CN106148311B

CN106148311B - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

Info

Publication number: CN106148311B
Application number: CN201610818847.XA
Authority: CN
Inventors: 余允东; 祝俊
Original assignee: SHANGHAI LIZU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI LIZU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-09-12
Filing date: 2016-09-12
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2036-09-12
Also published as: CN106148311A

Abstract

本发明公开一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体及其应用，至少为D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的以下突变中的一个：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。本发明提供的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体，含有G86D、D164E、W262S突变位点中的一个或多个突变位点，催化活性得到显著提高，催化活性为野生型的1.4倍以上，大大降低了合成D‑阿洛酮糖过程中的酶的用量，具有重要的工业应用价值。

Description

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPE)的突变体及其应用。

背景技术

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-Psicose-3-Epimerase，简写为DPE)属于差向异构酶类，可以催化多种酮糖C3位羟基的差向异构，如催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖，是生产稀有糖的很好的生物催化剂。

D-阿洛酮糖是近年发现的一种新型功能性稀少糖，它的甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿、预防肥胖等生理功能。2011年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质。自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少且极难获得，生物法制备D-阿洛酮糖是近年来的一个研究热点。

蛋白定向进化技术自上世纪70年代被开发以后，在生物、制药、蛋白结构与功能研究等领域得到了极大的应用。定向进化成为改造蛋白质分子的一种有效的新策略，不仅对研究蛋白质的结构和功能的关系具有非常重要的意义，而且可快速产生工业上有巨大应用价值的新酶，极大地推动了酶工程在制药、食品、环保等领域的快速发展。

由于来源于野生菌株未经改造的DPE酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，导致酶的应用成本偏高，限制了其工业应用范围。目前所报道的专利和文献主要是对DPE的热稳定性进行改造，江南大学在梭状芽孢杆菌Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DPE基础上获得了Y68I/G109P突变体(公开号CN103849612A)，热稳定性和催化活性均有所提高。然而，催化活性高的DPE酶的资源仍然很少，不利于D-阿洛酮糖的普及推广。利用蛋白定向进化技术对野生型DPE酶进行改造，以获得高活性的、适合工业应用的DPE酶突变体，将是生物法制备D-阿洛酮糖产业的关键。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体。本发明的另一目的是提供表达上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的载体或宿主菌。本发明还有一目的是提供上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，至少为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的以下突变中的一个：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。

所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的以下突变：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。

表达所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体的重组载体或宿主菌。

所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体在制备D-阿洛酮糖中的应用。

所述的重组载体或宿主菌在表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体中的应用。

所述的重组载体或宿主菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。

一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体的构建方法，具体如下：1.以来源于Burkholderia sp.MR1的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶BsDPE-pET29a质粒为模板，利用易错PCR技术对PsDPE进行随机突变，构建突变体库；2.挑取约400个单克隆，于96孔板中进行活化、诱导、表达和活性测定；3.利用HPLC来检测每个突变体的催化活性，从中筛选出催化活性有显著提高的突变体；4.将上述催化活性显著提高的突变体菌株送出去测序，并与野生型PsDPE序列进行比对，从而得到影响催化活性的几个主要突变位点，即G86D、D164E、W262S；5.对上述突变位点利用定点突变技术进行组合，测定各个突变体的催化活性。

DPE酶及其突变体表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k或pMA5等，表达宿主可以为大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。

有益效果：与现有技术相比，本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，含有G86D、D164E、W262S突变位点中的一个或多个突变位点，催化活性得到显著提高，催化活性为野生型的1.4倍以上，大大降低了合成D-阿洛酮糖过程中的酶的用量，具有重要的工业应用价值。具体催化活性如下：

名称	单位酶活(U/mg冻干粉)	提高倍数
			野生型BsDPE	25	--
G86D	35	1.4
			D164E	40	1.6
W262S	33	1.3
			G86D/D164E	80	3.2
G86D/W262S	121	4.8
			D164E/W262S	63	2.5
G86D/D164E/W262S	220	8.8

