昂贵,酶利用率低,生产成本昂贵,限制了其在工业中的应用。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法,其反应条件温和、生产成本低、酶催化效率高,适合工业化生产。
本发明提出了一种用于制备NADPH的催化剂,包括固定到载体上的GDH。
进一步的,所述载体包括硅胶、大孔树脂、海藻酸钠中的任意一种或多种,硅胶上GDH的固载率为:57%-62%。
本发明提出了一种制备NADPH的催化剂的制备方法,将硅胶置于GDH溶液中进行吸附固定。
进一步的,将固定了GDH的硅胶加入反应柱中,进行加压处理。
进一步的,压力为0.01MPa-0.02MPa。
进一步的,吸附固定的温度为20℃-25℃。
进一步的,吸附固定的时间为50min-60min。
进一步的,GDH溶液的质量浓度为16.7%-25%,GDH溶液是GDH用磷酸缓冲溶液稀释4-6倍得到。
进一步的,稀释GDH的磷酸缓冲浓度为0.1mol/L。
进一步的,GDH溶液中硅胶的加入量为1.37g/g-2.23g/g。
进一步的,GDH的比活力为600u/mg。
进一步的,将GDH固定到硅胶上之前,还包括对硅胶的处理步骤:将硅胶加入磷酸缓冲溶液中浸泡,然后清洗。
进一步的,磷酸缓冲溶液中硅胶的加入量为0.4g/mL-0.43g/mL。
进一步的,磷酸缓冲溶液的浓度为0.2mol/L。
进一步的,浸泡时间为10-15h。
进一步的,清洗的步骤包括:将硅胶加入到磷酸缓冲溶液中,震荡后静置,然后更换缓冲液。
进一步的,震荡和静置的时间为3min-6min。
进一步的,清洗的步骤重复3-5次。
本发明提出了一种制备NADPH的催化剂在催化葡萄糖反应中的应用。
进一步的,将葡萄糖、NADP+溶于磷酸缓冲溶液中制成混合溶液。
进一步的,将葡萄糖、NADP+溶于0.1mol/L磷酸缓冲溶液中制成混合溶液。
进一步的,上述混合溶液中,葡萄糖加入量为180g/L-220g/L、NADP+加入量为9g/L-11g/L。
进一步的,将上述混合溶液流过反应柱,催化葡萄糖反应,流经反应柱的混合溶液总量为3.83mL/cm2-4.59mL/cm2
进一步的,催化葡萄糖的反应中,混合溶液的温度为25℃-40℃。
进一步的,反应柱流速为25mL/min-30mL/min。
进一步的,反应时间为18min-24min。
进一步的,用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸缓冲溶液,pH 6.8-7.2。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:本发明提供一种硅胶固定GDH催化制备NADPH的方法,以硅胶为载体,固定GDH并装入反应柱,以葡萄糖和NADP+为底物制备NADPH,硅胶上GDH的固载率为57%-62%,固定化酶催化生成NADPH效率为0.53g/g-0.55g/g,与传统游离酶催化相比,固定化酶催化效率提高了60%-62%,说明固定化GDH催化制备NADPH时,具有酶催化效率高、生产成本低、产品纯度高的优点,适合工业化生产。在催化反应过程中,通过向反应柱不断的进样,实现了对酶的重复利用,酶被固定后,酶不易失活,相较于游离酶,其反应时间延长,催化效率提高。
附图说明
图1为实施例3中反应柱的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。
实施例中NADP+由江苏美科生物科技有限公司提供,GDH由上海鼓臣生物技术有限公司提供,大孔硅胶由青岛康业鑫药用硅胶干燥剂有限公司提供。
实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1(固定化酶催化)
一种固定化酶催化制备NADPH的工艺,包括如下步骤:
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH6.8-7.2),备用。
2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液,备用。
3)将130g硅胶加入到300mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h;浸泡后,清洗硅胶:去除上清液,将130g浸泡后的硅胶加入300mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液,震荡3min,静置2min,更换缓冲液,清洗硅胶的步骤重复4次。
4)将处理好的硅胶置于73g GDH溶液(14.6g GDH用0.1mol/L磷酸缓冲溶液稀释5倍,GDH的比活力为600u/mg)中,并在25℃下吸附固定55min,得到固定化GDH。
GDH的固载率测定:采用考马斯亮蓝法,测出固定前游离酶含量、固定后上清液游离酶含量,测出GDH的固载率为60%。
Figure BDA0001653239270000031
5)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+,用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL,备用。
6)取一烧杯向其中加入580mL上述混合溶液和步骤4中固定的GDH,于37℃下保温搅拌反应,并滴加氢氧化钠溶液维持pH=7.0。
7)实验表明,当反应时间为15min时,NADPH-Na4生成量为4.008g,15min后,NADPH-Na4的合成速率显著下降。
