KR20110023703A

KR20110023703A - Ｏ-아세틸-호모세린 생산 균주 및 이를 이용하여 ｏ-아세틸 호모세린을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20110023703A
Application number: KR1020100011649A
Authority: KR
Inventors: 김소영; 신용욱; 허인경; 김현아; 서창일; 김주은; 손성광; 이상목; 전성후; 이한진; 나광호
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2009-08-28
Filing date: 2010-02-08
Publication date: 2011-03-08
Also published as: ES2606540T3; JP2011045360A; US20110053253A1; MY169764A; KR101117012B1; EP2290051B1; CN104911136A; JP5445243B2; PL2290051T3; DK2290051T3; EP2290051A1; CN106868066A; US8283152B2; CN102002473A; EP3042950A1

Abstract

본 발명은 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제, 아스파토키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제 활성이 도입 및 증진되고; 및 포스포에놀파이루베이트카복실라제 (phosphoenolpyruvate carboxylases), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(apartate semialdehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 도입 및 증진된, O-아세틸 호모세린의 생산능이 향상된 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 유래 균주, 및 이를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｏ-아세틸-호모세린 생산 균주 및 이를 이용하여 Ｏ-아세틸 호모세린을 생산하는 방법 {Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-Acetyl-homoserine using the microorganism}

본 발명은 O-아세틸 호모세린의 생산능이 향상된 에스케리치아 속 (Escherichia sp.) 균주, 및 이를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

메치오닌은 동물 사료, 식품 및 의약품에 적용하기 위하여 화학적으로 또는 생물학적으로 합성될 수 있다.

메치오닌의 화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 이용한다.　　그러나 이런 화학합성을 통하여 생산된 메치오닌은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산되어서, 각각을 분리하는 어려운 추가적 공정이 있다는 단점이 있다.　 이에 본 발명자들은 이러한 문제들을 해결하기 위해, 생물학적 방법을 이용하여 L-메치오닌을 선택적으로 생산할 수 있는 기술을 개발하여 특허를 출원한 바 있다(국제특허공개공보 제2008/013432호). 이 방법은 간편하게 "2단계 공법"으로 명명하며, 발효에 의한 L-메치오닌 전구체 생산 공정, 및 상기 L-메치오닌 전구체를 효소에 의하여 L-메치오닌으로 전환하는 공정을 포함한다. 상기의 L-메치오닌 전구체는 바람직하게 O-아세틸 호모세린(O-acetylhomoserine) 및 O-숙시닐 호모세린(O-succinylhomoserine)을 포함한다. 이러한 2단계 공법을 개발함으로서, 기존에 문제가 되었던 황화물 특유의 기질 독성 문제 및 메치오닌과 SAMe에 의한 메치오닌 합성에서 피드백 조절 문제 및 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 특유의 중간 산물 분해 활성 문제를 모두 해결할 수 있었다. 또한 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있어 DL-메치오닌을 동시에 생산하는 기존의 화학 합성 공정에 비하여 우수한 공정이며, 추가적으로 동일한 반응을 통하여 부산물로서 유기산, 보다 구체적으로는 숙신산 및 아세트산을 동시에 생산 할 수 있는 매우 우수한 공정이다.

O-아세틸 호모세린은 메치오닌 생산의 전구체로 사용되는 물질로 메치오닌 생합성 경로상에 있는 중간체이다(국제특허공개공보 제2008/013432호). O-아세틸 호모세린은 하기의 반응식과 같이 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제(O-acetyl transferase)에 의해 L-호모세린 및 아세틸-CoA를 기질로 하여 합성된다.

L-호모세린 + 아세틸-CoA → O-아세틸-호모세린

본 발명자들은 미국특허출원 제12/062835호에서 아스파테이트 키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제 활성을 가지는 thrA 유전자와 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제 활성을 가지는 데이노코커스 유래 metX 유전자의 발현 강화를 통하여 L-호모세린과 O-아세틸 호모세린의 생합성 경로를 증폭하여 높은 수율의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주 및 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공한 바 있다.

본 발명자들은 더욱 높은 수율로 O-아세틸 호모세린을 생산하기 위해 노력한 결과, O-아세틸 호모세린의 기질 중 하나인 호모세린이 합성되는 생합성 경로 중 포스포에놀파이루베이트로부터 호모세린까지의 생합성 경로상에 위치하는 3종의 효소 즉, 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(ppc), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspC), 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd)의 발현을 동시에 강화하여 본 발명자들이 종래에 출원한 미국특허출원 제12/062835호에서 개시한 방법보다 더 높은 수율로 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법과 균주를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 제공하는 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린에 이르는 일련의 효소들의 동시 발현 강화와 유사하게 아스파테이트 유래 아미노산인 L-라이신, L-트레오닌, L-메치오닌 생합성 경로상의 중요 합성 효소들의 동시 발현 강화를 통하여 L-아미노산의 생산능을 강화하려는 시도는 종전에도 있었다.

유럽특허 EP00900872는 대장균에서 디히드로피콜리네이트 신타아제(dihydropicolinate synthase, dapA), 아스파토키나아제(aspartokinase, lysC), 디히드로피콜리네이트 리덕타아제(dihydropicolinate reductase, dapB), 디아미노피멜레이느 디히드로게나아제(diaminopimelate dehydrogenase, ddh), 테트라히드로피콜리네이트 숙시닐라아제(tetrahydropicolinate succinylase, dapD), 숙시닐 디아미오피멜레이트 디아실라아제(succinyl diaminopimelate diacylase, lysE), 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(aspartate semi-aldehyde dehydrogenase, asd) 및 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase, ppc)의 활성을 증대하여 라이신 생산을 증대할 수 있는 방법을 특징으로 하는 L-라이신의 효율적인 생산을 제공하였고, 일본특허 JP2006-520460와 JP2000-244921은 대장균에서 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd), 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(ppc), 아스파토키나아제(thrA), 호모세린 디히드로게나아제(thrA), 호모세린 키나아제(thrB) 및 트레오닌 신타아제(thrC)의 활성증대를 통하여 L-트레오닌의 효율적인 생산을 개시하고 있다. 또한 국제특허공개공보 제07012078호에서 제공한 L-메치오닌 생산 특허의 경우 코리네박테리아를 이용하여 아스파토키나아제(lysC), 호모세린 디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase, hom), 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine acetyl transferase, metX), O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase, metY), 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase, metB), 코발라민 요구성 트랜스메틸라아제(cobalamin-dependent transmethylase, metH), 코발라민 비요구성 메치오닌 신타아제(cobalamin-independent methionine synthase, metE), 메틸테트라히드로폴레이트 리덕타아제(methyltetrahydrofolate reductase, metF), 글루코즈 6-포스페이트 디히드로게나아제(glucose 6-phosphate dehydrogenase, zwf)등과 같은 유전자들의 발현 증가와 메치오닌 억제 단백질(methionine repressor protein, mcbR), 호모세린 키나아제(homoserine kinase, hsk), S-아데노실메치오닌 신테타아제(S-adenosylmethionine synthetase, metK), 트레오닌 디히드라타아제 (threonine dehydratase, livA) 등의 유전자의 발현감소의 방법을 통하여 L-메치오닌의 생합성을 증대하였다.

그러나, 상기에 예시한 아스파테이트 유래의 L-아미노산 생산에 관련된 특허들의 경우 모두 아스파테이트로부터 유래하여 각각 L-라이신, L-트레오닌, L-메치오닌을 생산하는 특허이며, 이들 특허의 경우 최종적으로 생산하려는 산물의 종류에 따라 각각 다른 유전자들의 조합을 통하여 그 생산성을 증대하였음을 개시하고 있을 뿐이다.

그러나, 본 발명의 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린에 이르는 일련의 효소들의 동시 발현 강화를 통하여 O-아세틸 호모세린을 보다 효율적으로 생산하는 내용은 현재까지 타 문헌을 통하여 개시된바 없다. 또한, 본 발명자들의 효소 조합은 상기의 L-아스파테이트 유래의 L-라이신, L-트레오닌 및 L-메치오닌 생산 방법에서 제공하지 않은 조합이며, 최종산물이 L-라이신, L-트레오닌 및 L-메치오닌이 아닌 다른 점이 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 O-아세틸 호모세린을 최대 수율로 생산하기 위해 예의 노력한 결과, O-아세틸 호모세린을 최종 산물로 하고 있으며, 최대의 생산이 가능하도록 아스파테이트 키나아제와 호모세린 디히드로게나아제(thrA) 및 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(metX)에 더하여 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(ppc), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspC) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd) 중 1종 이상의 효소를 대장균 염색체 DNA 및/또는 플라스미드 형태로 동시 강화하여, O-아세틸 호모세린 생산 수율 및 생산성을 증대시키는 방법 및 O-아세틸 호모세린의 수율 및 생산성이 증가된 균주를 개발하였다.