附图说明

图1是D-果糖标准品在HPLC上的保留时间结果图；

图2是D-阿洛酮糖在HPLC上的保留时间结果图；

图3是野生型DPE酶反应1h的样品HPLC图；

图4是G86D/D164E/W262S突变体酶反应1h的样品HPLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

实施例1、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体库的建立

以全基因合成的BsDPE-pET29a(+)质粒(由常州基宇生物技术有限公司合成，质粒上克隆有编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)为模板，以引物F1和R1分别为正反向引物，进行易错PCR，构建突变体库。

引物序列如下：F1:5'-GGAATTCCATATGAACAAAGTGGGC-3'；R1：5'-CGCGGATCCTTATGCCAGTTTTTC-3'，两端分别带有NdeI和BamHI限制性酶切位点。

易错PCR反应体系如下：10*PCR buffer 2.5μL，10mM dGTP 0.5μL，10mM dTTP 0.5μL，10mM dCTP 2.5μL，10mM dATP 2.5μL，1mM MnCl₂ 2.5μL，55mM MgCl₂ 2.5μL，10μM F1 1μL，10μM R1 1μL，Template(10ng/μL)1μL，Taq DNA polymerase(5U/μL，takara)0.2μL，ddH₂O补齐至25μL。

易错PCR在Bio-Rad T100thermal cycler上进行，PCR程序如下：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；15℃forever。

将上述PCR反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收880bp大小的片段(具体操作见天根生化科技(北京)有限公司琼脂糖凝胶回收试剂盒操作规程)，并经限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后，与经过同样双酶切的pET29a(+)(Novagen)载体进行连接，并转化BL21(DE3)(购自天根生化科技(北京)有限公司)，于37℃倒置过夜培养后，即得到DPE突变体库，长出的单克隆用于活性筛选。

实施例2 突变体库的活化和诱导表达

从上述培养过夜的平板上挑取单克隆至装有1mL含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基的96深孔板中，于37℃、220rpm振荡培养过夜。次日，从上述过夜培养的96空板中吸取100μL培养液，加入到新鲜的1mL含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基的96深孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导，随后在30℃继续培养20h。一共挑取了400个单克隆，用于活性筛选。

将上述诱导后的菌液在4℃、4000rpm离心15min，弃上清。菌体用100μL50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)悬浮，加入终浓度为0.5g/l的溶菌酶，于37℃处理1h，4℃、4000rpm离心30min，取50μL上清转移至新的96孔板，用作活性筛选的模板。

实施例3 高效液相色谱HPLC高通量筛选方法的确立

高效液相色谱HPLC按如下条件进行：岛津SHIMADZU LC-20A HPLC with RIDdetector or equivalent；分析柱：Waters Sugar-Pak I,6.5×300mm column；流动相：水；流速：0.6mL/min；柱温：80℃；检测器：RID，检测器温度60℃。

以Sigma公司生产的D-果糖和D-阿洛酮糖纯品为标准品，上样量为20μL。色谱分析结果见图1和2，D-果糖的保留时间为9.389min(图1)，D-阿洛酮糖保留时间为12.233min(图2)，两者分离度大，可作为酶突变体筛选的方法。

实施例4 突变体的活性筛选

在上述含50μL突变体酶上清的96孔板中，依次加入400μL 25％果糖水溶液(终浓度为200g/l)、50μL 5mM CoCl₂溶液(终浓度为0.5mM)，于60℃反应10min，然后在100℃处理10min灭活酶，4000rpm离心10min，取上清稀释50倍后进行HPLC检测，以D-阿洛酮糖的生成量来筛选突变体，野生型DPE生成的D-阿洛酮糖作为对照。

经HPLC分析发现，有3个突变体的D-阿洛酮糖的生成量要明显高于野生型对照，该三个突变体编号分别为克隆36、125和280号。随后将这三个克隆进行扩大培养，以验证其活性是否显著提高。