实施例2(反应柱固定化酶催化)
一种反应柱固定化酶催化制备NADPH的工艺,包括如下步骤:
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH6.8-7.2),备用。
2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液,备用。
3)将130g硅胶加入到300mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h;浸泡后,清洗硅胶:去除上清液,将130g浸泡后的硅胶加入300mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液,震荡3min,静置2min,更换缓冲液,清洗硅胶的步骤重复4次。
4)将处理好的硅胶置于73g GDH溶液(14.6g GDH用0.1mol/L磷酸缓冲溶液稀释5倍,GDH的比活力为600u/mg)中,并在25℃下吸附固定55min,得到固定化GDH。
GDH的固载率测定:采用考马斯亮蓝法,测出固定前游离酶含量、固定后上清液游离酶含量,算出GDH的固载率为60%。
5)将步骤4中固定的GDH加入反应柱,反应柱为玻璃材质的圆柱体,规格为:高18.5cm,内径3cm,然后用高压泵对反应柱进行加压处理,压力为0.02MPa,确保填充均匀紧实。
6)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+,用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL,备用。
7)取580mL上述混合溶液,于37℃,以29mL/min的流速通过反应柱,并在进样口滴加氢氧化钠溶液,维持pH=7.0。
8)实验表明,当反应时间为18min时,NADPH-Na4生成量为4.737g,18min后,NADPH-Na4的合成速率显著下降。
对比例1(游离酶催化)
一种GDH催化制备NADPH的工艺,包括如下步骤:
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.1mol/L的磷酸缓冲溶液,其pH为7.0,备用。
2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液,备用。
3)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+,用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL,备用。
4)取一烧杯向其中加入580mL上述混合溶液和8.76g GDH,于37℃下保温搅拌反应,并滴加氢氧化钠溶液维持pH=7.0。
5)实验表明,当反应时间为10min时,NADPH-Na4生成量为2.915g,10min后,NADPH-Na4的合成速率显著下降。具体结果见表1。
表1实施例1、2、对比例1中各时间段NADPH-Na4的生成量
Figure BDA0001653239270000051
反应时间20min,反应柱固定化酶催化效率为0.541g/g(酶催化效率:催化生成的NADPH-Na4质量除以参与催化反应的GDH质量),固定化酶催化效率为0.459g/g,游离酶催化效率为0.334g/g,反应柱固定化酶催化效率是固定化酶催化效率的1.18倍,是游离酶催化效率的1.62倍,因此反应柱固定化酶催化制备NADPH时,具有酶催化效率高、生产成本低、产品纯度高的优点,适合工业化生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种反应柱固定化酶催化制备NADPH的方法,包括如下步骤:
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾分别配置0.1mol/L和0.2mol/L pH 6.8-7.2的磷酸缓冲溶液,备用;
2)配置1.25mol/L的氢氧化钠溶液,备用;
3)将130g硅胶加入到300mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h;浸泡后,清洗硅胶:去除上清液,将130g浸泡后的硅胶加入300mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液,震荡3min,静置2min,更换缓冲液,清洗硅胶的步骤重复4次;
4)将处理好的硅胶置于73g GDH溶液中,即将14.6g GDH用0.1mol/L磷酸缓冲溶液稀释5倍,GDH的比活力为600u/mg,并在25℃下吸附固定55min,得到固定化GDH;
5)将步骤4中固定的GDH加入反应柱,反应柱为玻璃材质的圆柱体,规格为:高18.5cm,内径3cm,然后用高压泵对反应柱进行加压处理,压力为0.02MPa,确保填充均匀紧实;
6)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+,用0.1mol/L磷酸缓冲溶液定容至1000mL,备用;
7)取580mL上述混合溶液,于37℃,以29mL/min的流速通过反应柱,并在进样口滴加氢氧化钠溶液,维持pH=7.0。
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