본 발명의 하나의 목적은 호모세린 생합성 경로에 관련된 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린을 생합성하는 일련의 효소를 코딩하는 유전자를 강화하여 보다 높은 효율로 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 높은 효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 (a) 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine acetyl transferase), 아스파토키나아제(aspartokinase) 및 호모세린 디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase) 활성이 도입 및 증진되고; 및 (b) 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylases), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(apartate semialdehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 도입 및 증진된, O-아세틸 호모세린의 생산능이 향상된 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 균주를 배양배지에서 발효하는 단계를 포함하는, 당해 배지 내에 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 에스케리치아 속 유래 균주를 배양하여 발효에 의해 O-아세틸 호모세린을 생산하는 단계; (b) 생산된 O-아세틸 호모세린을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 O-아세틸 호모세린을 메칠머캡탄과 함께, 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase), O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제(O-acetyl homoserine sulfhydrylase) 및 O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제(O-succinyl homoserine sulfhydrylase) 활성을 갖는 효소로 이루어진 군에서 선택된 전환효소를 이용하여 효소반응을 일으켜서, L-메치오닌 및 아세테이트를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine acetyl transferase), 아스파토키나아제(aspartokinase) 및 호모세린 디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase) 활성이 도입 및 증진되고; 및 (b) 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylases), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(apartate semialdehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 도입 및 증진된, O-아세틸 호모세린의 생산능이 향상된 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "L-메치오닌 전구체"란, 메치오닌 특화 생합성 경로의 일부분인 대사물질 또는 이 대사물질에서 파생된 물질을 말한다. 특히, 본 발명에서의 L-메치오닌 전구체란 O-아세틸 호모세린을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "O-아세틸 호모세린 생산 균주"란, O-아세틸 호모세린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, 본 발명에 따른 조작에 의해 O-아세틸 호모세린을 축적할 수 있는 균주를 말한다. 예를 들어, 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.) 및 노카디아 속(Norcardia sp .), 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모이다. 더 바람직하게는, 에스케리치아 속의 미생물 균주이고, 더욱 더 바람직하게는, 대장균(Escherchia coli .)이고, 더욱 더 바람직하게는 L-라이신, L-트레오닌, L-이소류신 또는 L-메치오닌을 생산하는 균주 유래이다. 가장 바람직하게는 기존의 본 발명자가 제공한 특허(미국특허출원 제12/062835호)에 개시되어 있는 기탁번호 KCCM10921P 또는 기탁번호 KCCM10925P 유래의 균주이다. 또는 FTR2533(기탁번호 KCCM 10541) 유래의 균주를 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "활성의 도입 및 증진"이란 효소의 세포 내 활성의 증가를 의미하며, 이는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 과발현에 의해 이루어질 수 있다. 목적 유전자의 과발현은 상기 유전자의 프로모터 부위 및/또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질 발현을 증진시킬 수 있으며, 목적 유전자를 염색체상에 추가 도입함으로써 발현을 강화시킬 수 있으며, 목적 유전자를 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질전환시킴으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있다. 또한, 목적 유전자의 ORF(open reading frame) 지역에 돌연변이를 도입함으로써 목적 유전자의 과발현을 시킬 수 있다. 과발현의 측정에 따르면, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것을 알 수 있다. 바람직하게는 효소 활성의 도입 및 증진은 당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하거나, 염색체상에서 당해 효소를 코딩하고 있는 유전자의 카피수를 증가시키거나, 당해 효소의 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형시킴으로써 효소의 활성을 도입 및 증진시킬 수 있다.

바람직한 일 실시 태양으로서, 본 발명은 아스파테이트 키나아제와 호모세린 디히드로게나아제(thrA), 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(metX), 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(ppc), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspC), 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd)인 6종의 효소 활성의 도입 및 증진을 통하여 O-아세틸 호모세린을 보다 높은 수율과 생산성으로 생산하는 미생물 균주 및 상기 균주를 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 아스파테이트 키나아제와 호모세린 디히드로게나아제(thrA) 또는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(metX)을 발현하는 벡터를 균주에 형질전환할 수 있고, 포스포에놀파이루베이트 카복실라제(ppc), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspC) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd)로 이루어진 군에서 1종 이상의 효소를 코딩하는 유전자가 대장균 염색체 내에서 2 카피수 이상으로 존재시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 유전자 3종 모두가 대장균 염색체 내에서 2 카피수 이상으로 존재시켜서 상기 효소의 활성을 도입 및 증진할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서는 L-메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린의 합성을 증가시키기 위해서 메치오닌 생합성 경로 중 첫 단계를 매개하는 효소인 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 metX 유전자의 발현을 증진시킨다. metX는 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제의 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자의 통칭이고, 새로운 외부 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제는 다양한 미생물 종들로부터 얻어진다. 그 예로, 이에 제한은 없지만, 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제는 코리네박테리움 속(corynebacterium sp .), 렙토스피라 속(Leptospira sp .), 데이노코커스 속(Deinococcus sp .), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .), 또는 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp .)으로부터 선택된 균주에서 유래한 유전자에 의해 코딩된다. 바람직하게는, 상기 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제는 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum), 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)으로부터 선택된 균주에서 유래한 유전자에 의해 코딩된다. 더욱 바람직하게는, 상기 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제는 유니프로 데이터베이스(UniProt Database) 등록번호 Q9RVZ8 (서열번호 18), NP_249081(서열번호 19), 또는 YP_886028 (서열번호 20)의 아미노산 서열을 가진다. 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri)로부터 유래된 metX 유전자는 피드백 저해 저항성(J Bacteriol. 1998 Jan;180(2):250-5. Belfaiza J et al.)이 있는 것으로 알려져 있다. 다른 여러 가지 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제는 이전에 본 발명자들의 연구에서 피드백 저해가 해제된 것을 확인하였다.

metX 유전자의 도입과 증진은 유전자의 도입에 의해, 또는 목적 유전자의 5'-UTR 및/또는 프로모터 부위의 변형에 의해, 또는 목적 유전자의 ORF 지역에 돌연변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다. 바람직하게는 metX 유전자의 도입과 증진은 metX 유전자를 포함하는 발현 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질전환시켜, 플라스미드 형태로 도입한다. metX 유전자 발현의 증진에 의해 결국 메치오닌 전구체 합성이 증가하게 된다.

또한, 본 발명에서는 O-아세틸 호모세린의 전구체인 호모세린의 합성을 증가시키기 위해 아스파토키나아제 또는 호모세린 디히드로게나아제의 활성을 증진시킨다. 본원에서 thrA는 아스파토키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제의 활성을 가진 펩타이드를 코딩하는 유전자의 통칭이다. 바람직하게는, 아스파토키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제는 유니프로 데이터베이스 등록번호 AP_000666(Unipro database No: AP_000666)의 유전자에 의해 코딩된다. 바람직하게는 상기 thrA 유전자를 포함하는 발현 벡터를 균주에 형질전환시켜, 플라스미드 형태로 도입하고, 가장 바람직하게는 상기 metX 및 thrA 유전자를 동시에 포함하는 발현 벡터를 균주에 형질전환시켜, 플라스미드 형태로 도입하여 발현을 도입 및 증진시킬 수 있다.

본 발명의 구체적 실시태양으로서, 상기 O-아세틸-L-호모세린 생산 균주를 제조하는 방법은 다음과 같다.

O-아세틸-L-호모세린을 축적할 수 있도록 하기 위하여, 균주로부터, 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(ppc), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspC) 및/또는 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd)를 코딩하는 유전자를 각각 염색체 삽입 벡터인 pSG로 클로닝한 후, 균주에 형질전환시켜서, 상기 모균주의 염색체 내의 해당 유전자의 카피수를 2 카피수 이상으로 증대시켜 해당 유전자의 발현 증가를 유도한다. 또한 아스파테이트 키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제(thrA)의 프로모터를 CJ1 프로모터로 치환하고, 데이노코커스 유래의 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(metX)를 thrA-metX 오페론 형태로 제작하고, 낮은 카피 플라스미드 벡터(low copy plasmid vector)인 pCL1920 플라스미드에 클로닝한 플라스미드인 pCJ-thrA(M)-metX-C를 상기에서 제작한 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(ppc), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspC), 및/또는 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd)가 각각 2 카피수인 균주에 형질전환 하여 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린에 이르는 일련의 생합성 경로 모두를 강화한 균주를 제조한다.