实施例5 酶突变体的扩大培养和活性验证

将野生型DPE、克隆36、125和280接种到5mL含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基的试管中，37℃、220rpm振荡培养过夜。次日，按1％比例转接到100mL含终浓度为50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养3～4h，加入终浓度为1mM的IPTG，随后在30℃、200rpm诱导过夜。

诱导后的菌液于4℃、8000rpm离心10min，菌体用20mL pH7.0 50mM磷酸钠缓冲液洗涤两次后，加入10mL pH7.0 50mM磷酸钠缓冲液进行悬浮。随后在冰浴条件下进行超声破碎(超声功率200W，超声3S/间歇5S，超声10min)。超声后的样品在4℃、12000rpm离心20min，上清进行冷冻干燥，得到冻干粉用作活性检测。

反应条件和HPLC检测条件同实施例4，冻干粉用缓冲液溶解成1mg/mL浓度，反应体系为100mL。结果如下，野生型DPE的单位酶活为25U/mg，克隆36的单位酶活为40U/mg，克隆125的单位酶活为35U/mg，克隆280的单位酶活为33U/mg。1U相当于在60℃、pH7.0条件下单位时间内(1min)生成1μmol的D-阿洛酮糖所需要的酶量。

三个克隆的催化活性显著高于野生型DPE酶。随后将这三个克隆送测序，并与野生型DPE氨基酸序列进行比对，发现克隆36携带一个D164E突变，克隆125携带G86D突变，克隆280携带一个W262S突变。其中，D164E代表第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，G86D代表第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，W262S代表第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。

实施例6 多个突变位点联合的突变体的构建

利用定点突变技术(如stratagene公司的QuikChange Site-DirectedMutagenesis Kit)，将上述3个突变位点进行组合，构建了4个突变体，分别含有以下突变位点：G86D/D164E、G86D/W262S、D164E/W262S、G86D/D164E/W262S(即为：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸和第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸、第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸喝第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸、第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸和第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸、第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸和第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸以及第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸)。将上述4个突变体进行扩大培养和活性测定，反应条件同实施例5，结果如下：

名称	单位酶活(U/mg冻干粉)	提高倍数
			野生型BsDPE	25	--
G86D/D164E	80	3.2
			G86D/W262S	121	4.8
D164E/W262S	63	2.5
			G86D/D164E/W262S	220	8.8

实施例7 利用突变体进行D-阿洛酮糖的合成

在两个250mL三角烧瓶中分别加入100mL 50％果糖溶液和11.9mg六水合氯化钴固体粉末，在60℃水浴条件下搅拌10min后，分别加入0.25g的野生型DPE酶冻干粉和G86D/D164E/W262S突变体酶冻干粉，开始反应，于1h取样进行HPLC检测。结果显示加入G86D/D164E/W262S突变体酶的反应中D-阿洛酮糖的面积比已达到28.2％(见图4)，而加入野生型DPE的反应中D-阿洛酮糖的面积比仅为14.8％(见图3)。由此可见，突变体酶的反应催化活性要显著高于野生型DPE酶，在工业生产中可大大降低酶的用量和缩短反应时间，从而降低生产成本。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海立足生物科技有限公司