상기의 일련의 효소들은 하기 반응식에 나타난 바와 같이 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린으로 합성하는 활성을 가지고 있다. 따라서 이러한 일련의 활성을 가지는 유전자의 발현을 강화할 경우 세포 내에 O-아세틸 호모세린의 축적을 유도할 수 있다.

포스포에놀파이루베이트 + H₂O + CO₂ <-> 옥살로아세테이트 + 포스페이트

옥살로아세테이트 + 글루타메이트 <-> 아스파테이트 + α-케토글루타레이트

아스파테이트 + ATP <-> 아스파틸-4-포스페이트 + ADP

아스파틸-4-포스페이트 + NADPH <-> 아스파테이트-세미알데히드 + 포스페이트 + NADP+

아스파테이트-세미알데히드 + NADPH <-> 호모세린

호모세린 + 아세틸-CoA <-> O-아세틸-호모세린 + CoA

상기 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제, 아스파테이트 키나아제와 및 호모세린 디히드로게나아제, 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자 각각을 통칭 ppc , aspC , asd , thrA 및 metX로 표기한다. 상기 유전자는 문헌(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21., Science. 1999 Nov 19;286(5444):1571-7)에 의하여 공개된 대장균과 데이노코커스 라디오듀란스 R1의 게놈 서열로부터 얻을 수 있다.　 또한, 상기 유전자 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다.　 예를 들어, 유전자은행 ID(GenBank ID)는 ppc(89110074), aspC(85674274), asd(89110578), thrA(89106886), metX(1799718)이다. 상기의 방법을 통하여 제작된 O-아세틸 호모세린 생산 균주는 아스파테이트로부터 O-아세틸 호모세린에 이르는 일련의 생합성 경로의 강화를 통하여 O-아세틸-L-호모세린을 고효율로 생산할 수 있는 균주를 제작할 수 있다. 상기의 방법을 통하여 제작한 O-아세틸 호모세린 생산균주 CJM-XPA2 (pCJ-thrA(M)-metX-CL) 균주를 "대장균 CA05-0567"로 명명하고, KCCM(Korean Culture Center of Microorganism, 대한민국, 서울시 서대문구 홍제1동 유림 빌딩 361-221)에 2009년 8월 11일자로 기탁번호 KCCM11025P로 기탁하였다.

L-메치오닌 전구체 생산 균주는 L-라이신(lysine), L-트레오닌, L-이소류신(isoleusine)을 생산하는 균주를 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 L-트레오닌을 생산하는 균주를 사용함으로써 제조할 수 있다. 이 경우에는 이미 호모세린까지의 합성이 원활하게 이루어진 균주로서, 더 많은 양의 메치오닌 전구체를 합성할 수 있다. 또한, metX 유전자 발현을 증진시켜 보다 많은 양의 메치오닌 전구체 를 합성할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어, “L-트레오닌 생산 균주”란 생체 내에서 L-트레오닌을 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 말한다. 예를 들어, 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 또는 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.)에 속하는 L-트레오닌 생산 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 바람직하게는 에스케리치아 속(Escherichia sp.)이며, 가장 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)이다.

본 발명의 바람직한 실시태양으로서, 국제특허공개공보 제2005/075625호에 개시된 L-트레오닌 생산 균주인 FTR2533를 사용할 수 있다. FTR2533은 대장균 기탁번호 KCCM10236로부터 파생된 대장균 TFR7624로부터 유래하였다. 대장균 기탁번호 KCCM10236은 대장균 TF4076으로부터 유래하였다. 대장균 기탁번호 KCCM10236은 PEP로부터 옥살로아세테이트(oxaloacetate) 형성을 촉매 작용하는 ppc 유전자와 아스파테이트로부터 트레오닌을 생합성하기 위해 필요한 효소, 예를 들면 thrA(아스파토키나아제(aspartokinaze) 및 1-호모세린 디히드로게나아제), thrB(호모세린 키나아제), 및 thrC(트레오닌 신타아제)를 높은 수준으로 발현하므로 L-트레오닌 생산의 증가시킬 수 있다. 또한, 대장균 TFR7624(KCCM10538)는 L-트레오닌 생합성을 위해 필요한 tyrB 유전자의 발현을 억제하는 비활성된 tyrR 유전자를 가지고 있다. 또한, 대장균 FTR2533(KCCM10541)은 비활성된 galR 유전자를 가진 L-트레오닌 생산 균주이자 L-트레오닌 생산 대장균 돌연변이 균주이다.

본 발명의 바람직한 실시태양으로서, 미국특허출원 제12/062835호에 기재된 균주인CJM2-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10925P)을 사용할 수 있다. 상기 균주는 대장균 FTR2533 균주의 metB, thrB, metJ 및 metA 유전자를 결손시킨 후 metA의 위치에 데이노코커스 라디오듀란스 유래의 metX 유전자를 도입한 후, thrA 발현 벡터로 형질 전환시킨 균주로서, 대장균 기탁번호 KCCM 10925P의 균주이다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시태양으로서, 미국특허출원 제12/062835호에 기재된 균주인CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P)을 사용할 수 있다. 상기 균주는 대장균 CJM002(KCCM10568) 균주 유래로 metB , thrB , metJ 및 metA 유전자를 결손시키고 metA의 위치에 데이노코커스 라디오듀란스 유래의 metX 유전자를 도입한 후, thrA 발현 벡터로 형질 전환시킨 균주로서, 대장균 기탁번호 KCCM 10921P의 균주이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, ppc 유전자를 대장균의 염색체상에 2카피를 삽입하기 위한 삽입용 벡터 pSG-2ppc를 제작하였고(도 2), aspC 유전자를 대장균의 염색체상에 2카피를 삽입하기 위한 삽입용 벡터 pSG-2aspC를 제작하였고(도 3), asd 유전자를 대장균의 염색체상에 2카피를 삽입하기 위한 삽입용 벡터 pSG-2asd를 제작하였다(도 4). 또한, thrA 유전자와 동시에 metX 유전자의 발현을 위한 pCJ-thrA(M)-metX-CL벡터를 제작하였다(도 5). 상기 pSG-2ppc, pSG-2aspC 및 pSG-2asd 벡터를 차례로 미국특허출원 제 12/062835호에 개시된 thrA 및 metX의 강화 균주인 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P)모균주에 형질전환시켜서, 상기 균주 내에 ppc , aspC 및 asd 가 2카피로 증폭되어 존재하는 균주를 제조하여, CJM-XPA2로 명명하였다. 상기 균주에 pCJ-thrA(M)-metX-CL벡터를 형질전환하여, O-아세틸 호모세린의 생산능을 플라스크 배양을 통하여 확인하였다. 그 결과, 생산균주의 염색체 내에 포스포에놀파이루베이트로부터 아스파테이트에 이르는 유전자인 ppc , aspC 및 asd를 2카피로 증폭하면 O-아세틸 호모세린의 생성 수율이 ppc , aspC , asd 유전자가 2카피로 증폭되지 않은 균주인 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) 균주에 비하여 29,1%에서 32.7%로 3.6% 증가되는 것을 확인하였고, 추가적으로 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린의 생합성에 이르는 모든 유전자인 ppc , aspC , asd , thrA 및 metX 유전자를 염색체 또는 플라스미드 DNA 형태로 증폭 시에 O-아세틸 호모세린의 생성 수율이 ppc , aspC 및 asd 유전자가 2카피로 증폭되지 않은 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) 균주에 비하여 29.1%에서 46%로 매우 높게 16.9% 향상되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 포스포에놀파이루베이트로부터 아스파테이트에 이르는 ppc , aspC 및 asd만을 증폭한 경우에는 O-아세틸호모세린의 수율이 32.7%, ppc, aspC 및 asd의 증폭 없이 thrA 및 metX만을 증폭한 경우에는 O-아세틸 호모세린의 수율이 37.5%인 결과를 미루어 볼 때, 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린의 생합성 경로상에 위치하는 전체 유전자인 ppc , aspC , asd , thrA 및 metX 유전자를 염색체와 플라스미드 형태로 유전자 카피수를 증대하여 발현량을 동시에 증가시킬 경우 어느 한 유전자의 발현량을 증가시킨 것에 비하여 O-아세틸 호모세린의 생산 수율이 46%로 크게 증가 시킬 수 있음을 확인하여 (실시예 2, 표 2), 본 발명의 방법으로 제조된 균주의 O-아세틸 생산능이 크게 향상된 것을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 O-아세틸-호모세린 생산능이 향상된 대장균을 배양배지에서 발효하는 단계를 포함하여, 배지에 O-아세틸-호모세린을 축적시킴으로써, O-아세틸- 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 상기 방법에 의하여 제조된 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 에스케리치아 속 유래 균주를 배양하여 발효에 의해 O-아세틸 호모세린을 생산하는 단계; (b) 생산된 O-아세틸 호모세린을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리된 O-아세틸 호모세린 및 메칠머캅탄을 기질로 이용하여 시스타치오닌 감마 산타아제, O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제 및 O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제 활성을 갖는 효소로 이루어진 군에서 선택된 전환효소를 이용하여 효소반응을 일으켜서, L-메치오닌 및 아세테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 본 발명자가 2007년 출원한 국제특허공개공보 제 2008/013432호에 의거한 방법에 의한 것으로, 메치오닌 전환 효소인 시스타치오닌 감마 신타아제, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제, O-숙시닐 호모세린 설피드릴라아제 활성을 이용하여 L-메티오닌을 생산하는 방법으로 본 발명에서 제공하는 균주를 이용할 경우, 더 높은 수율로 L-메치오닌을 생산할 수 있다.

상기에서 제조된 O-아세틸-L-호모세린 생산 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다.　 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.　 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.　 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다.　 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　 탄소원은 포도당(glucose), 젖당(lactose), 자당(sucrose), 유당, 과당(fructose), 맥아당(maltose), 녹말(starch) 및 섬유소(cellulose)와 같은 탄수화물; 콩 기름(soybean oil), 해바라기 기름(sunflower oil), 피마자 기름, 베버 기름(castor oil) 및 코코넛 기름(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)산과 같은 지방산; 글리세롤(glycerol) 및 에탄올(ethanol)과 같은 알코올과 아세트산(acetic acid)과 같은 유기산(organic acid)을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육수(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor (CSL)) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소(urea), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 암모늄 클로라이드(chloride), 암모늄 포스페이트(phosphate), 암모늄 카보네이트(carbonate) 및 암모늄 니트레이트(nitrate)와 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 히드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염들(sodium-containing salts)을 포함할 수 있다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 또는 아이언 설페이트(iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 암모늄 히드록사이드(ammonium hydroxide), 포타슘 히드록사이드(potassium hydroxide), 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가함으로써 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르(polyglycol ester)와 같은 소포제를 사용함으로써 배양하는 동안 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양액의 호기성(aerobic) 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양의 기간은 L-메치오닌 전구체의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속될 수 있고 바람직한 배양시간은 10 내지 160 시간이다.

본 발명에서, 제공하는 아스파테이트 키나아제와 호모세린 디히드로게나아제(thrA), 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(metX), 포스포에놀 파이루베이트 카복실라아제(ppc), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspC), 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(asd) 이상의 6종의 효소를 대장균 염색체 DNA와 플라스미드 형태로 동시 강화하는 방법 및 균주를 통하여 보다 높은 수율로 O-아세틸-L-호모세린을 생산할 수 있으며 이렇게 생산된 O-아세틸-L-호모세린은 본 발명자가 2007년도에 출원한 "L-메티오닌 전구체 생산 균주 및 상기 균주를 이용한 L-메티오닌의 생산방법(국제특허공개공보 제2008/013432호)"에 기술한 것 같이 O-아세틸-호모세린 설피드릴라아제에 의해 메치오닌과 아세트산 합성의 전구체로 사용하여 L-메치오닌을 고수율로 생물전환 할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른O-아세틸 호모세린 생산 균주의 생합성 경로 모식도이다.
도 2는 염색체 삽입용 벡터 pSG-2 ppc 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 염색체 삽입용 벡터 pSG-2 aspC 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 염색체 삽입용 벡터 pSG-2 asd 벡터를 나타내는 도면이다.
도 5는 발현용 벡터 pCJ-thrA(M)-metX-CL 벡터를 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.　 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: O-아세틸 호모세린 생산 균주의 제조

<1-1> ppc 삽입용 pSG vector 제작

대장균의 염색체상에 ppc DNA를 삽입하기 위하여, 삽입용 벡터인 pSG-2ppc를 제작하였다.

미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 ppc 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi: 89110074)를 확보하고, 이에 근거하여 ppc 유전자의 -200 부분부터 ppc ORF를 함유하고 제한효소 EcoRI 및 SacI 인지부위를 포함하고 있는 프라이머(서열번호 1 및 2)와 SacI 및 KpnI 인지부위를 포함하고 있는 프라이머(서열번호 3 및 4)을 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 및 2와 서열번호 3 및 4 의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라아제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 4분을 30회 반복하였다.

그 결과, ppc 유전자와 제한효소 EcoRI 및 SacI, 그리고 SacI 및 KpnI을 함유한 약 3.1kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 ppc 유전자 말단에 포함된 제한효소 EcoRI 및 SacI, 그리고 SacI 및 KpnI을 처리하고, 제한효소 EcoRI 및 KpnI가 처리된 pSG76-C (J Bacteriol. 1997 Jul;179(13):4426-8.) 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고, 최종적으로 2카피의 ppc유전자가 클로닝된 pSG-2ppc 재조합 벡터를 제작하였다. 도 2는 ppc 염색체 삽입용 벡터 pSG-2ppc 를 나타내는 도면이다.

<1-2> aspC 삽입용 pSG vector 제작

대장균의 염색체상에 aspC DNA를 삽입하기 위하여 삽입용 벡터인 pSG-2aspC를 제작하였다.

미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 aspC 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi: 85674274)를 확보하고, 이에 근거하여 aspC 유전자의 -200 부분부터 ppc ORF를 함유하고 제한효소 BamH 인지 부위를 포함하고 있는 프라이머(서열번호 5 및 6)을 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 5 및 6인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라아제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.

그 결과, aspC 유전자와 제한효소 BamHI 부위를 함유한 약 1.5kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 aspC 유전자에 말단에 포함된 제한효소 BamHI을 처리하고, 제한효소 BamHI가 처리된 pSG76-C 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였다. 최종적으로 2카피의 aspC 유전자가 클로닝된 pSG-2aspC 재조합 벡터를 제작하였다. 도 3은 aspC 염색체 삽입용 벡터 pSG-2aspC 를 나타내는 도면이다.

<1-3> asd 삽입용 pSG vector 제작

대장균의 염색체상에 asd DNA 를 삽입하기 위하여 삽입용 벡터인 pSG-2asd를 제작하였다.

미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 asd 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi: 89110578)를 확보하고, 이에 근거하여 asd 유전자의 -200 부분부터 ppc ORF를 함유하고 제한효소 EcoRI 및 XbaI 인지 부위를 포함하고 있는 프라이머 (서열번호 7 및 8)와 XbaI 및 EcoRI 인지 부위를 포함하고 있는 프라이머 (서열번호 9 및 10)을 합성하였다.

대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 7 및 8과 서열번호 9 및 10 인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라아제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.

그 결과, asd 유전자와 제한효소 EcoRI 및 XbaI, 그리고 XbaI 및 EcoRI을 함유한 약 1.5 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기 PCR을 통하여 획득한 asd 유전자에 말단에 포함된 제한효소 EcoRI 및 XbaI을 처리하고, 제한효소 EcoRI가 처리된 pSG76-C 벡터에 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고 최종적으로 2카피의 ppc유전자가 클로닝된 pSG-2asd 재조합 벡터를 제작하였다. 도 4는 asd 염색체 삽입용 벡터 pSG-2asd를 나타내는 도면이다.

<1-4> ThrA및 MetX 발현용 pCJ-thrA(M)-metX-CL vector 제작

O-아세틸 호모세린의 합성을 위하여, thrA 및 metX을 발현하는 재조합 벡터를 도입하여 상기 유전자의 발현을 강화하였다.

thrA 유전자와 동시에 metX 유전자의 발현을 위한 벡터를 제작하기 위하여 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 metX 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 gi: 1799718)를 확보하고, 이에 근거하여 metX 유전자의 ATG부분부터 TAA부분까지 metX ORF를 함유하고 양 말단에 제한효소 HindIII 인지 부위를 함유하고 있는 프라이머(서열번호 11 및 12)를 합성하였다.

데이노코커스 라디오듀란스 R1의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 11 및 12인 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.

그 결과, metX 유전자와 제한효소 HindIII 부위를 함유한 약 1 kb의 증폭된 유전자를 획득하였다.