<120> 一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

<130> 100

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 290

<212> PRT

<213> Burkholderia sp

<400> 1

Met Asn Lys Val Gly Met Phe Tyr Thr Tyr Trp Ser Thr Glu Trp Met

1 5 10 15

Val Asp Phe Pro Ala Thr Ala Lys Arg Ile Ala Gly Leu Gly Phe Asp

20 25 30

Met Met Glu Ile Ser Leu Gly Glu Phe His Asn Leu Pro Asp Ala Lys

35 40 45

Lys Arg Glu Leu Lys Ser Val Ala Asp Asp Leu Gly Leu Thr Val Met

50 55 60

Cys Cys Ile Gly Leu Lys Ser Glu Tyr Asp Phe Ala Ser Pro Asp Lys

65 70 75 80

Ser Val Arg Asp Ala Gly Thr Glu Tyr Val Lys Arg Leu Leu Asp Asp

85 90 95

Cys His Leu Leu Gly Ala Pro Val Phe Ala Gly Leu Thr Phe Cys Ala

100 105 110

Trp Pro Gln Ser Pro Pro Leu Asp Met Lys Asp Lys Arg Pro Tyr Val

115 120 125

Asp Arg Ala Ile Asp Ser Val Arg Arg Val Ile Lys Val Ala Glu Asp

130 135 140

Tyr Gly Ile Ile Tyr Ala Leu Glu Val Val Asn Arg Phe Glu Gln Trp

145 150 155 160

Leu Cys Asn Asp Ala Lys Glu Ala Leu Ala Phe Ala Asp Ala Val Asp

165 170 175

Ser Pro Ala Cys Lys Val Gln Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu

180 185 190

Glu Ser Ser Phe Arg Asp Ala Ile Leu Ala Cys Lys Gly Lys Met Gly

195 200 205

His Phe His Leu Gly Glu Ala Asn Arg Leu Pro Pro Gly Glu Gly Arg

210 215 220

Leu Pro Trp Asp Glu Ile Phe Gly Ala Leu Lys Glu Ile Glu Tyr Asp

225 230 235 240

Gly Thr Ile Val Met Glu Pro Phe Met Arg Lys Gly Gly Ser Val Ser

245 250 255

Arg Ala Val Gly Val Trp Arg Asp Met Ser Asn Gly Ala Thr Asp Glu

260 265 270

Gln Met Asp Glu Arg Ala Arg Arg Ser Leu Gln Phe Val Arg Glu Lys

275 280 285

Leu Ala

290

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> Burkholderia sp

<400> 2

atgaacaaag tgggcatgtt ctatacctat tggagcaccg aatggatggt tgattttccg 60

gcaaccgcaa aacgtattgc aggtctgggt tttgatatga tggaaattag cctgggcgaa 120

tttcataatc tgccggatgc aaaaaaacgc gaactgaaaa gcgttgcaga tgatctgggt 180

ctgaccgtta tgtgttgtat tggtctgaaa tccgaatatg attttgccag tccggataaa 240

agcgttcgtg atgcaggcac cgaatatgtt aaacgtctgc tggatgattg tcatctgctg 300

ggtgcaccgg tttttgccgg tctgaccttt tgtgcatggc ctcagagccc tccgctggat 360

atgaaagata aacgtccgta tgttgatcgt gccattgata gcgttcgtcg tgttattaaa 420

gttgccgaag attatggcat tatctatgcc ctggaagtgg tgaatcgttt tgaacagtgg 480

ctgtgtaatg atgcaaaaga agcactggca tttgcagatg cagttgatag tccggcatgt 540

aaagttcagc tggatacctt tcacatgaac attgaagaaa gcagcttccg tgatgcaatt 600

ctggcctgta aaggtaaaat gggtcatttt catctgggtg aagcaaatcg tctgcctccg 660

ggtgaaggtc gtctgccgtg ggatgaaatt tttggtgcac tgaaagaaat cgagtatgat 720

ggcaccattg ttatggaacc gtttatgcgt aaaggtggta gcgttagccg tgcagttggt 780

gtttggcgtg atatgagcaa tggtgcaacc gatgagcaga tggatgaacg tgcccgtcgt 840

agcctgcaat ttgttcgtga aaaactggca taa 873

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> F1序列

<400> 3

ggaattccat atgaacaaag tgggc 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> R1序列

<400> 4

cgcggatcct tatgccagtt tttc 24

Claims

1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，所述突变体是在序列如SEQ ID NO.1所示的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基础上进行的突变，其特征在于，所述突变为选自以下突变中的至少两个：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。

2.根据权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，其特征在于，为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的以下突变：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。

3.表达权利要求1或2所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体的重组载体或宿主菌。

4.权利要求1或2所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体在制备D-阿洛酮糖中的应用。

5.权利要求3所述的重组载体或宿主菌在表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体中的应用。

6.权利要求3所述的重组载体或宿主菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。