상기의 PCR을 통하여 획득한 metX 유전자에 제한효소 HindIII를 처리하고 본 발명자가 출원한 미국특허출원 제12/062835호에서 제작된 thrA 발현 벡터인 pCJ-thrA(M)-CL 플라스미드에 제한 효소 HindIII를 처리한 절편과 접합(ligation)을 통하여 클로닝하였고, 최종적으로 thrA와 metX를 동시에 발현하는 벡터인 pCJ-thrA(M)-metX-CL를 제작하였다(도 5).

<1-5> O-아세틸 호모세린 생산균주 제작

상기의 실시예 <1-1> 에서 제작한 ppc 염색체 삽입 벡터인 pSG-2ppc를 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) (미국특허출원 제12/062835호) 균주에 형질전환하여 LB-Cm(효모 추출 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 클로람페니콜 25㎍/L) 배지에서 배양한 후, 클로람페니콜 내성을 가지는 콜로니를 선발하였다. 선발된 형질전환체는 pSG-2ppc 벡터가 염색체 내의 ppc 부분에 1차로 삽입된 균주이다. 상기에서 확보된 2카피의 ppc 유전자가 삽입된 균주에 pSG 벡터 내에 존재하는 I-SceI 부분을 절단하는 제한 효소인 I-SceI를 발현하는 벡터인 pAScep를 형질전환하여 LB-Ap(효모 추출 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 앰피실린 100㎍/L)에서 생장하는 균주를 선별하였다. 이렇게 선별된 균주는 ppc 유전자는 2카피로 증폭되고 1차 삽입을 통하여 ppc유전자와 동시에 삽입된 pST76-C 벡터가 제거된 형태이다. 이러한 방법을 동일하게 실시예 <1-2>에서 제작한 pST76C-2aspC 및 실시예 <1-3>에서 제작한 pST76C-2asd 벡터에 차례대로 반복 실시하였고, 그 결과 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) 균주에 ppc , asd 및 aspC가 2 카피로 증폭된 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 균주를 CJM-XPA2로 명명하였다.

제작된 CJM-XPA2균주에 상기의 실시예 <1-4>에서 제작한 pCJ-thrA(M)-metX-CL 벡터를 형질전환하여 LB-Sp(효모 추출 10g/L, NaCl 5g/L, 트립톤 10g/L, 스펙티노마이신 25㎍/L) 배지에서 배양한 후 스펙티노마이신에 내성을 보이는 콜로니 10주를 선발하여, O-아세틸 호모세린의 생산성을 비교하였다. CJM-XPA2(pCJ-thrA(M)-metX-CL) 균주를 "대장균 CA05-0567"로 명명하고, KCCM(Korean Culture Center of Microorganism, 대한민국, 서울시 서대문구 홍제1동 유림 빌딩 361-221)에 2009년 8월 11일자로 기탁번호 KCCM11025P로 기탁하였다. 각각의 O-아세틸 호모세린 생산 능력을 비교하였다.

실시예 2: O-아세틸 호모세린 생산을 위한 발효

상기 실시예 1에서 제작한 균주의 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린의 생산성을 확인하기 위하여 삼각 플라스크 배양을 실시하였다.

하기 표 1에 나타낸 O-아세틸-호모세린 역가배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 O-아세틸 호모세린의 생산성을 비교하였다.

<O-아세틸-호모세린 생산배지 조성>

조성	농도(리터당)
포도당	60 g
황산암모늄	17 g
KH₂PO₄	1.0 g
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.5 g
FeSO₄ㆍ7H₂O	5 mg
MnSO₄ㆍ8H₂O	5 mg
ZnSO₄	5 mg
탄산칼슘	30 g
효모엑기스	2 g
메치오닌	0.15g
트레오닌	0.15g

32℃의 배양기에서 LB 고체배지 중에 밤새 배양한 단일 콜로니를 25 ml의 O-아세틸-호모세린 역가 배지에 1 백금이씩 접종하여 32℃에서 250 rpm으로 42 내지 64시간 동안 배양하였다. 배양물로부터 O-아세틸-호모세린을 HPLC에 의하여 분석하였다. 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

하기 표 2에 나타난 결과와 같이, O-아세틸 호모세린 생산 균주의 염색체 내에 포스포에놀파이루베이트로부터 아스파테이트에 이르는 유전자인 ppc , aspC 및 asd를 2카피로 증폭시에 O-아세틸 호모세린의 생성 수율이 ppc , aspC 및 asd 유전자가 2카피로 증폭되지 않은 균주인 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) 균주에 비하여 29.1%에서 32.7%로 3.6% 증가되는 것을 확인하였고, 추가적으로 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린의 생합성에 이르는 모든 유전자인 ppc , aspC , asd , thrA 및 metX 유전자를 염색체와 플라스미드 형태로 증폭시에 O-아세틸 호모세린의 생성 수율이 ppc , aspC , asd 유전자가 2카피로 증폭되지 않은 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P) 균주에 비하여 29.1%에서 46%로 매우 높은 16.9%가 향상되는 것을 확인하였다.

이러한 결과는 포스포에놀파이루베이트로부터 아스파테이트에 이르는 ppc , aspC 및 asd만을 증폭한 경우에는 O-아세틸호모세린의 수율이 32.7%, ppc , aspC , 및 asd의 증폭 없이 thrA 및 metX만을 증폭한 경우에는 O-아세틸 호모세린의 수율이 37.5%인 결과로 미루어 볼 때, 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린의 생합성 경로상에 위치하는 전체 유전자인 ppc , aspC , asd , thrA 및 metX 유전자를 염색체와 플라스미드 형태로 유전자 카피수를 증대하여 발현량을 동시에 증가시킬 경우 어느 한 유전자의 발현량을 증가시킨 것에 비하여 O-아세틸 호모세린의 생산 수율이 46%로 크게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

<O-아세틸-호모세린(OAH) 생산 Flask test>

균주	플라스미드	OAH 생산량 (g/L)	수율(%)
CJM-X/pthrA(M)-CL (기탁번호 KCCM 10921P)	-	17.5	29.1
CJM-X/pthrA(M)-CL (기탁번호 KCCM 10921P)	pCJ-thrA(M) -metX-CL	22.5	37.5
CJM-XPA2	-	19.6	32.7
CJM-XPA2	pCJ-thrA(M)-metX-CL	27.6	46.0

본 발명의 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 균주의 배양을 통해, O-아세틸 호모세린을 제작하여 O-아세틸 호모세린을 높은 효율로 생산하고 2단계 L-메치오닌 생산 공법을 이용하여 전환 반응을 일으킬 경우 매우 높은 수율로 L-메치오닌과 아세트산을 동시에 생산할 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM10921

20080123

한국미생물보존센터(국외)

KCCM10925

20080212

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11025

20090811

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-Acetyl-homoserine using the microorganism <130> PA100015/KR <150> US12/550,121 <151> 2009-08-28 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ppc <400> 1 gccggaattc tgtcggatgc gatacttgcg c 31 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ppc <400> 2 gaaggagctc agaaaaccct cgcgcaaaag 30 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ppc <400> 3 gccggagctc tgtcggatgc gatacttgcg c 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ppc <400> 4 gaagggtacc agaaaaccct cgcgcaaaag 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for aspC <400> 5 tccgagctca taagcgtagc gcatcaggca 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for aspC <400> 6 tccgagctcg tccacctatg ttgactacat 30 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for asd <400> 7 ccggaattcc caggagagca ataagca 27 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for asd <400> 8 ctagtctaga tgctctattt aactcccg 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for asd <400> 9 ctagtctaga ccaggagagc aataagca 28 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for asd <400> 10 ccggaattct gctctattta actcccg 27 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for metX <400> 11 ctgaaagctt atgaccgccg tgctcgcggg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for metX <400> 12 cgccaagctt tcaactcctg agaaacgccc 30 <210> 13 <211> 1005 <212> DNA <213> Deinococcus radioduran R1 <400> 13 atgaccgccg tgctcgcggg ccacgcctct gccctgctgc tgaccgaaga acccgactgt 60 tcggggccgc agacggtcgt tctcttccgg cgtgagccgc tgctgctcga ctgcggacgg 120 gcgctgagcg acgtgcgggt ggcctttcac acctacggca cgccgcgcgc cgacgccacg 180 ctggtgctgc acgccctgac cggcgacagc gcggtgcacg agtggtggcc cgactttctg 240 ggcgcgggcc ggccactgga cccggcagac gactacgtgg tgtgcgccaa cgtcctcggc 300 gggtgcgccg gcacgacgag cgccgctgaa ctcgccgcca cctgttccgg accggtgccg 360 ctcagcctgc gcgacatggc ccgggtgggg cgcgccctgc tggattctct cggcgtgcga 420 cgggtgcggg tcatcggcgc gagcatgggc gggatgctcg cctacgcctg gctgctggag 480 tgccccgacc tggtggaaaa ggccgtgatt ataggagccc cggcgcggca ctcgccctgg 540 gctattggac tgaacacggc ggcccgcagc gccattgccc tcgctcccgg cggcgagggg 600 ctgaaggtgg cgcgccagat tgccatgctc agttaccgca gccccgaaag cctaagccgc 660 acgcaggcgg ggcagcgcgt gccgggggtg cccgccgtta cgtcttacct gcactaccaa 720 ggcgaaaaac tcgccgcccg cttcgacgag cagacctact gcgccctcac ctgggcgatg 780 gacgcctttc agccgagcag cgccgacctc aaagcggtgc gcgcgccggt actcgtcgtc 840 ggcatctcca gcgatctgct ctaccccgcc gccgaggtcc gcgcctgcgc cgccgagctt 900 ccccacgccg actactggga actgggcagc attcacggcc acgacgcctt tttgatggac 960 ccacaggact tgccggagcg ggtgggggcg tttctcagga gttga 1005 <210> 14 <211> 3125 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <400> 14 gccgcaataa tgtcggatgc gatacttgcg catcttatcc gaccgacagt gactcaaacg 60 atgcccaact gtaggccgga taaggcgctc gcgccgcatc cggcactgtt gccaaactcc 120 agtgccgcaa taatgtcgga tgcgatactt gcgcatctta tccgacctac acctttggtg 180 ttacttgggg cgatttttta acatttccat aagttacgct tatttaaagc gtcgtgaatt 240 taatgacgta aattcctgct atttattcgt ttgctgaagc gatttcgcag catttgacgt 300 caccgctttt acgtggcttt ataaaagacg acgaaaagca aagcccgagc atattcgcgc 360 caatgcgacg tgaaggatac agggctatca aacgataaga tggggtgtct ggggtaatat 420 gaacgaacaa tattccgcat tgcgtagtaa tgtcagtatg ctcggcaaag tgctgggaga 480 aaccatcaag gatgcgttgg gagaacacat tcttgaacgc gtagaaacta tccgtaagtt 540 gtcgaaatct tcacgcgctg gcaatgatgc taaccgccag gagttgctca ccaccttaca 600 aaatttgtcg aacgacgagc tgctgcccgt tgcgcgtgcg tttagtcagt tcctgaacct 660 ggccaacacc gccgagcaat accacagcat ttcgccgaaa ggcgaagctg ccagcaaccc 720 ggaagtgatc gcccgcaccc tgcgtaaact gaaaaaccag ccggaactga gcgaagacac 780 catcaaaaaa gcagtggaat cgctgtcgct ggaactggtc ctcacggctc acccaaccga 840 aattacccgt cgtacactga tccacaaaat ggtggaagtg aacgcctgtt taaaacagct 900 cgataacaaa gatatcgctg actacgaaca caaccagctg atgcgtcgcc tgcgccagtt 960 gatcgcccag tcatggcata ccgatgaaat ccgtaagctg cgtccaagcc cggtagatga 1020 agccaaatgg ggctttgccg tagtggaaaa cagcctgtgg caaggcgtac caaattacct 1080 gcgcgaactg aacgaacaac tggaagagaa cctcggctac aaactgcccg tcgaatttgt 1140 tccggtccgt tttacttcgt ggatgggcgg cgaccgcgac ggcaacccga acgtcactgc 1200 cgatatcacc cgccacgtcc tgctactcag ccgctggaaa gccaccgatt tgttcctgaa 1260 agatattcag gtgctggttt ctgaactgtc gatggttgaa gcgacccctg aactgctggc 1320 gctggttggc gaagaaggtg ccgcagaacc gtatcgctat ctgatgaaaa acctgcgttc 1380 tcgcctgatg gcgacacagg catggctgga agcgcgcctg aaaggcgaag aactgccaaa 1440 accagaaggc ctgctgacac aaaacgaaga actgtgggaa ccgctctacg cttgctacca 1500 gtcacttcag gcgtgtggca tgggtattat cgccaacggc gatctgctcg acaccctgcg 1560 ccgcgtgaaa tgtttcggcg taccgctggt ccgtattgat atccgtcagg agagcacgcg 1620 tcataccgaa gcgctgggcg agctgacccg ctacctcggt atcggcgact acgaaagctg 1680 gtcagaggcc gacaaacagg cgttcctgat ccgcgaactg aactccaaac gtccgcttct 1740 gccgcgcaac tggcaaccaa gcgccgaaac gcgcgaagtg ctcgatacct gccaggtgat 1800 tgccgaagca ccgcaaggct ccattgccgc ctacgtgatc tcgatggcga aaacgccgtc 1860 cgacgtactg gctgtccacc tgctgctgaa agaagcgggt atcgggtttg cgatgccggt 1920 tgctccgctg tttgaaaccc tcgatgatct gaacaacgcc aacgatgtca tgacccagct 1980 gctcaatatt gactggtatc gtggcctgat tcagggcaaa cagatggtga tgattggcta 2040 ttccgactca gcaaaagatg cgggagtgat ggcagcttcc tgggcgcaat atcaggcaca 2100 ggatgcatta atcaaaacct gcgaaaaagc gggtattgag ctgacgttgt tccacggtcg 2160 cggcggttcc attggtcgcg gcggcgcacc tgctcatgcg gcgctgctgt cacaaccgcc 2220 aggaagcctg aaaggcggcc tgcgcgtaac cgaacagggc gagatgatcc gctttaaata 2280 tggtctgcca gaaatcaccg tcagcagcct gtcgctttat accggggcga ttctggaagc 2340 caacctgctg ccaccgccgg agccgaaaga gagctggcgt cgcattatgg atgaactgtc 2400 agtcatctcc tgcgatgtct accgcggcta cgtacgtgaa aacaaagatt ttgtgcctta 2460 cttccgctcc gctacgccgg aacaagaact gggcaaactg ccgttgggtt cacgtccggc 2520 gaaacgtcgc ccaaccggcg gcgtcgagtc actacgcgcc attccgtgga tcttcgcctg 2580 gacgcaaaac cgtctgatgc tccccgcctg gctgggtgca ggtacggcgc tgcaaaaagt 2640 ggtcgaagac ggcaaacaga gcgagctgga ggctatgtgc cgcgattggc cattcttctc 2700 gacgcgtctc ggcatgctgg agatggtctt cgccaaagca gacctgtggc tggcggaata 2760 ctatgaccaa cgcctggtag acaaagcact gtggccgtta ggtaaagagt tacgcaacct 2820 gcaagaagaa gacatcaaag tggtgctggc gattgccaac gattcccatc tgatggccga 2880 tctgccgtgg attgcagagt ctattcagct acggaatatt tacaccgacc cgctgaacgt 2940 attgcaggcc gagttgctgc accgctcccg ccaggcagaa aaagaaggcc aggaaccgga 3000 tcctcgcgtc gaacaagcgt taatggtcac tattgccggg attgcggcag gtatgcgtaa 3060 taccggctaa tcttcctctt ctgcaaaccc tcgtgctttt gcgcgagggt tttctgaaat 3120 acttc 3125 <210> 15 <211> 1563 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <400> 15 gatccgtcca cctatgttga ctacatcatc aaccagatcg attctgacaa caaactgggc 60 gtaggttcag acgacaccgt tgctgtgggt atcgtttacc agttctaata gcacacctct 120 ttgttaaatg ccgaaaaaac aggactttgg tcctgttttt tttatacctt ccagagcaat 180 ctcacgtctt gcaaaaacag cctgcgtttt catcagtaat agttggaatt ttgtaaatct 240 cccgttaccc tgatagcgga cttcccttct gtaaccataa tggaacctcg tcatgtttga 300 gaacattacc gccgctcctg ccgacccgat tctgggcctg gccgatctgt ttcgtgccga 360 tgaacgtccc ggcaaaatta acctcgggat tggtgtctat aaagatgaga cgggcaaaac 420 cccggtactg accagcgtga aaaaggctga acagtatctg ctcgaaaatg aaaccaccaa 480 aaattacctc ggcattgacg gcatccctga atttggtcgc tgcactcagg aactgctgtt 540 tggtaaaggt agcgccctga tcaatgacaa acgtgctcgc acggcacaga ctccgggggg 600 cactggcgca ctacgcgtgg ctgccgattt cctggcaaaa aataccagcg ttaagcgtgt 660 gtgggtgagc aacccaagct ggccgaacca taagagcgtc tttaactctg caggtctgga 720 agttcgtgaa tacgcttatt atgatgcgga aaatcacact cttgacttcg atgcactgat 780 taacagcctg aatgaagctc aggctggcga cgtagtgctg ttccatggct gctgccataa 840 cccaaccggt atcgacccta cgctggaaca atggcaaaca ctggcacaac tctccgttga 900 gaaaggctgg ttaccgctgt ttgacttcgc ttaccagggt tttgcccgtg gtctggaaga 960 agatgctgaa ggactgcgcg ctttcgcggc tatgcataaa gagctgattg ttgccagttc 1020 ctactctaaa aactttggcc tgtacaacga gcgtgttggc gcttgtactc tggttgctgc 1080 cgacagtgaa accgttgatc gcgcattcag ccaaatgaaa gcggcgattc gcgctaacta 1140 ctctaaccca ccagcacacg gcgcttctgt tgttgccacc atcctgagca acgatgcgtt 1200 acgtgcgatt tgggaacaag agctgactga tatgcgccag cgtattcagc gtatgcgtca 1260 gttgttcgtc aatacgctgc aggaaaaagg cgcaaaccgc gacttcagct ttatcatcaa 1320 acagaacggc atgttctcct tcagtggcct gacaaaagaa caagtgctgc gtctgcgcga 1380 agagtttggc gtatatgcgg ttgcttctgg tcgcgtaaat gtggccggga tgacaccaga 1440 taacatggct ccgctgtgcg aagcgattgt ggcagtgctg taagcattaa aaacaatgaa 1500 gcccgctgaa aagcgggctg agactgatga caaacgcaac attgcctgat gcgctacgct 1560 tat 1563 <210> 16 <211> 1556 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <400> 16 gaattcccag gagagcaata agcaactctc gcaccatgat tgcccgccgt cttttcggtt 60 cagtatgttt cagtacggac atgaaaatag gtaggtttcc gagcggatcc ataatcagga 120 tcaataaaac tgctgcagaa atgatttcat tcataactca aattccctga taattgccgc 180 ggactttctg cgtgctaaca aagcaggata agtcgcatta ctgatggctt cgctatcatt 240 gattaatttc acttgcgact ttggctgctt tttgtatggt gaaagatgtg ccaagaggag 300 accggcacat ttatacagca cacatctttg caggaaaaaa acgcttatga aaaatgttgg 360 ttttatcggc tggcgcggta tggtcggctc cgttctcatg caacgcatgg ttgaagagcg 420 cgacttcgac gccattcgcc ctgtcttctt ttctacttct cagcttggcc aggctgcgcc 480 gtcttttggc ggaaccactg gcacacttca ggatgccttt gatctggagg cgctaaaggc 540 cctcgatatc attgtgacct gtcagggcgg cgattatacc aacgaaatct atccaaagct 600 tcgtgaaagc ggatggcaag gttactggat tgacgcagca tcgtctctgc gcatgaaaga 660 tgacgccatc atcattcttg accccgtcaa tcaggacgtc attaccgacg gattaaataa 720 tggcatcagg acttttgttg gcggtaactg taccgtaagc ctgatgttga tgtcgttggg 780 tggtttattc gccaatgatc ttgttgattg ggtgtccgtt gcaacctacc aggccgcttc 840 cggcggtggt gcgcgacata tgcgtgagtt attaacccag atgggccatc tgtatggcca 900 tgtggcagat gaactcgcga ccccgtcctc tgctattctc gatatcgaac gcaaagtcac 960 aaccttaacc cgtagcggtg agctgccggt ggataacttt ggcgtgccgc tggcgggtag 1020 cctgattccg tggatcgaca aacagctcga taacggtcag agccgcgaag agtggaaagg 1080 gcaggcggaa accaacaaga tcctcaacac atcttccgta attccggtag atggtttatg 1140 tgtgcgtgtc ggggcattgc gctgccacag ccaggcattc actattaaat tgaaaaaaga 1200 tgtgtctatt ccgaccgtgg aagaactgct ggctgcgcac aatccgtggg cgaaagtcgt 1260 tccgaacgat cgggaaatca ctatgcgtga gctaacccca gctgccgtta ccggcacgct 1320 gaccacgccg gtaggccgcc tgcgtaagct gaatatggga ccagagttcc tgtcagcctt 1380 taccgtgggc gaccagctgc tgtggggggc cgcggagccg ctgcgtcgga tgcttcgtca 1440 actggcgtaa tctttattca ttaaatctgg ggcgcgatgc cgcccctgtt agtgcgtaat 1500 acaggagtaa gcgcagatgt ttcatgattt accgggagtt aaatagagca tctaga 1556 <210> 17 <211> 2464 <212> DNA <213> Escherichia coli W3110 <400> 17 atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60 gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120 gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180 ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240 gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300 ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360 gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420 cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480 ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540 gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600 gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660 gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720 cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780 ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840 ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900 gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960 tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020 cgcgcccgta tttccgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080 tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140 gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200 gtggtaggtg atggtatgcg caccttgcgt gggatctcgg cgaaattctt tgccgcactg 1260 gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320 gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380 aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440 ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500 tgcggtgttg ccaactcgaa ggctctgctc accaatgtac atggccttaa tctggaaaac 1560 tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620 gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680 gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740 gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800 cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860 aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920 tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980 cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040 cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100 attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gccgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160 aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220 aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggcg tctgccgcgt gaagattgcc 2280 gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttc 2340 tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400 gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460 tgaa 2464 <210> 18 <211> 334 <212> PRT <213> Deinococcus radiodurans <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(334) <223> homoserine O-acetyltransferase peptide with Unipro database No.Q9RVZ8 <400> 18 Met Thr Ala Val Leu Ala Gly His Ala Ser Ala Leu Leu Leu Thr Glu 1 5 10 15 Glu Pro Asp Cys Ser Gly Pro Gln Thr Val Val Leu Phe Arg Arg Glu 20 25 30 Pro Leu Leu Leu Asp Cys Gly Arg Ala Leu Ser Asp Val Arg Val Ala 35 40 45 Phe His Thr Tyr Gly Thr Pro Arg Ala Asp Ala Thr Leu Val Leu His 50 55 60 Ala Leu Thr Gly Asp Ser Ala Val His Glu Trp Trp Pro Asp Phe Leu 65 70 75 80 Gly Ala Gly Arg Pro Leu Asp Pro Ala Asp Asp Tyr Val Val Cys Ala 85 90 95 Asn Val Leu Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Ser Ala Ala Glu Leu Ala 100 105 110 Ala Thr Cys Ser Gly Pro Val Pro Leu Ser Leu Arg Asp Met Ala Arg 115 120 125 Val Gly Arg Ala Leu Leu Asp Ser Leu Gly Val Arg Arg Val Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ala Ser Met Gly Gly Met Leu Ala Tyr Ala Trp Leu Leu Glu 145 150 155 160 Cys Pro Asp Leu Val Glu Lys Ala Val Ile Ile Gly Ala Pro Ala Arg 165 170 175 His Ser Pro Trp Ala Ile Gly Leu Asn Thr Ala Ala Arg Ser Ala Ile 180 185 190 Ala Leu Ala Pro Gly Gly Glu Gly Leu Lys Val Ala Arg Gln Ile Ala 195 200 205 Met Leu Ser Tyr Arg Ser Pro Glu Ser Leu Ser Arg Thr Gln Ala Gly 210 215 220 Gln Arg Val Pro Gly Val Pro Ala Val Thr Ser Tyr Leu His Tyr Gln 225 230 235 240 Gly Glu Lys Leu Ala Ala Arg Phe Asp Glu Gln Thr Tyr Cys Ala Leu 245 250 255 Thr Trp Ala Met Asp Ala Phe Gln Pro Ser Ser Ala Asp Leu Lys Ala 260 265 270 Val Arg Ala Pro Val Leu Val Val Gly Ile Ser Ser Asp Leu Leu Tyr 275 280 285 Pro Ala Ala Glu Val Arg Ala Cys Ala Ala Glu Leu Pro His Ala Asp 290 295 300 Tyr Trp Glu Leu Gly Ser Ile His Gly His Asp Ala Phe Leu Met Asp 305 310 315 320 Pro Gln Asp Leu Pro Glu Arg Val Gly Ala Phe Leu Arg Ser 325 330 <210> 19 <211> 379 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(379) <223> homoserine O-acetyltransferase peptide with GenBank Acession No.NP_249081 <400> 19 Met Pro Thr Val Phe Pro Asp Asp Ser Val Gly Leu Val Ser Pro Gln 1 5 10 15 Thr Leu His Phe Asn Glu Pro Leu Glu Leu Thr Ser Gly Lys Ser Leu 20 25 30 Ala Glu Tyr Asp Leu Val Ile Glu Thr Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Thr 35 40 45 Gln Ser Asn Ala Val Leu Ile Cys His Ala Leu Ser Gly His His His 50 55 60 Ala Ala Gly Tyr His Ser Val Asp Glu Arg Lys Pro Gly Trp Trp Asp 65 70 75 80 Ser Cys Ile Gly Pro Gly Lys Pro Ile Asp Thr Arg Lys Phe Phe Val 85 90 95 Val Ala Leu Asn Asn Leu Gly Gly Cys Asn Gly Ser Ser Gly Pro Ala 100 105 110 Ser Ile Asn Pro Ala Thr Gly Lys Val Tyr Gly Ala Asp Phe Pro Met 115 120 125 Val Thr Val Glu Asp Trp Val His Ser Gln Ala Arg Leu Ala Asp Arg 130 135 140 Leu Gly Ile Arg Gln Trp Ala Ala Val Val Gly Gly Ser Leu Gly Gly 145 150 155 160 Met Gln Ala Leu Gln Trp Thr Ile Ser Tyr Pro Glu Arg Val Arg His 165 170 175 Cys Leu Cys Ile Ala Ser Ala Pro Lys Leu Ser Ala Gln Asn Ile Ala 180 185 190 Phe Asn Glu Val Ala Arg Gln Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Phe Leu 195 200 205 Gly Gly Tyr Phe Gln Glu Gln Gly Val Ile Pro Lys Arg Gly Leu Lys 210 215 220 Leu Ala Arg Met Val Gly His Ile Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Ala Met 225 230 235 240 Gly Ala Lys Phe Gly Arg Val Leu Lys Thr Glu Lys Leu Asn Tyr Asp 245 250 255 Leu His Ser Val Glu Phe Gln Val Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly 260 265 270 Glu Glu Phe Ser Thr Arg Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Met Thr 275 280 285 Lys Ala Leu Asp Tyr Phe Asp Pro Ala Ala Ala His Gly Asp Asp Leu 290 295 300 Val Arg Thr Leu Glu Gly Val Glu Ala Asp Phe Cys Leu Met Ser Phe 305 310 315 320 Thr Thr Asp Trp Arg Phe Ser Pro Ala Arg Ser Arg Glu Ile Val Asp 325 330 335 Ala Leu Ile Ala Ala Lys Lys Asn Val Ser Tyr Leu Glu Ile Asp Ala 340 345 350 Pro Gln Gly His Asp Ala Phe Leu Met Pro Ile Pro Arg Tyr Leu Gln 355 360 365 Ala Phe Ser Gly Tyr Met Asn Arg Ile Ser Val 370 375 <210> 20 <211> 380 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(380) <223> homoserine O-acetyltransferase peptide with GenBank Accession No.YP_886028 <400> 20 Met Thr Ile Ile Glu Glu Arg Ala Thr Asp Thr Gly Met Ala Thr Val 1 5 10 15 Pro Leu Pro Ala Glu Gly Glu Ile Gly Leu Val His Ile Gly Ala Leu 20 25 30 Thr Leu Glu Asn Gly Thr Val Leu Pro Asp Val Thr Ile Ala Val Gln 35 40 45 Arg Trp Gly Glu Leu Ala Pro Asp Arg Gly Asn Val Val Met Val Leu 50 55 60 His Ala Leu Thr Gly Asp Ser His Val Thr Gly Pro Ala Gly Asp Gly 65 70 75 80 His Pro Thr Ala Gly Trp Trp Asp Gly Val Ala Gly Pro Gly Ala Pro 85 90 95 Ile Asp Thr Asp His Trp Cys Ala Ile Ala Thr Asn Val Leu Gly Gly 100 105 110 Cys Arg Gly Ser Thr Gly Pro Gly Ser Leu Ala Pro Asp Gly Lys Pro 115 120 125 Trp Gly Ser Arg Phe Pro Gln Ile Thr Ile Arg Asp Gln Val Ala Ala 130 135 140 Asp Arg Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Ile Thr Glu Val Ala Ala Val 145 150 155 160 Val Gly Gly Ser Met Gly Gly Ala Arg Ala Leu Glu Trp Leu Val Thr 165 170 175 His Pro Asp Asp Val Arg Ala Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Arg 180 185 190 Ala Thr Ala Asp Gln Ile Gly Thr Gln Ser Thr Gln Val Ala Ala Ile 195 200 205 Lys Ala Asp Pro Asp Trp Gln Gly Gly Asp Tyr His Gly Thr Gly Arg 210 215 220 Ala Pro Thr Glu Gly Met Glu Ile Ala Arg Arg Phe Ala His Leu Thr 225 230 235 240 Tyr Arg Gly Glu Glu Glu Leu Asp Asp Arg Phe Ala Asn Thr Pro Gln 245 250 255 Asp Asp Glu Asp Pro Leu Thr Gly Gly Arg Tyr Ala Val Gln Ser Tyr 260 265 270 Leu Glu Tyr Gln Gly Gly Lys Leu Ala Arg Arg Phe Asp Pro Gly Thr 275 280 285 Tyr Val Val Leu Ser Asp Ala Leu Ser Ser His Asp Val Gly Arg Gly 290 295 300 Arg Gly Gly Val Glu Ala Ala Leu Arg Ser Cys Pro Val Pro Val Val 305 310 315 320 Val Gly Gly Ile Thr Ser Asp Arg Leu Tyr Pro Ile Arg Leu Gln Gln 325 330 335 Glu Leu Ala Glu Leu Leu Pro Gly Cys Gln Gly Leu Asp Val Val Asp 340 345 350 Ser Ile Tyr Gly His Asp Gly Phe Leu Val Glu Thr Glu Leu Val Gly 355 360 365 Lys Leu Ile Arg Arg Thr Leu Glu Leu Ala Gln Arg 370 375 380

Claims

(a) 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine acetyl transferase), 아스파토키나아제(aspartokinase) 및 호모세린 디히드로게나아제(homoserine dehydrogenase) 활성이 도입 및 증진되고; 및
(b) 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylases), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(apartate semialdehyde dehydrogenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 효소의 활성이 도입 및 증진된, O-아세틸 호모세린의 생산능이 향상된 에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주.
제1항에 있어서, 상기 효소 활성의 도입 및 증진은 당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하거나, 염색체상에서 당해 효소를 코딩하고 있는 유전자의 카피수를 증가시키거나, 당해 효소의 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형시킴으로써 이루어지는 것인 균주.
제2항에 있어서, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제, 아스파토키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제 활성의 도입 및 증진은 당해 효소를 코딩하는 유전자인 metX 및 thrA를 포함하는 플라스미드를 도입함으로써 이루어지는 것인 균주.
제3항에 있어서, 상기 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylases), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(apartate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 3종 모두가 대장균의 염색체상에 2카피 이상으로 존재하는 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제, 아스파토키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제, 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제 효소는 각각 대장균 유래의 metX , thrA, ppc , aspC 및 asd 유전자가 코딩하는 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제 효소는 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp .), 랩토스피라 속( Leptospira sp .), 데이노코커스 속( Deinococcus sp .), 슈도모나스 속( Pseudomonas sp .) 또는 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp .)에서 유래한 것인 균주.
제6항에 있어서, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제 효소는 코리네박테리움 글루타미쿰(corynebacterium glutamicum ), 랩토스피라 메에리( Leptospira meyeri), 데이노코커스 라디오듀란스 ( Deinococcus radiodurans ), 슈도모나스 애루기노사( Pseudomonas aeruginosa ) 또는 마이코박테리움 스메스마티스(Mycobacterium smegmatis)에서 유래한 것인 균주.
제7항에 있어서, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제 효소는 서열번호 18, 서열번호 19 또는 서열번호 20의 아미노산 서열 전체 또는 일부분을 포함하는 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 호모세린 아세틸 트랜스퍼라아제 효소는 데이노코커스 라디오듀란스 Q9RVZ8 (Deinococcus radiodurans Q9RVZ8)유래의 아미노산 서열 전체 또는 일부분을 포함하는 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 L-트레오닌, L-이소류신 또는 L-라이신을 생산할 수 있는 균주로부터 유래한 것인 균주.
제 1항에 있어서, 상기 균주는 대장균(Escherichia coli .)인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 대장균 CJM-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10921P)에서 유래한 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 대장균 CJM2-X/pthrA(M)-CL(기탁번호 KCCM 10925P)에서 유래한 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 대장균 FTR2533(기탁번호 KCCM 10541)에서 유래한 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM11025P인 균주.